PL195657B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 - Google Patents

Abstract

1. Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 zdeponowany pod numerem B/00004. 2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 zdeponowany pod numerem B/00004.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1.

Znany jest z opisu patentowego EP 199535 szczep Lactobacillus casei subs. rhamnosus zwany szczepem GG wykazujący dobre przyleganie do komórek śluzu w jelicie cienkim. Dzięki temu w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem szczep ten można stosować w celach leczniczych.

Posługując się definicją Fullera ogólnie można powiedzieć, że probiotyki to żywe, bakteryjne dodatki do żywności, stymulujące i poprawiające funkcjonowanie przewodu pokarmowego gospodarza.

Wymagania stawiane szczepom probiotycznym są bardzo wysokie a mianowicie powinny one:

1. pochodzić ze zdrowej mikroflory ludzkiego organizmu,

2. posiadać precyzyjnie określony rodzaj i gatunek, potwierdzony najnowszymi badaniami molekularnymi,

3. wykazywać wyjątkową, antagonistyczną aktywność wobec typowych patogenów przewodu pokarmowego,

4. posiadać zdefiniowane właściwości powierzchniowe i adherencyjne, potwierdzone za pomocą hodowli tkankowej,

5. wykazywać oporność na sok żołądkowy i sole żółci,

6. potwierdzać swoje probiotyczne działanie w prawidłowo przeprowadzonych badaniach klinicznych.

Na świecie jest zaledwie kilkanaście, dobrze scharakteryzowanych szczepów probiotycznych, z czego większość należy do grupy bakterii kwasu mlekowego. Probiotyki są szczególnie rozpowszechnione w niektórych, wysoko rozwiniętych krajach. Tak na przykład w Japonii od lat stosuje się preparat parafarmaceutyczny pod nazwą handlową Yacult, który zawiera szczepy Lactobacillus casei o ściśle zdefiniowanych właściwościach, potwierdzonych badaniami klinicznymi. Najbardziej znanym probiotykiem jest szczep Lactobacillus rhamnosus GG, produkowany w różnych postaciach, np. w USA pod nazwą Culturelle. W ostatnim okresie także i w Polsce pojawiło się kilka preparatów farmaceutycznych zawierających szczepy Lactobacillus, ale ich właściwości probiotyczne nie zostały zdefiniowane.

W celu otrzymania prawidłowego składu mikroflory przewodu pokarmowego człowieka należy zapewnić w niej obecność bakterii kwasu mlekowego. Obecność ta będzie skuteczna jeśli szczep bakterii kwasu mlekowego będzie charakteryzował się dobrym przyleganiem do ludzkiego nabłonka.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 i nośnik. Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, gdzie nadano mu numer B/00004. Stwierdzono, że szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 posiada zdolność dobrego przylegania do komórek organizmu ludzkiego oraz blokuje receptory śluzówki.

Charakterystyka szczepu.

Szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 został wyizolowany z kału zdrowego noworodka urodzonego siłami natury przez matkę nie leczoną antybiotykami przez co najmniej 3 miesiące przed porodem. Został zidentyfikowany za pomocą metod fenotypowych (zestaw API 50 CHL) i genotypowych (reakcja PCR z starterami swoistymi dla gatunku Lactobacillus rhamnosus) jako Lactobacillus rhamnosus.

1. Morfologia: drobnoustrój gramdodatni, nieruchomy, niezarodnikujący.

2. Fermentacja cukru: ribose (+), galactse (+), d-glucose (+), d-fructose (+), d-mannose (+), l-sorbose (+), rhamnose (+), dulcitol (+), mannitol (+), sorbitol (+), a methyl-d-glucoside (+), n ecetyl glucosamine (+), amygdaline (+), arbutine (+), esculine (+), salicine (+), cellobiose (+), maltose (+), lactose (+), trehalose (+), d-tagatose (+).

3. Własności antagonistyczne szczepu:

Szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 posiada wybitne właściwości antagonistyczne. Szczep działa hamująco na wzrost następujących bakterii wykorzystując wystandaryzowaną metodę słupkową.

PL 195 657 B1

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1
Bakterie wskaźnikowe:	Strefa zahamowania wzrostu (w mm)/stopnień
Staphylococcus aureus	19/++
Salmonella enteritidis	18/++
Shigella sonnei	20/+++
E. coli, szczepy enteropatogenne	18/++
Helicobacter pylori	20/+++
Campylobacter coli	30/+++
Campylobacter jejuni	30/+++
Clostridium difficile	20/+++

Legenda: średnica stref zahamowania wzrostu wg metody słupkowej: +++ => 20 mm, ++ = 16-19 mm,+ = 12-15 mm

Zastosowana metoda badania właściwości antagonistycznych

Zastosowano własną metodę badania. Szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 hodowano w temperaturze 37°C, w warunkach beztlenowych na płytkach z podłożem stałym MRS (OXOID) o objętości 40 ml. Po upływie 18 godzin inkubacji, w płytkach agarowych wycinano korkoborem okrągłe słupki o średnicy 9 mm, które po 3 nakładano na płytki z naniesionymi, za pomocą wymazu, bakteriami wskaźnikowymi, po czym umieszczano je na 4 godziny w lodówce w temperaturze 4°C (za wyjątkiem bakterii beztlenowych).

Grupę drobnoustrojów wskaźnikowych stanowiły tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne ludzkiego przewodu pokarmowego. Do tlenowych bakterii wskaźnikowych, zaliczono Gram-ujemne pałeczki: Salmonella enteritidis, Shigella sonnei i enteropatogenny szczep Escherichia coli, wywołujące ostre biegunki i inne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego.

Pałeczki pochodziły z kolekcji zebranej w latach 1995/96 w Państwowym Zakładzie Higieny.

Ponadto do tlenowych bakterii wskaźnikowych zaliczono również Gram-dodatnie ziarenkowce: Staphylococcus aureus, pochodzące z materiału ludzkiego.

Beztlenową grupę bakterii wskaźnikowych stanowiły: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Helicobacter pylori i Clostridium difficile, pochodzące z materiałów klinicznych.

Tlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano w optymalnych warunkach to znaczy na bulionowym podłożu Mueller-Hintona (MH) (Difco) przez 24 godziny, w temperaturze 37°C. Po inkubacji, 1 oczko ezy przenoszono do 5 ml czystego bulionu MH i ponownie inkubowano przez 4-8 godzin w temperaturze 37°C w łaźni wodnej. Stężenie wskaźnikowych bakterii tlenowych doprowadzano do gęstości 0,5 według skali Mc Farland'a, rozcieńczając hodowlę solą fizjologiczną. Następnie 0,1 ml takiego inokulum przenoszono na podłoże stałe MH i rozprowadzano je po powierzchni płytki wacikiem.

Beztlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano na odpowiednich podłożach wzrostowych. Dla Helicobacter i Campylobacter był to agar Brucella (Difco) z dodatkiem krwi ludzkiej (lub końskiej), heminy oraz witaminy K1, a dla Clostridium difficile - Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej. Inkubowano je w warunkach beztlenowych (Clostridium difficile) lub mikroaerofilnych (Helicobacter i Campylobacter) stosując odpowiednie generatory atmosfery przez 48-72 godziny, a następnie bakterie zawieszano w soli fizjologicznej, starając się doprowadzić gęstość zawiesiny do 3,0 w skali Mc Farland'a. Objętość 0,1 ml tej zawiesiny rozprowadzano na powierzchni płytek z odpowiednimi, powyżej opisanymi agarowymi podłożami wzrostowymi. Dalszą inkubację przeprowadzano w temperaturze 37°C przez 24-72 godziny w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych, lub też beztlenowych w zależności od wymagań bakterii wskaźnikowych. Po inkubacji wokół słupka powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę stopnia antagonizmu.

4. Szczep rhamnosus 57t^l^/1 wykazuje wybitne powinowactwo do komórek ustroju ludzkiego dzięki unikalnym właściwościom powierzchniowym:

PL 195 657 B1

Cechy określające aktywność powierzchniową	Stopień aktywności
Produkcja śluzu zewnątrzkomórkowego	+ +
Hydrofobowość powierzchni	+ +
Adherencja do linii komórkowej CaCO2	+ + +
Adherencja do linii komórkowej HT-29	+ + +

5. Określanie właściwości powierzchniowych.

Badanie hydrofobowości powierzchni.

W celu określenia hydrofobowych właściwości powierzchni szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/1 posłużono się dwoma odczynami: pierwszym z nich był test agregacji w soli (SAT = salt-aggregation test) według Jonssona i wsp., zaś drugim - odczyn bakteryjnej interakcji z ksylenem według Rosenberga.

Test agregacji w soli (SAT).

Test agregacji w soli (SAT)- wykonano w następujący sposób: 18 godziną, płynną hodowlę badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/1 przemywano 0,02 mol/l buforem fosforanowym o pH 6,8, a otrzymaną zawiesinę ponownie rozcieńczono tym samym buforem do gęstości 5x10⁹ j.t.k./ml. Na szkiełkach podstawowych mieszano następnie powyższą zawiesinę bakterii ze wzrastającymi stężeniami siarczanu amonu (0,02, 0,05, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mol/l). Końcowe, najniższe stężenie siarczanu amonu powodujące agregację Lactobacillus rhamnosus 573L/1 podawano jako wartość SAT. Uważa się, że szczepy wykazujące wartość SAT < 0,9 mol/I posiadają najwyższą hydrofobowość, podczas gdy szczepy o wartości SAT > 1,5 mol/l najniższą.

Test bakteryjnego powinowactwa do ksylenu.

Test powinowactwa szczepów z rodzaju bakterii kwasu mlekowego do ksylenu wykonano według metody Rosenberga. W tym celu 18-godzinną, płynną hodowlę bakterii kwasu mlekowego 573L/1 odwirowywano (1500 obrotów na minutę przez 15 minut), a następnie przemywano dwukrotnie w PBS. Tak przygotowane komórki bakteryjne zawieszano w 1,2 ml buforu o następującym składzie: 22,2 g K2HPO4 x 3 H2O, 7,26 g K2HPO4, 1,8 g mocznika, 0,2 g MgSO4 w 1000 ml H2O, o pH 7,1. Zawiesinie tej mierzono absorbancję za pomocą densytometru przy długości fali 540 nm. Następnie dodawano 0,2 ml ksylenu i tak otrzymaną mieszaninę energicznie wytrząsano przez 30 sekund i odstawiano. Po upływie 30 min, gdy mieszanina ponownie rozdzielała się na dwie fazy dokonywano końcowego pomiaru absorpcji fazy wodnej za pomocą densytometru przy tej samej długości fali. Uzyskane wyniki dla każdego porównano wykazując różnice w absorbancji przed i po dodaniu ksylenu. Spadek absorpcji fazy wodnej był miarą hydrofobowości powierzchni bakterii.

Test na produkcję śluzu.

Do określenia jakościowej produkcji śluzu posłużono się metodą Christensena i współpracowników. W tym celu szczep bakterii kwasu mlekowego 573L/1 hodowano w szklanych probówkach zawierających 10 ml płynnego podłoża MRS przez 18 godzin w warunkach ściśle beztlenowych. Po zakończonej inkubacji, jałową pipetą, bez dotknięcia ścian probówki, odciągano MRS, a następnie, po ściankach probówki, wlewano pipetą 1 ml - 0,1 % roztworu safraniny. Przez 60 sekund delikatnie obracano probówką, a następnie odwracano ją do góry dnem, pozostawiając ją przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Na ściankach probówki uwidaczniał się, lub też nie, różowy biofilm w zależności od zdolności badanego szczepu do tworzenia śluzu, którego natężenie oceniano w skali od 0 do ++++.

6. Określenie oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus 573L/1 na sole żółci i sok żołądkowy.

Oporność na sole żółci: znaczna

Oporność na sok żołądkowy: średnia

Tempo namnażania: wysokie.

Zatem szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 wykazuje oporność na działanie soku żołądkowego oraz soli żółci, co zbadano za pomocą standardowych metod rozcieńczeniowych.

Badanie oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 na sok żołądkowy

Aby oznaczyć stopień oporności Lactobacillus rhamnosus 573L/1 na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, że zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o stałym pH wynoszącym 2,5 według następującego przepisu: 2.0 g NaCl, 3,2 g pepsyny w 7 ml 36% HCl o pH 1,2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Tak

PL 195 657 B1 przygotowany, jałowy, sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 10 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej kolejno dolewano po 100 ml wcześniej wyhodowanych bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 minut w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych i kolejno rozcieńczano w soli fizjologicznej w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej. Spadek gęstości badanego szczepu po inkubacji z sztucznym sokiem żołądkowym był miarą wrażliwości na niskie pH soku żołądkowego i trawienie przez pepsynę.

Badanie oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 na sole żółci.

W celu oznaczenia oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz i Feighner, która polegała na tym, że do agaru MRS dodawano wskaźnika - purpury bromokrezolowej w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci, w pięciu kolejnych stężeniach tj.: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10g/l i 20g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoże MRS posiewano hodowlę szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1, które następnie inkubowano w standardowych warunkach przez 24 godziny. Po zakończonej inkubacji kolonie bakterii kwasu mlekowego 573L/1 oporne na dane stężenie soli nabierały koloru jasno żółtego.

P r z y k ł a d I.

Badanie siły przylegania (adherencji) do komórek ustroju ludzkiego.

W celu oznaczenia siły przylegania bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 do komórek ustroju ludzkiego posłużono się ludzkimi liniami komórkowymi CaCO2 i HT 29 pochodzenia jelitowego. Hodowlę prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża RPMI - 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mM/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 mg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. W celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 10⁴/ml do 6-cio- dołkowych plastikowych płytek. Używano 14-dniowej hodowli komórkowej tworzącej jednolitą warstwę (monolayer). Tak wyrośnięte komórki przemywano dwukrotnie PBS.

Badane bakterie Lactobacillus rhamnosus 573L/1 inkubowano w standardowych warunkach przez 18 godzin, po czym hodowlę płukano dwukrotnie roztworem fizjologicznym NaCl. Do testu adherencji bakterie doprowadzano do gęstości 10⁹/ml, a następnie bakterie zawieszone w podłożu: bulion MRS i MEM lub RPMI w stosunku 1:1 dodawano do dołków zawierających komórki CaCO2 lub HT-29. Komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37°C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. W każdym preparacie oglądano 20 pól widzenia. Adherencję określano półilościowo, według skali:

- brak przylegania, + pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, ++ pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, +++ liczne komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia.

P r z y k ł a d II.

Oporność na antybiotyki i określenie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne

Oporność na antybiotyki

Antybiotyk	Wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) w mg/l
1	2
Gentamycyna	2,0
Wankomycyna	256,0
Erytromycyna	0,016
Klindamycyna	0,125
Metronidazol	256,0
Cyprofloksacyna	0,25

PL 195 657 B1 ciąg dalszy

1	2
Doksycyklina	0,125
Penicylina G	0,38
Ampicylina	0,5
Metycylina	4,0
Kotrymoksazol	32,0
Cefaklor	8,0
Mupirocyna	1,5

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 wykazuje zatem zakres oporności na leki odpowiadający gatunkowi Lactobacillus rhamnosus: wrażliwość na penicylinę, erytromycynę i klindamycynę oraz gatunkowo-swoistą oporność na kotrymoksazol, metronidazol i wankomycynę.

Określanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne

Zastosowano najnowocześniejszą, ilościową metodę E-testu, umożliwiającą badanie bakterii kwasu mlekowego na korzystnym dla nich podłożu. Polega ona na umieszczaniu na podłożu Brucella Agar z dodatkiem krwi, posianym badanym szczepem bakterii kwasu mlekowego 573L/1 o stężeniu 0,5 w skali Mc Farlanda specjalnych pasków nasyconych gradientem badanego leku i inkubacji w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. Wynik badania odpowiadający wartości najniższego stężenia hamującego (MIC) w mg/l odczytuje się bezpośrednio ze skali umieszczonej na pasku.

Szczep bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus 573L/1 wykazuje silną aktywność hamującą wzrost podstawowych tlenowych czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego: Salmonella, Shigella i Escherichia coli. Ponadto jest aktywny wobec bakterii beztlenowych powodujących przewlekłe stany zapalne żołądka i jelit. Działa także na ziarenkowce Gram-dodatnie. Dzięki unikalnym właściwościom powierzchniowym szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/1 wykazuje wybitne powinowactwo do komórek ustroju ludzkiego. Posiada również bardzo dobre własności probiotyczne.

Claims (2)

1. Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 zdeponowany pod numerem B/00004.

2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/1 zdeponowany pod numerem B/00004.