PL218840B1

PL218840B1 - Pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych oraz zastosowanie pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych

Info

Publication number: PL218840B1
Application number: PL396622A
Authority: PL
Inventors: Łukasz Winiarski; Marcin Sieńczyk; Józef Oleksyszyn
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2011-10-13
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2015-01-30
Also published as: PL396622A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych oraz zastosowanie ich, jako inhibitorów ludzkiej neutrofilowej elastazy.

W publikacji Oleksyszyn J, Powers JC, Methods in Enzymology, 1994, 244, 423-441 opisano sposób otrzymywania fosfonowego analogu waliny, kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego. Z publikacji Boduszek B, Brown AD, Powers JC, J. Enzym. Inhib. 1994, 8, 147-158, znane są pochodne fosfonowego analogu waliny posiadające jako grupy estrowe podstawione pierścienie fenylowe, związki te nie są inhibitorami ludzkiej neutrofilowej elastazy. Opisano także fosfonowe analogi waliny posiadające podstawniki w pierścieniach fenylowych w publikacji Sieńczyk M, Winiarski Ł, Kasperkiewicz P, Psurski M, Wietrzyk J, Oleksyszyn J., Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2011, 21, 1310-1314. W literaturze opisane są także fosfonowe peptydomimetyki będące analogami waliny (Sieńczyk M, Podgórski D, Błażejewska A, Kulbacka J, Saczko J, Oleksyszyn J., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2011, 19, 1277-1284).

Dotychczas nie opisano jednak w literaturze pochodnych tripeptydowych estrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych, z podstawnikami według wynalazku, które posiadają właściwości nieodwracalnych i specyficznych inhibitorów ludzkiej elastazy neutrofilowej. Co najważniejsze, nie otrzymano i nie pokazano jakichkolwiek różnic w hamowaniu aktywności ludzkiej elastazy neutrofilowej przez diastereomerycznie czyste pochodne tripeptydowe estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych z podstawnikami według wynalazku. Ludzka elastaza neutrofilowa (LNE) jest proteazą serynową, która niekontrolowana uczestniczy w powstawaniu i rozwoju szeregu schorzeń. Wpływ niekontrolowanej aktywności elastazy na rozwój chorób płuc opisano w publikacjach Cardin C. i in., Curr. Med. Chem., 2008, 15, 83-808; Abboud RT, Vimaloathan S., Int. J. Tuberc. Lung Dis., 2008, 12, 362-367; Kelly E, i in., Expert Opi. Ther. Targets, 2008, 12, 145-157, natomiast prowadzące do powikłań reumatologicznych opisano w publikacji Momohara S. i in., Clin. Rheumatol., 1997, 16, 133-140, skutkujące zapaleniami i arteriosklerozą opisano w Bieth JG. J. Soc. Biol., 2001, 195, 173-179. Głównym naturalnym endogennym inhibitorem ludzkiej elastazy neutrofilowej jest alfa-1-PI. tzn. inhibitor proteinazy, dawniej zwany alfa-1-antytrypsyną. Białko to jest inhibitorem nieodwracalnym, którego szybkość działania ograniczona jest tylko i wyłącznie przez szybkość dyfuzji. Wiele stanów patologicznych opisanych w cytowanych publikacjach jest związanych z miejscową niezdolnością organizmu do utrzymania stężenia alfa-1-PI na poziomie umożliwiającym kontrolę proteolitycznej aktywności elastazy, co może być także uwarunkowane wadami genetycznymi. Elastaza odgrywa też ważną rolę w przerzutowaniu komórek nowotworowych raka płuc i piersi. W modelach zwierzęcych tych schorzeń inhibitory elastazy wykazują efekt terapeutyczny, opisany w publikacji Sato T., i in., Surg. Oncol., 2006, 15, 217-222. W literaturze patentowej i naukowej między innymi w Edwards PD., Bernstein PR., Med. Res. Rev., 1994, 14, 127-194; Macdonald SJ.. i in., J. Med. Chem., 2002, 45, 3878-90; Sykes NO., i in., J. Med. Chem., 2002, 45, 2850-56, opisano szereg niskocząsteczkowych inhibitorów LNE. Wszystkie one charakteryzują się „odwracalnością”, to znaczy powstający kompleks enzym-inhibitor jest stosunkowo nietrwały i po pewnym czasie uwalniany jest z niego aktywny enzym przyczyniając się do dalszych zniszczeń macierzy międzykomórkowej. Z kinetyki inhibicji elastazy in vivo przez odwracalne inhibitory wynika, że takie inhibitory nie są w stanie skorygować braku równowagi między LNE i alfa-1-PI.

Istotą wynalazku są pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym:

R1 oznacza grupę tert-butyloksykarbonylową (Boc); benzyloksykarbonylową (Cbz); 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową; 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylową;

R2 oznacza wodór lub grupę metylową, metyloetylową, 1-metylopropylową, 2-metylopropylową, 2-metylotioetylową, tert-butoksymetylową, izobutylową, natomiast

R3 oznacza wodór lub grupę metylową.

Korzystnie pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych są mieszaninami diastereoizomerów lub dla pochodnych o wzorze od XVII do XXII, czystymi diastereoizomerami.

PL 218 840 B1

Sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym:

R1 oznacza grupę tert-butyloksykarbonylową (Boc) lub benzyloksykarbonylową (Cbz),

R2 oznacza wodór lub grupę metylową, metyloetylową, 1-metylopropylową, 2-metylopropylową, 2-metylotioetylową, tert-butoksymetylową, natomiast

R3 oznacza wodór lub grupę metylową polega na tym, że z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymuje się Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, którą po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną. Z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc, otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z aminokwasami wybranymi z grupy: Boc-glicyna, Boc-L-alanina, Boc-D-alanina, Boc-L-walina, Boc-L-leucyna, Boc-L-izoleucyna, kwas Boc-aminoizomasłowy, Boc-L-metionina lub Boc-L-(OtBu)seryna w obecności odczynnika sprzęgającego.

W odmianie sposobu wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym:

R1 oznacza grupę 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową,

R2 oznacza grupę metyloetylową, natomiast

R3 oznacza wodór polega na tym, że otrzymuje się ester t-butylowy kwasu 2-O-4-hydroksyfenylo octowego z hydrochinonu i estru t-butylowego kwasu 2-bromooctowego, a następnie bromooctan benzylu, otrzymany z alkoholu benzylowego i kwasu 2-bromooctowego, poddaje się reakcji z estrem t-butylowym kwasu 2-O-4-hydroksyfenylo octowego. Z tak otrzymanego estru benzylowego kwasu 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy octowego usuwa się grupę benzylową i otrzymuje się kwas 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy)octowy. Równolegle z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymuje się Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, którą po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną. Z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc, otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z Boc-L-waliną w obecności odczynnika sprzęgającego. Z tak otrzymanego fosfonotripeptydu usuwa się grupę ochronną t-Boc i otrzymuje się tripeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego,który poddaje się reakcji z kwasem 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy)octowym w obecności odczynnika sprzęgającego.

R1 oznacza grupę 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylo-karbonylową,

R2 oznacza grupę metyloetylową, natomiast

R3 oznacza wodór polega na tym, że z bromooctanu benzylu, otrzymanego z alkoholu benzylowego i kwasu 2-bromooctowego, w reakcji z uracylem lub tyminą otrzymuje się benzylo-2-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octan lub benzylo-2-(5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octan, który następnie poddaje się reakcji z estrem t-butylowym kwasu bromooctowego. Z tak otrzymanego produktu usuwa się grupę benzylową i otrzymuje się kwas 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowy lub kwas 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowy. Równolegle z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu tri-p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymujemy Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, które po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną. Z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc, otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z Boc-L-waliną w obecności odczynnika sprzęgającego. Z tak otrzymanego fosfonotripeptydu usuwa się grupę ochronną t-Boc i otrzymuje się tripeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego, który poddaje się reakcji z kwasem 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowym lub kwasem 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowym w obecności odczynnika sprzęgającego.

PL 218 840 B1

Korzystnie w każdym sposobie, jako odczynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylo-uroniowy (HBTU).

Zastosowanie diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylo-propanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym:

R1 oznacza grupę tert-butyloksykarbonylową (Boc); benzyloksykarbonylową (Cbz); 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową; 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonyIową;

R3 oznacza wodór lub grupę metylową, jako nieodwracalnych inhibitorów LNE w preparatach przeciwzapalnych, w leczeniu arteriosklerozy, powikłań reumatycznych oraz jako nowych leków antyrakowych, przydatnych w leczeniu raków piersi i płuc.

Korzystnie stosuje się tylko jeden, reaktywny izomer optyczny, który reaguje z enzymem, odpowiednio tylko jedną formą optyczną, która odpowiada izomerowi L-waliny.

Pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych według wynalazku charakteryzują się okresem półtrwania kompleksu inhibitor-elastaza większym niż trzy dni. Zaletą zastosowania pochodnych według wynalazku jest fakt, że po trzech dniach, kompleks enzym-inhibitor in vivo zostaje wyeliminowany, a aktywność enzymatyczna elastazy zostaje unieszkodliwiona.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach realizacji.

Pr zyk ła d 1

Sposób wytwarzania estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-leucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylo-propanofosfonowego przedstawionego wzorem II.

Etap 1: Otrzymywanie fosforynu trój-4-metylotiofenylowego

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 5 g (36 mmola) 4-metylotiofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1,065 ml (12 mmola) chlorku fosforu(III). Całość ogrzewa się przez trzy godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego.

Etap 2: Otrzymywanie estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-2-metylo-propanofosfonowego

W tym celu do kolby okrągłodennej-zawierającej fosforyn trój-4-metylotiofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1-wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,82 g (12 mmola) karbaminianu benzylu i 1,36 ml (15 mmola) aldehydu izomasłowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 2 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej, a pozostałość rozpuszcza się w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 2,26 g surowego produktu (wydajność 35%).

³¹P NMR (122 MHz, CDCfe, ppm): δ 17.69 (s);

¹H NMR (300 MHz, CDCI3, ppm): δ 7.41-6.96 (m, 13H, Ar-H), 5.19 (d, J=9.9 Hz, 1H, NH), 5.19-5.05 (m, 2H, ArCH2O), 4.48-4.34 (m, 1H, CHP), 2.45 (s, 3H, SCH3), 2.43 (s, 3H, SCH3), 2.49-2.31 (m, 1H, CH), 1.10 (d, J=6.8 Hz, 6H, 2xCH3).

MS m/z 531.13/532.14 (M+H)⁺;

Etap 3: Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metylotiofenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 2,26 g estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo)-1-amino-2-metylo-propanofosfonowego (4,25 mmol) i dodaje się 10 ml 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny reakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,93 g (wydajność 95%) bromowodorku estru di-4-metylotiofenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego.

PL 218 840 B1

Etap 4: Otrzymywanie estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-t-butyloksykarbonylo-L-prolilo)-L-ammo-2-metylopropano fosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 1,01 g (2,11 mmol) bromowodorku estru di-4-metylotiofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego i dodaje się 0,48 g Boc-L-Pro-OH (2,22 mmola). Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml) i po upływie 2 minut dodaje się 1,09 ml N,N'-diizopropyloaminy (6,33 mmola). Po 10 minutach dodaje się 0,88 g (2,32 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach10 μΐ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników mieszaniny reakcyjnej powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (100 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x30 ml), solanką (30 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x30 ml), solanką (30 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu, a następnie usuwa się rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej i produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,1 g (wydajność 88%).

Rf = 0,41 (CHCI3:AcOEt; 4:1).

³¹P NMR (121 MHz, CDCI3) δ 18.59 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.24-7.00 (m, 8H, Ar), 4.80-4.63 (m, 1H, CHP), 4.43-4.27 (m, 1H, NH), 3.52-3.24 (m, 2H, CH2), 2.46-2.43 (m, 6H, 2xSCH3), 2.33-2.06 (m, 2H, CH2), 2.03-1.86 (m, 2H, CH2), 1.86-1.74 (m, 1H, CH), 1.72-1.59 (m, 1H, CH), 1.44 (s, 9H, 3xCH3), 1.15-0.96 (m, 6H, 2xCH3).

Etap 5: Otrzymywanie trifluorooctanu estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 1,1 g (1,85 mmol) estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i rozpuszcza się go w 50% roztworze kwasu trójfluorooctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy jako substrat wyjściowy do otrzymania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-leucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego.

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-leucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctanu estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i dodaje się 43 mg (0,17 mmola) Boc-L-Leu-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) N,N-diizopropyloetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΐ/porcję aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników mieszaniny powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 100 mg (wydajność 86%).

Rf = 0,38 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCl3) δ 18.30 (s), 17.65 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.26-7.01 (m, 8H, Ar), 5.19-4.99 (m, 1H, NH), 4.79-4.53 (m, 2H, CHP, NH), 4.53-4.37 (m, 1H, CH), 3.79-3.37 (m, 2H, CH2), 2.48-2.43 (m, 6H, 2xSCH3), 2.42-2.28 (m, 1H, CH), 2.11-1.55 (m, 6H, 2xCH, 2xCH2), 1.43 (s, 9H, 3xCH3), 1.39-1.21 (m, 2H, CH2), 1.14-0.63 (m, 12H, 4xCH3).

MS m/z 707.3/730.2 (M+Na)⁺.

PL 218 840 B1

Pr zyk ła d 2

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem III.

Pierwsze pięć etapów przebiega w ten sam sposób jak w przykładzie pierwszym.

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-Lalanylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctanu estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i dodaje się 38 mg (0,17 mmola) Cbz-L-Ala-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) N,N'-diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N' -tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΐ/porcję aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 100 mg (wydajność 87%).

Rf = 0,44 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCfe) δ 18.07 (s), 17.58 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.58-7.42 (m, 1H, NH), 7.41-7.28 (m, 5H, Ar), 7.27-7.00 (m, 8H, Ar), 5.73-5.53 (m, 1H, NH), 5.18-5.01 (m, 2H, CH2), 4.81-4.41 (m, 3H, CHP), 3.77-3.24 (m, 3H), 2.50-2.41 (m, 6H, 2xSCH3), 2.41-2.30 (m, 1H), 2.21-1.73 (m, 3H), 1.42-0.92 (m, 9H, 3xCH3).

MS m/z 699.2/722.2(M+Na)⁺.

Przykład 3

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-metionylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem IV.

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-metionylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctanu estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 49 mg (0,17 mmola) Cbz-L-Met-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 110 mg (wydajność 88%).

Rf = 0,44 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCl3) δ 18.04 (s), 17.55 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.58 (d, J=10.2 Hz, 1H, NH), 7.41-7.30 (m, 5H, Ar), 7.27-6.71 (m, 8H, Ar), 5.70-5.50 (m, 1H, CH), 5.46-5.18 (m, 1H, NH), 5.17-5.02 (m, 2H, CH2), 4.80-4.61 (m, 2H, CH2), 4.55-4.34 (m, 1H, CHP), 3.84-3.46 (m, 2H, CH2), 2.56 (t, J= 6.9 Hz, 1H, CH), 2.43 (s, 6H, 2xSCH3), 2.41-1.58 (m, 10H, CH, 3xCH2, CH3), 1.15-0.84 (m, 6H, 2xCH3).

MS m/z 759.2/760.2 (M+H)⁺.

PL 218 840 B1

P r z y k ł a d 4

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-glicylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem V.

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonyloglicylo-_L-prolilo)-a-aminoizobutylofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctanu estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i dodaje się 30 mg (0,17 mmola) Boc-Gly-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΙ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 90 mg (wydajność 84%).

Rf = 0,43 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCb) δ 17.94 (s), 17.67 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.72-7.34 (m, 1H), 7.25-7.00 (m, 8H), 4.75-4.49 (m, 2H), 4.08-3.64 (m, 3H), 3.59-3.25 (m, 2H), 2.48-2.43 (m, 6H), 2.43 -1.74 (m, 5H), 1.44 (s, 9H), 1.15-0.96 (m, 6H).

MS m/z 651.2/674.2 (M+Na)⁺.

P r z y k ł a d 5

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-D-alanylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem VI

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-D-alanylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 32 mg (0,17 mmola) Boc-D-Ala-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 90 mg (wydajność 84%).

Rf = 0,36 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (121 MHz, CDCl3) δ 18.69 (s), 18.38 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.69-7.50 (m, 1H, NH), 7.27-6.77 (m, 8H, Ar), 5.39-5.26 (m, 1H, NH), 4.75-4.40 (m, 3H, CH2, CHP), 3.88-3.60 (m, 1H, CH), 3.57-3.35 (m, 1H, CH), 2.46 (s, 6H, 2xSCH3), 2.44-1.79 (m, 5H, CH, 2xCH2), 1.48-1.36 (m, 9H, 3xCH3), 1.34 (t, J=6.6 Hz, 3H, CH3), 1.16-0.97 (m, 6H, 2xCH3).

MS m/z 665.2/688.2 (M+Na)⁺.

PL 218 840 B1

P r z y k ł a d 6

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-aminoizobutylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem VII

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-aminoizobutylo-L-prolilo)-L-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i dodaje się 41 mg (0,17 mmol) Cbz-Aib-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΐ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 85 mg (wydajność 73%).

Rf = 0,25 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCI3) δ 19.02 (s). 18.09 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.68 (d, J= 9.7 Hz, 1H, NH), 7.36-7.25 (m, 5H, Ar), 7.25-7.03 (m, 8H, Ar), 6.82-6.73 (m, 1H, NH), 5.28-4.87 (m, 3H, CH, CH2), 4.81-4.61 (m, 1H, CHP), 3.78-3.23 (m, 2H, CH2), 2.42 (s, 6H, 2xSCH3), 2.37-1.64 (m, 5H, CH, 2xCH2), 1.62-1.36 (m, 6H, 2xCH3), 1.24-0.96 (m, 6H, 2xCH3).

MS m/z 713.2/736.2 (M+Na)⁺.

P r z y k ł a d 7

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-(Nbutylo)serylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem VIII

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-(O-t-butylo)serylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifiuorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 51 mg (0,17 mmol) Cbz-L-Ser(tBu)-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 102 mg (wydajność 81%).

Rf = 0,51 (CHCl3:MeOH; 30:1).

³¹P NMR (122 MHz, CDCl3) δ 18.14 (s), 17.76 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.69-7.50 (m, 1H, NH), 7.43-7.27 (m, 5H, Ar), 7.25-6.69 (m, 8H, Ar), 5.69-5.51 (m, 1H, NH), 5.19-5.00 (m, 2H, CH2), 4.80-4.49 (m, 3H, 2xCH, CHP), 3.91-3.62 (m, 2H, CH2), 3.62-3.34 (m, 2H, CH2), 2.43 (s, 6H, 3xSCH3), 2.39-1.74 (m, 5H, CH, 2xCH2), 1.21-0.86 (m, 15H, 5xCH3).

MS m/z 771.3/794.3 (M+Na)⁺.

PL 218 840 B1

P r z yk ł a d 8

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-glicylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem IX

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-glicylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i dodaje się 35,9 mg (0,17 mmol) Cbz-Gly-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΐ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 93 mg (wydajność 83%).

Rf = 0,04 (CHCl3:AcOEt; 4:1).

³¹P NMR (121 MHz, CDCI3) δ 18.47 (s), 18.23 (s).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.74-7.38 (m, 1H, NH), 7.38-7.29 (m, 5H, Ar), 7.24-7.01 (m, 8H, Ar), 5.80-5.64 (m, 1H, CH), 5.18-5.05 (m, 2H, CH2), 4.76-4.52 (m, 2H, CHP, NH), 4.05-3.74 (m, 2H, 2xCH), 3.63-3.26 (m, 2H, CH2), 2.49-2.41 (m, 6H, 2xSCH3), 2.41-1.78 (m, 5H, CH, 2xCH2), 1.16-0.98 (m, 6H, 2xCH3).

HRMS m/z 685,2045/686, 3538 (M+H)⁺.

P r z yk ł a d 9

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem X

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol trifluorooctan estru di-4-metylo-tiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 43,2 mg (0,17 mmol) Cbz-L-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-di-izopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΐ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 104 mg (wydajność 87%).

Rf = 0,2 i 0,13 (CHCl3:AcOEt; 4:1) (dwa diastereoizomery).

³¹P NMR (122 MHz, CDCI3) δ 17.97 (s), 17.65 (s).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.57-7.36 (m, 1H, NH), 7.36-7.26 (m, 5H, Ar), 7.21-7.03 (m, 8H, Ar), 5.90-5.49 (m, 1H, CH), 5.16-5.00 (m, 2H, CH2), 4.79-4.53 (m, 2H, CHP, NH), 4.39-4.26 (m, 1H, CH), 3.84-3.46 (m, 2H, CH2), 2.43 (s, 6H, 2xSCH3), 2.41-1.75 (m, 6H, 2xCH, 2xCH2), 1.14-0.80 (m, 12H, 4xCH3).

HRMS m/z 727,2515/750,2394 (M+Na⁺).

PL 218 840 B1

P r z y k ł a d 10

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XI

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 45,6 mg (0,17 mmol) Cbz-L-Leu-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 107 mg (wydajność 88%).

Rf = 0,2 i 0,15 (CHCl3:AcOEt; 4:1) (dwa diastereoizomery).

³¹P NMR (122 MHz, CDCl3) δ 18.11 (s), 17.56 (s).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.62-7.40 (m, 1H NH), 7.39-7.28 (m, 5H, Ar), 7.24-6.99 (m, 8H, Ar), 5.55-5.29 (m, 1H, CH), 5.16-5.01 (m, 2H, CH2), 4.78 -4.42 (m, 3H, CHP, CH, NH), 3.80-3.37 (m, 2H, CH2), 2.43 (s, 6H, 2xSCH3), 2.40-1.13 (m, 8H, 2xCH, 3xCH3), 1.12-0.62 (m, 12H, 4xCH3).

HRMS m/z 741,2671/742,2828 (M+H⁺).

P r z y k ł a d 11

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-izoleucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XII

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-izoleucylo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropano fosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 45,6 mg (0,17 mmol) Cbz-L-Ile-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~1 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,084 ml (0,49 mmola) diizopropyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 75 mg (0,19 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (40 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x10 ml), solanką (10 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 101 mg (wydajność 83%).

Rf = 0,13 i 0,09 (CHCl3:AcOEt; 4:1) (dwa diastereoizomery).

³¹PNMR(121 MHz, CDCl3) δ 18.66 (s), 18.13 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.44 (s, 1H, NH), 7.39-7.27 (m, 5H, Ar), 7.25 -6.70 (m, 8H, Ar), 5.67-5.37 (m, 1H, CH), 5.19-5.00 (m, 2H, CH2), 4.80-4.48 (m, 2H, CHP, NH), 4.42-4.25 (m, 1H, CH), 3.89-3.51 (m, 2H, CH2), 2.44 (s, 6H, 2xSCH3), 2.41-1.46 (m, 8H, 2xCH, 3xCH2), 1.16-0.70 (m, 12H, 4xCH3).

HRMS m/z 741,2609/764,2609 (M+Na)⁺.

PL 218 840 B1

P r z y k ł a d 12

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XIII.

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,76 g (1,25 mmol) trifluorooctan estru di-4-metylotiofenylowego kwasu N-(N-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 285 mg (1,31 mmola) Boc-L-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,653 ml (3,75 mmola) N,N'-diizopropyloetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,52 g (1,37 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μΙ/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (100 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x30 ml), solanką (30 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x30 ml), solanką (30 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,63 g (wydajność 73%).

Rf = 0,15 i 0,07 (CHCI3:AcOEt; 4:1) (dwa diastereoizomery).

³¹P NMR (122 MHz, CDCI3) δ 17.94 (s), 17.56 (s).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.25-7.04 (m, 8H, Ar), 5.28-5.10 (m, 1H, NH), 4.78-4.68 (m, 1H, CHP), 4.67-4.45 (m, 1H, NH), 4.35-4.20 (m, 1H, CH), 3.84-3.43 (m, 2H, CH2), 2.49-2.43 (m, 6H, 2xSCH3), 2.43-1.76 (m, 7H, 3xCH, 2xCH2), 1.49-1.36 (m, 9H, 3xCH3), 1.15-0.82 (m, 12H, 4xCH3).

HRMS m/z 693,2671/694,2738 (M+H)⁺.

P r z y k ł a d 13

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XIV

Sposób otrzymywania wyjściowego substratu estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-benzyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego opisano w przykładzie 12 etap 6.

Etap 1: Otrzymywanie t-butylo-2-(4-hydroksyfenoksy)octanu

Do kolby okrągłodennej odważa się 2,2 g (0,02 mol) hydrochinonu oraz 1,7 g (0,04 mol) wodorotlenku sodu, które rozpuszcza się w 75 ml roztworu dioksan:woda zmieszanych w stosunku objętościowym 1:1. Reakcję prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego (np. argon). Po około 10 minutach dodaje się 2,95 ml (0,02 mol) tert-butylobromooctanu. Po około jednej godzinie mieszaninę reakcyjną zakwasza się 3 M kwasem solnym do pH 2-3. Następnie mieszaninę dwukrotnie ekstrahuje się 50 ml roztworu eter dietylowy:benzen w stosunku objętościowym 2:1. Warstwę organiczną suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki mieszaniny, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,59 g (wydajność 35%).

Rf = 0,71 (CHCI3:AcOEt; 4:1).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 6.75-6.59 (m, 4H, Ar), 4.48 (s, 2H, CH2), 1.40 (s, 9H, 3xCH3).

Etap 2: Otrzymywanie benzylo-2-bromooctanu

Do kolby okrągłodennej odważa się 4 g (36,98 mmol) alkoholu benzylowego i rozpuszcza się w 100 ml DMF. Następnie dodaje się 10,26 g (73,96 mmol) kwasu 2-bromooctowego, 15,26 g (73,96 mmol) N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu oraz 1,354 g (11,094 mmol) 4-dimetyloaminopirydyny. Po 24 godzinach mieszaninę przenosi się do rozdzielacza zawierającego 1 litr wody destylowanej, którą następnie ekstrahuje się czterokrotnie 500 ml porcjami octanu etylu. Warstwę organiczną suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent heksan/octan etylu w stosunku objętościowym 20:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 5,7 g (wydajność 67%).

PL 218 840 B1

Rf = 0,4 (Hex:AcOEt; 20:1).

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.46-7.32 (m, 5H, Ar), 5.21 (s, 2H, CH2), 3.88 (s, 2H, CH2).

Etap 3: Otrzymywanie benzylo-2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy) octanu

Do kolby okrągłodennnej odważa się 1,59 g (7,1 mmol) tert-butylo-2-(4-hydroksyfenoksy)octanu, 1,96 g (8,6 mmol) benzylo-2-bromooctanu oraz 1,96 g (14 mmol) bezwodnego węglanu potasu i zawiesza się w 7 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Po 24 godzinach mieszaninę przenosi się do rozdzielacza z 70 ml wody destylowanej i 3 krotnie ekstrahuje się 30 ml porcjami octanu etylu. Połączone warstwy organiczne przemywa się 30 ml solanki, a następnie suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent heksan/octan etylu w stosunku objętościowym 8:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,93 g (wydajność 73%).

Rf = 0,02 (Hex:AcOEt; 8:1).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.39-7.31 (m, 5H, Ar), 6.93-6.70 (m, 4H. Ar), 5.17 (s, 2H, CH2), 4.78 (s, 2H, CH2), 4.56 (s, 2H, CH2), 1.41 (s, 9H, 3xCH3).

Etap 4: Otrzymywanie kwasu 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy) octowego

Do dwuszyjnej kolby okrągłodennej odważa się 1,93 g (5,18 mmol) benzylo-2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy) octanu i rozpuszcza się go w 20 ml octanu etylu. Następnie dodaje się 10% wagowych palladu na węglu i przepuszcza wodór przez mieszaninę reakcyjną. Przebieg reakcji monitoruje się za pomocą chromatografii TLC. Po stwierdzeniu przereagowania całego substratu mieszaninę przepuszcza się przez lejek ze spiekiem wypełniony Silica żelem i celitem. Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,35 g (wydajność 92%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.86 (s, 1H, COOH), 6.81 (s, 4H, Ar), 4.58 (s, 2H, CH2), 4.55 (s, 2H, CH2), 1.41 (s, 9H, 3xCH3).

HRMS m/z 282,1103/305,1005 (M+Na)⁺.

Etap 5: Otrzymywanie trifluorooctanu estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,63 g (0,91 mmol) estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-t-butyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i rozpuszcza się go w 50% roztworze kwasu trójfluorooctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy, jako substrat wyjściowy do dalszych syntez.

HRMS m/z 593,2147/594,2250 (M+H⁺).

Etap 6: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 205 mg (0,29 mmol) trifluorooctan estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 90 mg (0,32 mmola) kwasu 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy) octowego. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,120 ml (0,87 mmola )trójetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 121 mg (0,32 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami W,W-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (100 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x30 ml), solanką (30 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x30 ml), solanką (30 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 100 mg (wydajność 40%).

PL 218 840 B1

Etap 7: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 100 mg estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i rozpuszcza się go w 50% roztworze kwasu trójfluorooctowego w dichlorometanie (5ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Następnie olej rozpuszcza się, w jak najmniejszej ilości octanu etylu, zalewa się zimnym (-20°C) eterem diizopropylowym i pozostawia się do krystalizacji. Uzyskany produkt odsącza sie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 80 mg (wydajność 86%).

HRMS m/z 801,2519/824,2443 (M+H⁺).

Pr zyk ła d 14

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XV.

Sposób otrzymywania benzylo-2-bromooctanu opisano w przykładzie 13 etap 2, natomiast otrzymywanie trifluorooctanu estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego opisano w przykładzie 13 etap 5.

Etap 1: Otrzymywanie benzylo-2-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo) octanu

Do kolby okrągłodennej odważa się 1 g (9 mmol) uracylu, 2,5 g (18,1 mmol) bezwodnego węglanu potasu oraz 2,5 g (11 mmol) benzylo-2-bromooctanu, całość zawiesza się w 10 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Na kolbę zakłada się suszkę wypełnioną bezwodnym chlorkiem wapnia. Po 24 godzinach mieszaninę przenosi się do rozdzielacza z 100 ml wody destylowanej i 3 krotnie ekstrahuje się porcjami 50 ml octanu etylu. Połączone warstwy octanowe przemywa się solanką i suszy bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie powstały olej zalewa się eterem dietylowym i pozostawia do krystalizacji. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,98 g (wydajność 42%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 11.43 (s, 1H, NH), 7.65 (d, J=7.9 Hz, 1H, CH), 7.40-7.34 (m, 5H, Ar), 5.63 (dd, J= 7.9, 2.1 Hz, 1H, CH), 5.20 (s, 2H, CH2), 4.59 (s, 2H, CH2).

HRMS m/z 260,0797/261,0853 (M+H⁺).

Etap 2: Otrzymywanie benzylo 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksoetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo) octanu

Do kolby okrągłodennnej odważa się 0,98 g (3,76 mmol) benzylo-2-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octanu i zawiesza się go w 10 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Mieszaninę schładza się w łaźni lodowej, a następnie ostrożnie dodaje się 0,18 g (4,5 mmol) 60% wodorku sodu. Po 15 minutach dodaje się 681 pl (4,6 mmol) fe/f-butylobromooctanu. Reakcję prowadzi się przez około 2 godziny w temperaturze pokojowej, następnie mieszaninę przenosi się do rozdzielacza z 100 ml nasyconego roztworu chlorkuamonu i 3 krotnie ekstrachuje 50 ml porcjami octanu etylu. Połączone warstwy octanowe przemywa się solanką i suszy bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,82 g (wydajność 58%).

Rf = 0,24 (CHCl3:AcOEt; 4:1).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.76 (d, J= 7.9 Hz, 1H, CH), 7.41-7.28 (m, 6H, Ar), 5.82 (d, J=7.9 Hz, 1H, CH), 5.18 (s, 2H, CH2), 4.67 (s, 2H, CH2), 4.41 (s, 2H, CH2), 1.38 (s, 9H, 3xCH3).

Etap 3: OT/zymywanie kwasu 2-(3(2-Te/T-buToksy)-2-oksyeTylo)-2,4-diokso-3,4-dihyd/opi/ymid-1-ylo)ocTowego

Do kolby okrągłodennej odważa sie 0,82 g (2,19 mmol) benzylo 2-(3-(2-Te/T-butoksy)-2-oksoetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo) octanu i rozpuszcza się go w 20 ml octanu etylu. Następnie dodaje się 10% wagowych paladu na węglu i zaczyna się przepuszczać wodór przez mieszaninę reakcyjną. Przebieg reakcji monitoruje się za pomocą chromatografi TLC. Po stwierdzeniu przereagowania całego substratu. Mieszaninę przepuszcza się przez lejek ze spiekiem wypełniony silika żelem

PL 218 840 B1 i celitem. Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,55 g (wydajność 88%).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 13.18 (s, 1H, COOH), 7.72 (d, J=7.9 Hz, 1H, CH), 5.79 (d, J=7.9 Hz, 1H, CH), 4.48 (s, 2H, CH2), 4.40 (s, 2H, CH2), 1.38 (s, 9H, 3xCH3).

HRMS m/z 284,1008/307,0894 (M+Na⁺).

Etap 4: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropano fosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 50 mg (71 μmol) trifluorooctanu estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 30 mg (106 μmola) kwasu 2-(3-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowego. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 36 μl (212 μmola) diizopropyloetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 40 mg (106 μmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo- N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (100 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x30 ml), solanką (30 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x30 ml), solanką (30 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej, stosując jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 10 mg (wydajność 16%).

Rf = 0,11 i 0,07 (CHCl3:MeOH; 30:1) (dwa diastereoizomery).

Etap 5: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 10 mg (11,6 μmola) estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-ammo-2-metylopropanofosfonowego i rozpuszcza się go w 50%) roztworze kwasu trójfluorooctowego w dichlorometanie (1 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Następnie olej rozpuszcza się w jak najmniejszej ilości octanu etylu, zalewa się zimnym (-20°C) eterem diizopropylowym i pozostawia się do krystalizacji. Uzyskany produkt odsącza sie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 5,1 mg (wydajność 55%).

HRMS m/z 803,2424/826,2312 (M+H⁺).

P r z y k ł a d 15

Sposób wytwarzania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XVI.

Etap 1: Otrzymywanie benzylo-2-(5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octanu

Do kolby okrągłodennej odważa się 1,23 g (9,75 mmol) tyminy, 2,70 g (19,54 mmol) bezwodnego węglanu potasu oraz 2,35 g (10,26 mmol) benzylo-2-bromooctanu, całość zawiesza się w 10 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Na kolbę zakłada się suszkę wypełnioną bezwodnym chlorkiem wapnia. Po 24 godzinach mieszaninę przenosi się do rozdzielacza z 100 ml wody destylowanej i 3 krotnie ekstrachuje się porcjami 50 ml octanu etylu. Połączone warstwy octanowe przemywa się solanką i suszy bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie powstały olej zalewa się eterem dietylowym i pozostawia do krystalizacji. Uzyskany osad odsącza się pod zmniejszonym, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/otan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających

PL 218 840 B1 oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,74 g (wydajność 28%).

Rf = 0,1 (CHCl3:AcOEt;4:1).

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 11.41 (s, 1H, NH), 7.52 (s, 1H, CH), 7.36 (s, 5H, Ar), 5.18 (s, 2H, CH2), 4.53 (s, 2H, CH2), 1.74 (s, 3H, CH3).

Etap 2: Otrzymywanie benzylo 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksoetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo) octanu

Do kolby okrągłodennnej odważa się 0,74 g (2,7 mmol) benzylo-2-(5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octanu i zawiesza się go w 10 ml bezwodnego dimetyloformamidu. Mieszaninę schładza się w łaźni lodowej, a następnie ostrożnie dodaje się 0,14 g (3,24 mmol) 60% wodorku sodu. Po 15 minutach dodaje się 680 μl (4,59 mmol) fe/Y-butylobromooctanu. Reakcję prowadzi się przez około 2 godziny w temperaturze pokojowej, następnie mieszaninę przenosi się do rozdzielacza z 100 ml nasyconego roztworu chlorku amonu i 3 krotnie ekstrahuje 50 ml porcjami octanu etylu. Połączone warstwy octanowe przemywa się solanką i suszy bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 20:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,32 g (wydajność 30%).

Rf = 0,19.

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.66 (s, 1H), 7.41-7.27 (m, 5H), 5.18 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 4.43 (s, 2H), 1.81 (s, 3H), 1.38 (s, 9H).

Etap 3: OY/zymywanife kwasu 2-(3-(2-Yfe/Y-buYoksy)-2-oksyfeYylo)-5-mfeYylo-2,4-diokso-3,4-dihyd/opi/ymid-1-ylo)ocYowfego

Do kolby okrągłodennej odważa sie 0,32 g (0,82 mmol) benzylo 2-(3-(2-Yfe/Y-butoksy)-2-oksoetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo) octanu i rozpuszcza się go w 15 ml octanu etylu. Następnie dodaje się 10% wagowych palladu na węglu i zaczyna się przepuszczać wodór przez mieszaninę reakcyjną. Przebieg reakcji monitoruje się za pomocą chromatografii TLC. Po stwierdzeniu przereagowania całego substratu. Mieszaninę przepuszcza się przez lejek ze spiekiem wypełniony Silica żelem i celitem. Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,22 g (wydajność 89%).

¹H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 10.16 (s, 1H), 7.03 (d, J=1.2 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H), 4.49 (s, 2H), 1.94 (d, J=1.2 Hz, 3H), 1.47 (s, 9H).

HRMS m/z 298,1165/321,0996 (M+H⁺).

Etap 4: OY/zymywanife fesY/u di-p-mfeYyloYioffenylowfego kwasu N-(N-3-(2-(Yfe/Y-buYoksy)-2-oksofeYylo)-5-mfeYylo-2,4-diokso-3,4-dihyd/opi/ymid-1-ylo)mfeYyloka/bonylo-L-walilo-L-p/olilo)-1-amino-2-mfeYylop/opanofosfonowfego

Do kolby okrągłodennej odważa się 50 mg (71 μmol) trifluorooctanu estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego dodaje się 32 mg (10 μmola) kwasu 2-(3-(2-fe/Y-butoksy)-2-oksyetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowego. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 36 μl (212 μmola) diizopropyloetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 40 mg (106 μmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Po dodaniu wszystkich składników monitoruje się pH mieszaniny reakcyjnej i w razie potrzeby dodaje się porcjami N,N'-diizopropyloetyloaminę w ilościach 10 μl/porcję, aby pH mieściło się w zakresie 8-9. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po odparowaniu lotnych składników powstały olej rozpuszcza się w octanie etylu (100 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorosiarczanu potasu (2x30 ml), solanką (30 ml), dwukrotnie 5% wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x30 ml), solanką (30 ml). Frakcję octanową suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/metanol w stosunku objętościowym 30:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne składniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 23 mg (wydajność 37%).

Rf = 0,14 i 0,09 (CHCl3:MeOH; 30:1) (dwa diastereoizomery).

PL 218 840 B1

Etapy 5: Otrzymywanie estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego

Do kolby okrągłodennej odważa się 23 mg (26,3 μmola) estru ó/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego i rozpuszcza się go w 50% roztworze kwasu trójfluorooctowego w dichlorometanie (1 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Następnie olej rozpuszcza się, w jak najmniejszej ilości octanu etylu, zalewa się zimnym (-20°C) eterem diizopropylowym i pozostawia się do krystalizacji. Uzyskany produkt odsącza sie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 9 mg (wydajność 42%).

HRMS m/z 817,2580/840,2507 (M+Na⁺).

P r z yk ł a d 16

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-D-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XVII.

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 13 z tą różnicą, że podczas etapu oczyszczania esteru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcje o współczynniku retencji Rf = 0,15.

P r z yk ł a d 17

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-L-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XVIII.

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 13 z tą różnicą, że podczas etapu oczyszczania esteru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcje o współczynniku retencji Rf = 0,07.

P r z yk ł a d 18

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-D-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XIX.

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 14 z tą różnicą, że podczas oczyszczania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcję o współczynniku retencji Rf = 0,15.

P r z yk ł a d 19

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-L-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XX.

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 14 z tą różnicą, że podczas oczyszczania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcję o współczynniku retencji Rf = 0,07.

P r z yk ł a d 20

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-D-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XXI.

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 15 z tą różnicą, ze podczas oczyszczania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcję o współczynniku retencji Rf = 0,15.

P r z yk ł a d 21

Sposób wytwarzania estru d/-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-L-1-amino-2-metylopropanofosfonowego przedstawionego wzorem XXII.

PL 218 840 B1

Sposób syntezy jest analogiczny do przykładu 15 z tą różnicą, ze podczas oczyszczania estru di-p-metylotiofenylowego kwasu N-(N-3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo-metylokarbonylo-L-walilo-L-prolilo)-1-amino-2-metylopropanofosfonowego zbiera się tylko frakcję o współczynniku retencji Rf = 0,07.

P r z y k ł a d 22

Aktywność inhibitorowa otrzymanych w przykładach 1-21 pochodnych wobec ludzkiej elastazy netrofilowej

Aktywność biologiczną pochodnych tripeptydowych estrów 4-metylotiofenylowych kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego przebadano pod kątem zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności ludzkiej elastazy neutrofilowej. Wszystkie pomiary kinetyki enzymatycznej sporządzono przy użyciu czytnika mikropłytek Molecular Devices Spectramax Gemini XP. Badania rozpoczęto od wyznaczania Km dla substratu w warunkach prowadzonych testów (temperatura 37°C, długość fali wzbudzenia 400 nm i emisji 505 nm, czas pomiaru 15 minut). Pomiaru dokonano przy różnych stężeniach substratu w zakresie stężeń od 10 μM do 500 μM przy stałym stężeniu enzymu 0,0025 U/ml (~4,5 μM). Wartość K_m wynosiła 125 μM w podanych warunkach. Pomiary aktywności inhibitorowej wykonano przy różnych stężeniach inhibitorów w zakresie stężeń od 7 μM do 25 μM. W badaniach wykorzystano zsyntetyzowany przez autorów patentu substrat MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AFC. Końcowe stężenie substratu wynosiło 40 μM. Do każdej studzienki odmierzono 100 μl enzymu, 50 μl substratu i 50 μl inhibitora. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 1 (wartości k₂/K_i [M^-1s^-1]).

Związek	LNE (k₂/Ki [M'¹s'¹])
Wzór II	127 567 ± 5 180
Wzór III	143 484 ± 2 582
Wzór IV	223 190 ± 1 711
Wzór V	34 991 ± 544
Wzór VI	39 402 ± 684
Wzór VII	1 304 ±127
Wzór VIII	162 213 ± 10 597
Wzór IX	38 973 ± 140
Wzór X	231 110 ± 13 534
Wzór XI	86 229 ± 1 696
Wzór XII	145 057 ± 3 655
Wzór XIII	217 265 ± 2 529
Wzór XIV	1 216 160 ± 59 004
Wzór XV	1 069 400 ± 71 863
Wzór XVI	1 515 500 ± 86 315
Wzór XVII	1 548 ± 36
Wzór XVIII	2 002 440 ± 116 781
Wzór XIX	2043 ± 96
Wzór XX	1 266 500 ± 41 936
Wzór XXI	4 093 ± 370
Wzór XXII	2 137 600 ± 120 120

Claims

1. Pochodne diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza grupę tert-butyloksykarbonylową (Boc); benzyloksykarbonylową (Cbz); 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową; 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową, R2 oznacza wodór lub grupę metylową, metyloetylową, 1-metylopropylową, 2-metylopropylową, 2-metylotioetylową, tert-butoksymetylową, natomiast R3 oznacza wodór lub grupę metylową.

2. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że są mieszaninami diastereoizomerów lub, dla pochodnych o wzorze od XVII do XXII, czystymi diastereoizomerami.

3. Sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza grupę tert-butyloksykarbonylową (Boc) lub benzyloksykarbonylową (Cbz), R2 oznacza wodór lub grupę metylową, metyloetylową, 1-metylopropylową, 2-metylopropylową, 2-metylotioetylową, tert-butoksymetylową, natomiast R3 oznacza wodór lub grupę metylową, znamienny tym, że z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu-p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymuje się Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, którą po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną, po czym z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc, otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z aminokwasami wybranymi z grupy: Boc-glicyna, Boc-L-alanina, Boc-D-alanina, Boc-L-walina, Boc-L-leucyna, Boc-L-izoleucyna, kwas Boc-aminoizomasłowy, Boc-L-metionina lub Boc-L-(OtBu) seryna w obecności odczynnika sprzęgającego.

4. Sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza grupę 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową, R2 oznacza grupę metyloetylową, natomiast R3 oznacza wodór, znamienny tym, że otrzymuje się ester t-butylowy kwasu 2-O-4-hydroksyfenylo octowego z hydrochinonu i estru t-butylowego kwasu 2-bromooctowego, a następnie bromooctan benzylu, otrzymany z alkoholu benzylowego i kwasu 2-bromooctowego, poddaje się reakcji z estrem t-butylowym kwasu 2-O-4-hydroksyfenylo octowego, po czym z tak otrzymanego estru benzylowego kwasu 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy octowego usuwa się grupę benzylową i otrzymuje się kwas 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy) octowy, równolegle z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu-p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymuje się Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, którą po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną, następnie z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc, otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z Boc-L-waliną w obecności odczynnika sprzęgającego, po czym z tak otrzymanego fosfonotripeptydu usuwa się grupę ochronną t-Boc i otrzymuje się tripeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego, który poddaje się reakcji z kwasem 2-(4-(2-tert-butoksy)-2-oksyetoksy)fenoksy)octowym w obecności odczynnika sprzęgającego.

5. Sposób wytwarzania pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-amino-2-metylopropanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza grupę 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylo-karbonylową, R2 oznacza grupę metyloetylową natomiast R3 oznacza wodór, znamienny tym, że z bromooctanu benzylu, otrzymanego z alkoholu benzylowego i kwasu 2-bromooctowego, w reakcji z uracylem lub tyminą otrzymuje się benzylo-2-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octan lub benzylo-2-(5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octan, który następnie poddaje się reakcji z estrem t-butylowym kwasu bromooctowego, po czym z tak otrzymanego produktu usuwa się grupę benzylową i otrzymuje się kwas 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowy lub kwas 2-(3-(2-tert-butoksy)-2-oksyetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowy, równolegle z fosforynu tri-p-tiometylofenylowego, otrzymanego z fenolu p-tiometylowego oraz chlorku fosforu(III), w reakcji z karbaminianem benzylu i aldehydem izomasłowym otrzymujemy Cbz-pochodną diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych, które po usunięciu grupy ochronnej Cbz wykorzystuje się do syntezy fosfonodipeptydu przez reakcję z N-t-Boc-L-proliną, następnie z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy ochronnej t-Boc,

PL 218 840 B1 otrzymuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego i poddaje się reakcji z Boc-L-waliną w obecności odczynnika sprzęgającego, w kolejnym kroku z tak otrzymanego fosfonotripeptydu usuwa się grupę ochronną T-Boc i otrzymuje się tripeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego, który poddaje się reakcji z kwasem 2-(3-(2-Te/T-butoksy)-2-oksyetylo)-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowym lub kwasem 2-(3-(2-Te/T-butoksy)-2-oksyetylo)-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylo)octowym w obecności odczynnika sprzęgającego.

6. Sposób według zastrz. 3, zastrz. 4 i zastrz. 5, znamienny tym, że jako odczynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylo-uroniowy (HBTU).

7. Zastosowanie pochodnych diestrów 4-metylotiofenylowych kwasów 1-aminoizobutylofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza grupę Te/T-butyloksykarbonylową (Boc); benzyloksykarbonylową (Cbz); 4-karboksymetoksyfenoksymetylokarbonylową; 3-karboksymetylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową lub 3-karboksymetylo-5-metylo-2,4-diokso-3,4-dihydropirymid-1-ylometylokarbonylową, R2 oznacza wodór lub grupę metylową, metyloetylową, 1-metylopropylową, 2-metylopropylową, 2-metylotioetylową, Te/T-butoksymetylową, natomiast R3 oznacza wodór lub grupę metylową, jako nieodwracalnych inhibitorów LNE w preparatach przeciwzapalnych, w leczeniu arteriosklerozy, powikłań reumatycznych oraz jako nowych leków antyrakowych, przydatnych w leczeniu nowotworów piersi i płuc.

8. Zastosowanie pochodnych według zastrz. 7, znamienne tym, że stosuje się tylko jeden, reaktywny izomer optyczny, który reaguje z enzymem, odpowiednio tylko jedną formą optyczną, która odpowiada izomerowi L-waliny.