PL201594B1 - Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków - Google Patents

Abstract

Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków, znamienny tym, że do genomu komórek rośliny wprowadza się konstrukt genowy zawierający cDNA genu markerowego w orientacji sensowej i pod kontrolą promotora transferazy glukozowej o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201594 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 360191 ^{(51) Int.Cl.}

C12N 15/82 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 16.05.2003

Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków (73) Uprawniony z patentu:

Uniwersytet Wrocławski,Wrocław,PL Instytut Genetyki Roślin PAN,Poznań,PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

29.11.2004 BUP 24/04 (72) Twórca(y) wynalazku:

(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2009 WUP 04/09

Jan Szopa,Wrocław,PL

Alina Korobczak,Radwanice,PL Anna Aksamit,Wrocław,PL Marcin Łukaszewicz,Wrocław,PL Jacek Skała,Wrocław,PL

Tadeusz Rorat,Poznań,PL ⁽⁵⁷⁾ Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków, znamienny tym, że do genomu komórek rośliny wprowadza się konstrukt genowy zawierający cDNA genu markerowego w orientacji sensowej i pod kontrolą promotora transferazy glukozowej o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1.

PL 201 594 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków, zapewniający wzrost odporności roślin na warunki środowiskowe, znajdujący zastosowanie w rolnictwie.

Obserwowana w ostatnich latach redukcja warstwy ozonowej w stratosferze powoduje znaczne zwiększenie poziomu promieniowania UV docierającego do powierzchni Ziemi, powodując wzrost uszkodzeń DNA w komórkach roślinnych i zahamowanie ich wzrostu, a przez to również straty w zbiorach [A.Tanaka i inni. Plant Physiol. 129 (2002) 64-71; A.Takeuchi i inni, Plant, Cell Environ 25 (2002) 695-706]. Analogiczny skutek jeśli idzie o plonowanie roślin ma chłód, szczególnie w naszej strefie geograficznej, w okresie wiosennym, podczas wschodów roślin oraz w okresie jesiennym, podczas ich zbiorów. Również szczególne znaczenie dla plonowania roślin ma kwas abscysynowy (ABA), hormon roślinny. ABA kontroluje okres wegetacji roślin. Wzrost jego poziomu w roślinie oznacza koniec wegetacji i aktywację wielu enzymów, a w tym szczególnie poligalakturonazy, powodujących szybkie mięknięcie owoców. Z tych powodów prowadzi się wiele badań, które mają doprowadzić do takiej modyfikacji roślin, aby były w stanie szybciej i skuteczniej przeciwdziałać negatywnemu wpływowi środowiska zewnętrznego. I tak ustalono, że wzmożona synteza flawonoidów może przeciwdziałać niektórym z tych czynników. Flawonoidy są to substancje fitochemiczne, wtórne metabolity roś linne. Do najważ niejszych funkcji flawonoidów zaliczyć należy pigmentację roślin, zapobieganie negatywnemu wpływowi promieniowania UV-B oraz właściwości antyoksydacyjne i antypatogenne. Znane sposoby genetycznej modyfikacji roślin, zwiększające ich odporność, polegają na wprowadzeniu do roślin jednego z genów odpowiedzialnych za syntezę flawonoidów pod kontrolą nieswoistego promotora z wirusa mozaiki kalafiora oznakowanego 35S [M.E. Verhoyen i inni, J.Exp.Bot. 53 (2002) 2099-2106]. Promotor kieruje ekspresją genu niezależnie od zmian w środowisku naturalnym oraz nie posiada żadnej swoistości tkankowej. Zatem gen znajdujący się pod kontrolą takiego promotora jest ekspresjonowany na stałym i takim samym poziomie w każdych warunkach i w każdej tkance. Ograniczenie zastosowania takiego sposobu modyfikacji roślin wynika stąd, że syntetyzowane w nadmiernych ilościach flawonoidy są toksyczne dla komórek. Takie ograniczenie daje się usunąć wtedy, gdy synteza flawonoidów jest ściśle skorelowana z wystąpieniem niekorzystnego zjawiska (np. promieniowanie UV). Rozpoznano w roślinach, że w niekorzystnych warunkach chłodu syntetyzują się białka o właściwościach ochronnych, a między innymi białka opiekuńcze (chaperonowe) i dehydryny [A. Caruso i inni, Plant Physiol. Biochem. 40 (2002) 1033-1042]. Nadekspresja tych białek ma korzystny wpływ na zdolność roślin do przeżycia w warunkach niskich temperatur. Istotnym byłoby wzmocnienie ich syntezy tylko wtedy, gdy zadziała niekorzystny bodziec. Okres dojrzewania roślin jest szczególnie ważnym etapem ich rozwoju. Zbyt wczesny zbiór gwarantuje co prawda odpowiednią twardość owocom lub bulwom, ale jest niekorzystny ze względu na małą zawartość w nich drugorzędowych metabolitów (np. karotenoidy, flawonoidy) korzystnych dla konsumenta, które są syntetyzowane w końcowym okresie wegetacji. Istnieje zatem potrzeba wydłużenia czasu dojrzewania, jednak bez utraty twardości owoców i bulw, ważnej dla transportu i przechowalnictwa. Rozpoznano, że ochronną tkanką roślin jest skórka, zatem istnieje potrzeba aby dla przeciwdziałania negatywnemu wpływowi środowiska wykorzystać tę naturalną barierę. Zatem zwiększenie syntezy związków o istotnym znaczeniu dla przeciwdziałania ujemnemu wpływowi promieniowania UV, chłodu i skróconego okresu wegetacji powinno mieć miejsce w skórce rośliny.

Stosując narzędzia biologii molekularnej przeciwdziałanie niekorzystnym zjawiskom środowiskowym odbywa się przez transformację roślin odpowiednimi genami. Dla funkcji tych genów podstawowym jest sekwencja regulatorowa, promotor. Promotor kontroluje czas i miejsce ekspresji genu i jest wyposażony w elementy odbierające sygnały środowiska, które determinują przykładowo aktywację genu w okresie chłodu lub po naświetleniu promieniami UV. Tak wiele funkcji promotora wynika z obecności odpowiednich domen w jego sekwencji. Podkreślić należy, że nie ma uniformizmu wśród promotorów, niektóre z nich są bardzo słabe lub mocne, niektóre zapewniają konstytutywną ekspresję kontrolowanych genów natomiast inne są stymulowane chłodem, UV lub ABA, jedne nie gwarantują tkankowoswoistej ekspresji genów, a inne są aktywne tylko w określonych organach rośliny lub w określonym typie komórek. Wielka różnorodność promotorów i zróżnicowane potrzeby są przyczyną intensywnych poszukiwań nowych promotorów dla potrzeb badawczych i komercyjnych. Wspólną cechą zdecydowanej większości promotorów jest posiadanie kilku konserwowanych domen, a pośród nich CAAT i TATA sekwencji. W wielu aktualnych badaniach, również o znaczeniu komercyjnym, stosuje się promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora jako mocny, nieindukowalny i tkankowonieswoisty [B. Tinland, Trends Plant Sci. 1 (1996) 178-184] i pod jego kontrolą umieszcza się żądane geny. Jednak wtedy

PL 201 594 B1 gdy ekspresję genu planuje się zrealizować w określonej tkance, przykładowo w skórce liścia i w warunkach indukcji czynnikami środowiskowymi, to wtedy należy szukać odpowiedniego promotora, o określonej mocy i swoistego tkankowo, oraz regulowanego w odpowiedzi na warunki środowiskowe.

Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków według wynalazku polega na tym, że do genomu komórek rośliny wprowadza się konstrukt genowy zawierający cDNA genu markerowego w orientacji sensowej i pod kontrolą promotora transferazy glukozowej o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1.

Nieoczekiwanie okazało się, że w odróżnieniu od znanych sposobów genetycznej modyfikacji roślin, w sposobie według wynalazku nadekspresja białek odbywa się tylko wtedy gdy zadziała niekorzystny bodziec środowiskowy, oraz ma miejsce w skórce tkanek roślinnych. Dzięki temu odporność stransformowanych roślin na niekorzystne warunki środowiskowe, takie jak promieniowanie UV, niska temperatura, światło, wzrasta kilkakrotnie w porównaniu z roślinami niemodyfikowanymi genetycznie.

Przedmiot wynalazku jest objaśniony w przykładzie wykonania, który ilustruje sposób genetycznej modyfikacji ziemniaków Solanum tuberosum var. Desiree, oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową promotora transferazy glukozowej, a fig. 2 - schemat konstruktu genu markerowego uidA użytego do transformacji komórki ziemniaka, którego integralną częścią jest promotor transferazy glukozowej.

P r z y k ł a d

Bibliotekę genomową ziemniaczaną Solanum sogarandinum w bakteriofagu λ-F^II przeszukiwano klonem cDNA Ssci17 opisanym w literaturze [T. Rorat i inni, Plant Sci. 133 (1998) 57-67]. W tym celu bakteriofagi wysiano na płytki zawierające stałe medium LB z bakteriami Xl-1 MRA. Po inkubacji w 37°C i uzyskaniu dostatecznie dużych łysinek sporządzano replikę płytki na filtrze hybrydyzacyjnym. Filtr hybrydyzacyjny inkubowano następnie w ścisłych warunkach hybrydyzacyjnych z sondą, którą stanowił cDNA klonu Ssci17. Sondę znakowano metodą wydłużania „random priming”, dobrze znaną specjalistom, z użyciem nukleotydu znakowanego ³²P. Hybrydyzację prowadzono w 65°C w roztworze zawierającym 5xSSC, 0,5% SDS, 5x roztwór Denhardta i 100 μg/ml denaturowanego DNA śledzia. Odmywanie niezwiązanej sondy prowadzono w ścisłych warunkach tj. 0,2xSSC i 0,1% SDS w 65°C. Ścisłe warunki hybrydyzacji to takie, w których hybrydyzacja zachodzi w temperaturze pomiędzy 50 a 60°C, w 2-5xSSC zawierającym 0,1-0,5% SDS, po której następuje odmywanie membrany w tej samej temperaturze i w buforze o zmniejszonym stężeniu SSC, nie wpływającym na efektywność przeprowadzonej hybrydyzacji. Stosuje się bufory o zmniejszającym się stężeniu SSC: (a) 1xSSC, 0,1% SDS; (b) 0,5xSSC, 0,1% SDS; lub (c) 0,2xSSC, 0,1% SDS. Wyizolowano klon DNA jądrowego, który zawierał sekwencję komplementarną do cDNA Ssci17. Otrzymany klon zsekwencjonowano metodą terminacyjną z użyciem nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie i postępujących primerów. W celu wytworzenia konstruktu genu reporterowego, w reakcji PCR powielono wyizolowany promotor transferazy glukozowej o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1. W tym celu użyto dwóch primerów zaopatrzonych w miejsca restrykcji Hind III i BamHI i sekwencje nukleotydowe komplementarne do promotora transferazy glukozowej. Powielony fragment był zawarty między miejscami restrykcyjnymi Hind III w końcu 5' i BamHI w końcu 3'. Primery zaprojektowano w taki sposób, aby powielana sekwencja zawierała region promotorowy obejmujący nukleotydy od 1 do 1628 genu transferazy glukozowej. Powielony promotor wprowadzono do plazmidu pBI101 (Clontech) w miejsce restrykcyjne Hind III/BamHI, czego rezultatem było przyłączenie fragmentu do sekwencji kodującej genu uidA kodującego β-glukuronidazę (GUS); na 3' końcu konstruktu w stosunku do genu uidA znajdował się sygnał poliadenilacji pochodzący z genu syntazy nopalinowej. W ten sposób uzyskano konstrukt transferazy glukozowej-GUS, w którym gen GUS znajdował się pod kontrolą promotora transferazy glukozowej. Schemat tego konstruktu przedstawia fig. 2. Konstrukt kontrolny p35S-GUS, w miejscu sekwencji pochodzącej z genu transferazy glukozowej posiadał szeroko stosowany i dobrze znany, nieswoisty i silny promotor wirusowy CaMV (wirus mozaiki kalafiora) 35S. Konstrukty wprowadzono przez elektroporację do Agrobacterium tumefaciens szczepu C58C1 niosące plazmid pGV2260, a następnie bakterie inkubowano z eksplantatami liści ziemniaka Solanum tuberosum var. Desiree. Stransformowane rośliny selekcjonowano na podłożu MS zawierającym agar i kanamycynę. Z 30 roślin kanamycynoopornych 25 ekspresjonowało gen uidA, co oceniono metodą PCR. W tak uzyskanych roślinach transgenicznych śledzono aktywność promotora transferazy glukozowej przez identyfikację obecności genu uidA na podstawie aktywności kodowanego przez ten gen enzymu β-glukuronidazy oraz lokalizację tkankową jego ekspresji w teście histochemicznym.

PL 201 594 B1

Aktywność promotora oznaczano w teście ilościowym, znanym specjalistom, przez oznaczenia aktywności enzymatycznej β-glukuronidazy w reakcji z substratem MUG (4-metyl-umbelliferyl-e-D-glukuronid), który pod wpływem zawartej w ekstraktach roślinnych β-glukuronidazy rozkładany jest do fluoryzującego produktu MU (4-metyl-umbelliferyl). Poziom fluorescencji mieszaniny reakcyjnej przekłada się na poziom aktywności β-glukuronidazy, a to z kolei na poziom indukcji promotora transferazy glukozowej genu transferazy glukozowej. Ekstrakty roślinne przygotowano z transgenicznych roślin zawierających konstrukt genu reporterowego β-glukuronidazy pod kontrolą promotora transferazy glukozowej. Analizowane rośliny poddawane były uprzednio działaniu rozmaitych czynników stresowych, takich jak kwas abscysynowy, promieniowanie UV, niska temperatura, światło. Poprzez ocenę poziomu ekspresji genu reporterowego możliwe było stwierdzenie pod wpływem jakich czynników i w jakim stopniu indukowany jest promotor genu transferazy glukozowej.

Swoistość tkankową promotora oceniano mikroskopowo w znanym specjalistom teście. W tym celu świeże tkanki lub całą roślinę nasączano pod obniżonym ciśnieniem związkiem X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-glukuronid). W miejscu lokalizacji enzymu, produktu genu uidA, substrat ulega hydrolizie do niebieskiego produktu. Następnie roślinę lub jej fragmenty prześwietla się przez przemywanie w etanolu i przechowuje się w 70% etanolu. Miejsce ekspresji genu wyznaczone przez promotor genu transferazy glukozowej łatwo się rozpoznaje przez analizę mikroskopową, intensywne niebieskie zabarwienie tkanek informuje o silnej ekspresji GUS. Rośliny stransformowane konstruktem zawierającym bezpromotorowy gen uidA wykazywały znikome zabarwienie tkanek. Rośliny stransformowane konstruktem zawierającym gen uidA pod kontrolą promotora 35S wykazywały silne zabarwienie w każdej tkance, co odpowiada właściwościom promotora 35S.

Stwierdzono, że krótka ekspozycja roślin na promieniowanie UV (312 nm) prowadzi do wzrostu aktywności glukuronidazy, przy czym wzrost ten jest najwyższy po 15 minutach i wynosi aż 4,5 krotną wartość aktywności oznaczonej w roślinach kontrolnych, transformowanych 35S promotorem. Naświetlanie dłuższe prowadzi do obniżenia ekspresji genu uidA. Zatem rośliny reagują na światło UV i gen jest silnie indukowany.

Krótka ekspozycja roślin na chłód (4°C) prowadzi do wzrostu aktywności glukuronidazy, przy czym wzrost ten jest najwyższy po 8 godzinach i wynosi 2,5 krotną wartość aktywności oznaczonej w roślinach kontrolnych (transformowanych 35S promotorem). Zatem rośliny reagują na chłód i gen jest silnie indukowany.

Traktowanie roślin ABA (100 μM) prowadzi do wzrostu aktywności glukuronidazy, przy czym wzrost ten jest najwyższy po 24 godzinach i wynosi 6,5 krotną wartość aktywności oznaczonej w roślinach kontrolnych (transformowanych 35S promotorem). Zatem rośliny reagują na ABA i gen jest silnie indukowany.

Ekspozycja roślin na światło prowadzi do wzrostu aktywności glukuronidazy. przy czym wzrost ten jest najwyższy po 12 godzinach i wynosi 2,8 krotną wartość aktywności oznaczonej w roślinach kontrolnych (transformowanych 35S promotorem). Zatem rośliny reagują na światło i gen jest silnie indukowany.

Ekspozycja roślin na światło i chłód prowadzi do 9,7 krotnego wzrostu aktywności glukuronidazy, natomiast w ciemności i chłodzie wzrost ten jest mniejszy i wynosi 4,4 krotną wartość aktywności oznaczonej w roślinach kontrolnych (transformowanych 35S promotorem). Zatem rośliny reagują synergistycznie na światło i chłód i gen jest silnie indukowany.

Rośliny transgeniczne stransformowane genem markerowym uidA pod kontrolą promotora transferazy glukozowej analizowano w mikroskopie fluorescencyjnym. Mierzono poziom aktywności glukuronidazy w różnych tkankach roślin ziemniaka. Najsilniej barwiły się komórki skórki, pozostałe tkanki nie barwiły się lub barwiły się bardzo słabo w porównaniu do roślin kontrolnych (transformowanych 35S promotorem). Zatem gen swoiście ekspresjonuje się w komórkach skórki.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób genetycznej modyfikacji roślin, zwłaszcza ziemniaków, znamienny tym, że do genomu komórek rośliny wprowadza się konstrukt genowy zawierający cDNA genu markerowego w orientacji sensowej i pod kontrolą promotora transferazy glukozowej o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1.