PL195656B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 - Google Patents

Abstract

1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 zdeponowany pod numerem B/00006. 2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 zdeponowany pod numerem B/00006

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3

Znany jest z polskiego opisu patentowego nr 178193 szczep bakterii kwasu mlekowego CNCM I 1225 posiadający zdolność obniżania in vivo zakażeń spowodowanych przez bakterię Helicobacter pylori poprzez usuwanie bakterii chorobotwórczych z komórek jelitowych i żołądkowych.

Każdego dnia wraz z pokarmem wnikają do ludzkiego organizmu liczne drobnoustroje, które w większości giną pod wpływem działania naturalnych, fizjologicznych barier przewodu pokarmowego. Niskie pH soku żołądkowego, oraz zawarte w nim enzymy trawienne, przede wszystkim pepsyna, stanowią podstawową barierę regulującą ilościowy skład flory pokarmów. Każde ograniczenie wydzielania soku żołądkowego, czy jego neutralizacja prowadzi natychmiast do ilościowego wzrostu flory bakteryjnej kolonizującej jelito człowieka. Drugą, ważną barierę stanowi treść dwunastnicza wraz z, eliminującym wiele bakterii, działaniem soli żółci i enzymów trzustkowych.

Niektóre bakterie dzięki mechanizmom przystosowawczym mogą w różny sposób reagować na te wymienione powyżej, naturalne bariery przewodu pokarmowego człowieka i tak np. Helicobacter pylori znosi niskie pH soku żołądkowego dzięki produkowanej ureazie, która stwarza w środowisku żołądka, korzystne mikrośrodowisko dla H. pylori o odczynie zasadowym. Z kolei niektóre pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (jak np. Salmonella) są nie tylko oporne na działanie soli żółci, ale wręcz wymagają ich obecności w podłożu do prawidłowego wzrostu.

Bakterie kwasu mlekowego izolowane zarówno ze środowiska zewnętrznego człowieka, jak i z naszej, naturalnej mikroflory generalnie dobrze znoszą niskie pH, ponieważ same bytując w kwaśnym środowisku kwasu mlekowego, czy octowego wytworzyły pewne mechanizmy przystosowawcze. Jednakże enzymy trawienne, sole żółci, a ponadto brak adhezyn umożliwiających im aktywne przywieranie do powierzchni śluzówki ludzkiego przewodu pokarmowego eliminują wraz z treścią jelitową większość bakterii z rodzaju Lactobacillus. Tylko szczepy posiadające właściwości probiotyczne są w stanie zarówno przejść przez naturalne bariery przewodu pokarmowego, jak i trwale kolonizować śluzówkę jelita.

Trwała i ilościowo istotna obecność wybranych bakterii kwasu mlekowego w mikroflorze naszego organizmu jest zatem szalenie pożądana. Lekarze, mikrobiolodzy, oraz praktycy zajmujący się żywieniem człowieka zgodnie zalecają przyjmowanie wraz z pokarmem tylko takich bakterii kwasu mlekowego, których właściwości są bardzo dobrze poznane i ściśle zdefiniowane jako tzw. właściwości probiotyczne.

Posługując się definicją Fullera ogólnie można powiedzieć, że: probiotyki to żywe, bakteryjne dodatki do żywności, stymulujące i poprawiające funkcjonowanie przewodu pokarmowego gospodarza.

Wymagania stawiane szczepom probiotycznym są bardzo wysokie; a mianowicie powinny one:

1. pochodzić ze zdrowej mikroflory ludzkiego organizmu,

2. posiadać precyzyjnie określony rodzaj i gatunek, potwierdzony najnowszymi badaniami molekularnymi,

3. wykazywać wyjątkową, antagonistyczną aktywność wobec typowych patogenów przewodu pokarmowego,

4. posiadać zdefiniowane właściwości powierzchniowe i adherencyjne, potwierdzone za pomocą hodowli tkankowej,

5. wykazywać oporność na sok żołądkowy i sole żółci,

6. potwierdzać swoje probiotyczne działanie w prawidłowo przeprowadzonych badaniach klinicznych.

Na świecie jest zaledwie kilkanaście, dobrze scharakteryzowanych szczepów probiotycznych, z czego większość należy do grupy bakterii kwasu mlekowego. Probiotyki są szczególnie rozpowszechnione w niektórych, wysoko rozwiniętych krajach. Tak na przykład w Japonii od lat stosuje się preparat parafarmaceutyczny pod nazwą handlową Yacult, który zawiera szczepy Lactobacillus casei o ściśle zdefiniowanych właściwościach, potwierdzonych badaniami klinicznymi. Najbardziej znanym probiotykiem jest szczep Lactobacillus rhamnosus GG, produkowany w różnych postaciach, np. w USA pod nazwą Culturelle. W ostatnim okresie także i w Polsce pojawiło się kilka preparatów farmaceutycznych zawierających szczepy Lactobacillus, ale ich właściwości probiotyczne nie zostały zdefiniowane.

Istotą wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 i kompozycja farmaceutyczna zawierająca nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 oraz nośnik.

PL 195 656 B1

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, gdzie nadano mu numer B/00006.

Cechy charakterystyczne szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3.

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 został wyizolowany z kału zdrowego noworodka urodzonego siłami natury przez matkę nie leczoną antybiotykami przez co najmniej 3 miesiące przed porodem. Został zidentyfikowany za pomocą metod fenotypowych (test API 50 CHL) i genotypowych (reakcja PCR ze starterami swoistymi dla gatunku Lactobacillus rhamnosus) jako Lactobacillus rhamnosus.

1. Morfologia: drobnoustrój gramdodatni, nieruchomy, niezarodnikujący.

2. Fermentacja cukru: ribose (+), galactse (+), d-glucose (+), d-fructose (+), d-mannose (+), l-sorbose (+), rhamnose (+), dulcitol (+), mannitol (+), a methyl-d-glucoside (+), n acetyl glucosamine (+), amygdaline (+), arbutine (+), esculine (+), salicine (+), cellobiose (+), maltose (+), lactose (+), sacchase (+), trehalose (+), melezitose (+), d-turanose (+), d-tagatose (+),gluconate (+).

Własności antagonistyczne szczepu.

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 posiada wybitne właściwości antagonistyczne. Szczep działa hamująco na wzrost następujących bakterii wykorzystując metodę słupkową.

Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3
Bakterie wskaźnikowe:	Strefa zahamowania wzrostu (w mm)/stopień
Staphylococcus aureus	19/++
Salmonella enteritidis	19/++
Shigella sonnei	22/+++
E. coli, szczepy enteropatogenne	18/++
Helicobacter pylori	34/+++
Campylobacter coli	36/+++
Campylobacter jejuni	36/+++
Clostridium difficile	25/+++

Legenda: średnica stref zahamowania wzrostu wg metody słupkowej: +++ => 20 mm, ++ = 16-19 mm, + = 12-15 mm

Zastosowana metoda badania właściwości antagonistycznych

Zastosowano własną metodę badania. Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 hodowano w temperaturze 37°C, w warunkach beztlenowych na płytkach z podłożem stałym MRS (OXOID) o objętości 40 ml. Po upływie 18 godzin inkubacji, w płytkach agarowych wycinano korkoborem okrągłe słupki o średnicy 9 mm, które po 3 nakładano na płytki z naniesionymi, za pomocą wymazu, bakteriami wskaźnikowymi, po czym umieszczano je na 4 godziny w lodówce w temperaturze 4°C (za wyjątkiem bakterii beztlenowych). Grupę drobnoustrojów wskaźnikowych stanowiły tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne ludzkiego przewodu pokarmowego. Do tlenowych bakterii wskaźnikowych, zaliczono Gram-ujemne pałeczki: Salmonella enteritidis, Shigella sonnei i enteropatogenny szczep Escherichia coli, wywołujące ostre biegunki i inne dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego. Pałeczki pochodziły z kolekcji zebranej w latach 1995/96 w Państwowym Zakładzie Higieny. Ponadto do tlenowych bakterii wskaźnikowych zaliczono również Gram-dodatnie ziarenkowce: Staphylococcus aureus, pochodzące z materiału ludzkiego.

Beztlenową grupę bakterii wskaźnikowych stanowiły: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Helicobacter pylori i Clostridium difficile, pochodzące z materiałów klinicznych badanych w trakcie bieżącej diagnostyki Zakładu Mikrobiologii Centrum Zdrowia Dziecka oraz Katedry Mikrobiologii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu i Katedry Mikrobiologii Klinicznej Akademii Medycznej w Warszawie.

Tlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano w optymalnych warunkach to znaczy na bulionowym podłożu Mueller-Hintona (MH) przez 24 godziny, w temperaturze 37°C. Po inkubacji, 1 oczko ezy przenoszono do 5 ml czystego bulionu MH i ponownie inkubowano przez 4-8 godzin w temperaturze 37°C w łaźni wodnej. Stężenie wskaźnikowych bakterii tlenowych doprowadzano do gęstości 0,5

PL 195 656 B1 według skali Mc Farland'a, rozcieńczając hodowlę solą fizjologiczną. Następnie 0,1 ml takiego inokulum przenoszono na podłoże stałe MH i rozprowadzano je po powierzchni płytki wacikiem.

Beztlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano na odpowiednich podłożach wzrostowych. Dla Helicobacter i Campylobacter był to agar Brucella z dodatkiem krwi ludzkiej (lub końskiej), heminy oraz witaminy K1, a dla Clostridium difficile - Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej. Inkubowano je w warunkach beztlenowych (Clostridium difficile) lub mikroaerofilnych (Helicobacter i Campylobacter) stosując odpowiednie generatory atmosfery firmy bio-Merieux przez 48-72 godziny, a następnie bakterie zawieszano w soli fizjologicznej, starając się doprowadzić gęstość zawiesiny do 3,0 w skali Mc Farland'a. Objętość 0,1 ml tej zawiesiny rozprowadzano na powierzchni płytek z odpowiednimi, powyżej opisanymi agarowymi podłożami wzrostowymi. Dalszą inkubację przeprowadzano w temperaturze 37°C przez 24-72 godziny w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych, lub też beztlenowych w zależności od wymagań bakterii wskaźnikowych. Po inkubacji wokół słupka powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę antagonizmu.

Szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/3 wykazuje silną aktywność hamującą wzrost podstawowych tlenowych czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego: Salmonella, Shigella i Escherichia coli. Ponadto jest aktywny wobec bakterii beztlenowych powodujących przewlekłe stany zapalne żołądka i jelit. Działa także na ziarenkowce Gram-dodatnie.

4. Szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 wykazuje wybitne powinowactwo do komórek ustroju ludzkiego dzięki unikalnym właściwościom powierzchniowym:

Cechy określające aktywność powierzchniową	Stopień aktywności
Produkcja śluzu zewnątrzkomórkowego	+ +
Hydrofobowość powierzchni	+ + +
Adherencja do linii komórkowej CaCO2	+ +
Adherencja do linii komórkowej HT-29	+ +

5. Określanie właściwości powierzchniowych.

Badanie hydrofobowości powierzchni.

W celu określenia hydrofobowych właściwości powierzchni szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 posłużono się dwoma odczynami: pierwszym z nich był test agregacji w soli (SAT = salt-aggregation test) według Jonssona i wsp. zaś drugim - odczyn bakteryjnej interakcji z ksylenem według Rosenberga.

Test agregacji w soli (SAT).

Test agregacji w soli (SAT)- wykonano w następujący sposób: 18 godziną, płynną hodowlę badanego szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 przemywano 0,02 mol/l buforem fosforanowym o pH 6,8, a otrzymaną zawiesinę ponownie rozcieńczono tym samym buforem do gęstości 5x10^{5 * * * 9} j.t.k./ml. Na szkiełkach podstawowych mieszano następnie powyższą zawiesinę bakterii ze wzrastającymi stężeniami siarczanu amonu (0,02, 0,05, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 mol/l). Końcowe, najniższe stężenie siarczanu amonu powodujące agregację bakterii kwasu mlekowego podawano jako wartość SAT. Uważa się, że szczepy wykazujące wartość SAT < 0,9 mol/I posiadają najwyższą hydrofobowość, podczas gdy szczepy o wartości SAT > 1,5 mol/l najniższą.

Test bakteryjnego powinowactwa do ksylenu.

Test powinowactwa szczepów bakterii kwasu mlekowego do ksylenu wykonano według metody Rosenberga. W tym celu 18-godzinną, płynną hodowlę bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 odwirowywano (1500 obrotów na minutę przez 15 minut), a następnie przemywano dwukrotnie w PBS. Tak przygotowane komórki bakteryjne zawieszano w 1,2 ml buforu o następującym składzie: 22,2 g K2PO4 x 3 H2O, 7,26 g K2HPO4, 1,8 g mocznika, 0,2 g MgSO4 w 1000 ml H2O, o pH 7,1. Zawiesinie tej mierzono absorbancję za pomocą densytometru przy długości fali 540 nm. Następnie dodawano 0,2 ml ksylenu i tak otrzymaną mieszaninę energicznie wytrząsano przez 30 sekund i odstawiano. Po upływie 30 min, gdy mieszanina ponownie rozdzielała się na dwie fazy dokonywano końcowego pomiaru absorpcji fazy wodnej za pomocą densytometru przy tej samej długości fali. Uzyskane wyniki dla każdego porównano wykazując różnice w absorbancji przed i po dodaniu ksylenu. Spadek absorpcji fazy wodnej był miarą hydrofobowości powierzchni bakterii.

PL 195 656 B1

Test na produkcję śluzu.

Do określenia jakościowej produkcji śluzu posłużono się metodą Christensena i współpracowników. W tym celu szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 hodowano w szklanych probówkach zawierających 10 ml płynnego podłoża MRS przez 18 godzin w warunkach ściśle beztlenowych. Po zakończonej inkubacji, jałową pipetą, bez dotknięcia ścian probówki, odciągano MRS, a następnie, po ściankach probówki, wlewano pipetą 1 ml - 0,1% roztworu safraniny. Przez 60 sekund delikatnie obracano probówką, a następnie odwracano ją do góry dnem, pozostawiając ją przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Na ściankach probówki uwidaczniał się, lub też nie, różowy biofilm w zależności od zdolności badanego szczepu do tworzenia śluzu, którego natężenie oceniano w skali od 0 do ++++.

6. Określanie wrażliwości na leki przeciwbakteryjne

Zastosowano najnowocześniejszą, ilościową metodę E-testu, umożliwiającą badanie bakterii kwasu mlekowego na korzystnym dla nich podłożu. Polega ona na umieszczaniu na podłożu Brucella Agar z dodatkiem krwi, posianym badanym szczepem bakterii kwasu mlekowego 573L/3 o stężeniu 0,5 w skali Mc Farlanda specjalnych pasków nasyconych gradientem badanego leku i inkubacji w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. Wynik badania odpowiadający wartości najniższego stężenia hamującego (MIC) w mg/l odczytuje się bezpośrednio ze skali umieszczonej na pasku.

7. Określenie oporności na sole żółci i sok żołądkowy.

Oporność na sole żółci: znaczna

Oporność na sok żołądkowy: średnia

Tempo namnażania: wysokie

Zatem szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 wykazuje oporność na działanie soku żołądkowego oraz soli żółci, co zbadano za pomocą standardowych metod rozcieńczeniowych.

Badanie oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 na sok żołądkowy.

Aby oznaczyć stopień oporności szczepu bakterii kwasu mlekowego na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, że zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o stałym pH wynoszącym 2,5 według następującego przepisu: 2,0 g NaCl, 3,2 g pepsyny w 7 ml 36% HCl o pH 1,2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Tak przygotowany, jałowy, sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 10 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej kolejno dolewano po 100 m l wcześniej wyhodowanego szczepów bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 minut w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych i kolejno rozcieńczano w soli fizjologicznej w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej. Spadek gęstości badanego szczepu po inkubacji z sztucznym sokiem żołądkowym był miarą wrażliwości na niskie pH soku żołądkowego i trawienie przez pepsynę.

Badanie oporności bakterii kwasu mlekowego na sole żółci.

W celu oznaczenia oporności szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz i Feighner, która polegała na tym, że do agaru MRS dodawano wskaźnika - purpury bromokrezolowej w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci -OXGAL firmy Difco, w pięciu kolejnych stężeniach tj.: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l i 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoże MRS posiewano hodowlę szczepu bakterii kwasu mlekowego 573L/3, które następnie inkubowano w standardowych warunkach przez 24 godziny. Po zakończonej inkubacji kolonie bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 oporne na dane stężenie soli nabierały koloru jasno żółtego.

P r zyk ł a d I.

Badanie siły przylegania (adherencji) do komórek ustroju ludzkiego.

W celu oznaczenia siły przylegania szczepu bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 do komórek ustroju ludzkiego posłużono się ludzkimi liniami komórkowymi Caco2 i HT 29 pochodzenia jelitowego. Hodowlę prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża RPMI - 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mM/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 mg/ml^-1 - streptomycyny i 100 U/ml^-1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. W celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 10⁴/ml do 6-cio- dołkowych plastikowych płytek. Używano 14-dniowej hodowli komórkowej tworzącej jednolitą warstwę. Tak wyrośnięte komórki przemywano dwukrotnie PBS.

Badane bakterie Lactobacillus rhamnosus 573L/3 inkubowano w standardowych warunkach przez 18 godzin, po czym hodowlę płukano dwukrotnie roztworem fizjologicznym NaCl. Do testu adherencji bakterie doprowadzano do gęstości 10⁹/ml, a następnie bakterie zawieszone w podłożu: bulion MRS i MEM lub RPMI w stosunku 1:1 dodawano do dołków zawierających komórki Caco2 lub HT-29. Komórki linii

PL 195 656 B1 tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37°C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. W każdym preparacie oglądano 20 pól widzenia. Adherencję określano półilościowo, według skali:

-brak przylegania, + pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, ++ pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, +++ liczne komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia.

Przykład II.

Oporność na antybiotyki.

Antybiotyk	Wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) w mg/l
Gentamycyna	4,0
Wankomycyna	256,0
Erytromycyna	0,032
Klindamycyna	0,094
Metronidazol	256,0
Cyprofloksacyna	0,38
Doksycyklina	0,5
Penicylina G	0,75
Ampicylina	1,5
Metycylina	8,0
Kotrymoksazol	32,0
Cefaklor	24,0
Mupirocyna	3,0

Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/3 wykazuje zatem zakres oporności na leki odpowiadający gatunkowi Lactobacillus rhamnosus: wrażliwość na penicylinę, erytromycynę i klindamycynę oraz gatunkowo-swoistą oporność na kotrymoksazol, metronidazol i wankomycynę.

Stwierdzono, że nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/3 działa na bakterie mikroaerofilne, leczy przewlekłe stany zapalne.

Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus 573L/3 posiada zdolność do hamowania bakterii chorobotwórczych dla przewodu pokarmowego, przywierania do nabłonka ludzkiego przewodu pokarmowego oraz jest oporny na działanie soku żołądkowego.

Claims (2)

1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 zdeponowany pod numerem B/00006.

2. Kompozycja farmaceutyczna składająca się z nowego szczepu bakteryjnego i nośnika, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus 573L/3 zdeponowany pod numerem B/00006.