PL188670B1 - Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania i sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu - Google Patents
Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania i sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptyduInfo
- Publication number
- PL188670B1 PL188670B1 PL97332083A PL33208397A PL188670B1 PL 188670 B1 PL188670 B1 PL 188670B1 PL 97332083 A PL97332083 A PL 97332083A PL 33208397 A PL33208397 A PL 33208397A PL 188670 B1 PL188670 B1 PL 188670B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- poly
- tag
- methionine
- cleavage
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 30
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 22
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 17
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002715 modification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000003375 sulfoxide group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 150000002742 methionines Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFLOSCXGXJGS-XOMXBQTJSA-N (e)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O.COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O LXCFLOSCXGXJGS-XOMXBQTJSA-N 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 101100067721 Caenorhabditis elegans gly-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 101000916458 Plasmodium berghei Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010063086 avidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000017103 tryptophane Nutrition 0.000 description 1
- 150000003654 tryptophanes Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ulatwienia ich oczyszczania, obejmujaca in- sercje co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny oraz znacznika na koncu lancucha (poli)peptydu podczas jego syntezy, i zabezpieczenie reszt metioniny w (po- li)peptydzie, jesli sa obecne, przeciwko odszczepieniu, przez zabezpieczenie ich grupa sulfotlenkowa, znam ienna tym, ze jako znacznik stosuje sie znacznik his lub duza czasteczke, taka jak glikol polietylenowy. 2. Sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu przy uzyciu metody modyfikacji okreslonej w zastrz. 1, obejmujacy nastepujace etapy: a) syntezy zadanego (poli)peptydu; b) dolaczenia co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny na koncu lancu- cha (poli)peptydu, przy zabezpieczonej przed odszczepieniem metioninie/metioninach w polipeptydzie, jesli jest/sa obecne, przez zabezpieczenie grupa sulfotlenkowa; c) przedluzenia (poli)peptydu i dolaczonej do niego metioniny/metionin znacznikiem z wytworzeniem (poli)peptydu przedluzonego; d) oczyszczenia (poli)peptydu przedluzonego za pomoca metody oczyszczania specy- ficznej w stosunku do znacznika; e) usuniecia znacznika i dodatkowej metioniny/metionin z przedluzonego (poli)peptydu za pomoca metody odszczepiania za pomoca bromku cyjanu, z wytworzeniem oczyszczo- nego (poli)peptydu, znam ienny tym, ze jako znacznik stosuje sie sekwencje znakujaca his lub duza czasteczke, taka jak glikol polietylenowy. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich wytwarzania oraz sposob wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu z zastosowaniem tej metody modyfikacji.
W ostatnich latach metoda syntezy peptydów w fazie stałej przy użyciu strategii t-Boc lub F-moc została znacznie ulepszona. Skomplikowane procedury syntezy umożliwiły wytwarzanie polipeptydów o około 100 lub więcej resztach1-’. Jednakże niekompletne sprzęganie i terminacja łańcucha, które mogą mieć miejsce w każdym z cyklów zestawiania peptydu, prowadzą do tworzenia sekwencji delecyjnych i obciętych.
188 670
To oraz możliwość występowania reakcji ubocznych, obserwowanych głównie podczas końcowego odszczepiania od żywicy, utrudniają proste oddzielenie żądanego peptydu od innych zanieczyszczeń. Oczyszczanie długołańcuchowych peptydów syntetycznych stanowi poważny problem w wytwarzaniu produktów użytecznych do badań biologicznych oraz produktów dla ludzi i zwierząt, w których przypadku wymagany jest wysoki poziom czystości.
W szczególności, jeśli syntetyzuje się sekwencje zawierające 30 lub więcej reszt, różnice we właściwościach fizycznych, takich jak wielkość, ładunek i hydrofobowość między żądanym produktem, a zanieczyszczającymi peptydami delecyjnymi, obciętymi lub modyfikowanymi, mogą być zbyt małe aby możliwe było odpowiednie oczyszczenie. Ponadto, ograniczeniem nowoczesnych potężnych technik separacji, takich jak HPLC w układzie faz z odwróconych, jest często niska wydajność i możliwość oczyszczania tylko małych próbek, co jest czasochłonne i drogie.
Dla przezwyciężenia tych ograniczeń testowano dotychczas różne techniki. Prowadzono biotynylowanie 153-resztowego syntetycznego białka IL-15 i 99-resztowego syntetycznego białka proteazy SIV6, i biotynylowane łańcuchy oddzielano na kolumnie awidyna-agaroza.
Ball i współpr? zaproponowali ostatnio procedurę oczyszczania opartą na przyłączeniu do ostatniej reszty łańcucha peptydowego odwracalnej grupy zabezpieczającej, połączonej z inną lipofilową, kwasową lub zasadową grupą funkcyjną.
Zoptymalizowano bardziej specyficzne metody chromatograficzne, wykorzystujące obecność konkretnych reszt w syntetyzowanych sekwencjach. Na przykład peptydy zawierające cysteinę oczyszczano przez reakcję z immobilizowanymi pochodnymi rtęciowymi8 lub aktywowanymi tiolami9, zaś do oczyszczania peptydów zawierających histydynę lub tryptofan’i z dobrym skutkiem zastosowano chromatografię powinowactwa na immobilizowanych jonach metali (IMAC)’
W białkach rekombinacyjnych celowo dołączano „ogon” histydynowy, epitop komórki B lub grupy GST. „Ogony” te mogą być następnie wykorzystane w chromatografii powinowactwa.
Generalnie, protokół oczyszczania, który jest oparty na właściwościach fizykochemicznych syntetyzowanego peptydu, musi być dla każdej próbki zoptymalizowany indywidualnie, co jest czasochłonne i kosztowne. Z tych powodów opracowano wiele technik dla nadania procedurom oczyszczania ogólnej stosowalności15. Jednakże opisane dotychczas metody nie są całkowicie zadowalające, ponieważ są nadal czasochłonne i/lub pozostawiają kowalencyjnie derywatyzowane peptydy w końcowych oczyszczonych produktach, co może mieć pewne znaczenie jeśli idzie o ich właściwości biologiczne i fizykochemiczne i ich końcowe zastosowanie u ludzi i zwierząt.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie ulepszenia znanych metod poprzez dostarczenie metody modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania, oraz sposobu oczyszczania polipeptydów, które to metoda i sposób miałyby uniwersalne zastosowanie, dawałyby wysokie wydajności wyodrębniania i były łatwe do realizacji.
Cel ten osiągnięto zgodnie z wynalazkiem poprzez metodę modyfikacji, która polega na insercji co najmniej jednego specyficznie odszczepialnego aminokwasu na końcu łańcucha (poli)peptydu podczas jego syntezy i zabezpieczeniu tego aminokwasu(ów) w (poli)peptydzie, jeśli jest(są) obecne, przeciwko odszczepieniu, w celu umożliwienia specyficznego odszczepienia dokładnie przy specyficznie odszczepialnym aminokwasie.
Zatem przedmiotem wynalazku jest metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania, obejmująca insercję co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny oraz znacznika na końcu łańcucha (poli)peptydu podczas jego syntezy, i zabezpieczenie reszt metioniny w (poli)peptydzie, jeśli są obecne, przeciwko odszczepieniu, przez zabezpieczenie ich grupą sulfotlenkową, polegająca na tym, że jako znacznik stosuje się znacznik his lub dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy.
Sposób oczyszczania przy użyciu tej metody modyfikacji według wynalazku obejmuje zgodnie z wynalazkiem następujące etapy:
a) syntezy żądanego (poli)peptydu;
b) dołączenia co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny na końcu łańcucha (poli)peptydu, przy zabezpieczonej przed odszczepieniem metioninie/metioninach w polipeptydzie, jeśli jest/są obecne, przez zabezpieczenie grupą sulfotlenkową;
188 670
c) przedłużenia (poli)peptydu i dołączonej do niego metioniny/metionin znacznikiem z wytworzeniem (poli)peptydu przedłużonego;
d) oczyszczenia (poli)peptydu przedłużonego za pomocą metody oczyszczania specyficznej w stosunku do znacznika;
e) usunięcia znacznika i dodatkowej metioniny/metionin z przedłużonego (poli)peptydu za pomocą metody odszczepiania za pomocą bromku cyjanu, z wytworzeniem oczyszczonego (poli)peptydu, polegający na tym, że jako znacznik stosuje się sekwencję znakującą his lub dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy.
Specyficzną metodą odszczepiania jest korzystnie metoda odszczepiania chemicznego, co będzie dodatkowo objaśnione poniżej.
Metoda i sposób według wynalazku nadają się do stosowania dła każdego (poli)peptydu, ponieważ nie zależą one od jego składu aminokwasowego. Ponadto, w niektórych korzystnych wykonaniach metoda i sposób są tanie i wysoce efektywne.
Takie wykonanie polega na zastosowaniu reszty metioninowej jako dodatkowego aminokwasu przed dołączeniem znacznika powinowactwa (na przykład ciągu sześciu reszt histydynowych lub innych związków ułatwiających oczyszczanie). Po odpowiednich etapach oczyszczania, takich jak chromatografia powinowactwa specyficzna dla znacznika, znacznik histydynowy można usunąć przez trawienie za pomocą CNBr, tani i wysoce efektywny proces, który specyficznie odszczepia resztę metioninową.
W korzystnym wykonaniu znacznik stanowi zatem co najmniej ciąg reszt histydyny, korzystnie sześć lub więcej, i reszta metioniny. Ewentualnie może być włączony jeden lub więcej niż jeden inny aminokwas.
Jeśli sekwencja żądanego (poli)peptydu zawiera reszty metioniny, to będą one ulegać odszczepianiu bromkiem cyjanu podczas usuwania znacznika. Jednakże zgodnie z wynalazkiem można tego uniknąć stosując w syntezie (poli)peptydu modyfikowane reszty metioniny. Taką modyfikowaną resztą metioniny jest na przykład sulfotlenek metioniny.
W alternatywnym wykonaniu metody i sposobu według wynalazku jako znacznik stosuje się dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy. W tym przypadku specyficzną dla znacznika metodą oczyszczania jest chromatografia żelowa.
Metoda i sposób według wynalazku mają również zastosowanie do polipeptydów wytwarzanych technikami rekombinacji DNA. W korzystnym wykonaniu reszty metioniny obecne pierwotnie w żądanym polipeptydzie, ale nie w znaczniku, zabezpiecza się przed odszczepieniem, na przykład przez podstawienie innym aminokwasem, takim jak walina, glicyna, albo wycina się.
W niniejszym opisie określenie „znacznik” jest stosowane dla oznaczenia usuwalnej cząsteczki, dołączanej do żądanego polipeptydu podczas lub po jego syntezie. „Znacznik” może być sekwencją aminokwasów, dołączaną podczas syntezy polipeptydu, ale może być także inną cząsteczką, od której mieszaninę składników można łatwo oczyścić. Przykładem tej innej cząsteczki jest glikol polietylenowy (PEG).
W niniejszym opisie określenia „peptyd”, „polipeptyd” i (poh)peptyd są stosowane zamiennie.
Poniższy przykład przedstawiono dla zilustrowania wynalazku. Jest oczywiste, że dla znawcy przykład ten dostarcza wystarczających wskazówek do opracowania następnych metod, objętych zakresem wynalazku. W przykładzie ujawniono procedurę oczyszczania o ogólnym zastosowaniu, opartą na połączeniu: 1) protokołu cappingu, 2) użycia sulfotlenku metioniny jako zabezpieczonej reszty metioniny podczas zestawiania sekwencji natywnej, i 3) przedłużenia żądanego peptydu metioniną i 2 resztami glicyny i końcowym ciągiem 6 histydyn, który będzie stosowany do chromatografii powinowactwa. Po odpowiednich etapach oczyszczania przeprowadzono odszczepienie znacznika his bromkiem cyjanu i końcową redukcję sulfotlenku metioniny do metioniny. Ta prosta i bezpośrednia strategia umożliwiła oczyszczenie do jednorodności za pomocą typowych procedur chromatograficznych i z wysoką wydajnością 69-resztowego polipeptydu „PbCS 242-310”, obejmującego C-terminalny region białka CS Plasmodium berghei.
188 670
PRZYKŁAD
1. Materiały i metody
1.1. Reagenty i rozpuszczalniki
Chemikalia i rozpuszczalniki użyte do syntezy peptydu pochodziły z firm CalbiochemNovabiochem AG (Laufelfingen, Szwajcaria) i Fluka (Buchs, Szwajcaria).
1.2. Synteza i analiza peptydu
Dla zilustrowania wynalazku zsyntetyzowano chemicznie polipeptyd oznaczony „PbCS 242-310”, obejmujący C-terminalny region białka CS Plasmodium bergheA, stosując syntezę F-moc w fazie stałej w syntetyzerze peptydów Applied Biosystems 431A. Polipeptyd wytworzono na żywicy F-moc-Ser(e-bueyl)-p-alkoksybenzylo-alkoholowej (żywica Wang) o stopniu podstawienia 0,43 mmole/g w skali 0,1 mmola. Syntezę przeprowadzono stosując pięciokrotny nadmiar F-moc pochodnych aminokwasu, DCCI i HOBt jako czynniki aktywujące, czas sprzęgania 60 minut dla pierwszych 34 aminokwasów i podwójne sprzęganie dla pozostałych reszt. Na końcu każdego cyklu prowadzono capping bezwodnikiem octowym. Grapy zabezpieczające łańcuchy boczne obejmowały: grupę pentametylochromanosulfonylową dla Arg; -S-t-butyl dla Cys; grupę trifenyłomeeylową dla Asn, Gln i His; grupę t-butoksykarbonylową dla Lys i Trp; grupę t-butylową dla Asp, Clu, Ser, Thr i Tyr. Met 306 wstawiono jako FmocMet-sulfoelenek w celu zabezpieczenia jej przez późniejszym odszczepieniem bromkiem cyjanu.
Następnie peptyd przedłużono N-terminalnie sekwencją His-His-His-His-His-His-GlyGly-Met, stosując takie same warunki jak opisane powyżej, z pominięciem cappingu po sprzęganiu drugiego Gly. Tak otrzymany polipeptyd jest oznaczony „znacznik His PbCS 242-310”. _
Surowy peptyd otrzymano przez działanie na połączenie peptyd-żywica 2,5% H2O, 5% erieeylosilanem w TFA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Syntetyczny polipeptyd oczyszczono metodą cieczowej chromatografii wykluczania (kolumna Sephadex G50 7- x 2,5 cm, stosując układ 50% kwas octowy/H2O jako fazę ruchomą). Czystość polipeptydu analizowano metodą RP-HPLC, stosując kolumnę C4 W-Porex 250 x 4,6 mm i gradient 10 - 90% CH3CN w 0,1% TFA/H 2 O w ciągu 60 minut, przy szybkości przepływu 1,0 ml/minutę. Skład aminokwasów oznaczono według Knecht i Chang 3
1.3. Chromatografia powinowactwa na immobilizowanych jonach metali (IMAC) i odszczepienie CNBr.
Polipeptyd oczyszczono najpierw przez chromatografię powinowactwa z wykorzystaniem znacznika histydynowego. Następnie usunięto znacznik bromkiem cyjanu.
Przygotowano kolumnę Ni, stosując żywicę agarozową Ni-NTA (Qiagen Inc., Chatsworth, USA) i równowagowano ją buforem A (8 M mocznik, 0,1M Na2PO4, 0,01M Tris, pH ustawione na 8,0 za pomocą H3PO4). Oczyszczony przez chromatografię wykluczania polipeptyd „znacznik His PbCS 242-310” rozpuszczono w buforze A i załadowano na kolumnę przy prędkości przepływu 15 ml/h. Kolumnę przemyto buforem A (prędkość przepływu 15 ml/h) i buforem B (8 M mocznik, 0,1M Na2 HPO4, 0,01M Tris, pH skorygowane do 6,3 za pomocą H 3PO4), zawierającym 50 mM imidazolu przy prędkości przepływu 30 ml/h. Następnie polipeptyd „znacznik His PbCS 242-310” eluowano (prędkość przepływu 30 ml/h) buforem B, zawierającym 250 mM imidazolu.
Eluowany materiał odsolono na kolumnie Sephadex G25 (50 x 2,5 cm, stosując układ 50% kwas octowy/H2O jako fazę ruchomą) i liofilizowano. Dla usunięcia znacznika histydynowego tak otrzymany materiał traktowano przez 8 godzin w temperaturze pokojowej w stężeniu 20 mg/ml w 70% TFA, stosując 1Q0-kroeny nadmiar molowy CNBr.
Materiał po trawieniu liofilizowano, solubilizowano w Buforze A i ponownie załadowano na kolumnę agarozową Ni-NTA. Znacznik histydynowy został zatrzymany na kolumnie Ni, a odciek z kolumny zawierał polipeptyd „PbCS 242-310”. Odciek odsolono za pomocą kolumny Sephadex G25 (50 x 2,5 cm, stosując układ 50% kwas octowy-TTO jako fazę ruchomą) i liofilizowano.
188 670
1.4. Redukcja Met-sulfotlenku
Traktowany CNBr i oczyszczony IMAĆ materiał traktowano 10% merkaptoetanolem przy pH 8,0 w celu przekształcenia sulfotlenku metioniny w metioninę i S—t-butylo-Cys w Cys a następnie oczyszczano przez filtrację żelową (kolumna Sephadex G25 250 x 4,4 mm).
1.5. Spektrometria masowa
Analizę spektrometrii masowej przeprowadzono stosując spektrometr masowy typu „time-of-flight” LDI 1700 Mass Monitor (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA). Pięć μΐ roztworu 1 mg/ml polipeptydu zmieszano z 5 μΐ kwasu trans-3,5-dimetoksy-4-hydroksycynamonowego (kwas sinapinowy) (20 mg/ml w acetonitrylu, (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA)) i 1 μΐ tego roztworu umieszczono w końcówce sondy spektrometru masowego i wysuszono pod łagodną próżnią. Próbkę napromieniowano 3 impulsami laserowymi z lasera N2 (długość fali 337 nm). „Time-of-flight”, zmierzony za pomocą oscyloskopu cyfrowego (seria 9304; Le Croy Research Systems, Corp., Spring Valłey, NY), przekształcono w widmo masowe stosując wzorzec do kalibracji Peptide MALDITOFMS (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA).
2. Wyniki
69-resztowy polipeptyd „PbCS 242-310” odpowiada regionowi C-terminalnemu białka CS P. Berghei12. Syntezę „znacznik His PbCS 242-310” przeprowadzono stosując zautomatyzowany protokół, w którym po każdym sprzęganiu włączono etap cappingu, jak opisano w części „Materiały i metody”.
Działając na 600 mg odpowiadającego żywico-peptydu układem HiO/trietyłosilan/TFA otrzymano ponad 150 mg surowego polipeptydu.
Analiza widma masowego surowego polipeptydu wykazała obecność żądanych cząstek o ciężarze cząsteczkowym (MW) 9301 oraz innych składników o niskim MW (fig. 1).
mg surowego polipeptydu oczyszczono przez chromatografię powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali (IMAĆ) na 25 ml kolumnie agarozowej Ni-NTA (fig. 2). Po odsoleniu przez cieczową chromatografię wykluczania otrzymano 35 mg polipeptydu „znacznik His PbCS 242-310”. Pomiar absorbancji eluowanego materiału (35 mg) i odcieku (55 mg) przy 280 nm wykazał, że wydajność protokołu oczyszczania wyniosła 100%.
Materiał oczyszczony na kolumnie Ni odszczepiono następnie za pomocą CNBr w celu wyeliminowania znacznika 6xHis.
Po trawieniu materiał ponownie załadowano na kolumnę Ni w celu eliminacji nieodszczepionego peptydu i zadano 10% merkaptoetanolem przy pH 8,0 w celu redukcji sulfotlenku metioniny wstawionego podczas syntezy i grup zabezpieczających resztę Cys. Całkowitą redukcję sulfotlenku metioniny potwierdzono przez ponowne zadanie materiału CNBr i sprawdzenie skuteczności odszczepienia za pomocą spektrometrii masowej.
W wyniku dalszego oczyszczania przez chromatografię wykluczania otrzymano 19 mg oczyszczonego PbCS 242-310.
Na fig. 3 przedstawiono widmo masowe otrzymanego materiału, a na fig. 4 porównanie chromatograficznego profilu analitycznego surowego i oczyszczonego peptydu. Różnica czasów retencji między dwoma pomiarami jest spowodowana nieobecnością silnie naładowanego znacznika His w oczyszczanym materiale. Stwierdzono na podstawie całkowania powierzchni pików przy analizie przy 214 nm, że czystość oczyszczonego polipeptydu „PbCS 242-310” wynosi około 95%. Skład aminokwasów polipeptydu CS był zgodny ze składem oczekiwanym dla tego peptydu (tabela 1).
188 670
| Aminokwasa | Tabela 1. | Analiza aminokwasów. Reszty na mol PbCS 242-310 | |
| Oczekiwane | Obserwowaneb | S.D.C | |
| Asp+Asn | 10 | 9,4 | 1,0 |
| Glu+Gln | 9 | 9,1 | 0,9 |
| Ser | 7 | 8,4 | 2,1 |
| Thr | 4 | 2,2 | 0,8 |
| Gly | 3 | 3,1 | 1,0 |
| Ala | 2 | 3,4 | 1,1 |
| Arg | 4 | 4,8 | 0,9 |
| Pro | 1 | 1,1 | 0,2 |
| Val | 3 | 2,9 | 0,3 |
| Met | 1 | 1,0 | 0,1 |
| Ilc | 7 | 6,3 | 0,7 |
| Leu | 3 | 3,3 | 0,2 |
| Phe | i | 1,1 | 0,1 |
| Lys | 8 | 6,7 | 1,0 |
| His | 0 | - | - |
| Tyr | 1 | 1,2 | 0,2 |
a Nie oznaczano Cys i Trp b Wartość średnia z pięciu oznaczeń c Odchylenie standartowe
3. Omówienie wyników
Synteza chemiczna peptydów czynnych biologicznie stała się rozpowszechnioną i szybko rozwijającą się techniką ze względu na automatyzację i efektywne procedury łączenia łańcuchów. Dla większości zastosowań surowy produkt syntetyczny musi być oczyszczony w celu usunięcia resztek reagentów, nieudanych sekwencji i modyfikowanych chemicznie cząstek peptydowych. Zwykle dokonuje się tego przez HPLC w układzie faz odwróconych, stosując fazy ruchome kwas trifluorooctowy/acetonitryl. Chociaż synteza peptydów jest wysoce zautomatyzowana, to oczyszczanie jest ciągle procesem głównie manualnym i w związku z tym czasochłonnym, drogim i niezbyt efektywnym.
Przykład ten pokazuje, że sposób według wynalazku prowadzi do wysokiej czystości, jak wynika z fig. 3, i jest łatwy do przeprowadzenia oraz ma uniwersalne zastosowanie.
Problem specyficznego odszczepienia związany z obecnością reszt Met w żądanej sekwencji, tak jak w opisanym tu przypadku, jest zgodnie z wynalazkiem łatwy do przezwyciężenia przy użyciu reszt Met-sulfotlenek, które są odporne na działanie CNBr i ilościowo redukują się kwasem merkaptooctowym14.
r7 y żf-r ez rt yg η p rs p „ 1 n » » λ yl rs p < P n C+f w , p ca puwywyiuha, zc dpudcu wtuiug wynaidZAU z. puwuuz.wnun ζ,αύΐυουνναιιυ uu oczyszczania polipeptydu „PbCS 242-310”, 69-resztowego łańcucha odpowiadającego C-termmalnemu regionowi białka CS P. berghei12. Jakkolwiek w surowym materiale po odszczepieniu od żywicy obecnych było wiele zanieczyszczeń peptydowych, jak wynika z analizy metodą spektrometrii masowej przedstawionej na fig. 1, to Twórcy byli w stanie oczyścić celowy peptyd do jednorodności z wysoką wydajnością i w stosunkowo krótkim czasie. Kompletna procedura oczyszczania dała 19 mg oczyszczonego PbCS 242-310, co odpowiada około 20% surowego materiału.
188 670
W konkluzji, wykazano tu, że odszczepienie za pomocą CNBr i zabezpieczenie właściwych reszt Met jako sulfotlenków w połączeniu z efektywnym pod względem powinowactwa znacznikiem może stanowić wydajne i uniwersalne narzędzie do oczyszczania syntetyzowanych chemicznie peptydów o długich łańcuchach.
4. Opis figur
Figura 1. Widmo masowe surowego peptydu
Figura 2. Profil chromatograficzny oczyszczania IMAC
Figura 3. Widmo masowe oczyszczonego peptydu
Figura 4. Profile chromatograficzne peptydu surowego i oczyszczonego
Cytowane pożycie literaturowe
1. Chong, P., Sia, C., Tam, E., Kandil, A. & Klein, M. International Journal of Peptide & Protein Research 41,21-27 (1993).
2. Hahiemi, L.R, , Maskell, J.P, , Mascani· P · Coates , A.R· Scimdmaviim Journal of Immunology 34, 341-350 (1991).
3. Roggero, M.A, , el al , Motecuiar Immunolog, 32,1301-1309 (1995).
4. Smith, D.D. , el al . Ineeniafional oGumal of lepiti^dee & Protem Reeearch 44,
183-191 (1994).
5. Lob, , T.J, , Daibe,, M.J, & Yem , A.W , Biochemistiy 170, 502-511 (1988).
6. Tomasselh , A.G· , e, a. . Jo urna, of Biologicae CZtt^πiittv>'· 267, 10232110237 11992)
7. Bal,, H.L, & Macago) P. Inteπlaiiona1 Jo urna, of Peptide & Protem Research 40, 370-379 (1992).
8. Krieger, D.E, , ΙΥίο^οη, B.W, & , Memfiedd, R.B , Proceedings of the Naiwna, Academy of Sciences of the United States of America 73, 3160-3164 (1976).
9. Iirndebegg, G, , Tengborn., J,, E^^IIrir^^tl, H, & Ragnarsson, LJJ, Chromaroglaphy
156,366-369(1978).
10. Poraih, J. , Carlsson, J, , Olsson,. , & Belfrage, G, Nature 258, ->9J8^^-^i99 (1975..
11. Lmdeberg, G, , Bernich, H, & Engstiom, A, Intemationa1 Ίο^ηΗ, of Pepidde & Protein Research 38, 253-259 (1991).
12. Lanar, D.E , Mo. , Biochem Palasirol, 39, 151^15^4 (1990..
13. Knecht, R, & Chamg, J.Y, AndyŁ Chem, 58, (1986).
14. Η^^ίεη, R.A , & L,, CU, Methods in enzymology 91, 549-559 (1991).
15. Barany, G, & Memfield, R.B, Peptides, uialysis, synthesis, biology 1-163-165 (Academic Press, London, 1980).
188 670
188 670
Bufor A
Bufor B + 50 mM imidazolu
Bufor B + 250 mM imidazolu
Figura 2. Profil chromatograficzny oczyszczania IMAĆ
188 670
Figura 3. Widmo masowe oczyszczonego peptydu
188 670
MD
-4* m*
Figura 4. Profil chromatograficzny surowego (A) peptydu
188 670
Figura 4. Profil chromatograficzny oczyszczonego (B) peptydu
188 670
Figura 1. Widmo masowe surowego peptydu
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania, obejmująca insercję co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny oraz znacznika na końcu łańcucha (poli)peptydu podczas jego syntezy, i zabezpieczenie reszt metioniny w (poli)peptydzie, jeśli są obecne, przeciwko odszczepieniu, przez zabezpieczenie ich grupą sulfotlenkową, znamienna tym, że jako znacznik stosuje się znacznik his lub dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy.
- 2. Sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu przy użyciu metody modyfikacji określonej w zastrz. 1, obejmujący następujące etapy:a) syntezy żądanego (poli)peptydu;b) dołączenia co najmniej jednej specyficznie odszczepialnej metioniny na końcu łańcucha (poli)peptydu, przy zabezpieczonej przed odszczepieniem metioninie/metioninach w polipeptydzie, jeśli jest/są obecne, przez zabezpieczenie grupą sulfotlenkową;c) przedłużenia (poli)peptydu i dołączonej do niego metioniny/metionin znacznikiem z wytworzeniem (poli)peptydu przedłużonego;d) oczyszczenia (poli)peptydu przedłużonego za pomocą metody oczyszczania specyficznej w stosunku do znacznika;e) usunięcia znacznika i dodatkowej metioniny/metionin z przedłużonego (poli)peptydu za pomocą metody odszczepiania za pomocą bromku cyjanu, z wytworzeniem oczyszczonego (poli)peptydu, znamienny tym, że jako znacznik stosuje się sekwencję znakującą his lub dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako sekwencję znacznika his stosuje się sekwencję His-His-His-His-His-His- Gly-Gly-.
- 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że jako specyficzną w stosunku do znacznika metodę oczyszczania stosuje się chromatografię opartą na powinowactwie do sekwencji znacznika.
- 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako znacznik stosuje się dużą cząsteczkę, taką jak glikol polietylenowy, a jako specyficzną w stosunku do znacznika metodę oczyszczania stosuje się chromatografię żelową.
- 6. Sposób według zastrz. 2 albo 3, albo 5, znamienny tym, że żądany polipeptyd wytwarza się technikami rekombinacji DNA w żywym gospodarzu a reszty metioniny w (poli)peptydzie zamiast zabezpieczania wycina się lub zastępuje innym aminokwasem, takim jak walina, glicyna lub modyfikowana metionina.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że żyjącym gospodarzem jest gospodarz eukariotyczny lub gospodarz prokariotyczny, taki jak Escherichia coli.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96202515 | 1996-09-09 | ||
| EP97201318A EP0827966B1 (en) | 1996-09-09 | 1997-05-02 | Preparation of purified (poly) peptides |
| PCT/EP1997/004939 WO1998009983A2 (en) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Preparation of purified (poly)peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL332083A1 PL332083A1 (en) | 1999-08-30 |
| PL188670B1 true PL188670B1 (pl) | 2005-03-31 |
Family
ID=26143147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97332083A PL188670B1 (pl) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania i sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6075127A (pl) |
| EP (1) | EP0827966B1 (pl) |
| JP (1) | JP2001500489A (pl) |
| KR (1) | KR20000068514A (pl) |
| CN (1) | CN1166681C (pl) |
| AT (1) | ATE209213T1 (pl) |
| AU (1) | AU719029B2 (pl) |
| BR (1) | BR9711703A (pl) |
| CA (1) | CA2265249A1 (pl) |
| CO (1) | CO4870706A1 (pl) |
| CU (1) | CU22900A3 (pl) |
| DE (1) | DE69708420T2 (pl) |
| DK (1) | DK0827966T3 (pl) |
| ES (1) | ES2164297T3 (pl) |
| HK (1) | HK1022322A1 (pl) |
| HU (1) | HU223997B1 (pl) |
| IL (1) | IL128857A (pl) |
| NO (1) | NO991046L (pl) |
| NZ (1) | NZ334486A (pl) |
| PL (1) | PL188670B1 (pl) |
| PT (1) | PT827966E (pl) |
| RU (1) | RU2182155C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998009983A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA978054B (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE50112379D1 (de) * | 2000-08-11 | 2007-05-31 | Univ Ruprecht Karls Heidelberg | Fv-konstrukte mit beeinflussbarer affinitat zu einer zu bindenden substanz |
| US6800449B1 (en) | 2001-07-13 | 2004-10-05 | Syngenta Participations Ag | High throughput functional proteomics |
| US20030091976A1 (en) * | 2001-11-14 | 2003-05-15 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Methods for monitoring polypeptide production and purification using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry |
| EP1600455A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-11-30 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Preparation of solid phase bound peptides or PNAs |
| CN100386340C (zh) * | 2004-07-19 | 2008-05-07 | 西安蓝晶生物科技有限公司 | 光可切除的磁粒子分子标签、其制备方法及在多肽合成制备中的应用 |
| WO2009101737A1 (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Osaka University | メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター |
| GB201004372D0 (en) | 2010-03-16 | 2010-04-28 | Almac Sciences Scotland Ltd | Compounds for purification |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1219454B (it) * | 1988-02-17 | 1990-05-18 | Serono Cesare Ist Ricerca | Metodo di rottura alla metionina di polipeptidi contenenti pontidisolfuro |
| JP2960257B2 (ja) * | 1992-06-04 | 1999-10-06 | ピーイーバイオシステムズジャパン株式会社 | ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法 |
-
1997
- 1997-05-02 DK DK97201318T patent/DK0827966T3/da active
- 1997-05-02 AT AT97201318T patent/ATE209213T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-05-02 PT PT97201318T patent/PT827966E/pt unknown
- 1997-05-02 EP EP97201318A patent/EP0827966B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-02 DE DE69708420T patent/DE69708420T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-02 ES ES97201318T patent/ES2164297T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-08 CO CO97051965A patent/CO4870706A1/es unknown
- 1997-09-08 ZA ZA9708054A patent/ZA978054B/xx unknown
- 1997-09-09 BR BR9711703A patent/BR9711703A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 AU AU47016/97A patent/AU719029B2/en not_active Ceased
- 1997-09-09 WO PCT/EP1997/004939 patent/WO1998009983A2/en not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 PL PL97332083A patent/PL188670B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 JP JP10512266A patent/JP2001500489A/ja not_active Withdrawn
- 1997-09-09 CA CA002265249A patent/CA2265249A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-09 RU RU99107131/04A patent/RU2182155C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 IL IL12885797A patent/IL128857A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 CU CU1999023A patent/CU22900A3/es unknown
- 1997-09-09 NZ NZ334486A patent/NZ334486A/xx active IP Right Revival
- 1997-09-09 US US09/254,567 patent/US6075127A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-09 KR KR1019997001933A patent/KR20000068514A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 CN CNB971986371A patent/CN1166681C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-09 HU HU0000588A patent/HU223997B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-03 NO NO991046A patent/NO991046L/no unknown
-
2000
- 2000-03-01 HK HK00101287A patent/HK1022322A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6075127A (en) | 2000-06-13 |
| CN1166681C (zh) | 2004-09-15 |
| ES2164297T3 (es) | 2002-02-16 |
| NO991046D0 (no) | 1999-03-03 |
| ZA978054B (en) | 1998-03-20 |
| NZ334486A (en) | 2000-08-25 |
| HU223997B1 (hu) | 2005-04-28 |
| EP0827966B1 (en) | 2001-11-21 |
| NO991046L (no) | 1999-05-05 |
| WO1998009983A2 (en) | 1998-03-12 |
| HUP0000588A2 (en) | 2000-07-28 |
| CA2265249A1 (en) | 1998-03-12 |
| DK0827966T3 (da) | 2002-05-21 |
| IL128857A (en) | 2003-09-17 |
| CU22900A3 (es) | 2004-01-23 |
| ATE209213T1 (de) | 2001-12-15 |
| CO4870706A1 (es) | 1999-12-27 |
| HK1022322A1 (en) | 2000-08-04 |
| EP0827966A1 (en) | 1998-03-11 |
| AU4701697A (en) | 1998-03-26 |
| RU2182155C2 (ru) | 2002-05-10 |
| WO1998009983A3 (en) | 1998-04-30 |
| KR20000068514A (ko) | 2000-11-25 |
| JP2001500489A (ja) | 2001-01-16 |
| IL128857A0 (en) | 2000-01-31 |
| BR9711703A (pt) | 1999-08-24 |
| CN1233255A (zh) | 1999-10-27 |
| AU719029B2 (en) | 2000-05-04 |
| PL332083A1 (en) | 1999-08-30 |
| DE69708420D1 (de) | 2002-01-03 |
| HUP0000588A3 (en) | 2001-11-28 |
| PT827966E (pt) | 2002-05-31 |
| DE69708420T2 (de) | 2002-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7360397B2 (ja) | グルカゴンペプチドの製造 | |
| Hovgaard et al. | Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins | |
| JP2002505672A (ja) | 水溶液中における保護されていないか又はｎ−末端システインで保護されたペプチドの固相での自然化学連結 | |
| KR20030081315A (ko) | 화학적으로 합성한 폴리펩티드의 폴딩 방법 | |
| Hojo et al. | Total synthesis and structural characterization of caveolin‐1 | |
| Roggero et al. | A simple and rapid procedure for the purification of synthetic polypeptides by a combination of affinity chromatography and methionine chemistry | |
| PL188670B1 (pl) | Metoda modyfikacji (poli)peptydów dla ułatwienia ich oczyszczania i sposób wytwarzania oczyszczonego (poli)peptydu | |
| Yem et al. | Biotinylation of reactive amino groups in native recombinant human interleukin-1β | |
| Saporito et al. | The chemical synthesis of the GstI protein by NCL on a X‐Met site | |
| Sugeno et al. | The amino acid sequence of cytochrome c from Debaryomyces kloeckeri | |
| Marquis et al. | Stoichiometry and structure of a complex of acidic ribosomal proteins | |
| de Vijver et al. | Application of an omonasteine ligation strategy for the total chemical synthesis of the BRD7 bromodomain | |
| HUE034308T2 (en) | Preparation of hydantoin-containing peptide products | |
| MXPA99002208A (en) | Preparation of purified (poly)peptides | |
| DK2976325T3 (en) | SYNTHESIS OF PEPTIDE PRODUCTS CONTAINING CYCLIC IMID | |
| CA2534143A1 (en) | Method of peptide synthesis | |
| CZ80499A3 (cs) | Způsob modifikace polypeptidů | |
| JP4524823B2 (ja) | タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法 | |
| LUCIETTO et al. | Mycobacterium tuberculosis chaperonin 10 and N‐truncated fragments Their synthesis and purification by the isoelectric focusing technique carried out in solution | |
| Chaloin et al. | Synthesis of a template‐associated peptide designed as a transmembrane ion channel former | |
| L’Italien | Solid-phase method approaches to protein microsequence analysis | |
| Sabatier | 13 Chemical Synthesis and Characteri | |
| Čeřovský et al. | Combined solid‐phase/solution synthesis of large ribonuclease AC‐terminal peptides containing a non‐natural proline analog | |
| Violand et al. | RECOMBINANT PROTEINS SYNTHESIZED IN _E; COLI | |
| Sergeev et al. | Analytical biotechnology of recombinant peptides and proteins: I. determination of the purity, composition, and structure of human, porcine, and bovine insulins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070909 |