HU223997B1 - Tisztított (poli)peptidek előállítása - Google Patents
Tisztított (poli)peptidek előállítása Download PDFInfo
- Publication number
- HU223997B1 HU223997B1 HU0000588A HUP0000588A HU223997B1 HU 223997 B1 HU223997 B1 HU 223997B1 HU 0000588 A HU0000588 A HU 0000588A HU P0000588 A HUP0000588 A HU P0000588A HU 223997 B1 HU223997 B1 HU 223997B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- peptide
- methionine
- label
- poly
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 20
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 17
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 150000003462 sulfoxides Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims 7
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 claims 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 4
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N triethylsilane Chemical compound CC[SiH](CC)CC AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- -1 pentamethylchromanesulfonyl Chemical group 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 101100067721 Caenorhabditis elegans gly-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N L-methionine (R)-S-oxide group Chemical group N[C@@H](CCS(=O)C)C(=O)O QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000916458 Plasmodium berghei Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010038081 SIV(mac) proteinase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010063086 avidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
A találmány tárgya (poli)peptidek módosítására szolgáló eljárástisztításuk megkönnyítésére, amely módosítási eljárás abban áll, hogylegalább egy specifikusan hasítható aminosavat inszertálnak a(poli)peptidlánc végére szintézise során, és az ezzel azonosaminosav(ak)at a (poli)peptidláncban – ha jelen van(nak) – hasadásellen védőcsoporttal látják el, hogy specifikus hasítást hajthassanakvégre pontosan a specifikusan hasítható aminosav(ak)nál. A találmánytárgyát képezi továbbá eljárás tisztított (poli)peptidek e módosítotteljárással való előállítására. Az eljárás lépései a kívánt(poli)peptid szintézise, legalább egy specifikusan hasítható aminosavhozzáadása a (poli)peptidlánc végéhez, az ezzel azonos aminosav(ak)védelme – ha jelen van(nak) – a (poli)peptidláncban hasadás ellen, a(poli)peptidlánc és hozzáadott aminosav(ak) címkeszekvenciával valómeghosszabbítása, majd a kapott meghosszabbított (poli)peptidtisztítása valamely címkespecifikus tisztítási eljárással; acímkeszekvencia és a hozzáadott aminosav(ak) eltávolítása ameghosszabbított (poli)peptidről hozzáadott aminosav(ak)ra fajlagoshasítási eljárással, ezáltal a tisztított (poli)peptid kinyerése. ŕ
Description
A találmány tárgya módosított módszer tisztított (poli)peptidek előállításának megkönnyítésére, valamint tisztítási eljárás a módosított módszer alkalmazásával.
Az elmúlt évek során a szilárd fázisú peptidszintézis akár terc-Boc-, akár F-Moc-stratégiát követve, nagymértékben fejlődött. Kifinomult szintéziseljárások teszik lehetővé mintegy 100 vagy ennél több egységből álló polipeptidek előállítását [Chong, P., Sia, C., Tam, E., Kandil, A. & Klein, M.: International Journal of Peptide & Protein Research, 41, 21-27 (1993); Haaheim, L. R., Maskell, J. P., Mascagni, P. & Coates, A. R. Scandinavian Journal of Immunology, 34, 341-350 (1991); Roggero, M. A. és munkatársai: Molecular Immunology, 32, 1301-1309 (1995); és Smith, D. D. és munkatársai: International Journal of Peptide & Protein Research, 44, 183-191 (1994)]. Azonban a tökéletlen kapcsolás és lánczárás, ami a peptidfelépítés bármely ciklusában bekövetkezhet, hiányok és csonkolt szekvenciák képződéséhez vezet.
Ez, és a mellékreakciók lehetséges bekövetkezése, főként a szintézishez alkalmazott gyanta végső lehasítása során, a kívánt peptid más szennyezésektől való izolálása során észlelhető. A hosszú szintetikus polipeptidek tisztítása igen nagy problémát jelent az olyan biológiai vizsgálatokhoz szolgáló és emberi vagy állati alkalmazásra szánt termékek előállításánál, amelyeknél megkívánt a nagymértékű tisztaság.
A kívánt termék és a hiányos, csonkolt vagy módosított peptid szennyezései fizikai jellemzőiben, például méretében, töltésében és hidrofób voltában való különbség különösen akkor lehet igen kevés a megfelelő tisztítás végrehajtásához, ha 30 vagy több egységből álló szekvenciát szintetizálunk. Továbbá, a modern, hatékony elválasztási eljárások, azaz a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás korlátját gyakran a csekély hozam és a kis mintamennyiséggel való terhelhetőség jelentik, miáltal az eljárás időigényes és költséges.
E korlátok leküzdésére különféle megközelítéseket vizsgáltak. 153 egységből álló IL—1 szintetikus proteint [Lobi, T. J., Deibel, M. J. & Yem, A. W., Analytical Biochemistry, 170, 502-511 (1988)] és 99 egységből álló SIV-proteáz szintetikus proteint [Tomasselli, A. G. és munkatársai: Journal of Biological Chemistry, 267, 10 232-10 237 (1992)] biotinileztek, és a biotinilezett láncokat avidin-agaróz oszlopon izolálták.
Ball H. L. & Mascagni, P. [International Journal of Peptide & Protein Research 40, 370-379 (1992)] a közelmúltban olyan tisztítást eljárást javasoltak, amely azon alapszik, hogy a peptidlánc utolsó egységének lipofil, savas vagy bázikus funkciós csoportjai bármelyikére reverzibilis védőcsoportot visznek fel.
Közelebbről, a kromatográfiás eljárásokat optimalizálták azáltal, hogy kihasználták a szintetizált szekvenciák sajátos egységeinek jelenlétét. Például ciszteintartalmú peptideket tisztítottak rögzített higanyszármazékokkal [Krieger, D. E., Erickson, B. W. & Merrifield, R. B., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73, 3160-3164 (1976)] vagy aktivált tiolokkal [Lindeberg,
G., Tengbom, J., Bennich, H. & Ragnarsson, U. J. Chromatography, 156, 366-369 (1978)] való reagáltatással, és sikeresen alkalmaztak rögzített fémion affinitáskromatográfiás eljárást (IMAC) [Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. & Belfrage, G., Natúré 258, 598-599 (1975)] hisztidint vagy triptofánt tartalmazó peptidek tisztítására [Lindeberg, G., Bennich, H. & Engstrom, A., International Journal of Peptide & Protein Research, 38, 253-259(1991)].
Rekombináns proteinekhez hisztidinvégződést, B-sejt-epitópot vagy GST-egységeket adtak szándékosan. Ezek a végződések azután affinitáskromatográfiás eljárásban alkalmazhatók.
Általában a szintetizált peptid fizikokémiai jellemzőin alapuló tisztítási eljárást minden egyedi mintánál optimalizálni kell, ami időigényes és költséges. Ezért számos olyan eljárást fejlesztettek ki, amely a tisztítási eljárást általánosan alkalmazhatóvá teszi [Bárány, G. & Merrifield, R. B., Peptides, analysis, synthesis, biology 1-163-165 (Academic Press, London, 1980)]. Ezek az eljárások azonban még mindig nem teljesen kielégítőek, mivel még időigényesek és/vagy a tisztított termékben kovalens peptidszármazékokat hagynak hátra, ami a peptidek biológiai és fizikokémiai jellemzői tekintetében, valamint végső, állatgyógyászati, illetve humángyógyászati felhasználásuk tekintetében aggályokat kelthet.
Fentieknek megfelelően a találmány célja az ismert eljárások olyan fejlesztése, amely a (poli)peptidek tisztításának megkönnyítésére szolgáló módosítómódszert tartalmaz, és (poli)peptidek tisztítására szolgáló eljárás, amely módszer és eljárás univerzálisan alkalmazható, nagy hozamot biztosít, és könnyen megvalósítható.
A fenti célt a találmány szerint egy módosítómódszerrel értük el, amely abban áll, hogy legalább egy specifikus hasítható aminosavat inszertálunk a (poli)peptidlánc végébe a szintézis során, és a (poli)peptid fentivel azonos aminosav(jai)t - ha jelen vannak - a hasítás ellen védőcsoporttal látjuk el, hogy a specifikus hasítást pontosan a specifikusan hasítható aminosav(ak)nál valósíthassuk meg.
Egy a fenti módosítást tartalmazó tisztítási eljárás az alábbi lépésekből áll:
i) a kívánt (poli)peptidet szintetizáljuk;
ii) a (poli)peptid végéhez legalább egy specifikusan hasítható aminosavat adunk, miközben a (poli)peptidben lévő ezzel azonos aminosav(ak)at - ha van(nak) hasítás ellen védőcsoporttal látjuk el;
iii) a (poli)peptidet és a hozzáadott aminosav(ak)at egy címkefrekvenciával látjuk el, így egy meghosszabbított polipeptidet nyerünk;
iv) a meghosszabbított polipeptidet egy címkespecifikus tisztítási módszerrel tisztítjuk; és
v) a címkeszekvenciát és a hozzáadott aminosav(ak)at a hozzáadott aminosav(ak)ra fajlagos hasítási módszerrel eltávolítjuk a polipeptidről, így a tisztított polipeptidet nyerjük.
A specifikus hasítási módszer előnyösen kémiai hasítási módszer, amint az a továbbiakból kiviláglik.
HU 223 997 Β1
A találmány szerinti módszer és eljárás minden (poli)peptidre alkalmazható, mivel nem függ annak aminosav-összetételétől. Továbbá, bizonyos előnyös megvalósítási módok esetén a módszer és az eljárás olcsó és igen hatékony.
Ilyen megvalósítási mód metioninegység alkalmazása hozzáadott aminosavként, majd affinitáscímke (például hat hisztidinegységig terjedő címke vagy más, a tisztítást megkönnyítő vegyület) hozzáadása. A megfelelő tisztítási lépéseket követően, például címkespecifikus affinitáskromatográfiás tisztítás után, a hisztidincímkét CNBr-emésztéses eljárással lehasíthatjuk, ami olcsó, hatékony, és specifikusan a metioninegységnél ható hasítási eljárás.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a címke így legalább egy, előnyösen hat vagy több hisztidinegység kiterjedésű, és egy metioninegységet tartalmaz. Adott esetben egy vagy több aminosav is beépíthető.
Ha a kívánt polipeptidszekvencia metioninegységeket tartalmaz, ezeket a címke eltávolítására alkalmazott cianogén-bromid lehasítaná. Azonban, a találmány szerint ez elkerülhető azáltal, hogy a (poli)peptid szintézisénél módosított metioninegységeket alkalmazunk. Az ilyen módosított metioninegység például metioninszulfoxid.
A találmány szerinti módszer egy alternatív megvalósítási módja szerint a címke egy nagy molekula, például polietilénglikol. Ebben az esetben a címkespecifikus tisztítási módszer a gélszűréses kromatográfia.
A találmány szerinti módszer és eljárás egyaránt jól alkalmazható rekombináns DNS-eljárással előállított polipeptideknél is. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a kívánt polipeptidben eredetileg jelen lévő metioninegységeket (a címkében lévőket nem) hasítás ellen védjük, ezt megvalósíthatjuk például egy másik aminosavval, például valinnal vagy glicinnel való helyettesítéssel vagy delécióval (kiiktatással).
A leírás és az igénypontok körében a „címkét” a kívánt polipeptidhez a szintézis során vagy azt követően hozzáadott eltávolítható molekula jelzésére alkalmazzuk. A „címke” lehet egy a polipeptid szintézise során hozzáadott aminosavszekvencia, de lehet más olyan molekula is, amely a komponensek elegyéből tisztítási eljárás során könnyen eltávolítható. Az utóbbiak példájaként említjük a polietilénglikolt (PEG).
A leírás és az igénypontok körében a „peptid”, „polipeptid'' és „(poli)peptid” kifejezések felcserélhetők.
A kívánt (poli)peptidet előállíthatjuk élő gazdaszervezetben is rekombináns DNS-eljárással, és a (poli)peptidben lévő metionincsoport(ok) szulfoxiddal való védelme helyett a metionincsoportokat kiiktatjuk, vagy más aminosawal, például valinnal, glicinnel vagy módosított metionnal helyettesítjük.
Élő gazdaszervezetként előnyösen eukarióta gazdaszervezetet, például Escherichia colit alkalmazunk.
A következő példa a találmány bemutatását szolgálja. Nyilvánvaló, hogy a példa szakember számára kellő kitanítást nyújt ahhoz, hogy további, a találmány körébe eső módszereket fejlesszen ki. A példában általánosan alkalmazható tisztítási eljárást ismertetünk, amely az alábbi elemek kombinációján alapszik: i) védőcsoportfelviteli protokoll; ii) metionin-szulfoxid alkalmazása védett metioninegységként a natív szekvencia felépítése során; és iii) a kívánt peptid meghosszabbítása egy metionin- és két glicinegységgel, majd végül hat hisztidin kiterjedésű lánccal, amelyet affinitáskromatográfiánál hasznosítunk. A megfelelő tisztítási lépéseket követően a hisztidincímkét cianogén-bromiddal lehasítjuk, majd végül a metionin-szulfoxidot metioninná redukáljuk. Ez az egyszerű, egyenes stratégia lehetővé teszi, hogy a Plasmodium berghei CS protein C-terminális régióját képező 69 egységből álló „PbCS 242-310” polipeptidet homogenitásig tisztítsuk nagy hozammal és rövid idő alatt, szokásos kromatográfiás eljárások alkalmazásával.
Példa
1. Anyagok és módszerek
1.1. Reagensek és oldószerek
A peptidszintézisnél alkalmazott vegyszerek és oldószerek forrása a Calbiochem-Novabiochem AG (Láufelfingen, Svájc) és a Fluka (Buchs, Svájc).
1.2. Peptidszintézis és analízis
A találmány bemutatására a Plasmodium berghei CS protein C-terminális régióját képező „PbCS 242-310” jelölésű polipeptidet [Lanar, D. E. Mól. Biochem. Párásítói., 39, 151-154 (1990)] szintetizáljuk szilárd fázisú F-Moc-módszerrel Applied Biosystems 431A peptidszintetizátorban. A polipeptidet 0,1 mmol léptéknél 0,43 mmol/g helyettesítettségi mértékű F-Moc-Ser(tercbutil)-p-alkoxi-benzil-alkohol gyantán (Wang gyanta) szintetizáljuk. A szintézist az F-Moc aminosavszármazékok, DCCI és HOBt aktiválószer ötszörös feleslegének alkalmazásával végezzük, az első 34 aminosavnál 60 perces kapcsolási időt, a további egységeknél dupla kapcsolást alkalmazunk. Minden ciklus végén védőcsoportot viszünk fel ecetsavanhidriddel való reagáltatással. Az oldallánc-védőcsoportok közé tartoznak pentametilkromán-szulfonil-csoport Arg esetén; S-terc-butilcsoport Cys esetén; trifenil-metil-csoport Asn, Gin és His esetén; terc-butoxi-karbonil-csoport Lys és Trp esetén; terc-butil-csoport Asp, Clu, Ser, Thr és Tyr esetén. A Met 306-ot Fmoc-Met-szulfoxidként inszertáljuk, hogy megvédjük a későbbi cianogén-bromidos hasítástól.
A peptidet N-terminálisán a His-His-His-His-HisHis-Gly-Gly-Met szekvenciával hosszabbítjuk meg ugyanazon körülmények alkalmazásával, amelyeket az előzőekben leírtunk, de a második Gly kapcsolása után a védőcsoport-felvitelt kihagyjuk. Az így kapott polipeptid jelölése: „His címke PbCS 242-310”.
A nyerspeptidet a peptidgyanta 2,5% H2O és 5% trietil-szilán-tartalmú trifluor-ecetsawal 2 órán át szobahőmérsékleten való kezelésével nyerjük. A szintetizált peptidet méretkizárásos folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk (Sephadex G50 70*2,5 cm-es oszlop 50% ecetsavat tartalmazó vizet alkalmazunk mozgófázisként). A peptid tisztaságát RP-HPLC eljárással vizsgáljuk, C4 W-Porex 250*4,6 mm-es oszlopot alkalmazunk, és 60 perc alatt, 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellett 10 és 90% között növekvő CH3CN3
HU 223 997 Β1 gradienst tartalmazó 0,1% trifluor-ecetsav-tartalmú vizet használunk eluensként. Az aminosav-összetételt Knecht és Chang módszerével határozzuk meg [Knecht, R. & Chang, J. Y. Analyt. Chem., 58, 2375-2379 (1986)].
1.3. Rögzített (immobilizált) fémion affinitáskromatográfia (IMAC) és CNBr-hasitás
A polipeptidet először hisztidincímkéje alapján affinitáskromatográfiás eljárással tisztítjuk. Ezután a címkét cianogén-bromiddal eltávolítjuk.
Ni-oszlopot készítünk Ni-NTA agarózgyantával (Qiagen Inc., Chatsworth, Amerikai Egyesült Államok), és az oszlopot A pufferrel (8 mol/l karbamid, 0,1 mol/l Na2HPO4, 0,01 mol/l Trisz, pH foszforsavval 8,0-ra állítva) egyensúlyba hozzuk. Méretkizárásos eljárással tisztított „His-tag PbCS 242-310” polipeptidet A pufferben oldunk, és 15 ml/óra áramlási sebességgel az oszlopra visszük. Az oszlopot ezután A pufferrel mossuk (áramlási sebesség 15 ml/óra), majd a mosást 50 mmol/l imidazolt tartalmazó B pufferrel folytatjuk 30 ml/óra áramlási sebességgel (a B puffer összetétele: 8 mol/l karbamid, 0,1 mol/l Na2HPO4, 0,01 mol/l Trisz, a pH foszforsavval 6,3-ra állítva). Ezután a „His-címke PBCS 242-310” polipeptidet 250 mmol/l imidazolt tartalmazó B pufferrel eluáljuk (az áramlási sebesség 30 ml/óra).
Az eluált anyagot Sephadex G25 oszlopon sómentesítjük (az oszlop 50*2,5 cm, mozgófázisként 50% ecetsavat tartalmazó vizet alkalmazunk), majd liofilizáljuk. A hisztidincimke eltávolítására az így kapott anyagot 8 órán át szobahőmérsékleten 20 mg/ml CNBrtartalmú 70%-os trifluor-ecetsavval reagáltatjuk, ami 100-szoros moláris felesleget tesz ki.
Az így emésztett anyagot liofilizáljuk, A pufferben oldjuk, majd ismét a Ni-NTA agarózoszlopra visszük. A hisztidincimke visszamarad a Ni-oszlopon, az oszlopon átfolyó anyag a „PbCS 242-310” polipeptidet tartalmazza. Az átfolyó anyagot Sephadex G25 oszlopon (50*2,5 cm, mozgófázis 50% ecetsavat tartalmazó víz) sómentesítjük, majd liofilizáljuk.
1.4. A Met-szulfoxid redukálása
A CNBr-val kezelt és IMAC-tisztított anyagot pH=8,0 értékén 10%-os merkapto-etanollal reagáltatjuk, hogy a metionin-szulfoxidot metioninná, a cisz-Sterc-butil-egységet ciszteinné alakítsuk, majd a terméket gélszüréssel (Sephadex G25 oszlopon, 250*4,4 mm) tovább tisztítjuk.
1.5. Tömegspektrometria
Tömegspektrometriás analízist végzünk LDI 1700 Mass Monitor repülésiidő-méréssel működő tömegspektrométerrel (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA). 5 μΙ 1 mg/ml-es polipeptidoldatot 5 μΙ 20 mg/mles acetonitriles transz-3,5-dimetoxi-4-hidroxi-fahéjsavoldattal (szinapinsav) (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA) elegyítünk, és az oldatból 1,0 μΙ-t viszünk a tömegspektrométer próbacsúcsába, és enyhe vákuummal szárítjuk. A mintát N2-lézerből származó 3-ns lézerimpulzusokkal (337 nm hullámhosszú) sugározzuk be. A repülési időt digitális oszcilloszkóppal mérjük (szériaszám: 9304; Le Cray Research Systems, Corp., Spring Valley, NY), az értéket Peptide MALDI-TOFMS kalibrációs standard alkalmazásával (Linear Scientific Inc., Reno, NV., USA) tömegspektrummá alakítjuk.
2. Eredmények
A 69 egységből álló „PbCS 242-310” polipeptid a P. berghei CS protein C-terminális régiójának felel meg [Lanar, D. E. Mól. Biochem. Párásítói., 39, 151-154 (1990)]. A „His-címke PbCS 242-310” szintézisét olyan automatikus terv szerint végezzük, amelyben minden egyes kapcsolási lépés után az „anyagok és módszerek” résznél leírt védőcsoport-felvitel lépést beiktatjuk.
A megfelelő peptid/gyanta 600 mg mennyiségének H2O/trietil-szilán/trifluor-ecetsavval való kezelésével több mint 150 mg nyers polipeptidet nyerünk.
A nyers polipeptid tömegspektrum-elemzése azt mutatta, hogy más alacsony molekulatömegű komponensek között az érdeklődésre számot tartó 9301 molekulatömegű faj van jelen (1. ábra).
mg nyers polipeptidet rögzített fémionaffinitáskromatográfiás eljárással (IMAC) tisztítottunk 25 ml térfogatú Ni-NTA agarózoszlopon (2. ábra). Méretkizárásos folyadékkromatográfiás eljárással végzett sótalanítás után 35 mg „His-címke PbCS 242-310”-t nyertünk. Az eluált anyag (35 mg) és az átfolyó anyag (55 mg) 280 nm-nél mért abszorpciója azt jelezte, hogy a tisztítási művelet hozama 100%.
A Ni-oszlopon tisztított anyagot ezután a 6*His címke elkülönítésére CNBr-val hasítottuk.
Az emésztett anyagot ismét a Ni-oszlopra vittük, hogy a lehasított peptidet elkülönítsük, és 10%-os merkapto-etanollal kezeltük pH=8,0 értéken, hogy a szintézis során beépített metionin-szulfoxidot redukáljuk és a Cys-egység védőcsoportjait eltávolítsuk. A metioninszulfoxid teljes redukálódását az anyag CNBr-val való ismételt kezelésével és a hasítás hatékonyságának tömegspektrometriás ellenőrzésével igazoltuk.
Méretkizárásos kromatográfiás eljárással végzett további tisztítás után 19 mg tisztított PbCS 242-310-et nyertünk.
A 3. ábrán a kapott termék tömegspektrumát mutatjuk be, a 4. ábrán a nyers és a tisztított peptid analitikai kromatográfiás profilját hasonlítjuk össze. A két futtatás retenciós időiben mutatkozó különbség oka, hogy a tisztított anyagból hiányzik az erősen töltött His-címke. A tisztított „PbCS 242-310”-et a 214 nm-nél végzett analízissel kapott csúcs alatti területek integrálása alapján csak 95%-os tisztaságúnak tartjuk. A CS polipeptid aminosav-összetétele konzisztens a várt összetétellel (1. táblázat).
1. táblázat Aminosav-analízis
| Aminosav3 | Maradékok egy mól PbCS 2142-310-re számítva | ||
| Várt | Észlelt | S.D.C | |
| Asp+Asn | 10 | 9,4 | 1,0 |
| Glu+GIn | 9 | 9,1 | 0,9 |
| Ser | 7 | 8,4 | 2,1 |
HU 223 997 Β1
1. táblázat (folytatás)
| Aminosav3 | Maradékok egy mól PbCS 2142-310-re számítva | ||
| Várt | Észlelt | S.D.C | |
| Thr | 4 | 2,2 | 0,8 |
| Gly | 3 | 3,1 | 1,0 |
| Alá | 2 | 3,4 | 1,1 |
| Arg | 4 | 4,8 | 0,9 |
| Pro | 1 | 1,1 | 0,2 |
| Val | 3 | 2,9 | 0,3 |
| Met | 1 | 1,0 | 0,1 |
| llc | 7 | 6,3 | 0,7 |
| Leu | 3 | 3,3 | 0,2 |
| Phe | 1 | 1,1 | 0,1 |
| Lys | 8 | 6,7 | 1,0 |
| His | 0 | - | - |
| Tyr | 1 | 1,2 | 0,2 |
a Cys- és Trp-meghatározás nem történt. b Öt meghatározás átlagos értéke. c Standard deviáció.
3. Értékelés
A bioaktív peptidek kémiai szintézise a láncépítés automatizálása és hatékony módszerei folytán széleskörűen elterjedt és gyorsan fejlődő eljárássá vált. Legtöbb alkalmazás céljára a nyers szintetikus terméket tisztítani kell, hogy a visszamaradó reagenseket, a hibás szekvenciákat és kémiailag módosított peptid fajtáját eltávolítsák. Ezt szokásosan fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végzik, mozgófázisként vizes trifluor-ecetsav/acetonitril elegyet alkalmazva. Bár a peptidszintézis erősen automatizálttá vált, a tisztítás még mindig nagyrészt manuális eljárás, ezért időigényes, költséges, és nem túlságosan hatékony.
A példa azt mutatja, hogy a találmány szerinti eljárás nagy tisztasághoz vezet, amint az a 3. ábrán látható, könnyen végrehajtható, és általánosan alkalmazható.
Azt a problémát, ami a kívánt szekvenciában jelen lévő Met-egységek jelenléte folytán a specifikus hasításnál felmerül - amint a példában bemutattuk - a találmány szerint Met-szulfoxid-egységek alkalmazásával kerüljük el, ez utóbbi egységek rezisztensek a
CNBr-kezelésnek, és merkapto-ecetsawal kvantitatíven redukálhatok [Houghten, R. A. & Li, C. H.: Methods in enzymology, 91, 545-559 (1991)].
Fentiekből következik, hogy a találmány szerinti eljárást sikeresen alkalmaztuk a „PbCS 242-310” poli15 peptid tisztítására, amely polipeptid a P. berghei CS protein C-terminális régiója 69 egységének megfelelő lánc [Lanar, D. E.: Mól. Biochem. Párásítói., 39, 151-154 (1990)]. Bár - a tömegspektrum-analízis alapján, amit az 1. ábrán mutatunk be - a gyantáról 20 való lehasítás után a nyerstermékben számos peptidszennyeződés volt jelen, a célpeptidet nagy hozammal, viszonylag rövid idő alatt homogenitásig tudtuk tisztítani. A tisztítás teljes menete során 19 mg tisztított PbCS 242-310-et nyertünk, amely a nyerstermék mintegy
20%-ának felel meg.
Összegezve, kimutattuk, hogy a CNBr-hasítás és a releváns Met-egységek szulfoxidként való védelme megfelelően hatékony affinitáscímkével együttesen hatékony, és általános eszközt képviselhet kémiailag szintetizált hosszú láncú peptidek tisztításánál.
4. Az ábrák
1. ábra: A nyerspeptid tömegspektruma
2. ábra: IMAC-tisztítás kromatográfiás profilja
3. ábra: A tisztított peptid tömegspektruma
4. és a 4a. ábra: A nyers és a tisztított peptid kromatográfiás profiljai.
Claims (5)
1. Eljárás peptidek módosítására, tisztításuk megkönnyítésére, amely módosítási eljárás abban áll, hogy a peptidlánc végére a lánc szintézise során legalább egy sajátosan hasítható metionint és egy címkét inszertálunk, és a peptidben az adott esetben jelen lévő metioninegységeket - a hasítás ellen szulfoxidcsoporttal való védelemmel biztosítjuk, azzal jellemezve, hogy a címke egy His-címke vagy polietilénglikol.
2. Eljárás tisztított peptidek előállítására, amely eljárásban
a) a kívánt peptidet szintetizáljuk;
b) legalább egy specifikusan hasítható metionint adunk a peptid végéhez, miközben a peptidben az adott esetben jelen lévő metionint vagy metioninokat szulfoxidcsoporttal védjük a hasítás ellen;
c) a peptidet és a hozzáadott metionint vagy metio45 ninokat egy címkével hosszabbítjuk meg, így meghosszabbított peptidet nyerünk;
d) a meghosszabbított peptidet címkespecifikus tisztítási eljárással tisztítjuk; és
e) a címkét és a hozzáadott metionint vagy metioni50 nokat a meghosszabbított peptidről cianogén-bromiddal végzett hasítással eltávolítjuk, miáltal tisztított peptidet nyerünk, azzal jellemezve, hogy címkeként Hiscímkeszekvenciát vagy polietilénglikolt alkalmazunk.
3. Az 1-2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez55 ve, hogy a His-címkeszekvencia His-His-His-His-HisHis-Gly-Gly összetételű.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy címkespecifikus tisztítási eljárásként a címkeszekvencia affinitásán alapuló kroma60 tográfiás eljárást alkalmazunk.
HU 223 997 Β1
5. Az 1-2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy címkeként polietilénglikolt alkalmazunk, és címkespecifikus tisztításként gélszűréses kromatográfiás eljárást használunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt peptidet rekombináns DNS-eljárással állítjuk elő élő gazdaszervezetben, és a peptidben lévő metionincsoport vagy metionincsoportok szulfoxiddal való védelme helyett a metionincsoportokat kiiktatjuk, vagy más aminosavval, például valinnal, glicinnel vagy módosított metioninnal helyettesítjük.
5 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élő gazdaszervezetként eukarióta gazdaszervezetet vagy prokarióta gazdaszervezetet, például Escherichia colit alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96202515 | 1996-09-09 | ||
| EP97201318A EP0827966B1 (en) | 1996-09-09 | 1997-05-02 | Preparation of purified (poly) peptides |
| PCT/EP1997/004939 WO1998009983A2 (en) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Preparation of purified (poly)peptides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0000588A2 HUP0000588A2 (en) | 2000-07-28 |
| HUP0000588A3 HUP0000588A3 (en) | 2001-11-28 |
| HU223997B1 true HU223997B1 (hu) | 2005-04-28 |
Family
ID=26143147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0000588A HU223997B1 (hu) | 1996-09-09 | 1997-09-09 | Tisztított (poli)peptidek előállítása |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6075127A (hu) |
| EP (1) | EP0827966B1 (hu) |
| JP (1) | JP2001500489A (hu) |
| KR (1) | KR20000068514A (hu) |
| CN (1) | CN1166681C (hu) |
| AT (1) | ATE209213T1 (hu) |
| AU (1) | AU719029B2 (hu) |
| BR (1) | BR9711703A (hu) |
| CA (1) | CA2265249A1 (hu) |
| CO (1) | CO4870706A1 (hu) |
| CU (1) | CU22900A3 (hu) |
| DE (1) | DE69708420T2 (hu) |
| DK (1) | DK0827966T3 (hu) |
| ES (1) | ES2164297T3 (hu) |
| HK (1) | HK1022322A1 (hu) |
| HU (1) | HU223997B1 (hu) |
| IL (1) | IL128857A (hu) |
| NO (1) | NO991046L (hu) |
| NZ (1) | NZ334486A (hu) |
| PL (1) | PL188670B1 (hu) |
| PT (1) | PT827966E (hu) |
| RU (1) | RU2182155C2 (hu) |
| WO (1) | WO1998009983A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA978054B (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE50112379D1 (de) * | 2000-08-11 | 2007-05-31 | Univ Ruprecht Karls Heidelberg | Fv-konstrukte mit beeinflussbarer affinitat zu einer zu bindenden substanz |
| US6800449B1 (en) | 2001-07-13 | 2004-10-05 | Syngenta Participations Ag | High throughput functional proteomics |
| US20030091976A1 (en) * | 2001-11-14 | 2003-05-15 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Methods for monitoring polypeptide production and purification using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry |
| EP1600455A1 (en) * | 2004-05-28 | 2005-11-30 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Preparation of solid phase bound peptides or PNAs |
| CN100386340C (zh) * | 2004-07-19 | 2008-05-07 | 西安蓝晶生物科技有限公司 | 光可切除的磁粒子分子标签、其制备方法及在多肽合成制备中的应用 |
| WO2009101737A1 (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Osaka University | メチオニン残基含有ペプチドタグ付きタンパク質発現ベクター |
| GB201004372D0 (en) | 2010-03-16 | 2010-04-28 | Almac Sciences Scotland Ltd | Compounds for purification |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1219454B (it) * | 1988-02-17 | 1990-05-18 | Serono Cesare Ist Ricerca | Metodo di rottura alla metionina di polipeptidi contenenti pontidisolfuro |
| JP2960257B2 (ja) * | 1992-06-04 | 1999-10-06 | ピーイーバイオシステムズジャパン株式会社 | ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法 |
-
1997
- 1997-05-02 DK DK97201318T patent/DK0827966T3/da active
- 1997-05-02 AT AT97201318T patent/ATE209213T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-05-02 PT PT97201318T patent/PT827966E/pt unknown
- 1997-05-02 EP EP97201318A patent/EP0827966B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-02 DE DE69708420T patent/DE69708420T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-02 ES ES97201318T patent/ES2164297T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-08 CO CO97051965A patent/CO4870706A1/es unknown
- 1997-09-08 ZA ZA9708054A patent/ZA978054B/xx unknown
- 1997-09-09 BR BR9711703A patent/BR9711703A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 AU AU47016/97A patent/AU719029B2/en not_active Ceased
- 1997-09-09 WO PCT/EP1997/004939 patent/WO1998009983A2/en not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 PL PL97332083A patent/PL188670B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 JP JP10512266A patent/JP2001500489A/ja not_active Withdrawn
- 1997-09-09 CA CA002265249A patent/CA2265249A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-09 RU RU99107131/04A patent/RU2182155C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 IL IL12885797A patent/IL128857A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-09-09 CU CU1999023A patent/CU22900A3/es unknown
- 1997-09-09 NZ NZ334486A patent/NZ334486A/xx active IP Right Revival
- 1997-09-09 US US09/254,567 patent/US6075127A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-09 KR KR1019997001933A patent/KR20000068514A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-09-09 CN CNB971986371A patent/CN1166681C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-09 HU HU0000588A patent/HU223997B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-03 NO NO991046A patent/NO991046L/no unknown
-
2000
- 2000-03-01 HK HK00101287A patent/HK1022322A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6075127A (en) | 2000-06-13 |
| CN1166681C (zh) | 2004-09-15 |
| ES2164297T3 (es) | 2002-02-16 |
| NO991046D0 (no) | 1999-03-03 |
| ZA978054B (en) | 1998-03-20 |
| NZ334486A (en) | 2000-08-25 |
| EP0827966B1 (en) | 2001-11-21 |
| NO991046L (no) | 1999-05-05 |
| WO1998009983A2 (en) | 1998-03-12 |
| HUP0000588A2 (en) | 2000-07-28 |
| CA2265249A1 (en) | 1998-03-12 |
| DK0827966T3 (da) | 2002-05-21 |
| IL128857A (en) | 2003-09-17 |
| CU22900A3 (es) | 2004-01-23 |
| ATE209213T1 (de) | 2001-12-15 |
| CO4870706A1 (es) | 1999-12-27 |
| HK1022322A1 (en) | 2000-08-04 |
| EP0827966A1 (en) | 1998-03-11 |
| AU4701697A (en) | 1998-03-26 |
| RU2182155C2 (ru) | 2002-05-10 |
| WO1998009983A3 (en) | 1998-04-30 |
| KR20000068514A (ko) | 2000-11-25 |
| JP2001500489A (ja) | 2001-01-16 |
| IL128857A0 (en) | 2000-01-31 |
| BR9711703A (pt) | 1999-08-24 |
| CN1233255A (zh) | 1999-10-27 |
| AU719029B2 (en) | 2000-05-04 |
| PL332083A1 (en) | 1999-08-30 |
| DE69708420D1 (de) | 2002-01-03 |
| HUP0000588A3 (en) | 2001-11-28 |
| PT827966E (pt) | 2002-05-31 |
| PL188670B1 (pl) | 2005-03-31 |
| DE69708420T2 (de) | 2002-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0477885B1 (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
| KR100371824B1 (ko) | 정확하게연결된시스틴브릿지를갖는인슐린의수득방법 | |
| Imamura et al. | The amino acid sequence of the monomeric hemoglobin component from the bloodworm, Glycera dibranchiata | |
| Rattenholl et al. | Pro-sequence assisted folding and disulfide bond formation of human nerve growth factor | |
| JP4291900B2 (ja) | 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法 | |
| AU662083B2 (en) | Process for obtaining proinsulin possessing correctly linked cystine bridges | |
| NISHIUCHI et al. | Synthesis of γ‐carboxyglutamic acid‐containing peptides by the Boc strategy | |
| RU2275377C2 (ru) | Способ пространственной упаковки химически синтезированных полипептидов | |
| Roggero et al. | A simple and rapid procedure for the purification of synthetic polypeptides by a combination of affinity chromatography and methionine chemistry | |
| Decostaire et al. | Solid phase oxime ligations for the iterative synthesis of polypeptide conjugates | |
| HU223997B1 (hu) | Tisztított (poli)peptidek előállítása | |
| Katousian-Safadi et al. | Determination of the DNA-interacting region of the archaebacterial chromosomal protein MC1. Photocrosslinks with 5-bromouracil-substituted DNA | |
| SWANN et al. | Characterization of turkey myelin basic protein isolated by a simple procedure | |
| Tensen et al. | Comparative characterization of hyperglycemic neuropeptides from the lobster Homarus americanus | |
| JP4339797B2 (ja) | 非標的部位のアミンが保護されたペプチド、その製造方法、及びこれを利用したｐｅｇが特異的に接合されたペプチドの製造方法 | |
| Welinder et al. | Amino acid sequences and structures of chicken and turkey beta2-microglobulin | |
| EP1648930B1 (en) | Method of peptide synthesis | |
| OUDERAA et al. | The Amino-Acid Sequence of the aX2 Chain of Bovine a-Crystallin | |
| MENDRE et al. | Continuous flow synthesis of peptides using a polyacrylamide gel resin (Expansin™) | |
| Ogunjobi et al. | Ubiquitin: preparative chemical synthesis, purification and characterization | |
| CZ80499A3 (cs) | Způsob modifikace polypeptidů | |
| JPH07252299A (ja) | ヒルジン誘導体およびその製造方法 | |
| MXPA99002208A (en) | Preparation of purified (poly)peptides | |
| Čeřovský et al. | A convenient incorporation of conformationally constrained 5, 5‐dimethylproline into the ribonuclease A 89–124 sequence by condensation of synthetic peptide fragments | |
| Leondiadis et al. | Solid-phase synthesis of thymosin β10 using a p-cyanotrityl resin. Chemical characterization and immunochemical control of the synthetic peptide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050304 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |