KR20060013382A - 세포질 웅성 불임 고추에 특이 ｄｎａ 단편 및 이의 용도 - Google Patents

세포질 웅성 불임 고추에 특이 ｄｎａ 단편 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편, 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 구성된 세포질 웅성 불임 고추와 연관된 orf456이라 불리는 폴리뉴클레오타이드 후보 물질, 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 관련된 것이다.
본 발명의 서열번호 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편은 PCR에 의하여 웅성 불임 및 웅성 가임 고추간의 세포질 형태를 판단하기 위하여 이용될 수 있다. 더욱이, 잡종 고추 종자는 CMS 세포계 내에서의 보존 세포계의 불순물을 탐지할 수 있고, CMS 세포계의 순도를 지킴으로서 종자산업과 농부들을 위하여 이익에 반하는 잡종 종자의 오염의 주원인을 제거할 수 있는 장점이 있다.
세포질 웅성 불임 고추, 형질전환 웅성 불임, 형질전환, 화분 생산 억제, 세포질 웅성 불임 고추 판별법, 웅성-불임성 판별 PCR 프라이머 세트.

Description

세포질 웅성 불임 고추에 특이 ＤＮＡ 단편 및 이의 용도{DNA FRAGMENT SPECIFIC TO CYTOPLASMIC MALE STERILE PEPPER AND USE THEREOF}
본 발명은 세포질내의 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편, 상기 DNA 마커를 이용하여 식물의 세포질 유전자형을 판별하는 방법, 및 형질전환 웅성 불임 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
잡종 강세는 두 종의 순계간의 교배 자손이 양친 중 어느 한 쪽보다 높은 생산 잠재력을 갖는 현상이다. 잡종의 경우 가장 우수한 비잡종의 변종보다 10-30 % 정도 증가된 산출량을 보일 수 있고, 산출량의 증가에 있어서 유리하다.
잡종(hybrid) 고추를 생산하기 위하여 일반적으로 사용되는 시스템은 다음의 세가지 세포계 시스템이다: (a) 게놈의 세포질 성분에서 웅성 불임 부여 돌연변이를 일으키기 때문에 세포질 웅성 불임 (cytoplasmic male sterile, CMS)이라고 불리는 웅성 불임 및 자성 가임 세포계; (b) 보존(maintainer) 세포계, 및 (c) 임성회복(restorer) 세포계. 상기 보존 세포계 및 임성회복 세포계는 자성 가임일 뿐 아니라 웅성 가임이다. 상기 CMS와 보존 세포계는 게놈의 핵 성분에 있어서 실질적으로 동일하지만(그래서 종종 이소핵 세포계라고 불림), 게놈의 세포질내의 성분에 있어서는 서로 다르다. CMS 세포계의 웅성 불임성은 모계 유전되고, 미토콘드 리아 DNA에서의 돌연변이에 기인하는 것으로 보인다. 자성 가임인 CMS 세포계는 보존 세포계로부터의 화분발산으로 인하여 수정됨으로써 증식될 수 있다. 게놈의 세포질 성분은 화분에 의하여 전달되지 않기 때문에, 이러한 교배자손은 오직 CMS 세포계의 세포질 특성을 물려받아 웅성 불임이 되게 된다. 비록 보존 세포계로부터 절반만 물려받지만, 게놈의 성분과 관련하여서 두 계간의 차이점이 없기 때문에, 상기 자손에 있어서 게놈의 핵성분 또한 CMS 세포계의 핵성분과 동일할 것이다.
CMS 세포계를, 상기에서 나타낸 바와 같이 웅성 가임 및 자성 가임이고 임성회복 세포계로 불리는 또 다른 순종의 부모 세포계와 교배함으로써 잡종 종자를 생산할 수 있다. 이러한 교배에 있어서, 임성회복 세포계가 웅성 부모의 역할을 하는 반면 상기 CMS 세포계는 자성 부모의 역할을 한다. 또한 임성회복 세포계는 핵 게놈 내에 Rf (restorer of fertility; 임성 회복) 유전자를 운반하여, CMS 세포계로부터 유전된 세포질을 갖는 식물체에서 웅성 임성을 회복시킬 것이다. 그러므로 상기 잡종 종자가 생산된다. 상기 CMS 및 임성회복 세포계는 순종 변종보다 실질적으로 높은 수율로 생산하기에 충분한 잡종 강세 (또는 헤테로시스)를 나타내기에 적합하게 선택된다.
고추(Capsicum annuum L.) 내에서 CMS는 인도의 PI 164835에서 Peterson에 의해 처음으로 증명되었다(Peterson PA (1958) "Cytoplasmically inherited male sterility in Capsicum." Amer Nat., 92:111-119). 그 후, 상업적인 종자 회사는 이러한 특성을 이용하여 하이브리드 F1 종자를 생산하였다. Peterson의 세포계의 웅 성 불임 세포질은 하이브리드 F1 고추 종자를 생산하기 위하여 이용되는 일반적인 CMS 원료일 뿐이다.
잘 특징화된 CMS 시스템의 예 중 하나는 옥수수에서 발견된다. 불임성 및 가임성 mRNA를 지닌 cms-T 옥수수로부터의 mtDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, Dewey 등(Dewey RE, Levings III CS, Timothy DH (1986) "Novel recombination in the maize mitochondrial genome produces a unique transcriptional unit in the Texas male-sterile cytoplasm." Cell 44: 439-449)은 T-세포질에 특이적인 부위를 확인하였다. 상기 부위는 13-kDa 폴리펩타이드(URF13)를 코딩하는 것으로 예측되는 T-urf13 으로 명명된 특별한 유전자를 함유한다. T-urf13은 orf25의 상류에 위치하고 동시-전사된다.
또 다른 예는 페튜니아(petunia)에서 발견된다. S-pcf 유전자는 페튜니아 내 CMS와 관련된 것으로 발견되었다. 이러한 로커스(locus)는 atp9 유전자의 5부분; coxII의 엑손 부분; 알려지지 않은 오픈 리딩 프레임(open reading frame)인 urf- s 의 3개 부분으로 구성된다(Young EG, Hanson MR (1987) "A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male sterility is developmentally regulated."Cell 50: 41-49).
CMS와 관련된 특정한 유전자는 또한 강낭콩(Johns C, Lu M, Lyznik A, Mackenzie S (1992) "A mitochondrial DNA sequence is associated with abnormal pollen development in cytoplasmic male sterile bean plants." The Plant Cell 4: 435-449), 브라시카(Brassica) (Grelon M, Budar F, Bonhomme S, Pelletier G (1994) "Ogura cytoplasmic male-sterility (CMS)-associated orf138 is translated into a mitochondrial membrane polypeptide in male-sterile Brassica cybrids. Mol Gen Genet 243: 540-547), 무(Makaroff CA, Apel IJ, Palmer JD (1990) "Characterization of radish mitochondrial atpA-associated sequences and relationship with male sterility." Plant Mol Biol 15: 735-746), 해바라기(Moneger R, Smart CJ, Leaver CJ (1994) "Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with the tissue-specific regulation of a novel mitochondrial gene." The EMBO J. 13(1): 8-17), 쌀(Akagi H (1995) "Genetic diagnosis of cytoplasmic male sterile cybrid plants of rice." Theor. Appl. Genet. 90:948-951), 당근(Kanzaki H, Takeda M, Kameya T (1991) "Sequence analysis of a mitochondrial DNA fragment isolated from cultured cells of carrot cytoplasmic male-sterile strain." Japanese J Genet 66: 719-724), 및 사탕수수(Tang HV (1996) "Transcript processing internal to a mitochondrial open reading frame is correlated with fertility restoration in male-sterile Sorghum."Plant J. 10:123-133) 등에서도 보고되었다.
통상적으로 이들 CMS-관련 유전자가 mtDNA의 내부-재정렬에 의해 생성되더라도(Hanson MR (1991) "Plant mitochondrial mutations and male sterility." Annu Rev Genet 25:461-486), 오픈 리딩 프레임은 유의적인 서열 상동성을 공유하지 않는다. 어떻게 이들 유전자가 CMS 식물 내에서 활동하고, 미토콘드리아의 기 능장애 및 불능성 화분을 유발하는지는 아직 알려져 있지 않다.
CMS 특성은 F1 종자 생성에 있어서 상업적으로 매우 유용하고 중요하다. 이는 형질전환 웅성 불임 식물이 일부 연구자에 의하여 시도되고 개발되는 이유이다. 예를 들어 Mariani et al.(Mariani C, Beuckeleer J, Truettner J, Leemans J, Goldberg RB (1990) "Induction of male sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene." Nature 347:737-741)은 식물 내에서 리보뉴클레아제(rionuclease) 유전자로 기능하는 융단조직(tapetum)-특이적 프로모터 및 바나제(barnase) 유전자를 이용하여 웅성 불임 담배를 개발하였다. 일부 실험은 이들 CMS-관련 유전자를 가임 식물로 형질전환하는 시도를 하였다. 강낭콩에서 일반적인 CMS-관련 미토콘드리아 DNA 서열인 orf239은 미토콘드리아 타겟 서열을 지니거나 지니지 않은 담배로 형질전환 되었다(Abad AR, Mehrtens BJ, Mackenzie SA (1995) "Specific expression in reproductive tissues and fate of a mitochondrial sterility-associated protein in cytoplasmic male sterile beans. Plant Cell 7:271-285). 형질전환된 담배는 단백질의 미토콘드리아로의 타겟팅이 이루어지지 않더라도 반-불임(semi-sterile) 또는 웅성-불임 표현형을 나타냈다(He S, Abad AR, Gelvin SB, Mackenzie SA (1996) "A cytoplasmic male sterility-associated mitochondrial protein causes pollen disruption in transgenic tobacco." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11763-11768). 또 다른 CMS-관련 유전자인 페튜니아 속에서 25kDa 단백질을 인코딩하는 pcf 유전자의 urf -s 서열이 미토콘드리아 타겟팅 서열의 구조물로 페튜니아 및 담배 식물로 형질전환되었다. PCF 단백질의 발현이 형질전환 페튜니아 및 담배 식물의 미토콘드리아 내에서 검출되었더라도 식물의 번식력이 영향 받지 않았다(Wintz H, Chen HC, Sutton CA, Conley CA, Cobb A, Ruth D, Hanson MR (1995) "Expression of the CMS-associated urf -s sequence in transgenic petunia and tobacco." Plant Mol Biol 28:83-92).
더욱이, 식용 작물을 포함하는 식물체의 웅성 가임(N-) 세포질 및 웅성 불임(S-) 세포질의 올바른 판별은 육종 시스템에 있어서 매우 중요하다. 잡종 종자의 순도 및 세포질의 유전자형은 통상적으로 GOT(grow-out test)에 의하여 측정된다. 상기 GOT 법은 잘 발육된 대표적인 식물 표본에서 형태학적 및 꽃의 특징(잡종을 구별하는)을 평가하는 것에 기초를 두는 방법이다. 예를 들어, 고추 식물은 발육되기까지 몇 달의 시간을 필요로 하고, 종자는 이용할 수 있을 정도로 발육될 때까지는 시판될 수 없기 때문에 적합한 조건하에서 저장되어야만 한다. 더욱이, GOT 에 의하여 흡수된 잡종 종자 생산후 첫번째 생장기에 있어서 실질적인 지체가 발생되며, 이는 또한 잡종 배양을 위한 선호되는 시기이다. 이러한 경우, 상기 종자는 시판되기 전에, 예를 들어, 다음 발육시기까지 1년이상 동안 저장되어야만 한다. 그러므로 판매회사를 위하여 GOT 결과를 기다리기 위하여 연장된 기간동안 잡종 종자를 저장품의 형태로 저장한다. 다른 GOT법의 단점은 형태학적인 성질의 발현에 있어서 환경적인 영향에 의하여 변화를 일으킬 수 있다는 것이다. 더 나아가 불리한 기후적 조건(강한 바람 또는 비, 높은 기온, 가뭄과 같은)은 농작물을 파괴하거나 이에 악영향을 미칠 수 있고 자료를 모으는 것을 어렵게 만드는 가능성 또한 가진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 DNA 마커와 같은 CMS와 연관된 서열 을 이용하는 기술은 세포질 웅성 불임형을 판별하기 위하여 쉽게 발전해왔다. 이러한 기술은 PCR 법으로 검출하는 DNA 마커를 이용하고, RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 과 같은 하이브리디제이션을 기초로 하는 방법보다 많은 양의 표본에 이용하기 위하여 훨씬 효율적이어서 상기 목적에 적합하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 고추에서 세포질 웅성 불임과 관련된 DNA 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 형질전환 웅성-불임 식물을 얻기 위하여 사용되는 구조물 및 상기 유전자의 코딩 구역에 의해 발현된 단백질을 미토콘드리아로 표적화(타겟팅)하는 것이 가능한 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 형질전환 웅성 불임 식물의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 형질전환 식물체에서 화분 생성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 CMS 고추에 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 PCR 법에 의하여 고추에서 웅성 불임을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 고추에서 웅성 불임을 판별하기 위한 PCR 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환 웅성 불임 식물을 제공한다.
또한, 본 발명은:
a) 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 (orf456 이라 불리는) 폴리뉴클레오타이드 서열;
b) 식물에서 활성을 갖고, 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위하여 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합되어 있는 프로모터; 및
c) 상기 a)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 이동시키는 것이 가능한 DNA 서열
을 포함하는, 형질전환 웅성 불임 식물을 얻기 위하여 사용되는 구조물을 제공한다.
또한, 본 발명은:
a)ⅰ)서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 (orf456 이라 불리는) 폴리뉴클레오타이드 서열, ⅱ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위하여 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합되어 있는 결합시킨 식물에서 활성을 갖는 프로모터; 및 ⅲ) 상기 a)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 이동시키는 것이 가능한 DNA 서열을 포함하는 구조물을 제조하는 단계, 및
b) 상기 구조물을 식물체 또는 식물 세포 내로 형질전환시키는 단계
를 포함하는 형질전환 웅성 불임 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은:
a)ⅰ)서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어지는 (orf456 이라 불리는) 폴리뉴클레오타이드 서열; ⅱ) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위하여 작동 가능하게 결합되어 있는 식물에서 활성을 갖는 프로모터; 및 ⅲ)상기 a)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 이동시키는 것이 가능한 DNA 서열을 포함하는 구조물을 제조하는 단계, 및
b) 상기 구조물을 식물체 또는 식물 세포 내로 형질전환시키는 단계
를 포함하는 식물에서의 화분 생산 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은:
a) coxII 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 붙일 수 있는 정방향 프라이머, 및 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 붙일 수 있는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고,
b) DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 관찰하는 단계
를 포함하는 PCR에 의한 웅성 불임 고추를 판별하기 위한 coxII 3 인접 구역에서의 CMS 특이적인 DNA 단편 (서열번호 1, 1596 bp) 을 제공한다. 이 경우 증폭된 단편의 존재는 식물이 웅성 불임 세포계임을 나타내고, 증폭된 단편이 없는 경우는 웅성 가임 세포계임을 나타낸다.
또한, 본 발명은:
a) atp6 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링(annealing) 할 수 있는 정방향 프라이머, 및 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고,
b) DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 관찰하는 단계
를 포함하는 식물에서의 웅성 불임 판별 방법을 제공한다. 이 경우 증폭된 단편은 식물이 웅성 불임 세포계임을 나타내고, 증폭된 단편이 없는 경우는 웅성 가임 세포계임을 나타낸다.
또한, 본 발명은
a) coxII 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링 할 수 있는 정방향 프라이머, 및
b) 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머
를 포함하고, 증폭된 DNA 단편의 크기가 50 bp에서 2kbp 이상인 식물체의 웅성 불임성 판별을 위한 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은
a) atp6 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링할 수 있는 정방향 프라이머, 및
b) 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머를 포함하고 증폭된 단편의 크기가 50bp 내지 1kbp 이상인, PCR에 의한 웅성 불임성 고추를 판별하기 위한, 고추의 atp6의 3' 인접 부위에서 CMS 특이적인 DNA 단편을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드와 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드(1596 bp)는 coxII 유전자의 3'말단에 위치하고, 오픈 리딩 프레임으로서 염기서열의 223 내지 678 위치에서 orf456 부위을 포함한다. 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드(251bp)는 3'절단된 apt6 유전자의 3'말단에 위치한다.
상기 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편은 웅성 불임 식물의 제조 및/또는 웅성 불임 세포계를 보존 고추 세포계와 구별하는데 이용된다.
본 발명은 모든 종류의 식물체에 적용할 수 있고, 바람직하게는 고추, 가지, 담배, 토마토, 및 페튜니아 등의 가지과 식물; 튤립, 콜리플라워, 및 브로콜리 등의 십자화과 작물들; 백합과 및 국화과 등의 화훼 작물들; 그 외 목본 식물들을 포함할 수 있다.
형질전환 웅성 불임 식물체를 제조하기 위하여, 고추의 세포질 웅성불임과 관련된 DNA 단편(orf456)을 갖고 상기 DNA 단편이 전사 및 번역 조절 서열의 조절 하에서 상기 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 발현 구조물을 제조할 수 있다. 상기 전사 및 번역 조절 서열은 특정 생물체(예를 들어, 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 동물 및 인간), 세포 또는 조직에서 역할을 할 수 있고, 이들이 연관된 외래 유전자의 전사 및 번역 발현을 초래하고, 숙주세포의 종류에 따라 이용될 수 있다. 상기 전사 및 번역 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서, 타겟팅 프리시퀀스(presequence), 종결자 등을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로모터는 하류의 구조 유전자 서열의 전사를 유도하기 위하여 고발현 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 공지된 플라스미드 또는 벡터로부터 유래하고, 예로서 RA8 프로모터, TA29 프로모터 등이 있다. 상기 적합한 프로모터의 선택은 당업계의 통상적인 기술 수준 범위에 포함된다.
상기 발현 구조물은 복합-클로닝 사이트, 선택마커, 복제기원, 및 외부 유전자에 의하여 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 전달할 수 있는 DNA 서열, 예를 들어, 서열번호 3의 효모 사이토크롬 C 산화효소(yeast cytochrome c oxidase)의 서브유닛 IV (coxⅣ)의 프리시퀀스를 추가로 포함할 수 있다. 상기 발현 구조물은 일반적인 벡터일 수 있고, 예로서 CaMV 35S 프로모터 및 노팔린 합성효소 (nos) 유전자의 종결자로 구성된 pCAMBIA2300 벡터를 포함하는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터를 사용한다. 그러나 숙주에서 복제 및 생존 가능한 다른 모든 플라스미드 또는 벡터가 이용가능하다.
숙주 세포의 유형에 따라서 형질전환체를 생성하기 위한 형질전환방법, 예를 들어, 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기영동(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986), 열-충격(heat-shock), 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 DNA 전달, 원형질체 형질전환, 미세주입, 및 바이오리스틱(biolistic) 형질전환과 같은 방법은 잘 알려져 있다
본 발명의 일실시예에 있어서, orf456 유전자 단편을 갖는 재조합 pCAMBIA2300 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 DNA 전달체에 의하여 아라비돕시스 및 양파로 도입하였다. 양파의 일시적인 발현 실험은 서열번호 3의 효모 사이토크롬 c 산화효소 서브유닛 Ⅳ (coxⅣ)의 프리시퀀스가 외래 유전자에 의하여 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 전달시킬 수 있음을 보여주었다. orf456 유전자 단편을 갖는 재조합 pCAMBIA2300 벡터를 이용한 아라비돕시스 탈리아나로의 형질전환은 화분을 갖지 않는 웅성 불임 표현형을 나타내었다.
본 발명의 목적은 또한 형질전환 웅성 불임 식물체를 웅성 가임 식물체로 회복시키는 방법을 제공하는 것이며, 본 발명에 따르면, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 상기에 정의된 혼성화 DNA 구조물의 하나 이상의 복제본을, 상기 서열을 포함하는 벡터 플라스미드에 의하여 수용 식물체 내로 도입시킴으로써, 선별된 고등 식물을 형질전환시켜, 형질전환 웅성 불임 식물(TMSP)을 수득하고; (b) 역 orf456 서열을 포함하는 플라스미드에 의하여 orf456 유전자의 안티센스 코딩 부위를 포함하는 안티센스 하이브리드 DNA 구조물의 하나 이상의 복제본을 도입시킴으로써, (a)에서와 동일한 고등 식물을 형질전환시켜, 형질전환 웅성 가임 식물(TMFP)을 수득하고; (c) (a)에서 수득한 형질전환 웅성 불임 식물과 (b)에서 수득한 웅성 가임 식물을 교배하여, 웅성 번식력이 회복되고 미리 선택된 특성을 지닌 잘 자라는 잡종(hybrid)을 수득하는 단계. 또한, 본 발명의 목적은, 상기에서 정의된 바와 같이, 구성성(constitutive) 프로모터 및 꽃밥에 특이적인 프로모터 중에서 선택된 프로모터와 결합되고, 또한 적절한 종결자와 결합된 안티센스 하이브리드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명의 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편은 보존 고추로부터 웅성 불임 고추를 판별하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 웅성 불임 고추를 판별하기 위한 방법은 a) coxII 게놈 유전자의 일부, apt6 게놈 유전자, 또는 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오타이드 염기서열의 일부를 어닐링할 수 있는 정방향 프라이머 및 주형으로서 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA를 대한 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 어닐링할 수 있는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하는 단계, 및 DNA 단편이 증폭되는지 여부를 관찰하는 단계를 포함한다. 이 때, 증폭된 단편의 존재는 상기 식물이 웅성 불임 세포계임을 나타내고, 증폭된 단편이 존재하지 않는 것은 상기 식물이 웅성 가임 세포계임을 나타낸다. 증폭된 DNA 단편의 크기는 50bp 로부터 2 kbp 이상일 수 있고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 길이는 50bp 로부터 1kbp 이상일 수 있다.
관찰단계에 있어서, DNA 단편의 증폭여부는 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동 시킨 후 브롬산 에티디움 염색하여 측정할 수 있다. 또한, 방사선-표지법, 비색법, 화학발광법, 또는 형광법을 적용하여 PCR 산물을 탐지할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 정방향 프라이머로서 서열번호 15 또는 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머와 역방향 프라이머로서 서열번호 16 또는 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머를 설계제작한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
도 1은 C. annuum L 내의 웅성 가임(F) 및 웅성 불임(S) 세포계를 비교하기 위해 8개의 미토콘드리아 프로브(coxI , coxII , coxIII , atpA , atp6 , atp9 , cob, nad9 유전자)로 혼성화되고, EcoRI, HindIII, 및 BamHI로 분해된 mtDNA의 서던-블럿(southern-blot) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 3개의 미토콘드리아 프로브(atpA, atp6, coxII)를 갖는 mtRNA의 노던-블럿(northern-blot) 분석 결과를 나타낸 것이다. atp6 및 coxII 유전자는 RNA 전사체의 다형성 밴드 패턴을 나타낸다(화살표 표시됨).
도 3은 고추(Capsicum annuum L.)의 atp6 및 coxII 유전자의 역PCR(inverse PCR) 및 RFLP 결과를 나타낸 것이다. (A): atp6 (좌) 및 coxII (우) 프로브를 갖는 N-세포질 및 S-세포질간의 서던-블럿 분석결과. (B): 고추의 CMS 세포계에 특이적인 DNA 서열의 클로닝을 위한 인버스 PCR 증폭물. 예상된 PCR단편은 별표(*)로 표지하였다.
도 4는 고추의 보존계(N-세포질) 및 CMS세포계(S-세포질)간의 coxII 염기서열 비교의 개략도를 나타낸 것이다.
도 5는 고추의 보존계(N-세포질) 및 CMS세포계(S-세포질)간의 atp6 코딩부위 및 이의 인접부위의 염기 서열 비교의 개략도를 나타낸 것이다. (A): 고추(C. annuum L.)의 (N) atp6 -1 유전자 및 (S) atp6 -1 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 비교한 대표 개략도. (B): (N) atp6 -2 및 (S) ψ atp6 -2의 뉴클레오타이드 서열 비교의 대표 개략도. 높은 정도로 보존된 부위는 초록색 박스로 나타내었다. 빨간색 박스는 (N) atp6 -2의 3'부위와 클레오타이드 서열 상동성을 갖지 않는 절단 부위를 나타낸다. 상기 화살표는 atp6 3' 구역의 역PCR을 위한 프라이머 쌍을 나타내고, 각각의 atp6 복제본의 EcoRI-EcoRI 단편의 크기를 오른쪽에 나타냈다.
도 6은 가임 세포계 및 불임 세포계의 coxII 유전자의 염기 서열 비교의 개략도를 나타낸 것이다. 화살표는 coxII 3' 구역상에서의 인버스 PCR, 서열화 및 RT-PCR 실험을 위한 프라이머 쌍을 나타낸다.
도 7은 불임 세포계 내의 coxII 유전자의 3' 부위에 존재하는 orf456 유전자에 대한 RT-PCR 실험 결과이다.
도 8은 orf456 프로브를 갖는 가임, 불임, 및 회복 세포계의 mtRNAs의 노던-블럿 분석결과이다. 약 15㎍/lane의 RNA를 1.2% 아가로스 겔에서 로딩하여, N+ 나일론 멤브레인으로 전달시킨다. 　∞F: 가임 세포계, S: 불임 세포계, R: 임성회복 세포계.
도 9는 orf456 유전자 발현에 의한 박테리아 성장 억제 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 형질전환을 위한 orf456 및 egfp -1 트랜스유전자(transgene) 구조를 나타낸 것이다. 도식은 pCAMBIA2300 식물 형질전환 벡터로 각각의 유전자 구조물의 클로닝을 위한 전략을 나타낸다.
도 11은 양파의 일시적 발현 분석에서의 GFP 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 12는 아라비돕시스 형질전환체 내의 GFP 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 13은 웅성 불임(미토콘드리아-타겟된, a) 형질전환체 및 웅성 가임(미토콘드리아-비-타겟된, b) 형질전환체의 꽃 형태를 나타낸 것이다.
도 14는 미토콘드리아-타겟된 형질전환체의 종자 세트 단계의 아라비돕시스 표현형을 나타낸 것이다.
도 15는 웅성 가임 및 웅성 불임 표현형을 모두 나타내는 이종형 T0 형질전환-아라비돕시스 형질전환체를 나타낸 것이다.
도 16은 20 개의 고추 품종의 PCR 증폭 또는 CMS-특이적인 SCAR 프라이머 쌍을 이용한 증가물을 나타낸 것이다.
실시예 1: 웅성 불임 및 가임 고추간의 RFLP 및 노던- 블럿 분석
고추 밀양 품종(Capsicum annuum cv. Milyang)의 가까운 동질유전성 웅성 가임 세포계 (N/rf/rf 유전형), 웅성 불임 세포계(S/rf/rf), 및 임성회복된 세포계 (S/Rf/Rf)를 이용하였다. 이들의 임성회복은 흥농종묘회사에서 시행하였다.
1-1. RELP 분석
고추(C. annuum)의 어린잎을 황화현상 후에 수확하고 표본 10g 당 균질화 완충용액(0.1 M Tris-HCl pH7.2, 0.5 M 만니톨, 0.001 M 에틸렌 글리세롤-비스 (β-아미노에틸 에테르), N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 0.2% 소혈청알부민 (BSA), 0.05% 시스테인) 70 ㎖ 으로 균질화하여 보존 및 CMS 식물로부터 mtDNA를 분리하였다. 수크로오스 구배 원심법으로 미토콘드리아를 정제하고, mtDNA를 DNase Ⅰ기법으로 분리하였다(Sparks RB, Dale RMK (1980) "Characterization of 3H-labelled supercoiled mitochondrial DNA from tobacco suspension culture cells." Mol Gen Genet 180:351-355).
웅성 가임 세포계 및 불임 세포계의 MtDNA(10㎍)를 EcoRI (Boehringer Mannheim, 독일)로 분해한 후, 이는 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리하고, Hybond N+ 나일론 멤브레인 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, 미국)으로 옮겼다. 8개의 미토콘드리아 프로브(coxI, coxII , coxIII , atpA , atp6 , atp9 , cob, nad9)를 RFLP 분석 미토콘드리아 DNA 프로브로 선택하고, 방사능으로 표지하기 위해 [α-32P] dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, 미국)로 무작위 프라이밍(priming)하였다. 방사능으로 표지한 후, 하이브리디제이션 완충액 [.0.75 M NaCl, 0.125 M 구연산, 0.05 M 인산나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 3% 황산덱스트란, 2.5 mM EDTA, 0.6% SDS, pH 7.2, 50% 포름아마이드(formamide)] 내에서 42 ℃, 24시간 동안 서던 하이브리디제 이션을 수행하였다. 블럿을 2 X SSC, 0.1 % SDS 로 65℃ 에서 10분간; 1 X SSC, 0.05 % SDS 로 65℃ 에서 20분간 세척하였다. 상기 블럿을 X-선 필름 (Kodak, 미국)에 노출시켰다.
도 1은 EcoRI, HindIII, 및 BamHI로 분해하고, 8개의 미토콘드리아 프로브(coxI , coxII, coxIII , atpA , atp6 , atp9 , cob, nad9 유전자)와 혼성시킨 mtDNA 를 서던-블럿(southern-blot) 분석하여 C. annuum L. 내의 웅성 가임(F) 및 웅성 불임(S) 세포계를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
1-2: 노던- 블럿 분석
노던-블럿 분석을 위해 불임, 가임, 임성회복된 꽃밥으로부터 총 RNA (20㎍)를 모세관 블럿팅 (Sambrook et al., 1989) 에 의한 표준 포름알데하이드 겔 (1.2% 아가로스)상에 분리하였고, Hybond N+ 나일론 멤브레인 (Amersham Pharmacia Biotech., 미국)으로 옮겼다. 이들 3개의 유전자(atpA , atp6 , coxII) 상에서 노던-블럿 분석을 하였으며, 블럿은 60℃에서 16시간 동안 혼성화되었고, 최종세척은 0.5 X SSC, 0.1% SDS 에서 시행하였다.
도 2는 이들 세개의 미토콘드리아 프로브(atpA, atp6, coxII)를 갖는 mtRNA 의 노던-블럿 분석결과이다. 이러한 atp6 , coxII 유전자는 RNA 전사체의 다형성 밴드를 나타낸다(화살표 표시됨).
실시예 2: 역(inverse) PCR 및 coxII 및 atp6 의 인접부위 서열화
2-1. coxII 유전자의 3'인접 부위에 대한 역 PCR
역(inverse) PCR을 통하여 coxⅡ 유전자의 3' 부위를 분리하였다. 역PCR 을 위하여 mtRNA (5㎍)는 37℃ 에서 EcoRI (Boehringer Mannheim, 독일) 10 단위체를 포함하는 100 ㎕의 반응혼합물을 하루동안 처리하였다. 상기 소화혼합물(digestion mixure)을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 추출된 DNA를 에탄올로 침전시켰다. mtRNA의 재결찰(relegation)은 37℃ 에서 30분동안 T4 DNA 라이게이즈(BRL, 미국) 3단위체를 사용한 200㎕하에 진행하였으며, 상기 결합혼합물을 65℃ 에서 20분동안 활성을 저해하였다. 페놀/클로로포름 추출 과정후, 상기 DNA를 에탄올로 침전하고, 50 ㎕ TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.4) 에서 용해하였다.
서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 각각 25 pmol 의 프라이머와 dNTP, 2.5유니트의 ExTaq DNA 중합효소(TakaRa, Japan) 각각 200μM, 및 10 X ExTaq DNA 중합효소 완충액 5㎕를 포함하는 서모싸이클러(thermocycler) (Perkin Elmer 9600) PCR 반응 혼합물에 DNA 50ng를 첨가한 총 50㎕ 하에서 PCR을 수행하였다. PCR 증폭을 94℃ (1 분), 60℃ (1 분), 및 72℃ (2 분)에서 35번 반복하여 수행하였다. 상기 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분리하여 브롬산 에티디움으로 염색하고 자외선으로 관찰하였다.
2-2. atp6 유전자의 5'및 3' 인접부위를 위한 역 PCR
서열번호 7 및 8의 프라이머 세트 각각 25 pmol 의 프라이머와 dNTP, 2.5유니트의 ExTaq DNA 중합효소(TakaRa, Japan) 각각 200μM, 및 10 X ExTaq DNA 중합효소 완충액 5㎕를 포함하는 서모싸이클러(thermocycler) (Perkin Elmer 9600) PCR 반응 혼합물에 DNA 50ng를 첨가한 총 50㎕ 부피에서 PCR을 수행하였다. PCR 증폭을 94℃ (1 분), 60℃ (1 분), 및 72℃ (2 분)에서 35번 반복하여 수행하였다. 상기 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분리하여 브롬산 에티디움으로 염색하고 자외선으로 관찰하였다.
도 3은 고추(Capsicum annuum L.)에서 atp6 유전자 및 coxII 유전자의 RFLP 및 역PCR의 결과를 나타낸 것이다. "A"는 atp6 (좌) 및 coxII (우) 프로브를 갖는 N-세포질 및 S-세포질간의 서던-블럿 분석결과를 나타낸 것이다. EcoRI 효소로 소화시킨 후, 0.8% 아가로스 겔에서 보존(N-세포질) 및 CMS(S-세포질) 세포계의 mtDNA(10㎍) 를 분리하였다. "B"는 고추의 CMS 세포계에 특이적인 DNA 서열의 클로닝을 위한 인버스 PCR 증폭의 결과이고, "M1" 및 "M2"는 각각 λ/HindIII 사이즈 마커와 1kb DNA puls ladder를 나타낸다(Promega Co. 미국). 예상된 PCR 단편은 별모양(*)으로 표지하였다.
2-3. 고추의 CMS 세포계에 특이적인 뉴클레오타이드의 결정
실시예 2-1 및 2-2에서 얻어진 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔에서 분리하였고, 겔 추출 키트(Qiagen, 독일)을 이용하여 정제하였으며, pGEM-T 이지 벡터 (Promega, 미국)으로 클로닝하고 Perkin Elmer 9600 PCR 장치 및 an ABI377 자동 서열기 (Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 서열화하였다.
도 4는 보존 세포계(N-세포질) 및 CMS 세포계(S-세포질)의 coxII 코딩구역 및 이의 인접부위의 염기 서열 비교의 개략도를 나타낸 것이다. 화살표는 coxII3 부위상에서의 역 PCR를 위한 프라이머 쌍을 나타낸다. coxII 각각의EcoRI-EcoRI 단 편의 크기는 오른편에 나타냈다. coxII 유전자의 3 인접 구역의 CMS 특이적인 서열은 1596 염기로 나타났다(SEQ ID No. 1).
도 5는 고추의 보존 세포계(N-세포질) 및 CMS 세포계(S-세포질)의 atp6 및 이의 인접부위의 염기 서열 비교의 개략도를 나타낸 것이다. "A"는 고추(C. annuum)의 (N) atp6 -1 유전자 및 (S) atp6 -1 유전자의 구조적 비교의 개략도를 나타낸 것이고, "B"는 (N) atp6 -2 유전자 및 (S) ψ atp6 - 2 의 구조적 비교의 개략도를 나타낸 것이다. 높은 정도로 보존된 부위는 초록색 박스로 나타내었다. 빨간색 박스는 (N) atp6 -2의 3'부위와 뉴클레오타이드 서열상동성을 갖지 않는 절단구역을 나타낸다. 상기 화살표는 atp6 -2 3 부위의 역PCR을 위한 프라이머 쌍을 나타내고, 각각의 atp6 -2 복제본의 EcoRI-EcoRI 단편의 크기를 오른쪽에 나타냈다. 상기 atp6 유전자의 3 인접 부위의 CMS 특이적인 서열은 251개의 염기(서열번호 2)로 밝혀졌다.
2-4. 고추의 CMS과 관련된 오픈 리딩 프레임 후보의 판별
새로운 오픈 리딩 프레임을 NCBI 홈페이지 내 ORF 파인더 프로그램으로 발견하였다. 역PCR 및 서열화 결과에 의해 가임 고추와 불임 고추 사이의 coxII 유전자의 구조를 작성하였고, 불임 세포계 내의 coxII 유전자의 3'부위에서 orf456 로 명명된 새로운 오픈 리딩 프레임을 검출할 수 있었다(도 6). atp6 유전자의 경우, atp6 코딩 부위와 측면 부위 내에서 어떤 새로운 오픈 리딩 프레임 또는 키메릭(chimeric) 유전자도 검출할 수 없었다.
실시예 3: coxII 유전자의 3'부위에 대한 클로닝
3-1. 역전사효소 PCR 실험
특이적인 프라이머 쌍(서열번호 6,9 및 10)으로 RT-PCR을 수행하여 ORF 파인더 프로그램에 의하여 추정된 오픈 리딩 프레임이 실제로 CMS 식물 내에서 전사되는지 여부를 알아보았다. 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 총 꽃밥 RNA의 3㎍을 M-MLV 리버스 전사효소(Gibco.BRL. 미국)에 의한 첫번째 표준 cDNA 합성에 이용하였다. PCR을 25㎕ 내에 10pmol의 각각의 프라이머, 100μM의 각각의 dNTP, 1.5 유니트의 ExTaq DNA 중합효소 (TaKaRa, 일본) 및 2.5㎕의 10 X ExTaq DNA 중합효소 완충액을 이용한 써모사이클러(thermocycler) (Perkin Elmer 9600) 내의 1㎕ 의 cDNA 상에서 수행하였다. PCR 증폭은 30 사이클의 94℃ (1 분), 50℃ (1 분), and 72℃ (2 분)에서 수행되었다. 그 후, RT-PCR 생성물을 pGEM-T 이지 벡터(premega, 미국) 내로 클론화하고, T7 및 SP6 프라이머(서열번호:11-14)로 서열화하였다.
도 7은 불임 세포계 내의 coxII 유전자의 3' 부위에 위치하는 orf456 유전자에 대한 RT-PCR 실험 결과이다. 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR으로 새로이 만들어진 orf456 유전자가 불임 세포계에서 특이하게 전사되어진다는 사실을 밝혔졌다. 서열번호 6 및 10의 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하여, orf456 유전자가 상류 구역에 존재하는 coxII 유전자와 함께 동시-전사되는지 알아보았다. 도 8은 orf456 프로브를 갖는 가임, 불임 및 임성회복 세포계의 mtRNA에 대한 노던-블럿 분석 결과를 나타낸 것이다. 1.2% 아가로스 겔에서 RNA의 약15 ㎍/lane이 로딩되었고, N+ 나일론 멤브레인으로 전달시킨다. ∞F: 가임 세포 계, S: 불임 세포계, R: 임성회복 세포계. 도 3은 orf456 프로브를 갖는 가임, 불임 및 임성회복 세포계의 mtRNA에 대한 노던-블럿 분석 결과를 나타낸 것이다. 상기 orf456 오픈 리딩 프레임은 S-세포질을 운반하는 불임 및 임성회복 세포계에서 실제로 고유하게 전사된다.
실시예 4: 박테리아 생장 억제 시험
이형성체 시스템 내에서 orf 456 유전자의 박테리아 세포에 대한 독성을 측정하여, orf 456 이 식물 미토콘드리아에 영향을 미치고, 미토콘드리아 기능장애 및 웅성 불임성을 초래하는지를 측정하였다.
pTrcHis2-TOPO 발현 벡터 내로 orf 456 을 클로닝하였고, 대장균 균주 Top10 세포 (invitrogen,미국) 로 형질전환하였다. 대조군으로서 pTrcHis2-TOPO+LacZ 유전자를 운반하는 세포가 동일한 조건에서 배양하였고, 1mM IPTG 에 의해 발현을 유도하였다. 클로닝 및 형질전환은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. LacZ 유전자 (대조군) 및 orf456 유전자를 함유한 Top10 세포를 50 ㎍/ml 의 암피실린(ampicillin)을 지닌 3ml 의 LB 배지 내에서 37℃ 에서 16시간 동안 예비배양(preculture)하였다. 상기 초기 배양액중 50㎕ 를 20ml의 배지 내로 옮겼고, 37℃ 에서 2-3 시간동안 배양하였다. O.D.600= 0.6인 시점에서 1mM 의 IPTG 를 첨가하였으며, 1시간마다 각각의 형질전환체의 생장률을 흡광도를 이용하여 관찰하였다. 대장균 세포의 생장률은 orf456의 발현이 유도되자마자 극적으로 감소되었다. 도 9는 orf456 유전자 발현에 의한 박테리아 성장 억제 실험 결과를 나타낸 것이다. orf456 갖는 구조물을 가지고 있으며 1mM IPTG에 의하여 유도된 대장균의 성장율은 다른 구조물의 경우에 비하여 현저하게 감소하였다.
실시예 5: 미토콘드리아로의 외부 유전자 타겟팅을 위한 실험 및 형질전환체의 제조
5-1. 아라비돕시스의 형질전환을 위한 구조물의 제조
pEGFP-1 벡터(Clontech, Palo Alto, 미국)로 egfp -1 단편(서열번호 4, GFP 변이체는Clontech으로부터 구입)을 증폭하였다. 증폭된 coxIV 타겟 서열(서열번호 3, 사이토크롬 c 산화효소 서브유닛 IV 전구체를 위한 효모 DNA 단편) 및 egfp -1 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Promega, 미국)로 접합하였으며, pCAMBIA2300 벡터 (MJC)로 클론화하였다. 또한 도 9에 나타나듯이 coxIV - orf456 구조물 및 비-타겟된-orf456 구조물을 제조하였고, 이를 pCAMBIA2300 벡터 내로 접합하였다.
도 10에서는 노팔린 생성효소(nos)유전자 종결자 서열을 orf456 및 egfp -1 서열의 3' 말단에 융합하였다. coxIV - orf456 로 언급된 첫번째 구조물은 the orf456 서열을 효모 균주 Y187, (Stratagene, 미국)의 핵 coxIV 유전자 전서열의 이행 펩타이드 서열에 융합하였다. 비타겟된-orf456 로 언급된 두번째 구조물은 미토콘드리아 타겟팅 펩타이드를 갖지 않았다. coxIV - egfp -1로 언급된 세번째 구조물을 coxIV 프리시퀀스 및 pEGFP-1 벡터 (Clontech, 미국) 로부터의egfp - 1 를 이용하여 제조하였다.
5-2. 양파의 일시적 발현 실험
pCAMBIA2300 벡터에서의 융합 구조물을(egfp -1 유전자가 융합된 coxIV 전서 열) 핵산전달감염후 양파 내피 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 양파의 내피 껍질(2 X 2 cm )이 1 X MS 염, 30 g/L 수크로오스, 및 2% 아가를 함유한 pH 5.7의 아가 플레이트 상에 놓였다. 껍질은 아가 고체배지로 옮겨진 후 1시간 이내에 입자에 의하여 충격이 가해졌다. Scott et al (1999)에 의해 기술된 바와 같이 입자 충격을 수행하였다. 광조건하에서의 20-22 시간의 배양 후 미토콘드리아 위치를 환경관리기구센터(National Instrumentation Center for Environmental Management (NICEM, 수원, 대한민국)의 Radiance 2000 Multi-Photon Imaging System(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 측정하였다.
도 11은 양파의 일시적 발현 분석에서의 GFP 형광 이미지를 나타낸 것이다. 왼쪽 사진은 coxIV + egfp -1 구조물에 의한 양파에서의 GFP 형광을 나타낸 것이다. 미토콘드리아의 판별을 위하여서는 Mitotracker CMSRox 염색 (Molecular Probe Co., 미국)을 이용하였다. 상기 GFP 이미지 및 Mitotracker 염색 이미지는 완벽하게 대응되었다.
5-3. 아라비돕시스 식물의 형질전환
애기장대(Arabidopsis thaliana) 생태형 콜롬비아 식물을 형질전환 실험에 사용하였다. 벡터 구성에는 CaMV 35S 프로모터 및 nos 종결자를 사용하였다. 사용된 미토콘드리아 타겟 서열을 효모 coxIV 프리시퀀스로부터 유도하였고, 구조에 사용된 orf456 및 egfp-1 서열은 클로닝을 촉진시키기 위해 PCR에 의해 증폭하였다. 또한 삽입물을 효소 분해 및 서열화에 의해 확인하였다. 삽입물은 적당한 제한효소로 분해되어 식물 형질전환 벡터, pCAMBIA2300내로 클로닝되었다. 이는 정확한 삽입물을 지닌 클론이 카나마이신(kanamycin) LB 배지 상에서 선택하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404내로의 형질전환을 열-충격(heat-shock) 방법(Sambrook et al., 1989)에 의해 수행하였다. 애기장대 식물을 coxIV (타겟된)-orf456 및 비-타켓된 orf456 구조물을 운반하는 아그로박테리움에 의해 형질전환하였으며, 아그로박테리움 투메파시엔스-매개된 형질전환을 꽃-딥(dip) 방법을 변형시킨 방법(Clough and Bent, 1998)에 의하여 수행하였다. 이러한 형질전환 식물을 카나마이신(50 ㎍ml-1)을 함유한 배지상에서 선택하였다. 항생물질 처리에서 살아남은 초록색 식물은 심층 분석을 위해 남겨놓았다.
도 12는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 의 뿌리에서 발현된 GFP 형광 이미지를 나타낸 것이다.
형질전환체의 발육 생장은 비-형질전환된 대조 식물 또는 비-타겟된 형질전환체와 동일하거나 유사하였다. 개화시 51개 중 31개의 식물이 T1 세대에서 웅성-불임 표현형을 나타내었다. 이러한 분류는 꽃 형태 및 종자 결실률에 기초하였다. 비-타겟팅된 구조물로 형질전환된 50개의 형질전환체 중 3개의 아라비돕시스 식물체는 웅성-불임 표현형을 나타냈다. 이는 비-타겟팅 실험의 경우 예측되지 않은 결과이다. 그러나 orf456 는 박테리아 생장 억제 시험에서 증명된 결과처럼 이것이 미토콘드리아에서 발현되지 않더라도 식물에 있어서 어떠한 해로운 영향을 지닐 수 있다는 것을 추정할 수 있다.
도 13은 웅성 불임(미토콘드리아-타겟된) 형질전환체 및 웅성 가임(미토콘드 리아-비-타겟된) 형질전환체의 꽃 형태를 나타낸 것이다. "a"는 미토콘드리아-타겟된 orf456 를 운반하는 웅성-불임 형질전환체의 꽃형 형태이고, "b"는 미토콘드리아-비-타겟된 orf456 를 운반하는 웅성-가임 형질전환체의 꽃 형태이다.
도 14는 미토콘드리아-타켓된 형질전환체(a) 및 미토콘드리아-비-타겟된 형질전환체(b) 의 종자 세트 단계의 아라비돕시스 표현형을 나타낸 것이다.
도 15는 진공의 침윤 형질전환 방법으로 얻어지는 동일한 주세균에서 웅성-불임 및 웅성-가임 표현형을 보여주는 아라비돕시스 형질전환체의 사진이다. 화살표는 정상적인 수분작용으로부터 생산되는 정상적인 장각상 표피를 나타내고 화살표 머리부분은 수분되어지지 않고, 정상적인 종자 세트를 생산하지 못하는 꽃을 나타낸다.
5-4. 형질전환된 식물의 확인
형질전환체 잎에서 DNA를 추출하여 PCR 및 서던-블럿 분석을 하였다(Kim et al., 2001). PCR 증폭을 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 90초의 30사이클을 이용하여 써멀(thermal)사이클로 PTC-200(MJ리서치, 미국)으로 100ng의 DNA상에서 수행하였다. 제한효소로 분해된 총 DNA를 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고, 나일론 멤브레인 상으로 옮겼으며, [α-32P] dCTP(Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA)로 표지된 프로브로 혼성화하였다.
표 1는 orf456 트랜스유전자를 함유한 것으로 확인된 T1 식물 내의 화분 생성에 기초한 번식력 평가를 나타낸 것이다.
식물 타입 식물의 수 분류
가임 불임
비-타겟팅 타겟팅 50 51 47 20 3 31
실시예 6: 표현형에 의한 웅성 -가임 또는 웅성 -불임의 결정
6-1. 프라이머
고추(Capsicum annuum L.)의 보존 (N-세포질) 및 CMS(S-세포질) 세포계를 구별하기 위한 PCR에 이용할 수 있는 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제작하였다.
coxII SCAR PCR 프라이머
정방향 프라이머(서열번호 15) - coxII 유전자의 코딩 부위 일부
역방향 프라이머(서열번호 16) - CMS 세포계에 특이적인 서열의 일부
apt6 SCAR PCR 프라이머
정방향 프라이머(서열번호 17) - atp6 유전자의 코딩 부위의 일부
역방향 프라이머(서열번호 18) - CMS 세포계에 특이적인 서열의 일부
coxII 양성 대조군
정방향 프라이머: 서열번호 19
역방향 프라이머: 서열번호 20
6-2. 고추에서 CMS 및 보존 세포계를 구별하기 위한 PCR 분석
프라이머 세트를 이용하여 하기와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
총 DNA 200 ng를 200 mmol 의 dNTP, 20 pM의 각각의 프라이머, 5㎕의 10 X 반응 완충액, 및 2.5 유니트의 Taq 중합효소 (Takara, 일본)을 포함하여 총 50㎕ 의 반응 부피로 혼합하였다. atp6 SCAR 마커를 위한 PCR 증폭을 35 사이클의 94℃ (1 분), 52℃ (1 분), 및 72℃ (2 분)에서 수행하였으며, 증폭된 DNA를 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동 하였으며, coxII SCAR 마커의 경우는 56℃에서 어닐링하였다.
도 16은 20개의 고추 품종에 대한 PCR 결과를 나타낸다. 이때, "S"는 가임 표현형을 나타내고, "N"는 불임 표현형을 나타내며 "M"은 λ/HindIII DNA 마커를 나타낸다.
coxII SCAR 프라이머 쌍을 이용하는 경우, CMS 세포계에서는 708 bp DNA 단편의 증폭이 있었으나 보존 세포계에서는 PCR 증폭이 일어나지 않았다. atp6 SCAR 프라이머 쌍의 경우는 CMS 세포계에서 607 bp DNA 단편의 증폭이 있었으나, 보존 세포계에서는 PCR 증폭이 나타나지 않았다. coxII 유전자의 코딩 부위를 spanning하는 PCR 프라이머 쌍을 이용하는 것을 대조군으로 하여 PCT 반응이 잘 일어나는지 살펴보았다. PCR로 증폭된 단편의 크기는 약 1.5 kb였다. PCR 실험에 이용된 고추는 표 2에 기재하였다.
Cultivar or Accessio n 세포질 유전자형** 표현형 Cultivar or Accession 세포질 유전자형** 표현형
1 80-2 S 불임 11 Subicho-1 N 가임
2 80-5 S s불임 12 Milyang-B N 가임
3 KC268-1-1 S s불임 13 FC-2(CMS from China) S 불임
4 KC268-1-3 S s불임 14 FC-3(CMS from Europe) S 불임
5 KC268-2-1 S s불임 15 FC-4 S 불임
6 CMS-A S s불임 16 4570 S 불임
7 Chilsungcho-A S s불임 17 4578 S 불임
8 Milyang-A S s불임 18 TF68 N 가임
9 CMS-R S s가임 19 Ancho N 가임
10 Chilsungcho-1 S s가임 20 CM334 N 가임
*N: N-세포질cytoplasm, S: S-세포질cytoplasm
본 발명의 효과는 세포질 웅성 불임성 고추에 특이적인 DNA 단편, 상기 DNA를 기초로 한 마커를 이용하여 식물의 세포질 표현형을 판발하는 방법 뿐만 아니라 형질전환된 세포질 웅성 불임 식물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

Claims (27)

  1. 서열번호 1의 223 내지 678 번째 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 단편은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 단편.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 coxⅡ 유전자의 3'-말단에 존재하는 것인 DNA 단편.
  4. 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포질 웅성 불임 고추에 특이적인 DNA 단편.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 3'-절단된 atp6 유전자의 3'-말단에 존재하는 것인 DNA 단편.
  6. 서열번호 1 의 223 내지 678 번째의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환 웅성 불임 식물.
  7. a) 서열번호 1의 223 내지 678번째 염기 서열로 이루어진 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드;
    b) 상기 폴리뉴클레오타이드가 발현될 수 있도록 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 결합되어 있고, 식물에서 활성을 갖는 프로모터; 및
    c) 상기 a)의 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된 단백질을 미토콘드리아 내로 이동시킬 수 있는 DNA 서열
    을 포함하는, 형질전환 웅성 불임 식물을 얻기 위하여 이용되는 구조물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 c) 단계의 DNA 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 구조물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 식물은 고추, 가지, 담배, 토마토 또는 페튜니아와 같은 가지과 식물, 순무, 꽃양배추 또는 브로콜리와 같은 십자화과 식물 및 백합, 국화 또는 목본 식물과 같은 화훼 식물종으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 구조물.
  10. 제 7항의 구조물을 식물체 또는 식물세포 내로 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 웅성 불임 식물 생산 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 식물은 고추, 가지, 담배, 토마토 또는 페튜니아와 같은 가지과 식물, 순무, 꽃양배추 또는 브로콜리와 같은 십자화과 식물 및 백합, 국화 또는 목본 식물과 같은 화훼 식물종으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 형질전환 웅성 불임 식물 생산 방법.
  12. 제 7항의 구조물을 식물 또는 식물세포로 전환하는 것을 포함하는, 식물의 화분 생산 억제 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 식물은 고추, 가지, 담배, 토마토 또는 페튜니아와 같은 가지과 식물, 순무, 꽃양배추 또는 브로콜리와 같은 십자화과 식물 및 백합, 국화 또는 목본 식물과 같은 화훼 식물종으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것인 화분 생산 억제 방법.
  14. a) coxⅡ 게놈 DNA의 일부 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드의 일부를 어닐링 할 수 있는 정방향 프라이머 및 식물 게놈 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열일부를 어닐링 할 수 있는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    b) DNA 단편이 증폭되었는지 여부를 관찰하는 단계
    를 포함하는 것으로, 상기 증폭된 단편의 존재는 식물이 웅성 불임 세포계임을 나타내고, 존재하지 않는 경우는 식물이 웅성 가임 세포계임을 나타내는 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 증폭된 DNA 단편은 50 bp 내지 2 kbp 인 것인 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 PCR을 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 15 내지 35 염기서열로 이루어진 것인 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 15의 염기서열로 이루어지고, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것인 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 b) 단계는 에티디움 브로마이드 염색에 의하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하는 것을 포함하는 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  19. 제 14항에 있어서,
    상기 b)단계는 방사선-표지법, 비색법, 화학발광법 또는 형광법을 이용하는 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  20. a) apt6 게놈 DNA의 일부 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드의 일부를 어닐 링 할 수 있는 정방향 프라이머 및 식물 게놈 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 2의 뉴클레오타이드 일부를 어닐링 할 수 있는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    b) 상기 DNA 단편이 증폭되었는지 관찰하는 단계
    를 포함하는 것으로, 상기 증폭된 단편의 존재는 식물이 웅성 불임 세포계임을 나타내고, 존재하지 않는 경우는 식물이 웅성 가임 세포계임을 나타내는 세포질 웅성 불임 고추 판별 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 증폭된 DNA 단편의 크기는 50 내지 1 kbp인 것인 식물체의 웅성 불임 고추 판별 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 15 내지 35개의 염기서열로 이루어진 식물체의 웅성 불임 고추 판별 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지고, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 식물체의 웅성 불임 고추 판별 방법.
  24. a) coxⅡ 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 일부 서열을 어닐링 할 수 있는 정방향 프라이머; 및
    b) 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 일부 서열을 어닐링 할 수 있는 역방향 프라이머
    를 포함하는 식물체의 웅성-불임성 판별을 위한 PCR 프라이머 세트로서, 이로 증폭된 DNA 단편의 크기는 50 bp 부터 2 kbp 인 PCR 프라이머 세트.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 15의 염기서열로 이루어지고, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 PCR 프라이머 세트.
  26. a) apt6 게놈 유전자의 일부 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 일부를 어닐링 할 수 있는 정방향 프라이머; 및
    b) 식물 DNA 또는 식물 미토콘드리아 DNA에서 서열번호 2의 뉴클레오타이드 일부를 어닐링 할 수 있는 역방향 프라이머
    를 포함하는 식물체의 웅성-불임성 판별을 위한 PCR 프라이머 세트로서, 이로 증폭된 DNA 단편의 크기는 50 bp 부터 1kbp 인 PCR 프라이머 세트.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 17의 염기서열로 이루어지고, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 PCR 프라이머 세트.
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