PL197107B1

PL197107B1 - Sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz

Info

Publication number: PL197107B1
Application number: PL353109A
Authority: PL
Inventors: Tadeusz Wilusz; Joanna Grybel
Original assignee: Univ Wroclawski
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2008-02-29
Also published as: PL353109A1

Abstract

Sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz z płynów fizjologicznych zawierających ten inhibitor, polegający na wydzieleniu frakcji białek, najkorzystniej albumin, i rozpuszczeniu ich w wodzie albo w roztworach soli, znamienny tym, że do roztworu białek dodaje się NaCl albo KCI do stężenia > 3M, po czym z roztworu wybiórczo adsorbuje się inhibitor z wykorzystaniem immobilizowanej metylochymotrypsyny zrównoważonej roztworami zawierającymi NaCl albo KCI w stężeniu > 3M, a następnie zaadsorbowany inhibitor wymywa się wodą albo roztworem NaCl albo KCI o stężeniu wielokrotnie niższym niż stężenie roztworu stosowanego w procesie adsorpcji.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197107 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 353109 ^{(51) Int.Cl.}

C12Q 1/37 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 29.03.2002 (54)

Sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 06.10.2003 BUP 20/03	(73) Uprawniony z patentu: Uniwersytet Wrocławski,Wrocław,PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.02.2008 WUP 02/08	(72) Twórca(y) wynalazku: Tadeusz Wilusz,Wrocław,PL Joanna Grybel,Wrocław,PL

⁽⁵⁷⁾ Sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz z płynów fizjologicznych zawierających ten inhibitor, polegający na wydzieleniu frakcji białek, najkorzystniej albumin, i rozpuszczeniu ich w wodzie albo w roztworach soli, znamienny tym, że do roztworu białek dodaje się NaCl albo KCI do stężenia > 3M, po czym z roztworu wybiórczo adsorbuje się inhibitor z wykorzystaniem immobilizowanej metylochymotrypsyny zrównoważonej roztworami zawierającymi NaCl albo KCI w stężeniu > 3M, a następnie zaadsorbowany inhibitor wymywa się wodą albo roztworem NaCl albo KCI o stężeniu wielokrotnie niższym niż stężenie roztworu stosowanego w procesie adsorpcji.

PL 197 107 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz, znajdującego zastosowanie zwłaszcza w terapii zastępczej i w badaniach laboratoryjnych.

Z publikacji J. Travis i D. Johnson pt. „Human a₁-Proteinase Inhibitor opublikowanej w 1981 roku w Methods in Enzymology, tom 80, część C, strony 754-776, znany jest sposób wytwarzania alfa-1-inhibitora proteinaz z osocza krwi ludzkiej. Sposób ten polega na tym, że do osocza krwi ludzkiej dodaje się stałego siarczanu amonu do uzyskania 0,5 nasycenia. Następnie roztwór klaruje się przez wirowanie, a osad odrzuca. Do otrzymanego supernatantu dodaje się stałego siarczanu amonu do uzyskania 0,8 nasycenia. Utworzony osad wysolonych białek zebrany po odwirowaniu, rozpuszcza się w 0,03 M buforze fosforanowym o pH 6,7, po czym dializuje 24 godziny w 4°C wobec tego samego buforu. Roztwór białek uzyskanych po dializie przepuszcza się przez kolumnę chromatograficzną napełnioną Cibacron Blue Sepharose, zrównoważoną 0,03 M buforem fosforanowym o pH 6,7. Frakcje białek nieadsorbujących się na kolumnie zawierają oprócz alfa-1-inhibitora proteinaz również transferynę, orosomukoid, pre-albuminę i niewielkie ilości innych wysokocząsteczkowych składników. Na kolumnie adsorbuje się albumina. W następnym etapie roztwór białek zawierający alfa-1-inhibitor proteinaz doprowadza się 0,01 N HCl do pH 6,5 i nakłada na kolumnę chromatograficzną wypełnioną DEAE-celulozą, zrównoważoną 0,03 M buforem fosforanowym o pH 6,5. Niezaadsorbowane na kolumnie białka odmywa się tym samym buforem, a białka zaadsorbowane na kolumnie wymywa w liniowo wzrastającym gradiencie NaCl od 0,0 do 0,2 M. Frakcje pierwszego szczytu wymywającego się z kolumny, zawierające głównie alfa-1-inhibitor proteinaz, zagęszcza się przez ultrafiltrację na membranie UM-10. Roztwór zagęszczonego inhibitora dodatkowo oddziela się od innych zanieczyszczających białek w chromatografii na kolumnie z Sephadex G-75, zrównoważonej 0,05 M buforem Tris-HCl o pH 8,0, zawierającym 0,05 M NaCl. Uzyskany w tym postępowaniu alfa-1-inhibitor proteinaz przechowuje się w stanie zamrożonym.

D. Drechsel. L. Karic i Ch.B. Glaser w publikacji pt: „Affinity Chromatography of a₁-Protease Inhibitor Using Sepharose-4B-Bound Anhydrochymotrypsin opublikowanej w 1984 roku w Analytical Biochemistry, tom 141, strony 141-145, opisali inny sposób wydzielania alfa-1-inhibitora proteinaz. Sposób ten polega na tym, że osocze krwi rozcieńcza się równą objętością 0,02M buforu Tris-HCl zawierającego 0,5 M NaCl i 0,02% NaN3 o pH 8,0 (bufor startowy) i nakłada na kolumnę chromatograficzną wypełnioną immobilizowaną anhydrochymotrypsyną. Związany alfa-1-inhibitor proteinaz eluuje się roztworem chymostatyny o stężeniu 0,1 mg/ml rozpuszczonej w buforze 0,05 M cytrynian-0,10 M fosforan o pH 5,0. Wymywany z kolumny roztwór natychmiast doprowadza się do pH 7,5 poprzez zbieranie frakcji o objętości 2 ml do probówek zawierających 400 μl 1,5 M buforu Tris-HCl o pH 8,8. Wymyty z kolumny roztwór inhibitora dializuje się wobec 10 mM buforu fosforanowego o pH 7,5 i dodatkowo oczyszcza w chromatografii jonowymiennej na kolumnie z DEAE celulozą. Związane na nośniku białka zwalnia się w liniowo wzrastającym gradiencie NaCl od 0,0 do 0,3 M w 10 mM buforze fosforanowym o pH 6,5.

Sposób oczyszczania alfa-1-inhibitora proteinaz z osocza owczego opisali R. Mistry, P.D. Snashall,

N. Totty, A. Guz i T.D.Tetley w pracy pt.: „Isolation and Characterization of Sheep a₁-proteinase Inhibitor opublikowanej w 1991 roku w Biochemical Journal, tom 273, strony 685-690. Sposób wytwarzania tego inhibitora polega na wysoleniu części białek osocza owczego siarczanem amonu w nasyceniu

O, 45, odrzuceniu po wirowaniu osadu wysolonych białek, a następnie zagęszczeniu roztworu znad osadu przez ultrafiltrację w aparacie Amicon przez membranę PM 10, w połączeniu z wymianą buforu na 0,05 M octan sodu o pH 6,0, zawierający 0,25 M NaCl, 1 mM Ca²⁺⁺, 1 mM Mg²⁺⁺ i 1 mM Mn²⁺⁺ (bufor startowy). Zagęszczony supernatant nakłada się na kolumnę z immobilizowaną na Sepharose 4B konkanawaliną, zrównoważoną buforem startowym. Materiał nieadsorbujący się na kolumnie wymywa się buforem startowym, a alfa-1-inhibitor proteinaz wymywa się 0,1 M metylo-a-D-glukopyranozydem w buforze startowym. Wyeluowany z kolumny inhibitor zagęszcza się przez ultrafiltrację, połączoną z wymianą buforu na 20 mM Tris-HCl o pH 7,5 i dalej oczyszcza w chromatografii jonowymiennej na kolumnie Mono Q, wymywając zaadsorbowane na kolumnie białka w gradiencie liniowo wzrastającego stężenia NaCl od 0 do 0,35 M. Frakcje zawierające inhibitor zagęszcza się przez ultrafiltrację i dodatkowo oczyszcza w preparatywnej elektroforezie w warunkach niedenaturujących, a inhibitor z żelu poliakryloamidowego wymywa za pomocą 20 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz z płynów fizjologicznych zawierających ten inhibitor, polegający na wydzieleniu frakcji białek, najkorzystniej albumin,

PL 197 107 B1 oraz rozpuszczeniu ich w wodzie albo w roztworach soli. Istota wynalazku polega na tym, że do roztworu białek dodaje się NaCl albo KCl do stężenia > 3M, po czym z roztworu wybiórczo adsorbuje się inhibitor z wykorzystaniem immobilizowanej metylochymotrypsyny zrównoważonej roztworami zawierającymi NaCl albo KCl w stężeniu > 3M, a następnie zaadsorbowany inhibitor wymywa się wodą albo roztworem NaCl lub KCl o stężeniu wielokrotnie niższym niż stężenie roztworu stosowanego w procesie adsorpcji.

Okazało się, że w sposobie według wynalazku, w odróżnieniu od sposobów znanych, alfa-1-inhibitor proteinaz wybiórczo adsorbuje się na nośniku z immobilizowaną metylochymotrypsyną, w obecności wysokich stężeń soli. W tych warunkach nie dochodzi do adsorpcji białek balastowych na nośniku. Zaadsorbowany na immobilizowanej metylochymotrypsynie inhibitor zwalnia się jednoetapowo, przez obniżenie siły jonowej roztworu desorbującego.

Wynalazek jest objaśniony w przykładach wykonania, które ilustrują sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz z różnych płynów fizjologicznych, ludzkich i zwierzęcych.

P r z y k ł a d 1. Do 200 ml osocza z krwi ludzkiej dodaje się 200 ml 10 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0 zawierającego 0,9% NaCl, po czym dodaje się 330 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu, co jest równoznaczne z uzyskaniem stopnia nasycenia 0,45. Po upływie 3 godzin całość wiruje się, oddziela osad globulin, a do supernatantu dodaje 660 ml nasyconego siarczanu amonu, w wyniku czego stopień nasycenia wzrasta do 0,8. Po kolejnych 3 godzinach osad wysolonych albumin odwirowuje się, rozpuszcza w 50 ml wody i dializuje w 5°C w ciągu 24 godzin do 10 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0, zawierającego 0,9% NaCl. Po ukończonej dializie roztwór doprowadza się do pH 9,0 przy pomocy 1 M roztworu Tris, po czym dodaje NaCl do stężenia 5 M. Tak przygotowany roztwór białek nakłada się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną 200 ml metylochymotrypsyny immobilizowanej na Sepharose 4B, zrównoważonej 10 mM buforem Tris-HCl o pH 8,0, zawierającym 5 M NaCl. Niezaadsorbowany materiał wymywa się tym samym buforem. Po odmyciu białek balastowych alfa-1-inhibitor proteinaz zwalnia się z kolumny 10 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0. Wyeluowany alfa-1-inhibitor proteinaz dializuje się 12 godzin w 5°C wobec 10 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0, po czym nakłada na kolumnę z DEAE-Sephadex A-50 (1,8 x 29 cm) zrównoważoną 10 mM buforem Tris-HCl o pH 8,0, celem oddzielenia niewielkich ilości białek balastowych. Zaadsorbowane białka eluuje się liniowo wzrastającym gradientem NaCl od 0,0 do 0,4 M NaCl w 10 mM buforze Tris-HCl o pH 8,0. Inhibitor wymyty z kolumny liofilizuje się. Otrzymuje się 31,2 mg elektroforetycznie (SDS-PAGE) homogennego alfa-1-inhibitora proteinaz.

P r z y k ł a d 2. Początkowe etapy preparacji prowadzi się identycznie jak opisano w przykładzie 1, natomiast adsorpcję alfa-1-inhibitora proteinaz prowadzi się nie na kolumnie chromatograficznej, ale w zlewce, w której umieszcza się zawiesinę 200 ml immobilizowanej metylochymotrypsyny zrównoważonej 10 mM buforem Tris-HCl o pH 8,0 zawierającym 5 M NaCl oraz roztwór albuminy uzyskany z 200 ml osocza krwi ludzkiej w tym samym buforze zawierającym również 5 M NaCl. Po 30 minutowym mieszaniu immobilizowaną metylochymotrypsynę sączy się na lejku Buchnera przez warstwę bibuły, odmywa od niezaadsorbowanych białek balastowych 10 mM buforem Tris-HCl o pH 8,0 zawierającym 5 M NaCl, a następnie zaadsorbowany alfa-1-inhibitor proteinaz wymywa 10 mM buforem Tris-HCl o pH 8,0. Dalej postępuje się jak opisano w przykładzie pierwszym. Z 200 ml osocza krwi ludzkiej uzyskuje się 31 mg elektroforetycznie homogennego alfa-1-inhibitora proteinaz.

P r z y k ł a d 3. Wszystkie etapy preparacji prowadzi się identycznie jak opisano w przykładzie pierwszym, z wyjątkiem zastosowania 3 M NaCl do adsorpcji alfa-1-inhibitora proteinaz na immobilizowanej metylochymotrypsynie. W tym postępowaniu z 200 ml osocza krwi ludzkiej uzyskano 7 mg elektroforetycznie homogennego alfa-1-inhibitora proteinaz.

P r z y k ł a d 4. Wszystkie etapy preparacji prowadzi się identycznie jak opisano w przykładzie pierwszym, z wyjątkiem zastosowania 3 M KCl do adsorpcji alfa-1-inhibitora proteinaz na immobilizowanej metylochymotrypsynie. W tym postępowaniu z 200 ml osocza krwi ludzkiej uzyskano 6 mg elektroforetycznie homogennego alfa-1-inhibitora proteinaz.

P r z y k ł a d 5. Z osocza krwi owczej otrzymuje się alfa-1-inhibitor proteinaz w sposób opisany w przykładzie pierwszym. Z 200 ml osocza uzyskuje się 23 mg elektroforetycznie homogennego alfa-1-inhibitora proteinaz.

P r z y k ł a d 6. Do 100 ml mleka krowiego o zawartości tłuszczu 3,2 % dodaje się 9 mg alfa-1-inhibitora proteinaz z osocza ludzkiego, otrzymanego według postępowania opisanego w przykładzie pierwszym. Z takiego mleka, które może być odpowiednikiem mleka zwierząt transgenicznych, wydzielających z mlekiem ludzki alfa-1-inhibitora proteinaz, można otrzymywać czysty alfa-1-inhibitora

PL 197 107 B1 proteinaz. W pierwszym etapie odwirowuje się tłuszcz przy 12 000 obrotów/min w ciągu 30 min. Do 90 ml odtłuszczonego mleka dodaje się 90 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu, w celu uzyskania nasycenia 0,5. Po upływie 3 godzin osad wysolonych globulin usuwa się przez wirowanie. Do 150 ml supernatantu zawierającego albuminy dodaje się 260 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu, w wyniku czego nasycenie wzrasta do 0,8. Po upływie kolejnych 3 godzin wysolone albuminy zbiera się przez wirowanie, a następnie zawiesza w 5 ml 10 mM buforu Tris-HCl o pH 8,0 i dializuje przez noc w 5°C wobec tego samego buforu. Po dializie roztwór doprowadza się do pH 9,0 za pomocą 1 M Tris, po czym dodaje NaCl do stężenia 5 M. Tak przygotowany roztwór nakłada się na kolumnę z immobilizowaną metylowaną chymotrypsyną, zrównoważoną 10 mM buforem Tris-HCl o pH 9,0, zawierającym 5 M NaCl. Niezaadsorbowany materiał wymywa się tym samym buforem. Po odmyciu białek balastowych alfa-1-inhibitor proteinaz zwalnia się z kolumny wodą. Dalej postępuje się jak opisano w przykł adzie pierwszym. Z 9 mg alfa-1-inhibitora proteinaz dodanego do 100 ml mleka krowiego odzyskuje się 3 mg elektroforetycznie homogennego inhibitora.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób otrzymywania alfa-1-inhibitora proteinaz z płynów fizjologicznych zawierających ten inhibitor, polegający na wydzieleniu frakcji białek, najkorzystniej albumin, i rozpuszczeniu ich w wodzie albo w roztworach soli, znamienny tym, że do roztworu białek dodaje się NaCl albo KCI do stężenia > 3M, po czym z roztworu wybiórczo adsorbuje się inhibitor z wykorzystaniem immobilizowanej metylochymotrypsyny zrównoważonej roztworami zawierającymi NaCl albo KCI w stężeniu > 3M, a następnie zaadsorbowany inhibitor wymywa się wodą albo roztworem NaCl albo KCI o stężeniu wielokrotnie niższym niż stężenie roztworu stosowanego w procesie adsorpcji.

Departament Wydawnictw UP RP