PL183552B1 - Nowe związki cykliczne i środek farmaceutyczny - Google Patents

Abstract

1. Nowe zwiazki cykliczne o ogólnym wzorze [Z-X1 -X2 -X3 -X4 -X5 ]2 Y w którym Z oznacza grupe aminowa, guanidynowa lub amidynowa; Y oznacza cy- klo (C4-10) alkilen, 4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylen, bicyklo[2.2.2]oktylen, 2,3-bi- cyklo[2.2.2]okt-5-enylen lub tetracyklo[3.3.1.13 ,7 ]decylen, X7 oznacza (C3 _ 6 )alkilen, oksa(C4-1 0 )alkilen lub -X6 -X7 -X8 -, gdzie X7 oznacza fenylen, cyklo(C3-6)alkilen lub pipery- dynylen, a X6 i X8 oznaczaja wiazanie lub (C1-3) alkilen, przy czym gdy Z oznacza grupe aminowa to wówczas X6 ma znaczenie inne niz wiazanie, X2 oznacza oznacza -NHC(O) O -C(O)-, -C(O)NH- lub -NH-C(O)-, X4 oznacza -C(O)-, -C(O) O - lub -N(R 1 )C(O)O-, gdzie R oznacza atom wodoru lub (C1 - 4)alkil X3 oznacza (C1 -8 ) alkilen lub -X9-X10-, gdzie X9 oznacza wiazanie lub (C1 -6) alkilen, a X1 0 oznacza piperazynylen, piperydynylen lub perhydro-7H-diazepinylen, a X5 oznacza wiazanie lub (C1 - 2)alkilen, a takze ich farmaceu- tycznie dopuszczalne sole. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe związki cykliczne i środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia immunologicznych stanów zapalnych przebiegających z udziałem komórek tucznych.

Związki i środki według wynalazku są szczególnie użyteczne w profilaktyce i leczeniu chorób zapalnych dróg oddechowych, takich jak astma i alergiczny nieżyt nosa, późnej fazy zwężenia oskrzeli i nadreaktywności dróg oddechowych związanej z przewlekłą astmą oraz innego typu immunologicznych stanów zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie spojówek i stan zapalny jelit, a także różnych stanów dermatologicznych. Środki według wynalazku są również użyteczne w leczeniu stanów wywołanych wirusem ze spólni układu oddechowego.

Astma jest złożoną chorobą, w której uczestniczą różne mediatory biochemiczne, zarówno w jej postaci ostrej jak i przewlekłej. Coraz częściej astma uznawana jest za chorobę zapalną (patrz np. Hood i inni, Immunology, 2 wyd., Benjamin-Cummings, 1984). Astma często charakteryzuje się postępującym rozwojem nadreaktywności tchawicy i oskrzeli zarówno na immunospecyficzne alergeny, jak i na uogólnione bodźce chemiczne lub fizyczne. Uważa się, źe nadreaktywność astmatycznej tkanki oskrzelowej wynika z przewlekłych reakcji zapalnych, które podrażniają i uszkadzają wyściółkę nabłonkową ścianki drogi oddechowej i przyspieszają patologiczne zgrubienie leżącej pod spodem tkanki. Badania biopsji oskrzelowej wykazały, że nawet u pacjentów z łagodną astmą występują objawy stanu zapalnego w ściankach dróg oddechowych.

Jednym z inicjatorów sekwencji zapalnej jest reakcja alergiczna na wdychane alergeny. Leukocyty przenoszące receptory IgE, zwłaszcza komórki tuczne i leukocyty zasadochłonne, ale także monocyty, makrofagi i granulocyty enzynochłonne, występują w nabłonku i znajdującej się pod spodem tkance mięśni gładkich w oskrzelach, gdzie uaktywniają się one wstępnie przez wiązanie specyficznych wdychanych alergenów z receptorami IgE. Uaktywnione komórki tuczne uwalniają szereg wstępnie uformowanych lub pierwotnych chemicznych mediatorów reakcji zapalnej oraz enzymów. Ponadto liczne wtórne mediatory zapalenia są wytwarzane in situ w reakcjach enzymatycznych uaktywnionych komórek tucznych, w tym mediatory pochodzące od nadtlenów i lipidów. Dodatkowo szereg dużych cząsteczek zostaje uwolnionych w wyniku degranulacji komórek tucznych: proteoglikany, peroksydaza, arylosulfotaza B, oraz, w szczególności, tryptaza proteazowa i proteinaza chymotryptynowa (chymaza). Patrz Drug Therapy ofAsthma, str. 1054-54.

Takie uwalnianie chemiczne przez komórki tuczne jest prawdopodobnie odpowiedzialne za wczesną reakcję skurczu oskrzeli występującą u podatnych osobników po ekspozycji na działanie alergenów wziewnych. Wczesna reakcja astmatyczna osiąga maksimum w ciągu około 15 minut po wystawieniu na działanie alergenów; powrót następuje w ciągu kolejnych 1-2 godzin. U 25-35% osobników po wczesnej reakcji astmatycznej następuje kolejne osłabienie w oddychaniu, rozpoczynające się po kilku godzinach i osiągające maksimum po 6-12 godzinach po ekspozycji. Takiej późnej reakcji astmatycznej towarzyszy znaczący wzrost

183 552 liczby zapalnych komórek penetrujących tkanki oskrzelowych mięśni gładkich i nabłonka i ich rozsiewanie się w drogach oddechowych. Do komórek tych należą granulocyty eozynochłonne, obojętnochłonne krwinki białe i limfocyty, przy czym wszystkie te komórki są przyciągane miejscowo w wyniku uwalniania czynników ćhemotaktycznych pochodzących z komórek tucznych. Same penetrujące komórki uaktywniają się w czasie późnej fazy reakcji. Uważa się, że późna reakcja astmatyczna stanowi wtórną reakcję zapalną przebiegającą w części z udziałem wydzielniczej aktywności makrofagów.

Tryptaza stanowi główną proteazę wydzielniczą z ludzkich komórek tucznych, przy czym sugeruje się, że odgrywa ona rolę w przemianie neuropeptydów oraz w stanach zapalnych tkanki. Dojrzała ludzka tryptaza stanowi glikozylowany, zasocjowany z heparyną tetramer heterogenicznych, katalitycznie aktywnych podjednostek. Patrz np. Vanderslice i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3811-3815 (1990); Miller i inni, J. Clin. Invest. 86:864-870 (1990); Miller i inni, J. Clin. Invest. 84:1188-1195 (1989); Vanderslice i inni, Biochemistry 28:4148-4155 (1989).

Tryptaza jest przechowywana w ziarnach wydzielniczych komórek tucznych. Po uaktywnieniu komórek tucznych ludzką tryptazę można łatwo oznaczyć w wielu płynach biologicznych. Przykładowo, po anafilaksji tryptaza pojawia się w prądzie krwi, w którym można ją wykryć przez kilka godzin. Patrz Schwartz i inni, N. Engi. J. Med. 316:1622-1626 (1987). Obecność jej wykryto w próbkach płynu z płukania nosa lub płuc atopowych osobników prowokowanych specyficznym alergenem. Patrz Castells i Schwartz, J. Allerg. Clin. Immunol. 82:348-355 (1988) oraz Wenzel i inni, Am. Rev. Resp. Dis. 141:563-568 (1988). Poziomy tryptazy w płynie z przemywania płuc uzyskanym od atopowych astmatyków zwiększają się po wewnątrzo-skrzelowym prowokowaniu alergenem. U pewnych palaczy papierosów występuje uderzający wzrost poziomu tryptazy w płynie oskrzelowo-pęcherzykowym z przemywania w porównaniu z grupą kontrolną osób niepalących; stwierdzenie to potwierdza w pewnym stopniu hipotezę, że uwalnianie proteinaz przez uaktywnione komórki tuczne może przyczyniać się do zniszczenia płuc przy rozedmie u palaczy. Patrz Kalenderian i inni, Chest 94:119-123 (1988). Ponadto wykazano, źe tryptaza jest silnym mitogenem fibroblastów, co sugeruje, że odgrywa ona pewną rolę w zwłóknieniu płuc i śródmiąższowym zapaleniu płuc. Patrz Ruoss i inni, J. Clin. Invest. 88:493-499 (1991).

Tryptazie przypisuje się uczestniczenie w różnych procesach biologicznych, takich jak degradacja neuropeptydów rozszerzających naczynia i rozluźniających oskrzela (patrz Caughey i inni, J. Pharmacol. Exp. Ther. 244:133-137 (1988); Franconi i inni, J. Pharmacol. Exp. Ther. 248:947-951 (1988); oraz Tam i inni, Am. J. Respir. Celi Mol. Blol. 3:27-32 (1990)) oraz modulowanie reakcji oskrzeli na histaminę (patrz Sekizawa i inni, J. Clin. Invest. 83:175179 (1989)). Badania te wykazują że tryptaza prawdopodobnie zwiększa skurcz oskrzeli w astmie, rozkładając peptydy rozszerzające oskrzela.

Wykazano także, że tryptaza rozszczepia a-łańcuchy fibrynogenu, a także kininogenu o wysokiej masie cząsteczkowej, z ewentualnym uwalnianiem kinin, a zatem może odgrywać rolę wraz z heparyną jako miejscowy przeciwkoagulant. Zdolność tryptazy do uaktywniania prostromelizyny (pro-MMP-3) i prokolagenazy (pro-MMP-1) poprzez MMP-3 sugeruje, że tryptaza może także odgrywać rolę w zapaleniu i przebudowie tkanek. Stwierdzenie to oznacza również, że tryptaza może odgrywać rolę w destrukcji stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Na dodatek wykazano, że tryptaza rozszczepia peptyd związany z genem kalcytoniny. W związku z tym, że peptyd ten odgrywa rolę w zapaleniach neurogenicznych, tryptaza może być czynnikiem regulującym reakcję zapalną w neurogenicznym zapaleniu skóry. Patrz Caughey, Am. J. Respir. Celi Mol. Biol. 4:387-394 (1991).

Stwierdzono, że również wirus zespólni układu oddechowego jest przyczyną chorób dróg oddechowych u ludzi. Wirus ten został uznany za główną przyczynę infekcji dróg oddechowych u niemowląt i dzieci, takich jak zapalenie oskrzelików i oskrzelowe zapalenie płuc. Wykazano, że pewne związki, a konkretnie aromatyczne pochodne amidyny, ogólnie uznane za inhibitory trypsyny, urokinazy i plazminy skutecznie blokują fuzję komórek wywoływaną przez wirusa zespólni układu oddechowego, a także znacząco zmniejszają wydajność wirusa.

183 552

Patrz R.R. Tidwell i inni, J. Med. Chem. 26(2):294-298 (1983) oraz R. R. Tidwell i inni, Antimicrobial Agents and. Chemotherapy 26:591 (1984).

Stany zapalne przebiegające z udziałem komórek tucznych oraz infekcje wywoływane wirusem zespólni układu oddechowego stanowią rosnący problem w ochronie zdrowia publicznego. W szczególności astma staje się rozpowszechnioną przewlekłą chorobą w krajach uprzemysłowionych. Z tego względu pożądane byłoby dostarczenie ulepszonych środków, które zapewniły by skuteczne leczenie takich chorób.

Wynalazek dotyczy nowych związków cyklicznych o wzorze [Z-X¹-X²-X³-X⁴-X⁵]₂ y w którym Z oznacza grupę aminową, guanidynową lub amidynową;

Y oznacza cyklo (C4.10) alkilen, 4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylen, bicyklo[2.2.2]oktylen, 2,3-bicyklo[2.2.2]okt-5-enylen lub tetracyklo[3.3.1.1^3,7]decylen, X¹- oznacza (Cj^jalkilen, oksa(C₄.6)alkilen lub -X⁶-X⁷-x⁸-, gdzie X⁷ oznacza fenylen, cyklo(C3-6)alkilen lub piperydynylen, a X⁶ i X⁸ oznaczają wiązanie lub (C1-3) alkilen, przy czym gdy Z oznacza grupę aminową, to wówczas X⁶ ma znaczenie inne niż wiązanie, X² oznacza oznacza -NHC(O)O -, C(O)-, -C(O)NH- lub -NH-C(O)-, X⁴ oznacza -C(O)-, -C(O)O - lub -N(R’)C(O)O-, gdzie R¹ oznacza atom wodoru lub (CM)alkil, X³ oznacza (Ci-s) alkilen lub -X⁹-X¹⁰- gdzie X⁹ oznacza wiązanie lub (Cj-Jalkilen, a X¹⁰ oznacza piperazynylen, piperydynylen lub perhydro-7Hdiazepinylen, a X⁵ oznacza wiązanie lub (Ci.2)alkilen, a także ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Związki te zwane są poniżej związkami symetrycznymi.

Korzystne są związki, w których X⁴ oznacza grupę -C(O)-lub -C(O)O-.

Korzystniejsze są związki, w których Y oznacza cyklopentylen, cykloheksylen lub cyklooktylen.

Jeszcze korzystniejsze są związki, w których X³ oznacza 1,4-piperazynylen, 1,4piperydylen, l,4-perhydro-7H-l,4-diazepinylen lub -X⁹-X¹⁰-, gdzie X⁹ oznacza metylen, a xlO oznacza 1,4-piperydylen, a X⁴ oznacza -C(O)- lub -C(O)O-; albo X³ oznacza (C^jalkilen, a X⁴ oznacza -NHC(O)O - lub -N(CH₃)C(O) O -.

Korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza cyklooktylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklo-oktylenu, ewentualnie w postaci bischlorowodorku lub chlorowodorku.

Innym szczególnie korzystnym związkiem jest bis[4-(trans-4-aminometylocyklo- heksylometylokarbamoilo)-!-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu w postaci bischlorowodorku.

Ponadto szczególnie korzystnym związkiem jest bis (4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) cis-l,5-cyklooktylenu w postaci bistrifiuorooctanu.

Innym szczególnie korzystnym związkiem jest bis [4-(4-guanidynofenyloacetylo)-lpiperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu.

Ponadto szczególnie korzystne są związki wybrane z grupy obejmującej:

bis{4- [4- (2-aminoetylo)benzylokarbamoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis[4-(5-aminopentylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-l-ylokarbonyloamino]butyloaminokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis[4-(6-aminoheksylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminometylo)-1 piperydynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-(perhydro-7H-l,4-diazepino)karboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-aminometylobicyklo[2.2.2]okt-1 -ylometylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis[4-(5-amino-2-pentenylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu,

183 552 bis[4-(4-aminobutylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[2-(2-aminoetoksy)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksyloaminoformyloksy)-l-piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis{N-2-(trans-4-aininometylocykloheksyloaminoformyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu;

bis[4-(4-aminometylobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis{N-2-(trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminofor-myloksy)etylo-N-metyłoaminokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminoformyloksy)-l-piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis{4-[3-(4-guanidynofenylo)propionylo-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis {4-[2-(l-amidynopiperyd-4-ylo)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylokarbonylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu, bis {4- [4-(2-aminoetylo)fenyloacetylo]-1 -piperazynokarbo-ksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-(4-(2-aminoetylo)benzoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(l-aminoprop-2-ylo)benzoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-[3-(l-amidynopiperyd-4-ylo)propionoilo)-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis{4-[3-(4-amidynofenylo)propionoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(2-aminoetylo)piperyd-l -ylokarbonylo)-l -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[trans-4-(2-aminoetylo)cykloheksylokarbonylo]-1 -piperazynokarboksylan} cis1,5-cyklooktylenu, bis {4-[trans-4-(2-aminoetylo)cykloheksyloacetylo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis {4-[2-(4-amidynofenylo)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(l-amidynopiperyd-4-yloacetylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(l-amidynopiperyd-4-ylometylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynofenyloacetylo)-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynobenzoiloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynopiperyd-l-ylokarbonyloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis1,5-cyklooktylenu i bis[4-(4-guanidynofenylokarbonyloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu.

Inną korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza cykloheksylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest bis(4-guanidyno-benzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu w postaci bistrifluorooctanu.

Szczególnie korzystnymi związkami są poniższe związki:

bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminometylo] -1 -piperydynokarboksylan} trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu i bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarbo-ksylan] cis-1, 4-cykloheksylenodimetylenu.

183 552

Inną korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza cykloheksylen.

Szczególnie korzystnymi tycimi związkami są związki wybrane z grupy obejmującej:

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu trans-1,4cykloheksanodikarboksylowego i bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu 1,2-cykloheksanodikarboksylowego.

Inną korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza 4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo) -1 -piperazynokarboksylan] trans-2,6-(4,8-dioksbicyklo[3.3.0]oktylenu).

Korzystną grupę związków cyklicznych stanowią też związki, w których X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza bicyklo[2.2.2]okt-5-enylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylan] trans-2,3-bicyklo-[2.2.2]okt-5-enylenodimetylenu.

Ponadto korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza tetracyklo[3.3.1.1^3,7]decylen.

Szczególnie korzystnymi związkami są związki wybrane z grupy obejmującej:

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-tetracyklo-[3.3.1. l³~]decylenodimetylenu i bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu cis-1,5-tetracyklo[3.3.1.1^3,7]dekanodioctowego.

Jeszcze inną korzystną grupę związków cyklicznych stanowią związki, w których X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza bicyklo[2.2.2]oktylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo) -1piperazynokarboksylan] 1,4-bicyklo-[2.2.2]oktylenodimetylenu.

Wynalazek dotyczy również nowych związków cyklicznych o ogólnym wzorze

R²-Y-R³

0,0 1 O O /1 c w którym R i R niezależnie oznaczają Ζ-Χ -X -X -λ -X -, gdzie Z oznacza grupę aminową lub guanidynową; Y oznacza cyklo (Có-iojalkilen, X¹ oznacza (C3-6) alkilen lub -X⁶X⁷-X⁸-, gdzie X⁷ oznacza fenylen lub cyklo(C3-6)alkilen, X⁶ oznacza wiązanie lub (61-2)alkilen, a X⁸ oznacza wiązanie lub (Ci.2)-alkilen, przy czym gdy Z oznacza grupę aminową, to wówczas X⁶ ma znaczenie inne niż wiązanie; X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, a X⁵ oznacza wiązanie, a także ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Związki te zwane są poniżej związkami niesymatrycznymi.

Korzystne są związki, w których Y oznacza cykloheksylen lub cyklooktylen. Szczególnie korzystne są związki, w których X³ oznacza 1,4-piperazy-nylen. Korzystne są związki, w których Y oznacza cyklooktylen.

Szczególnie korzystnym związkiem jest 4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo) -1piperazynokarboksylan cis-5-[4-(4-trans-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)piperazyn-1 -yloformyloksy)]cyklooktylu.

Ponadto szczególnie korzystnymi związkami są związki wybrane z grupy obejmującej:

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(5-aminopentylokarbamoilojpiperazyn-1 -yloformyloksy] cyklooktylu,

4-(4-guanidynob enzylokarb amoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5- [4-(4-aminobutylokarbamoilojpiperazyn-1 -yloformyloksy]-cyklooktylu,

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan lokarbamoilo)piperazyn-l -yloformyloksy] cyklooktylu i

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan lokarbamoilo)piperazyn-l -yloformyloksy] cyklooktylu.

cis-5-[4-(3-aminopropycis-5-[4-(6-aminoheksyOpisane powyżej związki są przydatne w profilaktyce i leczeniu immunologicznych stanów zapalnych, zwłaszcza dotyczących dróg oddechowych, w tym astmy, a przede wszystkim fazy nadreaktywności związanej z astmą przewlekłą, oraz alergicznego nieżytu nosa.

183 552

Zgodnie ze sposobem leczenia immunologicznych stanów zapalnych pacjentowi, u którego występuje immunologiczny stan zapalny, podaje się terapeutycznie skuteczną dawkę lub ilość związku według wynalazku. Opisane związki są również, użyteczne w leczeniu infekcji wywołanych wirusem zespólni układu oddechowego.

Tak więc zakresem wynalazku objęty jest również środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia stanów zapalnych, zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub substancje pomocnicze, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera związek o ogólnym wzorze [Z-X*-X²-X³-X⁴-X⁵]2 Y, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Środek według wynalazku korzystnie stanowi roztwór zawierający ten związek w stężeniu 0,01 - 30 mg/ml.

Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą mieć wiele różnych postaci, takich jak doustne postacie dawkowane, postacie do inhalacji, a także roztwory do iniekcji i infuzji. Przy stosowaniu środków w postaci do inhalacji lub w aerozolu związki według wynalazku wykorzystuje się w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem w postaci roztworu lub suchego proszku, który może zostać przekształcony w postać aerozolu. Podobnie przy stosowaniu do podawania doustnego związki według wynalazku można stosować w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem odpowiednim do takiego podawania doustnego. Przy stosowaniu do leczenia immunologicznych stanów zapalnych skóry związki według wynalazku stosuje się w połączeniu z nietoksycznym, farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do stosowania miejscowego. Związki według wynalazku można stosować w kombinacji ze środkami przeciwzapalnymi lub innymi środkami stosowanymi w leczeniu astmy, takimi jak agoniści β-adrenergiczni, kortykosteroidy przeciwzapalne, środki przeciwcholinergiczne, środki rozszerzające oskrzela takie jak metyloksanteny itp.

Następujące definicje podano w celu zilustrowania i zdefiniowania znaczenia i zakresu różnych określeń stosowanych dla opisania wynalazku.

„Immunologiczny stan zapalny obejmuje ogólnie choroby związane z uwalnianiem mediatora przez komórki tuczne i podatne na leczenie inhibitorem tryptazy. Do przykładowych stanów tego typu należą choroby bezpośrednie typu nadwrażliwości, takie jak astma, alergiczny nieżyt nosa, pokrzywka i obrzęk naczynioruchowy oraz wypryskowe zapalenie skóry (atopowe zapalenie skóry) i anafilaksja, a także nadproliferacyjna choroba skóry, wrzody trawienne, stan zapalny jelit, wkrętowe i wiosenne zapalenie spojówki, reumatoidalne zapalenie stawów, stany zapalne skóry itp.

Nadreaktywność odnosi się do późnej fazy skurczu oskrzeli i nadreaktywności dróg oddechowych związanej z astmą. Uważa się, że nadreaktywność astmatycznej tkanki oskrzelikowej spowodowana jest przewlekłymi reakcjami zapalnymi, które podrażniają i uszkadzają wyściółkę nabłonkową ścianki drogi oddechowej i przyspieszają patologiczne zgrubienie leżącej pod spodem tkanki. ·

Grupa aminowa oznacza grupę -NH2.

Alkil, np. (C^jalkil lub (Cj_g)alkil oznacza prosty lub rozgałęziony rodnik węglowodorowy zawierający od jednego do podanej liczby atomów węgla. Określenie to przykładowo obejmuje takie grupy jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, t-butyl, izobutyl, izopentyl, n-pentyl, heksyl itp.

Cykloalkił, np. cyklo(C3-8)alkil, oznacza nasycony monocykliczny rodnik węglowodorowy zawierający podaną liczbę atomów węgla. Określenie to przykładowo obejmuje takie grupy jak cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl itp. <

W niniejszym opisie (C|._s)alkilen oznacza nasycony lub nienasycony, dwuwartościowy rodnik zawierający podaną liczbę atomów węgla. Określenie to obejmuje-przykładowo takie grupy jak metylen (-CH₂-), etylen (-CH2CH2-), trimetylen (-CH2CH2CH2-) itp.

W niniejszym opisie określenie oksa(C3^)alkilen oznacza dwuwartościowy rodnik -RO-R', w którym R i R' niezależnie oznaczają powyżej określony alkilen, o podanej liczbie atomów węgla.

W niniejszym opisie określenie cyklo(C3^)alkilen oznacza cykliczny nasycony lub niearomatyczny nienasycony dwuwartościowy rodnik zawierający od 3 do podanej liczby

183 552 atomów węgla: Określenie to obejmuje przykładowo takie grupy jak cyklopropylen, cyklobutylen, cyklopentylen lub cykloheksylen.

Określenie farmaceutycznie dopuszczalna sól odnosi się do tych soli, które zachowują skuteczność biologiczną i właściwości macierzystego związku i które nie są niepożądane biologicznie lub z innych względów.

Prolek oznacza związek, który po podaniu ulega przemianie chemicznej w wyniku procesów metabolicznych In vivo.

Farmaceutycznie lub terapeutycznie dopuszczalny nośnik oznacza nośnik, który nie zakłóca skuteczności i aktywności biologicznej substancji czynnych i nie jest toksyczny dla gospodarza lub pacjenta.

Stereoizomer oznacza związek chemiczny o takiej samej masie cząsteczkowej, takim samym składzie chemicznym i takiej samej budowie jak inny związek, lecz w którym atomy są pogrupowane inaczej. Oznacza to, że pewne identyczne grupy chemiczne są inaczej zorientowane przestrzennie i z tego względu w stanie czystym wykazują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Jednakże pewne czyste stereoizomery mogą wykazywać tak małą skręcalność optyczną że nie da się ich wykryć istniejącymi przyrządami. Związki według wynalazku mogą zawierać jeden lub większą liczbę asymetrycznych atomów węgla i z tego względu mogą obejmować szereg stereoizomerów. Wszystkie stereoizomery są objęte zakresem wynalazku.

Leczenie lub terapia oznacza podawanie związku według wynalazku in vitro lub in vivo i obejmuje: (i) hamowanie objawów choroby; i/lub (ii) zmniejszanie lub hamowanie długotrwałych skutków choroby.

Związki według wynalazku są nazywane zgodnie z dopuszczalnymi regułami nomenklatury, zasadniczo zgodnymi z „Chemical Abstracts. Przykładowo związek, w którym n5 oznacza 0, Ζ-Χ¹- oznacza 4-guanidynobenzyl, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza 1,4-piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, a Y oznacza cis-l,5-cyklooktylen, to bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylanu] cis-l,5-cyklooktylenu; związek, w którym n5 oznacza 1, Ζ-Χ¹- oznacza trans-4-aminocykloheksylometyl, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza 1,4piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, a Y oznacza trans-1,4-cykloheksylen, to bis [4-(trans-4aminometylocykloheksylomety-lokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] trans-1,4cykloheksylenu; związek, w którym n5 oznacza 0, Ζ-Χ¹- oznacza 4-(2-aminoetylo)fenyl, X² oznacza -C(O)-, X³ oznacza 1,4-piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, a Y oznacza cis-1,5cyklooktylen, to bis{4-[4-(2-aminoetylo)benzoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu; a związek, w którym n5 oznacza O, Ζ-Χ1- oznacza trans-4-aminometylocykloheksyl, X² oznacza -NHC(O)O-, X³ oznacza etylen, X⁴ oznacza-N(CH3)C(O)O-, a Y oznacza cis-1,5cyklooktylen, to bis[N-2-(trans-4-aminome-tylocykloheksyloaminoformyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan cis-1,5-cyklooktylenu.

Związki według wynalazku można również nazywać zgodnie z nomenklaturą IUPAC, zatem, np. bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) trans-1,4-cyklo- heksylenodimetylenu, zgodnie z nomenklaturą IUPAC określany jest jako bis[N-(pguanidylobenzylo)glicynami do)-(N)-(a)-karboksylan]

1,1 -trans-1,4-bis(4-cykloheksylenodimetylenu); bis(4-guani-dynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) cis-l,5-cyklooktylenu, zgodnie z nomenklaturą IUPAC określany jest jako bis[N-4-(p-guanidylobenzylo)glicynamido)-(N)-(a)-karboksylan] l,l'-cis-l,5-cykłooktylenu.

Związki według wynalazku wytwarza się z użyciem standardowych sposobów i reagentów. Należy podkreślić, że połączenia pomiędzy różnymi grupami, X¹-, X , X³, X⁴, i X⁵ obejmują połączenia węgla z azotem w amidzie lub karbaminianie, z tlenem w karbaminianie lub moczniku albo z węglem w karbonylu. Dla fachowców jest zrozumiałe, że sposoby i reagenty do wytwarzania takich wiązań są dobrze znane i łatwo dostępne. Patrz np. March, Advanced Organie Chemiskry, 4 wyd. (Wiley 1992), La-rock, Comprehensive Organie Trans formations (VCH 1989); oraz Fumiss i inni, Vogel's Textbook of Practical Organie Chemistry, 5 wyd. (Longman 1989). Zrozumiałe jest również, że występujące grupy funkcyjne mogą wymagać zabezpieczania i odbezpieczania w różnych etapach syntezy związków według wy

183 552 nalazku. Fachowcom znane są takie sposoby (patrz np. Green i Wuts, Protective Groups in Organie Chemistry (Wiley 1991).

Różne grupy X¹-, X², X³, X⁴, i X⁵, zawarte w związkach według wynalazku, można łączyć pojedynczo lub jako większe ugrupowania. Przykładowo związki według wynalazku, w których X* oznacza metylen, a X⁴ oznacza -NHC(O)O -, można wytworzyć poddając najpierw reakcji odpowiedni cykloalkilenodiol (np. cis-l,5-cyklooktanodiol, trans-1,4cykloheksylenodimetanol itp. ) z nadmiarem odpowiedniego izocyjanianu octanu z wytworzeniem mostka formyloksylowego pomiędzy X⁴ i X⁵, albo Y w przypadku gdy X⁵ oznacza wiązanie, po czym przeprowadzając hydrolizę do odpowiedniego kwasu dikarboksylowego, a następnie poddając kwas dikarboksylowy reakcji z odpowiednio zabezpieczoną aminą (np. z 4-t-butoksykarbonyloaminobenzylo-aminą itp.) w obecności odpowiedniego środka sprzęgającego.

Alternatywnie, odpowiedni cykloalkilenodiol przeprowadza się w odpowiedni bischloromrówczan przez działanie fosgenem, a następnie prowadzi się reakcję z odpowiednią diaminą z jedną grupą zabezpieczoną z wytworzeniem mostka formyloksylowego pomiędzy X³ i X⁵, albo Y w przypadku gdy X⁵ oznacza wiązanie, po czym Związek odbezpiecza się z wytworzeniem odpowiedniego związku pośredniego z dwiema reaktywnymi grupami aminowymi, prowadzi się reakcję odbezpieczonego związku pośredniego z odpowiednio zabezpieczonym izocyjanianem (np. z 4-t-butoksy-karbonyloaminofenylometyloizocyjanianem itp.), odbezpiecza się produkt i przeprowadza się ostatni etap reakcji (np. przekształcanie grupy aminofenylowej w guanidynofenylową). Związki według wynalazku, w których X² oznacza grupę -C(O)-otrzymać można postępując w powyższy sposób, ale poddając reakcji odbezpieczony związek pośredni z odpowiednim kwasem karboksylowym (np. 2 kwasem 4aminobenzoesowym, kwasem 4-aminometylobenzoesowym itp.). Związki według wynalazku, w których Z jest podstawiony grupą guanidynową, można otrzymać z odpowiedniej bis(aminy) w reakcji z aminocyjanamidem. Związki według wynalazku, w których Z jest podstawiony grupą amidynową można otrzymać z odpowiedniego bis(nitrylu) przez działanie chlorowodorem i etanolem, a następnie traktowanie amoniakiem. Etapy reakcji opisane w tym i poprzednim akapicie można przeprowadzić sposobami znanymi fachowcom.

Niesymetryczne związki według wynalazku można wytwarzać sposobami analogicznymi do opisanych powyżej w odniesieniu do wytwarzania symetrycznych związków według wynalazku, ale wprowadzając niezależnie różne grupy X¹, X², X³, X⁴, i X⁵. Przykładowo związki według wynalazku, w których -X⁴-X⁵- w R² i R³ są takie same, a Z-X'-X²-X³- w R² i R³ są różne, można wytwarzać przeprowadzając odpowiedni cykloalkilenodiol w odpowiedni bis-chloromrówczan, poddając reakcji bis-chloromrówczan z jednym molowym równoważnikiem odpowiedniej diaminy z jedną grupą zabezpieczoną z wytworzeniem odpowiedniego monochloromrówczanu, poddanie monochloromrówczanu reakcji z odpowiednią diaminą z jedną grupą zabezpieczoną z wytworzeniem związku o wzorze P-X⁴-X⁵-Y-X⁵-X⁴-P', w którym P i P' oznaczają chemicznie różne grupy zabezpieczające (np. t-butoksykarbonyl i benzyl), wybiórczo usuwa się jedną lub drugą grupę zabezpieczającą i postępuje się w sposób opisany powyżej w odniesieniu do wytwarzania symetrycznych związków według wynalazku. Odpowiednie grupy zabezpieczające oraz sposoby selektywnego odbezpieczania są znane fachowcom. Dla fachowców jest zrozumiałe, że analogiczne sposoby można zastosować do wytwarzania innych niesymetrycznych związków według wynalazku, w których Z, X¹, X², X³, X⁴ i X⁵ w R² i R³ są niezależnie różne.

W pewnych przypadkach gdy X³ oznacza np. ugrupowanie piperazyny, to grupę tę można wprowadzać niezależnie sposobami analogicznymi do podanych wyżej, albo też wytwarzać In situ z odpowiednio funkcjonalizowanych alkilenów z użyciem powszechnie znanych sposobów syntezy, takich jak opisane we wspomnianych pracach Marcha, Larocka lub Fumissa, supra.

Dla fachowców zrozumiałe jest również, że grupę łączącą -X'-X²-X³-X⁴- oraz różne jej podgrupy można wytwarzać znanymi sposobami oraz analogicznie do podanych w opisie przykładów. Należy także zdawać sobie sprawę, że aminokwasy stanowią dogodne substancje, z których można wytwarzać różne grupy funkcyjne obejmujące grupę łączącą -X'-X²-X³

183 552

X⁴-. Do stosowanych aminokwasów należy 20 naturalnych L-aminokwasów oraz ich Denancjomery, a także ich pochodne. Do pochodnych aminokwasów należą takie związki jak norwalina, sarkozyna, hydroksyproliną N-metylo-L-leucyną kwas aminoizomasłowy, statyna, kwas γ-karboksyglutaminowy, O-fosforan seryny, O-fosforan tyrozyny, O-siarczan tyrozyny, kwas piroglutaminowy i 4-(E)-butenylo-(R)-metylo-N-metylo-L-treonina. Do innych pochodnych aminokwasów należą naturalne L- i nienaturalne D-aminokwasy, w których grupa funkcyjna w łańcuchu bocznym została przekształcona w pochodną lub jest zabezpieczona zwykłymi grupami zabezpieczającymi, takimi jak t-butoksykarbonyl (BOC). Liczne dodatkowe nienaturalne aminokwasy są dobrze znane i dostępne z takich źródeł jak np. Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, oraz Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Do takich substancji należą β-alanina i jej homologi z wyższymi alkilowymi łańcuchami, kwas 1-amino-lcyklopropanokarboksylowy i jego homologi z większymi pierścieniami alicyklicznymi, kwas 2-amino-2-norbomenokarboksylowy i kwas izonipekotynowy. Metody i sposoby stosowane do syntezy, oczyszczania i oceny talach związków są dobrze znane i opisane np. w Synthetic Peptides: A Practical Approach, Atherton i inni, red. (IRL Press 1989).

Dla fachowców jest zrozumiałe, że związki według wynalazku można wytwarzać stosując szereg alternatywnych strategii syntezy. Przykładowo w reakcji izocyjanianu N-tbutoksykarbonylo-4-aminobenzylu lub izocyjanianu N,N'-bis-t-butoksykarbonylo-4-guanidynobenzylu z odpowiednim diaminoalkilenem z jedną grupą zabezpieczoną lub z aminoalkanolem uzyskuje się odpowiedni związek pośredni, który można zastosować do wytwarzania związków według wynalazku sposobami analogicznymi do opisanych powyżej.

Dla fachowców zrozumiałe jest także, że związki według wynalazku można otrzymać z innych związków według wynalazku wykorzystując dobrze znane przekształcenia chemiczne.

Dla fachowców zrozumiałe jest ponadto, że związki według wynalazku można przeprowadzać w ich pochodne będące prolekami. Odpowiednie proleki można przedstawić wzorem (Τ-Χ'-Χ²-Χ³-Χ⁴-Χ⁵)2Υ, w którym każdy z X¹, X², X³, X⁴ i X⁵ ma wyżej podane znaczenie, a T oznacza -NHR< -C(NHR⁴)(NR⁴) lub -NHC(NHR⁴)(NHR⁴), gdzie R⁴ oznacza grupę C(O)OCH(R⁵)OC(O) R , w której R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają (Ci.io)alkil lub cyklo(C3-Cio)alkil. Podobnie odpowiednie proleki są określone wzorem R-Y-R⁸, w którym R⁷ i R⁸ niezależnie oznaczają grupę T-X¹-X²-X³-X⁴-X⁵, w którym T, X¹, X², X³, X⁴ i X⁵ mają wyżej podane znaczenie, przy czym R⁷ i R⁸ nie są takie same. Proleki związków według wynalazku można wytwarzać sposobami znanymi fachowcom (patrz Saulnier i inni, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 4:1985 (1994)). Przykładowo odpowiednie proleki można wytwarzać w reakcji nie przekształconego w pochodną związku według wynalazku z odpowiednim środkiem karbamylującym (np. z chlorkiem 1,1-acyloksyalkilokarbonylu, węglanem pnitrofenylu itp.).

Związki według wynalazku, w zależności od charakteru grup funkcyjnych, mogą tworzyć sole addycyjne z różnymi nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami. Do typowych kwasów nieorganicznych należą np. kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy itp. Do typowych kwasów organicznych należą np. kwas octowy, kwas propionowy, kwas glikolowy, kwas pirogronowy, kwas szczawiowy, kwas jabłkowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas cynamonowy, kwas migdałowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas salicylowy itp.

Można również wytwarzać sole kwasów karboksylowych przez działanie metalami alkalicznymi lub zasadami metali alkalicznych, takimi jak wodorotlenki metali alkalicznych i alkoholany metali alkalicznych, albo metalami ziem alkalicznych lub zasadami metali ziem alkalicznych, takimi jak wodorotlenki metali ziem alkalicznych i alkoholany metali ziem alkalicznych. Ponadto można wytwarzać sole kwasu karboksylowego z zasadą organiczną taką jak Metyloaminą dietyloaminą etanoloaminą piperydyną izopropyloaminą choliną kofeina itp.

Sole można wytwarzać znanymi sposobami, np. w reakcji produktu w postaci wolnego kwasu lub zasady z jednym lub większą liczbą równoważników odpowiedniej zasady lub kwasu w rozpuszczalniku lub ośrodku, w którym sól jest nierozpuszczalną albo w rozpuszczalniku takim jak woda, który następnie usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem lub drogą

183 552 liofilizacji, albo przez wymianę kationów istniejącej soli na inny kation z użyciem odpowiedniej żywicy jonowymiennej.

Badania in vitro i in vivo

Procedury in vitro selekcjonowania potencjalnych inhibitorów pod względem ich zdolności do hamowania tryptazy są znane. Patrz np. Sturzebecher i inni (1992) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373:1025-1030. Zazwyczaj w testach tych oznacza się wywołaną przez tryptazę hydrolizę opartych na peptydach substancji chromogenicznych. Szczegóły przykładowej procedury opisano poniżej.

Ponadto można oceniać aktywność związków według wynalazku in vivo z wykorzystaniem jednego z licznych zwierzęcych modeli astmy. Patrz Larson, Experimental Models of Reversible Airway Obstruction w The Lung: Scientific Foundations, Crystal, West i inni, red., Raven Press, New York, 1991; Warner i inni (1990) Am. Rev. Respir. Dis. 141:253-257. Idealny model zwierzęcy powinien powielać główne kliniczne i fizjologiczne cechy astmy u ludzi, obejmujące nadreaktywność dróg oddechowych na mediatory chemiczne i bodźce fizyczne; znoszenie niedrożności dróg oddechowych przez leki stosowane w przypadku astmy u ludzi (środki β-adrenergiczne, metyksanteny, kortykosteroidy itp.); stany zapalne dróg oddechowych z naciekaniem uaktywnionych leukocytów; oraz przewlekłe, zwyrodnieniowe zmiany zapalne, takie jak zgrubienie błony podstawnej, przerost mięśni gładkich i uszkodzenie nabłonka. Do gatunków wykorzystywanych jako zwierzęta modelowe należą myszy, szczury, świnki morskie, króliki, psy i owce. Wszystkie wykazują pewne ograniczenia, toteż właściwy dobór modelu zwierzęcego zależy od problemu, który ma być rozwiązany.

Wstępną reakcję astmatyczną można oceniać na świnkach morskich i psach, a zwłaszcza na szczepie krzyżowym basenjichart, u którego rozwija się niespecyficzna nadreaktywność dróg oddechowych na liczne substancje niealergiczne, takie jak metacholina i kwas cytrynowy. Pewne wybrane owce wykazują podwójną reakcję po prowokowaniu antygenem z białkami Ascaris. U podwójnie reagujących zwierząt po wstępnej reakcji astmatycznej (IAR) występuje późna reakcja astmatyczna (LAR) w 6-8 godzin po ekspozycji. Nadwrażliwość na cholinergicznego agonistę, karbachol, zwiększa się w 24 godziny po prowokowaniu antygenem w przypadku tych zwierząt, które wykazują LAR.

Model alergicznej owcy (patrz poniżej) wykorzystano do oceny potencjalnego działania przeciwastmatycznego związków według wynalazku. Podawanie środków zawierających związki według wynalazku alergicznej owcy w postaci preparatów doustnych lub do wdychania, albo w postaci aerozolu, przed lub po ekspozycji na specyficzne antygeny wykazuje, że środki takie zasadniczo zmniejszają lub eliminują późną reakcję astmatyczną, a w związku z tym również nadreaktywność.

Związki według wynalazku są również użyteczne w leczeniu innych immunologicznych stanów zapalnych, w których aktywność tryptazy przyczynia się do powstania stanów patologicznych. Do takich chorób należą choroby zapalne związane z komórkami tucznymi, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie spojówki, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie kości i stawów, ostre dnawe zapalenie stawów oraz inne stany artretyczne, stan zapalny jelit, wrzody trawienne oraz różne schorzenia skóry. Związki według wynalazku można także stosować do leczenia infekcji wywołanych wirusem, zespólni układu oddechowego.

Skuteczność związków według wynalazku w leczeniu zdecydowanej większości immunologicznych stanów zapalnych można ocenić w procedurach In vitro lub in vivo. I tak skuteczność działania przeciwzapalnego związków według wynalazku można wykazać w dobrze znanych testach, takich jak Reserved Passive Arthus Reaction (RPAR)-PAW (patrz np. Gangly i inni (1992), opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 126 352). Znane są także testy do oceny skuteczności terapeutycznej związków w leczeniu różnych schorzeń skóry, takich jak nadproliferacyjna choroba skóry, takie jak Arachidonic Acid Mouse Ear Test. Związki według wynalazku można oceniać pod względem ich przeciwwrzodowego działania zgodnie z procedurami opisanymi w pracy Chiu i innych (1984), Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie 270:128-140.

183 552

Skuteczność związków według wynalazku w blokowaniu fuzji komórek wywoływanej przez infekcję wirusem zespólni układu oddechowego można oceniać metodami ogólnie opisanymi przez Tidwella i innych, J. Med. Chem. 26:294-298 (1983).

Zgodnie z wynalazkiem terapeutycznie lub farmaceutycznie skuteczną ilość związku według wynalazku podaje się pacjentowi z immunologicznym stanem zapalnym. Zgodnie z jednym z rozwiązań środki według wynalazku są użyteczne w profilaktyce lub łagodzeniu astmy. Przy stosowaniu środków według wynalazku do leczenia astmy związki można podawać zapobiegawczo przed ekspozycją na działanie alergenu lub innego czynnika strącającego, albo też po ekspozycji na te czynniki. Związki według wynalazku są szczególnie użytecznne w polepszaniu stanu późnej fazy zniszczenia tkanki występującego przy sezonowym łub całorocznym katarze. W innym aspekcie związki według wynalazku stosuje się do profilaktyki lub leczenia innych immunologicznych stanów zapalnych przebiegających z udziałem komórek tucznych, takich jak pokrzywka i obrzęk naczynioruchowy oraz wypryskowe zapalenie skóry (atopowe zapalenie skóry) i anafilaksja, a także nadproliferacyjna choroba skóry, wrzody trawienne itp. W jeszcze innym aspekcie związki według wynalazku stosuje się w leczeniu infekcji wywołanych wirusem zespólni układu oddechowego oskrzelowego, a zwłaszcza infekcji dróg oddechowych wywołanych tym wirusem.

Środki zawierające te związki można podawać w celach terapeutycznych i/lub profilaktycznie. W zastosowaniach terapeutycznych środki podaje się pacjentowi, u którego już występuje choroba, taka jak opisana powyżej, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania objawów choroby i jej powikłań. Ilość odpowiednia do uzyskania takiego efektu określana jest jako terapeutycznie skuteczna ilość lub dawka. Ilości skuteczne w takim zastosowaniu zależą od ostrości i przebiegu choroby, poprzedniej terapii oraz stanu zdrowia pacjenta i jego reakcji na leki, a także od oceny nadzorującego lekarza.

W zastosowaniach profilaktycznych środki zawierające związki według wynalazku podaje się pacjentowi podatnemu na chorobę lub takiemu, u którego występuje ryzyko zachorowania, w ilości skutecznej do zapobieżenia lub opóźnienia wystąpienia objawów. Ilość taką określa się jako zapobiegawczo skuteczną ilość lub dawkę. Można ją podawać doustnie lub przez wdychanie. W takim zastosowaniu dokładna ilość również zależy od stanu zdrowia pacjenta, jego wagi itp.

Po wystąpieniu poprawy stanu zdrowia w razie potrzeby podaje się dawkę podtrzymującą. Następnie wielkość dawki i/lub częstość podawania można zmniejszyć w zależności od objawów, do poziomu, przy którym zachowany zostanie lepszy stan. Gdy objawy zmniejszą się do pożądanego poziomu, leczenie można przerwać. Pacjenci mogą jednak wymagać okresowego leczenia w dłuższej perspektywie czasowej, przy powrocie objawów choroby.

Zazwyczaj odpowiednia skuteczna dawka związków według wynalazku będzie wynosić od 0,05 do 1000 mg/biorcę na dzień, korzystnie od 0,1 do 100 mg/dzień. Pożądaną dawkę, korzystnie w postaci jednej, dwóch, trzech, czterech lub więcej poddawek podaje się w odpowiednich odstępach czasu w ciągu dnia. Takie poddawki można podawać jako jednostkowe postacie dawkowane, np. zawierające od 0,01 do 1000 mg, korzystnie od 0,01 do 100 mg substancji czynnej/jednostkowąpostać dawkowaną.

Środki stosowane w terapiach mogą mieć różne postacie. Należą do nich np. stałe, półstałe i ciekłe postaci dawkowane, takie jak tabletki, pigułki, proszki, ciekłe roztwory lub zawiesiny, liposomy oraz roztwory do iniekcji i infuzji. Można także stosować preparaty do wdychania, takie jak aerozole. Do korzystnych należą preparaty do stosowania doustnego, donosowego, miejscowego i pozajelitowego, z tym, że zrozumiałe jest iż korzystna postać będzie zależeć od konkretnego zastosowania terapeutycznego. Sposoby formułowania i wytwarzania środków terapeutycznych zawierających związki według wynalazku są dobrze znane i opisane np. w Remingtoris Pharmaceutical Sciences i The Merck Index 11 wyd. (Merck & Co. 1989).

Jakkolwiek można podawać samą substancję czynną według wynalazku, to korzystnie stanowi ona część preparatu farmaceutycznego. Preparaty według wynalazku zawierają co najmniej jeden związek według wynalazku w terapeutycznie lub farmaceutycznie skutecznej dawce, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Środki farmaceutyczne będą w

183 552 związku z tym zawierać związki według wynalazku w stężeniu wystarczającym do dostarczenia odpowiedniej dawki. Przykładowo jeśli odpowiednia dawka wynosi 0,05 mg/dzień, to zawartość związku według wynalazku w środku farmaceutycznym powinna wynosić 0,5 mg/dawkęprzy stosowaniu jednej dawki dziennie. W przypadku środka do wdychania lub aerozolowych stężenie związków według wynalazku w środku zasadniczo będzie zależeć od wielkości dawki. Typowe stężenie związków według wynalazku w środkach do wdychania lub aerozolowych powinno wynosić od około 0,01 do około 30 mg/ml. Środek może zawierać inne związki użyteczne klinicznie, takie jak związki β-adrenergiczne (np. albuterol, terbutalina, formoterol, fenoterol i prenalina) oraz kortykosteroidy (np. beklometazon, triamcinolon, flurisolid i deksametazon).

Działanie biologiczne związków według wynalazku wykazano w poniższych próbach.

Test hamowania tryptazy in vitro

Badane związki (około 1 mg) rozpuszczano w 200 μΐ dimetylosulfotlenku (DMSO) i rozcieńczano w stosunku 1:10 buforem zawierającym 50 mmolowy (mM) Tris-HCl (pH 8,2), 100 mM chlorek sodowy i 0,05% monolaurynianu polioksyetylenosorbitanu (Tween-20®, dostępny z Sigmą St. Louis, MO). Wykonano 7 dodatkowych trzykrotnych rozcieńczeń z rozcieńczenia wyjściowego stosując ten sam bufor uzupełniony 10% DMSO. Próbki (po 50 μΐ z każdego z 8 kolejnych rozcieńczeń przeniesiono do poszczególnych studzienek w płytce do mikromiareczkowania z 96 studzienkami z zaokrąglonym dnem. Do każdej studzienki dodano 25 μΐ podstawowego roztworu tryptazy, po czym próbki wymieszano i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (zastosowano tryptazę oczyszczoną z ludzkich preparatów tkanki płucnej i skórnej, HMC-1 (linia ludzkich komórek tucznych) oraz dostępną ze źródeł handlowych (ICN Biomedicals, Irvine, Kalifornia; Athens Research & Technology, Athens, Georgia)). Każdy inhibitor wykazywał podobne powinowactwo do tryptazy ze wszystkich podanych źródeł. Roztwór tryptazy przygotowywano umieszczając 60 pg/ml tryptazy w roztworze z 10 mM MES (kwas 2-[N-morfolino)etanosulfonowy) zawierającym 2 mM CaCL, 20% gliceryny i 50 pg/ml heparyny. Reakcję enzymatyczną inicjowano dodając syntetyczny substrat tripeptydowy, tosylo-Gly-Pro-Lys-p-nitroanilid (dostępny z Sigma, 25 μΐ; ostateczne stężenie 0,5 mM). Płytki do mikromiareczkowania przenoszono natychmiast do czytnika mikropłytek UV/MAX Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices) i hydrolizę chromogenicznego substratu śledzono spektrofotometrycznie przy 405 nm przez 5 minut. W testach enzymatycznych zazwyczaj w warunkach tych uzyskuje się liniowe krzywe wzrostu. Początkowe wartości szybkości obliczane z krzywych wzrostu z użyciem programu do analizy kinetyki (BatchKi; Petr Kuzmic, University of Wisconsin, Madison, WI) wykorzystano do oznaczania pozornych stałych hamowania dla związków 1, 5 i 38.

Silny inhibitor tryptazy według wynalazku, związek 6, sklasyfikowano jak silnie wiąźący inhibitor, gdyż jego pozorne powinowactwo względem tryptazy (obliczone za pomocą programu BatchKi Ki' oznacza 200 pM) jest zbliżone do stężenia enzymu użytego w teście. Jednakże Ki' zmienia się wraz ze stężeniem enzymu stosowanym w teście enzymatycznym. Metodę graficzną (P.J.F. Henderson, Biochem. J. 127, 131 (1972)) za- stosowano do oznaczania Ki związku 6, niezależnego od stężenia tryptazy. W doświadczeniu tym stężenia tryptazy (0,25, 0,50, 1,0 i 2,0 nM) oraz związku 6 (40, 110, 340 i 680 pM) zmieniano w mieszankach przedinkubacyjnych na godzinę przed dodaniem substratu (500 μΜ tosylo-Gły-Pro-Lys-pnitro-anilidu). Dla każdej wartości stężenia tryptazy wyznaczano IC50 związku 6. Z przecięcia z osią y wykresu IC50 (rzędna) względem stężenia tryptazy (odcięta) uzyskuje się wielkość Ki'. Rzeczywistą stałą dysocjacji konkurencyjnego inhibitorą Ki, obliczono z zależności (patrz J. F. Morrison, Methods in Enzymology 63, 437-467 (1969)):

Ki = Ki7(l+S/K_m), gdzie S = 500 μΜ, a K_m = 300 μΜ

Obliczona tym sposobem stała dysocjacji związku 6 dla tryptazy oznacza 60 pM.

Metodą tą określono stałe hamowania (Ki', stężenie mikromolowe, μΜ) dla związków według wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem związek określa się jako „aktywny lub skuteczny jako inhibitor tryptazy, gdy jego Ki' wynosi poniżej 5 μΜ.

183 552

Postępując w powyższy sposób zbadano w teście in vitro związki według wynalazku i uzyskano następujące wielkości Ki (μΜ): związek 1 (0,004), związek 2 (0,002), związek 3 (0,00037), związek 4 (0,005), związek 5 (0,002), związek 6 (0,0002), związek 7 (0,03), związek 8 (0,493), związek 9 (0,00047), związek 10 (0,207), związek 11 (0,26), związek 12 (0,00013), związek 13 (1,3), związek 14 (0,302), związek 15 (0,0015), związek 16 (0,0049), związek 17 (0,713), związek 18 (1,51), związek 19 (0,00081), związek 20 (0,0609), związek 21 (0,009), związek 22 (0,119), związek 23 (0,00016), związek 24 (0,734), związek 25 (0,332), związek 26 (0,614), związek 27 (0,0087), związek 28 (0,0038), związek 29 (0,008), związek 30 (0,0266), związek 31 (0,008), związek 32 (0,114), związek 33 (0,0122), związek 34 (0,772), związek 35 (0,00042), związek 36 (2,3), związek 37 (0,0034), związek 38 (0,0158), związek 39 (0,44), związek 40 (0,011), związek 41 (1,44), związek 42 (0,125), związek 43 (0,508), związek 44 (0,75), związek 45 (0,858), związek 46 (1,39), związek 47 (1,1), związek 48 (0,064), związek 49 (1,45), związek 50 (0,00045), związek 51 (0,0038), związek 52 (0,00048), związek 53 (0,044) oraz związek 54 (0,02).

Badania in vivo

Alergiczną owcę jako model astmy wykorzystano do oceny in vivo związków według wynalazku jako środków przeciwastmatycznych. Metody takie zostały opublikowane uprzednio (patrz Abraham i inni (1983) Am. Rev. Respir. Dis. 128:839-844; Allegra i inni (1983) J. Appl. Physiol. 55:726-730; Russi i inni (1985) J. Appl. Physiol. 59:1416-1422; Soler i inni (1989) J. Appl. Physiol. 67:406-413. Każda owca służyła jako własne zwierzę kontrolne. Waga ciała zwierząt wynosiła od 20 do 50 kg.

W badaniach 50 pg związku 6 według wynalazku rozpuszczano w buforowanym roztworze soli i cały roztwór podawano jako aerozol na 0,5 godziny przed prowokowaniem antygenem, 4 godziny po i 24 godziny po prowokowaniu antygenem (całkowita dawka = 150 pg; n = 3). Związek ten powodował znaczące osłabienie wczesnej i późnej reakcji na prowokowanie antygenem określanej na podstawie pomiaru oporności właściwej płuc (SRL). Przedstawiono to na fig. 1. Podobne wyniki uzyskano dla związku 5, co pokazano na fig. 5. Szczyt wczesnej reakcji przyjęto jako średnią wielkości maksymalnych występujących bezpośrednio po prowokowaniu. Szczytowe późne reakcje obliczano uśredniając maksymalne wielkości reakcji uzyskane dla każdego zwierzęcia w okresie czasu 6-8 godzin. Jest to podejście zachowawcze, które eliminuje ewentualny spadek późnej reakcji po prostu z uwagi na uśrednianie.

W 24 godziny po prowokowaniu antygenem zarówno w próbie kontrolnej jak i z lekiem u owcy rozwinęła się nadreaktywność dróg oddechowych. Nadreaktywność dróg oddechowych wyraża się jako PC400, stężenie karbacholu powodujące wzrost SRL o 400%; z tego względu spadek PC400 oznacza nadreaktywność. Stwierdzono, że związek 6 blokuje wystąpienie nadreaktywności. Jak to pokazano na fig 2, związek ten utrzymuje PC400 zasadniczo na poziomie linii odniesienia odpowiadającej 32 jednostkom oddechu. Liczba jednostek oddechu spada do 12 dla zwierząt z grupy kontrolnej. W związku z tym leczenie związkiem 6 według wynalazku powoduje znaczącą poprawę w działaniu dróg oddechowych u owcy prowokowanej antygenem. Również związek 5 daje podobne wyniki, co pokazano na fig. 6.

Stwierdzono, że związek 6 wykazuje również aktywność przy podawaniu doustnym. 3 dawki związku (2 mg w 10 ml wody) podawano owcy przez sondę dożołądkową na 1 godzinę przed prowokowaniem, w 4 godziny po prowokowaniu oraz w 24 godziny po prowokowaniu. Jak to pokazano na fig. 5, u zwierząt, którym podawano ten związek, SRL we wczesnej fazie wynosi około 175. U zwierząt nie leczonych SRL wynosi około 250. W odniesieniu do reakcji w późnej fazie u zwierząt, którym podawano ten związek, SRL wynosi około 50 w porównaniu z wielkością SRL ponad 200 dla zwierząt nie leczonych. Tak więc związek ten wykazuje znaczące właściwości przeciwastmatyczne przy podawaniu doustnym.

Stwierdzono, źe podawanie związku 6 w aerozolu przed prowokowaniem antygenem jest również skuteczne w osłabianiu wczesnej i późnej reakcji na antygen, określanej na podstawie pomiaru oporności właściwej płuc (SRL). W badaniach tych zwierzętom tym podawano wstępnie w aerozolu związek 6 (0,5 mg/dzień przez 3 dni oraz dodatkowo 0,5 mg na 0,5 godziny przed prowokowaniem antygenem). Na fig. 7 pokazano znaczące osłabienie reakcji

183 552 we wczesnej i późnej fazie na prowokowanie antygenem, w wyniku wstępnego podawania związku 6. Z fig. 8 wynika znacząca poprawa działania dróg oddechowych.

Wyniki uzyskane w tych próbach przedstawiono graficznie na rysunku. Poniżej podano opis figur rysunku.

Figura 1 przedstawia wykres oporności właściwej płuc (SRL) w funkcji czasu (w godzinach) prowokowanej antygenem owcy leczonej bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym w aerozolu w dawkach 3 i 50 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 2 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący nadreaktywność (oznaczaną jako PC400) owcy prowokowanej antygenem, leczonej bis [4- (4-guanidynobenzylokarbamoilo)1-piperazynokarboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym w aerozolu w dawkach 3 i 50 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 3 przedstawia wykres oporności właściwej płuc (SRL) w funkcji czasu (w godzinach) prowokowanej antygenem owcy leczonej bis [4- (4-guanidynobenzylokarbamoilo)1-piperazynokarboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym doustnie w dawkach 3 i 2 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 4 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący nadreaktywność (oznaczaną jako PC400) owcy prowokowanej antygenem, leczonej bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazyno-karboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym doustnie w dawkach 3 i 2 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 5 przedstawia wykres oporności właściwej płuc (SRL) w funkcji czasu (w godzinach) prowokowanej antygenem owcy leczonej bis(4-guanidynobenzylokarbamoilo- metyloaminokarboksylanem) cis-l,5-cyklooktylenu (związek 5) podawanym w aerozolu w dawkach 3 i 0,1 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 6 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący nadreaktywność (oznaczaną jako PC400) prowokowanej antygenem owcy leczonej bis (4-guanidynobenzylokarba- moilometyloaminokarboksylanem) cis-l,5-cyklooktylenu (żwiązek 5) podawanym w aerozolu w dawkach 3 i 0,1 pg w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 7 przedstawia wykres oporności właściwej płuc (SRL) w funkcji czasu (w godzinach) prowokowanej antygenem owcy leczonej bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym w aerozolu w dawce 0,5 mg dziennie przez 3 dni oraz dodatkowo w dawce 0,5 mg na 1/2 godziny przed prowokowaniem antygenem, w porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Figura 8 przedstawia wykres słupkowy ilustrujący nadreaktywność (oznaczaną jako PC400) owcy prowokowanej antygenem, leczonej bis [4- (4-guanidynobenzylokarbamoilo)1-piperazyno-karboksylanem] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) podawanym w aerozolu w dawce 0,5 mg dziennie przez 3 dni oraz dodatkowo w dawce 0,5 mg na 1/2 godziny przed prowokowaniem antygenem, porównaniu z owcą której podawano środek kontrolny.

Przykłady

Opisane związki można wytwarzać powszechnie znanymi sposobami, takimi jak sposoby opisane w publikacjach March, Advanced Organie Chemistry (Wiley 1992), Larock, Comprehensive Organie Transformations (VCH 1989); oraz Fumiss i inni, PogeTs Textbook o f Practical Organie Chemistry, 5 wyd. (Longman 1989). Należy zdawać sobie sprawę, że opisane syntezy mogą wymagać przeprowadzenia jednego lub więcej etapów zabezpieczania i odbezpieczania. W związku z tym stosowanie odpowiednich grup zabezpieczających może być konieczne w przedstawionych procesach, choć może to nie być wyraźnie zilustrowane. Takie etapy zabezpieczania i odbezpieczania można zrealizować znanymi sposobami innymi niż przedstawione w opisie, takimi jak sposoby opisane w publikacji Green i Wuts, Protective Groups In Organie Chemistry (Wiley 1991).

Związki i produkty pośrednie przedstawione w opisie można w razie potrzeby wyodrębniać i oczyszczać dowolnym odpowiednim sposobem wydzielania i oczyszczania, takim jak np. filtracją ekstrakcja, krystalizacja, chromatografia kolumnowa, chromatografia cienkowarstwowa, chromatografia grubowarstwowa, wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) lub kombinacja takich sposobów. Konkretne przykłady odpowiednich sposobów

183 552 rozdzielania i wyodrębniania można znaleźć w poniższych przykładach. Można jednak wykorzystać inne, równoważne sposoby rozdzielania lub wyodrędniania.

Widma rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR) rejestrowano w spektrometrze Generał Electric QE Plus (300 MHz). Widma w podczerwieni (IR) rejestrowano w aparacie Perkin-Elmer 1600 Fourier Transform IR (FTIR). Analityczną HPLC wykonywano w aparacie Ultrafast Microprotein Analyzer, Michrom BioResources, Inc., wyposażonym w kolumnę PLRP lub Ci8, 1 mm x 150 mm. Preparatywną HPLC wykonywano w aparacie Gilson LC stosując kolumnę VYDAC 1 x 25 cm Cis z odwróconymi fazami (RP) lub układ Waters Prep LC2000 z kolumną Vydac 5 x 25 cm Cis RP· Widma masowe (MS) rejestrowano w aparacie Finnigan SSQ 710 ze źródłem ESI, na drodze bezpośredniej infuzji, albo metodą HPLC MS (Ultrafast Microprotein Analyzer, kolumna Cis 2 mm x 150 mm).

O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie reagenty i stosowane urządzenia otrzymywano zgodnie z opublikowanymi procedurami lub zakupiono ze źródeł handlowych, takich jak Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) i ICN Chemical Co (Irvine, CA). Opisane poniżej sposoby stosowane w celu przeprowadzenia takich syntez będą uznane przez fachowców za rutynowe (patrz np. March, Larock lub Fur-niss, supra).

Poniżej podane przykłady ilustrują wytwarzanie związków według wynalazku.

Przykład 1. Bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) trans1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 1)

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie związku według wynalazku, w którym Z oznacza grupę guanidynową, X^r oznacza X⁶-X⁷-X⁸, gdzie X⁶ oznacza wiązanie, X⁸ oznacza metylen, a X⁷ oznacza 1,4-fenylen, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza metylen, X⁴ oznacza NHC(O)O-, a Y oznacza trans-1,4-cykloheksylenodimetylen.

Bis(etoksykarbonylometyloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu

Do roztworu trans-1,4-cykloheksanodimetanolu (482 mg, 3,34 mmola) w DMF (5 ml) dodano chlorku miedzi (I) (99 mg, 1,0 mmola), a następnie izocyjanianooctanu etylu (800 μΐ, 7,13 mmola) i uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Do mieszaniny dodano wody (25 ml) i dichlorometanu (25 ml), po czym fazę wodną wyekstrahowano dodatkowo dichlorometanem (25 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2 x 25 ml), ą następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu, a następnie zatężeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano bis[(ester etylowy glicyny).- (N) - (a) -karboksylan] trans1, 4-cykloheksylenodimetylenu (1,19 g, 89%) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃) : 7,42 (t, 2H), 4,15 (q, 4H), 3,75 (d, 4H), 3,70 (d, 4H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,55-1,40 (m, 2H), 1,55 (t, 6H), 1,00-0,80 (m, 4H).

Bis (etoksykarbonylometyloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu

Do roztworu bis(N-metoksykarbonyloglicynianu) trans-1,6-cykloheksylenu (1,19 g, 22,96 mmola) w mieszaninie tetrahydrofuran:woda 3:1 (25 ml) dodano wodnego roztworu wodorotlenku sodowego (1,6 M, 6 ml, 9,7 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po zatężeniu, a następnie zakwaszeniu wodnego roztworu do pH 1 przez wkroplenie stężonego kwasu solnego wytrącił się biały osad. Po przesączeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano bis(N-metoksykarbonyloglicynian) trans-1,6-cykloheksylenu.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-de): 12,50 (s, 2H), 7,30 (t, 2H), 3,75 (d, 4H), 3,60 (d, 4H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,55-1,50 (m, 2H), 1,00-0,80 (m, 4H).

Bis (4-aminobenzylokarbamoilomet yloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu

Bis(N-metoksykarbonyloglicynian) trans-1,6-cykloheksylenu (306 mg, 0,88 mmola), hydrat hydroksybenzotriazolu (260 mg, 1,92 mmola) i chlorowodorek l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (360 mg, 0,88 mmola) rozpuszczono w DMF (5 ml) w 0°C i uzyskany roztwór mieszano przez 1 godzinę. Następnie do mieszaniny dodano 4aminobenzyloaminy (300 μΐ, 2,64 mmola) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 12 godzin. Po usunięciu DMF pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie dodaniu wody (25 ml), odsączeniu substancji nie

183 552 rozpuszczalnych i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano pożądaną anilinę w postaci brązowej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-dć): 8,10 (t, 2H), 7,20 (t, 2H), 6,90 (d, 4H), 6,50 (d, 4H), 5,40 (br s, 2H), 4,05 (d, 4H), 3,75 (d, 4H), 3,55 (d, 4H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,50-1,40 (m, 2H), 1,00-0,80 (m, 4H).

Bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksy-lan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 1)

Bis(4-aminobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu (87 mg, 0,16 mmola) i cyjanamid (0,5 g, 11,9 mmola) ogrzano bez rozpuszczalnika do 60 °C i do uzyskanego bezbarwnego roztworu dodano roztworu chlorowodoru (4M w dioksanie, 160 μΐ, 0,64 mmola). Uzyskaną żółtą ciecz mieszano w 60°C przez 1,5 godziny, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej. Po dodaniu eteru etylowego (25 ml) uzyskano nierozpuszczalny żółty olej, który przemyto szereg razy eterem etylowym (3 x 25 ml) dla usunięcia resztek cyjanamidu, a następnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Żółty olej rozpuszczono w wodzie (5 ml) i oczyszczano drogą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami. Otrzymano bis-trifiuorooctan bis(4-guanidynobenzylokarba-moilometyloaminokarboksylanu) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 1) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

^-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 9,80 (s, 2H), 8,40 (t, 2H), 7,20 (t, 2H), 7,40 (s, 8H), 7,30 (d, 4H), 7,10 (d, 4H), 4,25 (d, 4H), 3,75 (d, 4H), 3,60 (d, 4H), 1,80-1,60 (m, 4H), 1,551,40 (m, 2H), 1,00-0,85 (m, 4H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C30H42N10O6 obliczono:

MH⁺ 637,9; MH2⁺²/2: 320,4. Stwierdzono: MH⁺ 639,1; MH2⁺²/2:319,8.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 1 oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące związki według wynalazku:

bis{4-[3-(l-amidynopiperyd-4-ylo)propionoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu (związek 2);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla CjóHmNsOć obliczono: MH⁺ 731. Stwierdzono: MH⁺ 730,7;

bis{4-[3-(4-amidyno feny 1 o)propionoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu (związek 3);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H52N8O6 obliczono: MH⁺ 716,9. Stwierdzono: MH⁺ 717,9; oraz bis {[4-(l-amidynopiperyd-4-yloacetylo)-l-piperazynokarboksylan] } cis-1, 5-cyklooktylenu (związek 4);

’H-NMR (300 MHz, DMSO-dó): 7,2 (m, 8H), 4,6 (s, 2H), 3,8 (d, 8H), 3,4 (m, 16H), 2,9 (t, 4H), 2,3 (s, 4H), 1,9 (m, 2H), 1,6 (m, 10H), 1,1 (m, 4H).

Przykład 2. Bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloami-nokarboksylan) cis-1,5cyklooktylenu (związek 5)

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie związku według wynalazku, w którym Z oznacza grupę guanidynową, X^r oznacza X⁶-X⁷-X⁸, gdzie X⁶ oznacza wiązanie, X⁸ oznacza metylen, a X⁷ oznacza 1,4-fenylen, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza metylen, X⁴ oznacza NHC(O)O-, a Y oznacza cis-l,5-cyklooktylen

Bis(etoksykarbonylometyloaminokarboksylan) cis-1,5-cykloktylenu

Do roztworu cis-l,5-cyklooktanolu (514 mg, 3,56 mmola) w DMF (5 ml) dodano chlorku miedzi (I) (110 mg, 1,1 mmola), a następnie izocyjanianooctanu etylu (850 μΐ, 7,6 mmola) i uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Do mieszaniny dodano wody (25 ml) i dichlorometanu (25 ml) po czym fazę wodną wyekstrahowano dodatkowo dichlorometanem (25 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto wodą (2 x 25 ml), a następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu, a następnie zatężeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano bis (etoksykarbonylometyloaminokarboksylan) cis-1,5cyklooktylenu w postaci bezbarwnego oleju.

183 552 ‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 7,40 (t, 2H), 4,60 (m, 2H), 4,05 (q, 4H), 3,65 (d, 4H), 1,80-1,40 (m, 12H), 1,15 (t, 6H).

Bis(N-metoksykarbonylogicynian) cis-1,5-cyklooktylenu

Do roztworu bis(etoksykarbonylometyloaminokarboksylanu) cis-1,5-cyklooktylenu (1,26 g, 3,1 mmola) w mieszaninie tetrahydrofuran: woda 3:1 (25 ml) dodano wodnego roztworu wodorotlenku sodowego (1,6 M, 6 ml, 9,4 mmola) i mieszaninę reakcyjnąmieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po zatężeniu, a następnie zakwaszeniu wodnego roztworu do pH 1 przez wkroplenie stężonego kwasu solnego i ekstrakcji wodnego roztworu octanem etylu uzyskano surowy dwukwas. Po wysuszeniu połączonych warstw organicznych nad bezwodnym siarczanem magnezowym, a następnie przesączeniu i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano bis(N-metoksykarbonylogicynian) cis-1,5-cyklooktylenu w postaci bezbarwnego oleju.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 7,25 (t, 2H), 4,60 (m, 2H), 3,60 (d, 4H), 1,80-1,40 (m, 12H).

Bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) cis-1,5-cyklooktylenu (związek 5)

Bis(N-metoksykarbonylogicynian cis-1,5-cyklooktylenu (64 mg, 0,19 mmola) w dimetyloformamidzie (3 ml) ochłodzono do 0° C i dodano hydroksybenzotriazolu (61 mg, 0,45 mmola), a następnie chlorowodorku l-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylo-karbodiimidu (76 mg, 0,40 mmola). Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1 godzinę, po czym dodano przez zgłębnik do zawiesiny zawierającej bis-trifluorooctan 4-guanidynofenylometyloaminy (290 mg, 0,74 mmola) i trietyloaminę (500 μΐ, 3,6 mmola) w dimetyloformamidzie (2 ml), ochłodzony do 0°C. Mieszaniną pozostawiono do powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej na 12 godzin, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (10 ml) i pH roztworu doprowadzono do 1112 wkraplając nasycony wodny roztwór węglanu sodowego. Nierozpuszczalny produkt oddzielono przez dekantację wodnego roztworu, po czym surowy produkt ponownie przeprowadzono w roztwór wodny przez zakwaszenie do pH 1-2 stężonym kwasem solnym. Po oczyszczeniu drogą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami otrzymano bistrifluorooctan bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylanu) cis-1,5-cyklooktylenu (związek 5) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 9,80 (s, 2H), 8,40 (t, 2H), 7,40 (s, 8H), 7,25 (d, 4H), 7,20 (t, 2H), 7,10 (d, 4H), 4,60 (m, 2H), 4,25 (d, 4H), 3,60 (d, 4H), 1,80-1,40 (m, 12H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla CaoH^NwOg obliczono:

MH⁺ 639,7; MH2⁺²/2:320,4. Stwierdzono: MH⁺ 639,1; MH2⁺²/2:319,8.

Bis-trifluorooctan 4-guanidynofenylometyloaminy

4-Aminobenzyloaminę (11,0 g, 90 mmoli) w dichlorometanie (30 ml) ochłodzono do 0°C, do roztworu dodano diwęglanu dibutylu (18,65 g, 85 mmoli) i mieszaninę pozostawiono na 12 godzin do powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej. Po przesączeniu, a następnie przemyciu roztworu w dichlorometanie nasyconym wodnym roztworem chlorku amonowego, a następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego, wysuszeniu nad bezwodnym siarczanem magnezowym, przesączeniu i zatężeniu otrzymano 4-amino-N-tbutoksykarbonylobenzyloaminę w postaci żółtego oleju. Roztwór aniliny w metanolu zakwaszono chlorowodorem w dioksanie (1 równoważnik) i chlorowodorek wykrystalizowano dodając do kwaśnego roztworu eteru etylowego. Po przesączeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano chlorowodorek w postaci żółtej krystalicznej substancji stałej, którą poddano guanylowaniu bez dalszego oczyszczania.

Chlorowodorek butoksykarbonylobenzyloaminy (25,77 g, 99,6 mmola) i cyjanamid (55 g, 1,3 mola) ogrzewano bez rozpuszczalnika w 65°Ć przez 1,5 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i dodano eteru (250 ml). Nierozpuszczalny żółty olej przemyto szereg razy eterem etylowym dla usunięcia śladów cyjanamidu i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano chlorowodorek 4-guanidyno-B-t-butoksy-karbonylobenzyloaminy w postaci bezpostaciowej żółtej substancji materiału, którą zastosowano bez dalszego oczyszczania.

183 552

Chlorowodorek 4-guanidyno-B-t-butoksykarbonylobenzyloaminy (14,4 g, 48 mmoli) rozpuszczono w kwasie trifluorooctowym (35 ml) i uzyskany żółty roztwór mieszano przez 30 minut. Po zatężeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano bistrifiuorooctan 4-guanidynofenylometyloaminy w postaci żółtego oleju.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 10,25 (s, 1H), 8,40 (br s, 3H), 7,65 (br s, 4H), 7,50 (d, 2H), 4,00 (d, 2H).

Przykład 3. Bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis1,5-cyklooktylenu (związek 6)

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie związku według wynalazku, w którym Z oznacza grupę guanidynową, oznacza Χ^-Χ^Χ⁸, gdzie X⁶ oznacza wiązanie, X⁸ oznacza metylen, a X⁷ oznacza 1,4-fenylen, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza l,4.-piperazynylen, X⁴ oznacza -C (O) O-, a Y oznacza cis-1, 5-cyklooktylen

Bis-chloromrówczan cis-1,5-cyklooktanodiolu

Cis-1,5-cyklooktanodiol (3,05 g, 21,2 mmola) dodano do roztworu fosgenu w toluenie (1,9M, 28,0 ml, 53 mmole) i mieszaninę ochłodzono do 0°C w atmosferze azotu. Następnie ze strzykawki dodano pirydynę (3,4 ml, 43 mmole) i uzyskaną zawiesinę pozostawiono na 12 godzin do ogrzania się do temperatury pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano dichlorometanu (50 ml) i wody (50 ml), po czym warstwę organiczną przemyto 0,lN kwasem solnym (2 x 25 ml). Roztwór w dichlorometanie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując surowy chloromrówczan (3,7 g, wydajność 65%) w postaci żółtej, krystalicznej substancji stałej. W wyniku dalszego oczyszczania drogą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z użyciem mieszaniny eter etylowy (heksany 1:10 otrzymano czysty chloromrówczan w postaci bezbarwnej, krystalicznej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃): 5,00-4,85 (m, 2H), 2,20-1,60 (m, 12H).

Bis [4- (t-butoksykarbonylo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1, 5-cyklooktylenu

Bis-chloromrówczan cis-l,5-cyklooktanodiolu (3,69 g, 13,7 mmola) i diizopropyloetyloaminę (7,2 ml, 41 mmoli) rozpuszczono w DMF (25 ml), do roztworu dodano 1piperazyno-karboksylanu t-butylu (5,1 g, 27,4 mmola) i mieszaninę pozostawiono na 12 godzin do ogrzania się do temperatury pokojowej. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem do uzyskanej półstałej pozostałości dodano dichlorometanu (50 ml) i wody (50 ml), po czym warstwę organiczną przemyto 0,lN kwasem solnym (2 x 25 ml) i uzyskano surowy roztwór pożądanego karbaminianu. Roztwór w dichlorometanie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano bis [4(t-butoksykarbonylo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu w postaci bezpostaciowej substancji stałej, którą użyto bez dalszego oczyszczania.

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃): 4,80 (m, 2H), 3,40 (br s, 16H), 2,00-1,40 (m, 12H), 1,40 (s, 18H).

Bis-chlorowodorek bis(l-piperazynokarboksylanu) cis-1,5-cyklooktylenu

Bis[4-(t-butoksykarbonylo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1, 5-cyklooktylenu otrzymany w sposób opisany powyżej poddano działaniu kwasu trifiuorooctowego (15 ml) w temperaturze pokojowej przez 15 minut, po czym mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej rozpuszczono w wodzie (30 ml) i zalkalizowano nadmiarem stałego węglanu potasowego. Diaminę wyekstrahowano dichlorometanem (3 x 25 ml) i połączone warstwy organiczne wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu, a następnie zatężeniu otrzymano bis (1-piperazynokarboksylan) cis-1,5-cyklooktylenu w postaci bezbarwnego oleju. Diaminę rozpuszczono w metanolu (15 ml) i zadano roztworem chlorowodoru w dioksanie (4,OM, 5,3 ml), po czym dodano eteru etylowego (250 ml). Wytrącony osad odsączono, przemyto eterem etylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano bis-chlorowodorek bis (1-piperazynokarboksylanu) cis-1,5-cyklooktylenu w postaci bezbarwnej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-dó) : 9,50 (br s, 4H), 4,65 (m, 2H), 3,60 (s, 8H), 3,05 (s, 8H), 1,90-1,40 (m, 12H).

183 552

Bis[4-((p-t-butoksykarbonyloaminobenzylo)karbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis1,5-cyklooktylenu

Bis-chlorowodorek bis(l-piperazynokarboksylanu) cis-l,5-cyklooktylenu (1,94 g, 4,5 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (75 ml), po czym do roztworu dodano diizopropyloetyloaminy (2,0 ml, 11,5 mmola). Następnie dodano t-butylokarbaminian 4-aminofenylometyloizocyjanianu (2,26 g, 9,1 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór w dichlorometanie przemyto 0,5N kwasem solnym (2 x 50 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym i przesączono. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z użyciem eteru etylowego, a następnie mieszaniny octan etylu: etanol 10:1 jako eluentu otrzymano czysty bis [4-((p-t-butoksykarbonyloaminobenzylo)karbamoilo)1-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (3,5 g, wydajność 90%) w postaci bezbarwnej piany.

*H-NMR (300 MHz, CDC1₃): 7,25 (dd AB, 8H), 6,70 (s, 2H), 5,00 (t, 2H), 4,80 (m, 2H), 4,30 (d, 4H), 3,45-3,30 (m, 16H), 2,00-1,40 (m, 12H), 1,50 (s, 18H).

Bis[4-((p-aminobenzylo)karbamoilo)-1 -piperazyno-karboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu

Bis[4-((p-t-butoksykarbonyloaminobenzylo)karbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis1,5-cyklooktylenu (3,5 g, 4,0 mmola) poddano działaniu chlorowodoru w dioksanie (4,OM, 20 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę rozcieńczono eterem etylowym (100 ml). Rozpuszczalnik ostrożnie zdekantowano znad wytrąconego chlorowodorku, który wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymno bis[4-((p-aminobenzylo)karbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu w postaci higroskopijnej, brązowej substancji stałej, którą użyto bez dalszego oczyszczania.

’H-NMR (300 MHz, DMSO-dg): 10,25 (br s, 6H), 7,30 (dd AB, 8H), 7,15 (t, 2H), 4,60 (m, 2H), 4,20 (d, 4H), 3,30 (s, 16H), 1,80-1,40 (m, 12H).

Bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazyno-karboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 6)

Bis-chlorowodorek bis[4-((p-aminobenzylo)karbamoilo)-1 -piperazynokarboksylanu] cis-1,5-cyklooktylenu otrzymany w sposób opisany powyżej ogrzewano bez rozpuszczalnika z nadmiarem cyjanamidu (8,0 g, 190 mmoli) w 60-65°C przez 1,5 godziny. Uzyskany żółty roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i dodano doń eteru etylowego (250 ml). Nierozpuszczalną pozostałość przemyło dodatkowo eterem etylowym (3 x 100 ml) i surowy chlorowodorek wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Bezpostaciowy produkt rozprowadzono w wodzie (40 ml) i zawiesinę przesączono przez bibułę filtrącyną Millipore typu GV (0,22 pm). Uzyskany wodny przesącz oczyszczano drogą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, a następnie zliofilizowano i otrzymano bis-chlorowodorek bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo) -1-piperazynokarboksylanu] cis-l,5-cyklooktylenu (związku 6) w postaci szarawej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 9,70 (s, 2H), 7,40 (s, 8H), 7,20 (dd AB, 8H), 7,15 (t, 2H), 4,65 (m, 2H), 4,20 (d, 4H), 3,30 (s, 16H), 1,80-1,40 (m, 12H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C₃gH5₂Ni₂O6 obliczono:

MH⁺ 749,9; MH2⁺²/2. 375,5. Stwierdzono: MH⁺ 749,9; MH2⁺²/2:H 375,3.

Chlorowodorek 4-(t-butoksykarbonyloamino)benzyloaminy 4-Aminobenzyloaminę (5,56 g, 45,6 mmola) rozpuszczono w wodzie (45 ml), po czym do roztworu dodano kwasu cytrynowego (9,63 g, 50 mmoli). Do uzyskanego roztworu wkroplono di węglan di-t-butylu (9,94 g, 45,5 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Żółtą zawiesinę przesączono, a roztwór wodny zalkalizowano nadmiarem stałego węglanu sodowego. Po ekstrakcji wodnego roztworu octanem etylu (3 x 35 ml), a następnie przemyciu połączonych warstw organicznych nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego i wysuszeniu nad bezwodnym siarczanem sodowym otrzymano surową benzyloaminę. Po przesączeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano białą substancję stałą, którą rozpuszczono w metanolu (30 ml) i roztwór zakwaszono roztworem chlorowodoru w dioksanie (4M, 8,4 ml, 33,6 mmola). Po dodaniu eteru etylowego (100 ml), przesączeniu uzy

183 552 skanej zawiesiny i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano chlorowodorek 4-(tbutoksykarbonyloamino)benzyloaminy w postaci bezbarwnej substancji stałej.

‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 9,43 (s, 1H), 8,20 (br s, 3H), 7,40 (dd AB, 4H), 3,92 (m, 2H), 1,50 (s, 9H).

Izocyjanian (t-butoksykarbonyloamino)benzylu

Chlorowodorek 4-(t-butoksykarbonyloamino)benzyloaminy (3,39 g, 13,1 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (120 ml) w 0°C, po czym do roztworu dodano pirydyny (4,3 ml, 53 mmole) i trifosgenu (1,3 g, 4,4 mmola). Mieszaninę pozostawiono na 12 godzin do powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej, po czym dodano kwas solny (0,5N, 100 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym i przesączono, a następnie zatężono i otrzymano izocyjanian (t-butoksykarbonyloamino)benzylu (2,7 g, wydajność 84%) w postaci brunatnej substancji stałej.

‘H-NMR (300 MHz, CDC1₃): 7,29 (dd AB, 4H), 6,55 (br s, 1H), 4,40 (s, 2H), 1,55 (s, 9H).

Sposób B

Chlorek t-butylo-l-piperazynokarboksylano-4-karbonylu

1-Piperazynokarboksylan t-butylu (321 mg, 1,72 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (3,0 ml), po czym do roztworu dodano pirydyny (210 μΐ, 2,6 mmola) i uzyskany roztwór ochłodzono do 0°C. Po dodaniu trifosgenu (255 mg, 0,86 mmola) mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 30 minut do ogrzania się do temperatury pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano kwasu solnego (0,lN, 5,0 ml) i dichlorometanu (5 ml), po czym warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu i zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymno chlorek t-butylo-l-piperazynokarboksylano-4-karbonylu (416 mg, 97%) w postaci żółtej, krystalicznej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 3,70 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 3,50 (m, 4H), 1,50 (s, 9H).

Bis-trifiuorooctan l-[ (4-guanidynobenzylo)karbamoilo]-piperazyny

Bis-trifiuorooctan 4-guanidynobenzyloaminy (380 mg, 0,97 mmola) rozpuszczono w DMF (2,0 ml), po czym do roztworu dodano diizopropyloetyloaminy (700 μΐ, 4,0 mmola). Po dodaniu chlorku t-butylo-l-piperazynylokarboksylano-4-karbamoilu (241 mg, 0,97 mmola) mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Uzyskany roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w wodzie (5 ml). Po przesączeniu uzyskanej zawiesiny, a następnie zalkalizowaniu wodnego roztworu nadmiarem stałego węglanu potasu otrzymano nierozpuszczalny żółty olej, który oddzielono od fazy wodnej przez dekantację. Po wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie potraktowaniu kwasem trifiuorooctowym (5 ml) przez 15 minut otrzymano po zatężeniu surowy bis-trifiuorooctan w postaci pomarańczowego oleju. Sól rozpuszczono w wodzie (5 ml) i materiał oczyszczano metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, a następnie zliofilizowano i otrzymano bis-trifiuorooctan l-[ (4-guanidynobenzylo)karbamoilo]piperazyny w postaci żółtej, bezpostaciowej substancji stałej.

^-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 10,15 (s, 1H), 9,10 (br s, 2H), 7,65 (s, 4H), 7,40 (t, 1H), 7,25 (dd AB, 4H), 4,25 (d, 2H), 3,55 (m, 4H), 3,10 (s, 4H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C13H20N6O obliczono: MH⁺ 277,4; MH2⁺²/2: 139,2. Stwierdzono: MH⁺ 277,4; MH2⁺²/2 139,3.

Bis[4-((4-guanidynobenzylo)karbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 6)

Bis-trifiuorooctan 1- [ (4-guanidynobenzylo)karbamoilo]-piperazyny (138 mg, 0,27 mmola) rozpuszczono w DMF (1,5 ml), po czym do roztworu dodano diizopropyloetyloaminy (71,5 pL, 0,4 mmola) i bis-chloromrówczanu cis-l,5-cyklooktanodiolu (36,0 mg, 0,14 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Bezpostaciową pozostałość rozpuszczono w wodzie (5 ml) i produkt oczyszczono drogą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, a następnie zliofilizowano. Dotrzymano bis[4-((4-guanidynobenzylo)karbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 6) w postaci szarawej substancji stałej.

183 552

Sposób C

Chlorowodorek N-t-butylo-N'-4-aminobenzylomocznika

4-Aminobenzyloaminę (50,34 g, 0,412 mmola) w dichlorometanie (200 ml) umieszczono w 1-litrowej tój szyjnej kolbie okrągłodennej wyposażonej w mieszadło mechaniczne, po czym roztwór ochłodzono 0°C. Do roztworu wkroplono w ciągu 30 minut diwęglan di-tbutylu (89,9 g, 0,412 mola) w dichlorometanie (200 ml) i powstałą zawiesinę mieszano w 0°C przez kolejne 2 godziny uzyskując prawie jednorodny roztwór. Następnie roztwór w dichlorometanie przemyto wodnym roztworem wodorotlenku sodowego (1,0 M, 500 ml) oraz wodą (500 ml) i fazę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu, a następnie zatężemu pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano N-tbutylokarbamoilobenzuloaminę w postaci żółtego oleju. Anilinę rozpuszczono w mieszaninie eter etylowy :metanol (2:1, 225 ml) i roztwór ochłodzono do 0°C. Po zakwaszeniu roztworem chlorowodoru w dioksanie (4,0 M, 115 ml, 0,412 mola), a następnie dodaniu eteru etylowego (200 ml) wytrącił się gęsty, blado żółty osad. Po przesączeniu, a następnie przemyciu eterem etylowym (500 ml) i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano chlorowodorek Nt-butylo-N'-4-aminobenzylomocznika (100,23 g, wydajność 94%) w postaci blado żółtej substancji stałej, którą użyto bez dalszego oczyszczania.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-dć): 10,40-10,20 (br s, 3H), 7,40 (t, 1H), 7,30 (s, 4H), 4,10 (d, 2H), 1,40 (s, 9H).

N-t-butylo-N-4-guanidynobenzylomocznik

Cyjanamid (100 g, 2,4 mola) umieszczono w 500-ml kolbie okrągłodennej i ogrzano do 60-65°Ć aż do całkowitego stopienia materiału. Następnie bezpośrednio do ciekłego cyjanamidu dodano chlorowodorku N-t-butylo-N'-4-aminobenzylomocznika (25,3 g, 97,8 mmola) i uzyskany żółty roztwór mieszano przez 2 godziny w 60-65°C. Do roztworu dodano wody (100 ml) i następnie ochłodzono go do temperatury pokojowej. Wodny roztwór przemyto eterem etylowym (1 litr), po czym fazę organiczną wyekstrahowano wodą (2 x 100 ml). Połączone warstwy wodne przemyto eterem etylowym (500 ml), po czym roztwór wodny ochłodzono w łaźni z lodem i wodą i zalkalizowano wodnym roztworem wodorotlenku sodowego (10M, 100 ml). Uzyskany nierozpuszczalny olej powoli wykrystalizował, po czym produkt odsączono. Produkt ten przemyto wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano N-tbutylo-N-4-guanidynobenzylomocznik (18,3 g, 70,8%) w postaci bezbarwnej, krystalicznej substancj i stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 9,70 (s, 1H), 7,42 (t, 1H), 7,40 (s, 4H), 7,25 (d, 2H), 7,15 (d, 2H), 4,10 (d, 2H), 1,40 (s, 9H).

4-Chlorokarbonylo-l -piperazynokarboksylan t-butylu

Trifosgen (25 g, 84,2 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (200 ml) i uzyskany roztwór ochłodzono do 0°C. Do roztworu trifosgenu wkroplono roztwór 1piperazynokarboksylanu t-butylu (40 g, 214,8 mmola) i pirydyny (35 ml, 432,7 mmola) w dichlorometanie (100 ml) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 30 minut do ogrzania się do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano dodając kwasu solnego (0,1 N, 200 ml) i fazę wodną przemyto dichlorometanem (50 ml), a połączone warstwy organiczne wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym. Po przesączeniu i wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 4-chlorokarbonylo-l-piperazynokarboksylan t-butylu (45,6 g, 85%) w postaci żółtej substancji stałej, którą można zastosować bez dalszego oczyszczania. Substancję tę można dalej oczyszczać drogą krystalizacji z mieszaniny eter etylowy/heksan.

¹ H-NMR (300 MHz, CDC1₃): 3,70 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 3,50 (m, 4H), 1,50 (s, 9H).

Trifiuorooctan 4-guanidynobenzylokarbamoilo-l-piperazynokarboksylanu t-butylu

N-t-butylo-N-4-guanidynobenzylomocznik (41,77 g, 0,158 mola) poddano działaniu kwasu trifiuorooctowego (100 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Uzyskaną prawie bezbarwną,ciecz zątężono pod zmniejszonym ciśnieniem w 45°C, po czym roztarto z eterem etylowym (3 x 400 ml) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując bezbarwną pianę. Do pozostałości dodano metanolu (200 ml), a następnie diizopropyloetyloaminy (55 ml, 0,32 mola, ilość obliczona na podstawie oczekiwanego nadmiaru TFA) i roztwór ochłodzono do 0°C. Do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorku t-butylo-1

183 552 piperazyno-karboksylano-4-karbamoilu (39,3 g, 0,158 mola) w dichlorome-tanie (120 ml), a następnie dodatkową ilość diizopropyloetyloaminy (30 ml). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej, po czym mieszano ją przez 12 godzin. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano pomarańczowy olej, do którego dodano wody (200 ml), a wytrącony gęsty osąd odsączono. Surową sól guanidyny z TFA poddano rekrystalizacji z mieszaniny acetonitryl/eter i otrzymano trifiuorooctan 4-guanidynobenzylokarbamoilo-l-piperazyno-karboksylanu t-butylu (62,0 g, 80%) w postaci blado żółtej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 10,15 (s, 1H), 9,10 (br s, 2H), 7,65 (s, 4H), 7,40 (t, 1H), 7,25 (dd AB, 4H), 4,25 (d, 2H), 3,55 (m, 4H), 3,10 (s, 4H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C13H20N6O obliczono: MH⁺ 277,4; MH2/2: 139,2. Stwierdzono: MH⁺ 277,4; MH2⁺²/2; 139,3.

Bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 6)

Trifluorooctan 4-guanidynobenzylokarbamoilo-l-piperazynokarboksylanu t-butylu (50 g, 0,102 mola) poddano działaniu kwasu trifluorooctowego (50 ml) w temperaturze pokojowej przez 15 minut i uzyskano jednorodny roztwór. Większość TFA usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano bezpostaciową pozostałość rozpuszczalną w wodzie. Substancję tę rozpuszczono w wodzie (100 ml) i pH roztworu doprowadzono do 7,0-7,5 ostrożnie dodając 10M wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Do powyższego wodnego roztworu dodano bis-chloromrówczanu cis-1,5-cyklooktylenu (13,5 g, 0,05 mola) w THF (75 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej. pH mieszaniny śledzono z użyciem standardowego pehametru laboratoryjnego doprowadzając je stale do 7,0-8,0, dodając w razie potrzeby 10M wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Po ustabilizowaniu się pH (po około 1 godzinie) metodą analitycznej HPLC z odwróconymi fazami stwierdzono, że reakcja przebiegła do końca. Do prawie jednorodnego roztworu dodano eteru etylowego (50 ml) i dwufazową mieszaninę zalkalizowano nadmiarem wodnego roztworu wodorotlenku sodowego otrzymując białą zawiesinę wolnej zasady aryloguanidynowej. Zawiesinę tą zatężono w wyparce rotacyjnej w celu usunięcia większości TFA, po czym drobny osad odsączono. Substancję stałą o pastowatej konsystencji przemyło raz wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu (31 g, 81%) w postaci białej substancji stałej (czystość ponad 97%, oznaczona metodą HPLC). Wolną zasadę rozpuszczono w kwasie solnym i przesączono dla usunięcia śladów nierozpuszczalnej pozostałości, i po liofilizacji otrzymano chlorowodorek bis[4-(4guanidynobenzylokarbamoilo) -1 -piperazynokarboksylanu] cis-1,5-cyklooktylenu.

Ή-NMR (chlorowodorek) (300 MHz, DMSO-dó): 9,70 (s, 2H), 7,40 (s, 8H), 7,20 (dd AB, 8H), 7,15 (t, 2H), 4,65 (m, 2H), 4,20 (d, 4H), 3,30 (s, 16H), 1,80-1,40 (m, 12H).

LRMS z elektrorozpylaniem (chlorowodorek): dla C36H52N12O6 obliczono: MH⁺ 749,9; MH2⁺²/2: 375,5. Stwierdzono: MH⁺ 749,9; MH2⁺²/2: 375,3.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 3, sposób A, oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące związki według wynalazku:

bis {4-(2-( 1 -amidynopiperyd-4-ylo)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu (związek 7);

’Η-NMR (300 MHz, DMSO-de): 7,4 (s, 8H), 6,6 (s, 2H), 4,6 (s, 2H), 3,8 (d, 4H), 3,6 (s, 8H), 3,3 (s, 14H), 3,0 (m, 20H), 1,0 (m, 4H);

bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylokarbonylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu (związek 8);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H62N6O6 obliczono: MH⁺ 647,9. Stwierdzono: MH⁺ 648,1;

bis[4-(4-guanidynofenyloacetylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1 ;5-cyklooktylenu (związek 9); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H50N10O6 obliczono: MH⁺ 718,9. Stwierdzono: MH⁺ 717,3;

183 552 bis{4-[3-(4-guanidynofenylo)propionylo]-l-piperazyno-karboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 10); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H54N10O6 obliczono: MH 746,9. Stwierdzono: MH⁺ 745,5;

bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-(perhydro-7H-l,4diazepino)karboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 11);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla CasHósNsOg obliczono: MH⁺ 734; ΜΗ₂ ⁺ /2: 367,5. Stwierdzono: MH2⁺²/2: 367,7;

bis[4-(4-ammometylobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 12); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H52N8O6 obliczono: MH⁺ 693,9. Stwierdzono: MH 693,5;

bis{4-[4-(2-aminoetylo)benzylokarbamoilo]-l-piperazyno-karboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu (związek 13);

^]H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 7,34, 7,15 (d, 8H), 4,64 (bt, 4H), 4,15 (m, 2H), 3,92 (d, 4H), 3,54 (m, 4H), 3,25 (appd, 16H), 1,73-1,47 (m, 12H); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CjsHsćNsOe obliczono: MH⁺ 721. Stwierdzono: MH 721;

bis[4-(4-aminometylobicyklo[2.2.2]okt-l-ylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 14);

'H-NMR (300 MHz, DMSO-iL): 4,18 (m, 2H), 3,40 (m, 4H), 3,21 (d, 16H), 2,8 (d, 4H), 1,75-1,39 (m, 36H);

bis {4-[4-(2-aminoetylo)fenylo acetyle]-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 15);

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 7,13, 6,93 (d, 8H), 5,8 (d, 4H), 3,68 (m, 4H), 3,56, 3,39 (d, 16H), 4,0 (m, 2H), 2,69 (t, 4H), 2,69 (t, 4H), 1,82-1,50 (m, 12H);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H54N6O6 obliczono: MH⁺ 691. Stwierdzono: MH⁺ 691;

bis {4-[4-(2-aminoetylo)benzoilo]-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 16); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CjćHsoNćOó obliczono: MH⁺ 662,8. Stwierdzono: MH⁺ 664;

bis {4-[4-(l-ammoprop-2-ylo)benzoilo]-1 -piperazynokarboksylan] cis-1, 5-cyklooktylenu (związek 17); ‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 7,33 (s, 8H), 4,6 (m, 2H), 3,35-3,06 (m, 18H), 2,97 (m, 4H), 1,73-1,5 (m, 12H), 1,22 (d, 8H), 1,82-1,50 (m, 12H) ; LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H54N6O6 obliczono: MH⁺ 691. Stwierdzono: MH⁺ 692;

bis{4-[4-(2-aminoetylo)piperyd-1 -ylokarbonylo]-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 18); *H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 3,62 (d, 8H), 3,42, 3,19 (s, 16H), 2,97 (t, 4H), 2,82 (t, 4H), 1,77-1,55 (m, 24H), 1,13 (m 4H); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C34H60N8O6 obliczono: MH⁺ 676,9. Stwierdzono: Mn 677;

bis{4-[trans-4- (2-aminoetylo) cykloheksyloacetylo] -1-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 19); ¹ H-NMR (300 MHz, DMSO-d_ó): 3,52 (m, 16H), 2,97 (t, 4H), 2,39 (d, 4H), 1,81-1,5 (m, 34H), 1,32 (m, 6H), 0,99 (m, 2H) ; LRMS z elektrorozpylaniem: dla CssHwNóOg obliczono: MH 703. Stwierdzono: MH⁺ 703;

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu trans-1,4cykloheksanodikarboksylowego (związek 20); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C32H44N12O4 obliczono: Mlf 688,8. Stwierdzono: MH⁺ 689; oraz bis {4-[4-(2-aminoetylo)cykloheksylokarbonylo]-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 21);

'H-NMR (300 MHz, DMSO-de): 3,56, 3,49 (d, 16H), 2,96 (t, 4H), 1,77 (m, 20H), 1,51 (m, 6H), 1,33 (m, 6H), 1,01 (m, 4H) ; LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H62N6O6 obliczono: MIL 674,9. Stwierdzono: MH⁺ 675.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 3, sposób B, oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące związki według wynalazku:

bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminomety-lo]-1 -piperydynokarboksylan] trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 22); 'H-NMR (300 MHz, DMSO-dg): 8,0 (s, 4H), 6,5 (s, 2H), 4,5 (m, 8H), 3,9 (m, 4H), 3,8 (m, 2H), 2,8 (s, 2H), 2,6 (m, 16H), 1,6 (m, 16H), 1,0 (m, 10H);

183 552 bis[4-(4-amidynofenyloacetylo)-1 -piperazynokarboksylan]cis-1,5-cyklooktylenu (związek 23); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C3₄H₄8N₈O₆ obliczono: MH⁺ 688,8. Stwierdzono: MH⁺ 689,6;

bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloamino]butyloaminokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu (związek 24);

'H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 8,1 (s, 6H), 7,0 (s, 2H), 4,6 (s, 2H), 4,2 (m, 12H), 3,9 (d, 4H), 2,9 (m, 8H), 2,6 (m, 8H), 1,6 (m, 20H), 1,3 (s, 6H), 1,0 (m, 4H) ; LRMS z elektrorozpylaniem: dla CsiH^NsOg obliczono: MH⁺ 652,9. Stwierdzono: MH⁺ 653,7;

bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminometylo]-1 -piperydynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu (związek 25);

'H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 8,1 (s, 6H), 6,5 (s, 2H), 4,6 (s, 4H), 4,0 (m, 24H), 2,9 (d, 4H), 2,6 (m, 12H), 1,6 (m, 20H), 0,9 (m, 14H); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C3₄H64N80g obliczono: MH⁺ 705. Stwierdzono: MH⁺ 706,6;

bis[4-(l-amidynopiperyd-4-ylometylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu (związek 26); *H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) : 7,2 (s, 8H), 6,6 (m, 2H), 4,6 (m, 4H), 3,8 (d, 6H), 4,3 (m, 31H), 2,9 (m, 8H), 1,7 (m, 16H), 1,1 (m, 4H);

bis[4-(4-amidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 27);

’Η-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 9,4 (s, 4H), 7,8 (d, 4H), 7,6 (d, 4H), 7,4 (m, 2H), 4,8 (m, 2H), 4,4 (m, 4H), 3,4 (m, 40H), 1,8 (m, 10H);

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] trans-2,6-(4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylenu) (związek 28); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C34H46N12O8 obliczono:

MH⁺751,8; MH2⁺²/2: 376,4. Stwierdzono: MH⁺ 751,2; MH2⁺²/2: 376,4;

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] trans-2,3-bicyklo-[2.2.2]okt-5-enylonedimetylenu (związek 29); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H5₂Ni₂O8 obliczono: MH⁺ 773,9; MH₂ ⁺²/2: 387,5. Stwierdzono: MH⁺ 773,2;

MH₂+²/2: 387,2;

bisl4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-l,5-tetracyklo-[3.3.1.r^,7]decylenodimetylenu (związek 30); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C4oH58Ni204 obliczono: MH⁺ 768; MH2⁺/2: 384,5. Stwierdzono: MH⁺ 769,4; MH₂ ⁺²/2: 385,4; oraz bis[4-(4-amidynobenzoiloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 31);

‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 9,43 (s, 2H), 9,16 (s, 2H), 8,77 (t, 1H), 8,00 (d, 2H), 7,86 (d, 2H), 4,61 (br s, 1H), 3,91 (br d, 2H), 3,14 (br s, 2H), 2,69 (br s, 2H), 1,79-1,54 (m, 8H), 1,51-1,42 (m, 1H), 0,99 (q, 2H); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H54N8O6 obliczono: MH⁺ 716,9; MH2⁺²/2: 358,5. Stwierdzono: MH⁺ 717,5; MH2+²/2: 359,5 bis[4-(4-amidynopiperyd-l-ylokarbonyloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis1,5-cyklooktylenu (związek 32);

^lH-NMR (300 MHz, DMSO-dć) : 8,8 (d, 4H), 6,57 (s, 1H), 4,61 (s, 1H), 4,06 (d, 2H), 3,9 (d, 2H), 2,84 (br s, 2H), 2,73-2,5 (m, 4H), 1,77-1,4 (m, 10 H), 0,89 (q, 2H); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CjeHóóNioOe obliczono: MH⁺ 732,9; MH₂ ⁺²/2:

366,9. Stwierdzono: MH⁺ 731,6 MH₂ ⁺²/2: 366,5; oraz bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid) kwasu cis-1,5-tetracyklo[3.3.1.1^3,7]-dekano-dioctowego (związek 33): LRMS z elektrorozpylaniem: dla C4oH5sNi₂06 obliczono: MH⁺ 801,9. Stwierdzono: Mn 802,1;

bis [4- (4-guanidynobenzylokarbamoilo) -1-piperazynokarboksyamid] kwasu 1,2-cykloheksanodikarboksylowego (związek 34);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C3₄H₄8Ni₂O₄ obliczono: MH₂ ⁺²/2: 345,7 Stwierdzono: MH₂ ⁺²/2: 345,3;

bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] 1,4-bicyklo[2.2.2]-oktylenodimetylenu (związek 35);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C₃₈H5₄Ni₂O₆ obliczono: MH₂ ⁺²/2 388,3 Stwierdzono: MH₂ ⁺²/2 388,3;

183 552 bis[4-(4-guanidynofenylokarbonyloaminometylo)-l -piperydynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 36); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C38H54Nio06 obliczono: MH₂ ⁺²/2:374,5 Stwierdzono: MH₂ ⁺²/2: 374,6; oraz bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 37); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C3₆H₅₂N|₂O6 obliczono: MH₂ ⁺ /2: 375,4 Stwierdzono: MH₂ ⁺²/2: 375,1.

Przykład 4

Bis[4-((trans-4-aminometylocykloheksylenometyleno)karbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 38)

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie związku według wynalazku, w którym Z oznacza grupę aminową? X¹ oznacza X⁶-X⁷-X⁸, gdzie X⁶ oznacza metylen, X⁷ oznacza trans-1,4-cykloheksylen, X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza 1,3-piperazynylen, X⁴ oznacza C(O)O-, a Yoznacza cis-l,5-cyklooktylen.

Chlorowodorek trans-4-(aminometylo)cykloheksanometanolu

1,0 M roztwór borowodoru w tetrahydrofuranie (250 ml, 260 mmoli) powoli wkroplono do zawiesiny kwasu trans-4-(aminometylo)cykloheksanokarboksylowego (10,0 g, 64,0 mmola) w tetrahydrofuranie (250 ml). Obserwowano wywiązywanie się gazu. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 14 godzin. Uzyskany roztwór ochłodzono do 0°C i ostrożnie wkroplono do niego IN roztwór kwasu solnego w metanolu (250 ml). Obserwowano wywiązywanie się gazu. Uzyskaną białą zawiesinę mieszano przez 1 godzinę w 23°C, po czym zatężono. Do pozostałości dodano metanolu i zawiesinę zatężono. Procedurę tą powtórzono dwukrotnie i otrzymano chlorowodorek trans4-(aminometylo)cykloheksanometanolu

4,56 (br, 1H),3,82 (d, 2H), 2,94 (t, 2H), 2,48 (s, 3H), 1,74 (d, 4H), 1,64 (m, 2H), 1,48 (s, 9H), 0,91 (t, 4H)

Azydek N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometylu

Azydek sodowy (4,7 g, 70,0 mmola) dodano do roztworu tosylanu N-tbutoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometylu (5,73 g, 14,0 mmola) w DMF (50 ml) zawierającego sita 4 χ 10'¹⁰ m i uzyskaną zawiesinę mieszano w 23°C przez 190 godzin, po czym ją zatężono. Uzyskaną pozostałość zmieszano z dichlorometanem i wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono. Azydek N-tbutoksykarbonylo-trans-4- (aminometylo)-cykloheksanometylu (3,22 g, wydajność 86%) otrzymano w postaci żółtego oleju.

Ή-NMR (300 MHz, CDC1₃): 3,14 (d, 2H), 2,99 (t, 2H), 1,82 (t, 4H), 1,51 (m, 2H), 1,48 (s, 9H), 0,99 (m, 4H).

Chlorowodorek N-t-butoksykarbonylo-trans-1,4-cykloheksanobis(metyloaminy)

Etanol (40 ml) dodano do azydku N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo) cykloheksanometylu (1,79 g, 6,67 mmola) i 5% palladu na węglu (270 mg, 0,15% wagowych) w atmosferze azotu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze wodoru pod ciśnieniem atmosferycznym przez 6 godzin w 23 °C. Czarną zawiesinę przesączono, po czym przesącz zatężono i uzyskano N-t-butoksykarbonylo-trans-l,4-cykloheksanobis(metyloaminę) w postaci żółtego oleju. Surową aminę rozpuszczono w metanolu (2,0 ml), po czym dodano roztworu chlorowodoru w dioksanie (4,0 M, 2,0 ml, 8,0 mmola) i eteru etylowego (25 ml). Wytrącony osad odsączono i otrzymano chlorowodorek N-t-butoksykarbonylo-trans-1,4-cykloheksanobisfmetyloaminy) (1,42 g, wydajność 76%) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

Ή-NMR (300 MHz, D₂O): 3/00-2,80 (m, 4H), 1,90-1,70 (m, (10,6 g, wydajność 93%) w postaci białej substancji stałej.

Ή-NMR (300 MHz, CD3OD) : 3,38 (d, 2H), 2,71 (d, 2H), 1,88 (d, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,01 (m, 2H)

N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometanol

Węglan sodowy (1,33 g, 12,4 mmola) dodano do roztworu chlorowodorku trans-4(aminometylo)cykloheksanometanolu (1,5 g, 8,3 mmola) w mieszaninie 1:1 dioksan:woda (40 ml). Do mieszaniny reakcyjnej dodano diwęglanu di-t-butylu (2,0 g, 9,13 mmola) w 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, po czym zmiesza

183 552 no z 10% metanolem w dichlorometanie i wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym, i zatężono. N-t-butoksykarbonylotrans-4-(aminometylo)cykloheksanometanol (1,97 g, wydajność 98%) otrzymano w postaci białej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃): 4,58 (br, 1H), 3,44 (d, 2H), 2,95 (t, 2H), 1,81 (m, 4H), 1,54 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 0,92 (t, 4H)

Tosylan N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometylu

Chlorek p-toluenosulfonylu (3,3 g, 17,0 mmola) dodano do roztworu N-tbutoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometanolu (3,5 g, 14,0 mmola) w pirydynie (20 ml) zawierającego sita 4 χ 10'¹⁰ m i mieszaninę reakcyjną mieszano w 23°C przez 23,5 godziny. Uzyskaną białą zawiesinę zatężono, a pozostałość zmieszano z dichlorometanem i 0,05N kwasem solnym. Warstwę organiczną wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i zatężono. Surowy tosylan N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometylu (5,73 g) otrzymano w postaci żółtej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 7,78 (d, 2H), 7,34 (d, 2H), 4H), 1,70-1,50 (m, 2H), 1,40 (s,9H), 1,10-0,90 (m,4H).

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C13H27N2O2 obliczono: MH⁺ 243. Stwierdzono: MH⁺ 243.

N-t-Butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksano-metyloizocyjanian

Chlorowodorek N-t-butoksykarbonylo-trans-l,4-cykloheksanobis(metyloaminy) (1,45 g, 5,2 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (25 ml), po czym do roztworu dodano pirydyny (1,75 ml, 21 mmoli) i mieszaninę ochłodzono do Ó°Ć. Następnie do powyższego roztworu dodano trifosgenu (617 mg, 2,1 mmola) i mieszaninę pozostawiono na 2 godziny do powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej. Roztwór organiczny przemyto 0,1 N kwasem solnym (2 x 25 ml), a następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym i przesączono. Po zatężeniu otrzymano N-t-butoksykarbonylo-trans-4-(aminometylo)cykloheksanometyloizocyjanian (1,38 g, wydajność 99%) w postaci żółtej, krystalicznej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 4,60 (br s, 1H), 3,15 (d, 2H), 2,95 (t, 2H), 1,85-1,75 (m, 4H), 1,50-1,40 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,05-0,90 (m, 4H).

Bis[4- ((trans-4-t-butoksykarbonyloaminometylocykloheksy-lenometyleno)karbamo-ilo)-1-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu

Bis-chlorowodorek bis(l-piperazynokarboksylanu) cis-l,5-cyklooktylenu (229,7 mg, 0,53 mmola) i diizopropyloetyloaminę (200 μΐ, 2,3 mmola) rozpuszczono w DMF (4,0 ml) i mieszaninę ochłodzono do 0°C. Następnie dodano N-t-butoksykarbonylo trans-4(aminometylo)cykloheksanometyloizocyjanianu (285 mg, 1,06 mmola) i mieszaninę pozostawiono na 12 godzin do ogrzania się do temperatury pokojowej. Mieszaninę zatężono, do pozostałości dodano dichlorometanu (25 ml), po czym roztwór organiczny przemyto 0,1 N kwasem solnym (2 x 25 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym z wytworzeniem surowego produktu. Po przesączeniu i zatężeniu otrzymano bis [4-((trans-4-tbutoksykarbonyloaminometylocykloheksylenometyleno)karbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (534 mg, wydajność 56%) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 4,80 (m, 2H), 4,70 (t, 2H), 4,65 (t, 2H), 3,45 (m, 8H), 3,35 (m, 8H), 3,10 (t, 4H), 2,95 (t, 4H), 1,95-1,50 (m, 24H), 1,45 (s, 18H), 1,00-0,90 (m, 8H).

Bis[4-((trans-4-aminometylocykloheksylenometyleno)karbamoilo) -1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 38)

Bis[4- ( (trans-4-t-butoksykarbonyloaminometylocykloheksy-lenometyleno)karbamoilo)-1-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (534 mg, 0,59 mmola) zadano kwasem trifluorooctowym (5 ml) i mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując po 15 minutach czerwony olej. Surowy produkt rozprowadzono w wodzie (10 ml) i wodną zawiesinę przesączono przez bibułę filtracyjną Millipore typu GV (0,22 pm) uzyskując żółty roztwór. Po oczyszczaniu drogą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami i liofilizacji otrzymano bis-chlorowodorek bis[4-( (trans-4-aminometylocykloheksylenometyleno)karbamoilo)-1 -pi

183 552 perazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 38) w postaci prawie bezbarwnej substancji stałej.

‘H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆): 8,00 (br s, 6H), 6,60 (m, 2H), 4,65 (m, 2H), 3,40 (s, 8H), 3,30 (s, 8H), 2,85 (m, 4H), 2,60 (t, 4H), 1,80-1,30 (m, 24H), 0,90-0,70 (m, 8H)

LRMS z elektrorozpylaniem: dla CjćHeĄNgÓfi obliczono: MH⁺ 706,0; MH⁺ /2 353,5 Stwierdzono: MH⁺ 705,7; MH2⁺²/2:353,3.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 4 oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące związki według wynalazku:

bis {4-[2-(4-amidynofenylo)etylokarbamoilo]-l -piperazyno-karboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu (związek 39) 'H-NMR (300 MHz, DMSO-cU): 9,3(s, 4H), 9,0(s, 4H), 7,7(d, 4H), 7,4(d, 4H), 6,7 (t, 2H), 4,6 (m, 2H), 3,8 (m, 52H), 2,8 (t, 4H), 1,7 (m, 10 H) ;

bis[4-(5-aminopentylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 40); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CsoHsóNgOe obliczono: MH⁺ 625,8. Stwierdzono: MH⁺ 625,7;

bis[4-(6-aminoheksylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan) cis-l,5-cyklooktylenu (związek 41); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C32H60N8O6 obliczono: MH⁺ 653,9. Stwierdzono: MH⁺ 654,2;

bis[4-(5-amino-2-pentenylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (związek 42); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C30H52N8O6 obliczono: MH⁺ 621,8. Stwierdzono: MH⁺ 621,5;

bis[4-(4-aminobutylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 43); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C28H52N8O6 obliczono: MH⁺ 597,8. Stwierdzono: MH⁺ 596,9;

bis {4-[2-(2-aminoetoksy)etylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu (związek 44); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C28H52N8O6 obliczono: MH⁺ 628,8. Stwierdzono: MH⁺ 628,5;

bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksyloaminoformyloksy)-l-piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 45);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H62N6O8 obliczono: MH⁺ 706,9. Stwierdzono: MH⁺ 707,7 bis[N-2-(trans-4-aminometylocykloheksyloaminofbrmyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 46); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C32H58N6O8 obliczono: MH⁺ 654,9. Stwierdzono: MH⁺ 655;

bis[N-2-(trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminofbrmyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu (związek 47); LRMS z elektrorozpylaniem: dla C34H62N6O8 obliczono: MH⁺ 683,9. Stwierdzono: MH⁺ 683,5;

bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu (związek 48); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CsćH^NsOg obliczono: MH⁺ 706. Stwierdzono: MH^ 704,6; oraz bis [4- (trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminoformyloksy)-l-piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (związek 49); LRMS z elektrorozpylaniem: dla CssH^NćOs obliczono: MH⁺ 736. Stwierdzono: MH⁺ 735,6.

Przykład 5

4-(4-Guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan cis-5-[4-(5-aminopentylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformylo-ksy]cyklooktylu (związek 50)

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie niesymetrycznego związku według wynalazku, w którym R² oznacza 4-(4-aminobutylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksyl, R³ oznacza 4-(4-aminobutylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksyl, a Y oznacza cis-1,5cyklooktylen.

Bischloromrówczan cis-l,5-cyklooktylenodiolu (1,91 g, 7,1 mmola) rozpuszczono w dichlorometanie (20 ml) i do roztworu wkroplono roztwór 1-piperazynokarboksylanu t-butylu (1,3 g, 7,1 mmola) i diizopropyloetyloaminę (1,3 ml, 7,1 mmola) w dichlorometanie (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano

183 552 do niej kwasu solnego (0,1 M, 30 ml). Warstwę organiczną oddzielono, wysuszono nad bezwodnym siarczanem amonowym, przesączono i zatężono. Po oczyszczaniu pozostałości drogą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z eluowaniem mieszaniną octan etylu/heksan (1:1) otrzymano 4-t-butoksykarbonylo-l-piperazynokarboksylan cis-5-chloroformyloksycyklooktylu (663,1 mg, 1,6 mmola) w postaci bezbarwnego oleju.

4-(4-Guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan t-butylu (383,7 mg, 1,1 mmola) poddawano działaniu kwasu trifluorooctowego (2 ml) w temperaturze pokojowej aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskano gęsty olej. Olej rozpuszczono w wodzie (10 ml) i wkroplono 5 M wodny roztwór wodorotlenku sodowego aż do uzyskania pH roztworu 7,5-8,0. Do roztworu w trakcie intensywnego mieszania dodano 4-t-butoksykarbonylo-l-piperazynokarboksylanu cis-5-chloroformyloksycyklooktylu (447,7 mg, 1,1 mmola) w THF (3 ml), kontynuując dodawanie 5M roztworu wodorotlenku sodowego dla utrzymania pH 7,5-8,0. Dodano 5 M roztwór wodorotlenku sodowego dla doprowadzenia pH roztworu do 14, a następnie eteru etylowego (1 ml). Mieszaninę odstawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut i uzyskano białą substancję stałą. Osad odsączono, przemyto wodą ochłodzoną w lodzie (1 x), acetonitrylem (1 x) i eterem etylowym (1 x) i wysuszono. Otrzymano 4-guanidynobenzylokarbamoilo-l-piperazynokarboksylan cis-5-(4-t-butoksykarbonylopiperazyn-l-ylo-formyloksy)cyklooktylu (527,2 mg, 0,85 mmola) w postaci białej substancji stałej.

4-Guanidynobenzylokarbamoilo-1 -piperazynokarboksylan cis-5-(4-t-butoksykarbonylopiperazyn-l-yloformyloksy)cyklooktylu (129 mg, 0,196 mmola) poddawano działaniu kwasu trifluorooctowego (1 ml) aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i uzyskano bezbarwny olej. Olej rozpuszczono w N,Ndimetyloformamidzie (2 ml), po czym dodano diizopropyloetyloaminy (340 μΐ, 2 mmole). Do roztworu dodano izocyjanianu 5-(t-butoksykarbonylo)aminopentylu (44 mg, 0,2 mmola) w N, N-dimetyloformamidzie (500 μΐ) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość połączono z wodą (5 ml) i poddawano działaniu kwasu trifiuorooctowego (2 ml) aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w wodzie (5 ml). Po oczyszczaniu drogą preparatywnej HPLC, a następnie liofilizacji otrzymano 4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokar-boksylan cis-5-[4(5-aminopentylokarbamoilo)piperazyn-l-ylo-formyloksy)cyklooktylu w postaci bezbarwnego oleju.

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C33H54N10O6 obliczono: MH⁺ 687,9. Stwierdzono: MH⁺ 687,6.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 5 lub innymi opisanymi sposobami oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące związki według wynalazku:

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(4-aminobutylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy)cyklooktylu (związek 51);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C32H52N10O6 obliczono:

MH⁺ 673,8. Stwierdzono: MH⁺ 673,8;

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(4-trans-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-piperazyn-l -yloformyloksy)]cyklooktylu (związek 52);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C36H57N10O6 obliczono:

MH⁺726,9. Stwierdzono: MH⁺ 727,3;

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5 - [4-(3 -aminopro-pylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy)cyklooktylu (związek 53);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C31H50N10O6 obliczono:

MH⁺ 659,8. Stwierdzono: MH⁺ 659,2; oraz

4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(6-aminoheksylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy]cyklooktylu (związek 54);

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C34H54N9O6 obliczono: MH⁺ 686,9. Stwierdzono: MH⁺ 686,4.

183 552

Przykład 6

Bis [4-{4- [ 1,2,3-tri(l -acetoksyetoksykarbonylo)guanidyno]benzylokarbamoilo] -1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu

W poniższym przykładzie opisano wytwarzanie pochodnej prolekowej związku według wynalazku, w którym Z oznacza grupę guanidynową X¹ oznacza X⁶-X⁷-X⁸, gdzie X⁶ oznacza wiązanie, X⁸ oznacza metylen, a X⁷ oznacza 1,4-fenylen, X² oznacza -NHC(O)-. X³ oznacza 1,4-piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, Y oznacza cis-1,5-cyklooktylen, a R⁴ oznacza 1acetoksyetoksy-karbonyl.

Bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu (49 mg, 0,065 mmola) zawieszono w N,N-dimetyloformamidzie (2 ml), po czym dodano diizopropyloetyloaminy (50 ml, 0,26 mola) i p-nitrofenylowęglanu ace-toksyetylu (70,4 mg, 0,26 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie (25 ml) i roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodowego (2 x) i 0,1 M kwasem solnym (1 x), wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym z eluowaniem eterem etylowym, a następnie mieszaniną octan etylu/etanol (20:1). Po zatężeniu orzymano bis (4-{4-[l,2,3-tri(l-acetoksyetoksykarbo-nylo)guanidyno]benzylokarbamoilo}-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu (40 mg, 0,031 mmola) w postaci bezbarwnej substancji stałej.

LRMS z elektrorozpylaniem: dla C56H76N12O22 obliczono:

MH⁺ 1269,3. Stwierdzono: MH⁺ 1269,4.

Postępując w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 6 lub innymi opisanymi sposobami oraz stosując różne substancje wyjściowe wytworzono następujące pochodne prolekowe związków według wynalazku:

4-guanidynobenzylokarbamoilo-l-piperazynokarboksylan) cis-5-[4-(5-N-acetyloglicyloaminopentylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy)cyklooktylu]; LRMS z elektrorozpylaniem: dla C37H59N11O8 obliczono: MLT 786,9. Stwierdzono: MH⁺ 786,5; i bis[4- {4-[ 1,2-di( 1 -acetoksyetoksykarbonylo)amidyno]-benzylokarbamoilo} -1 -piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu; LRMS z elektrorozpylaniem: dla C64H92N12O22 obliczono: MH⁺ 1381,7. Stwierdzono: MH⁺ 1403.

183 552

183 552

PC400 (jednostki oddechu)

(50 μ x 3; aerozol 0=2)

FIG. 2

183 552

Związek 6

Oporność właściwa płuc ( 2mg x 3 doustnie; n = 2 )

Czas (godziny)

FIG. 3

183 552

Związek 6 (2mg x 3 doustnie; n = 2)

Linia podstawowa

PC 400 (jednostki oddechu) □ Po antygenie

FIG. 4

183 552

Związek 5 (0,1 mg x 3; n = 2)

Oporność właściwa płuc (% zmian od linia podstawowej)

FIG. 5

183 552

Związek 5 (0,1 mg x 3; n = 2)

PC 400 (jednostki oddechu)

Linia podstawowa

FIG. 6

183 552

Związek 6 Podawanie wstępne (n = 3)

Oporność właściwa płuc

Czas (godziny) (0,5 mg b.i.d. x 3 dni + 0,5 mg 0,5 h przed antygenem)

FIG. 7

183 552

Zu sązek 6 Podawanie wstępne (n - 3)

PC 400 (jednostki oddechu)

(0,5 mg b.i.d. x 3 dni + 0,5 mg 0,5 h przed antygenem)

FIG. 8 $52

Czas (gocizjnyj >50 μ x 3' aerozol n)

FIG. Ί ii wyOg^jncrwUO Rf N „J,. ' TY?. <?

Cena 6.0^ z·

Claims (31)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowe związki cykliczne o ogólnym wzorze [Z-X¹-X²-X³-X⁴-X⁵]₂ y w którym Z oznacza grupę aminową guanidynową lub amidynową Y oznacza cyklo (C4.10) alkilen, 4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylen, bicyklo[2.2.2]oktylen, 2,3-bicyklo[2.2.2]okt5-enylen lub tetracyklo[3.3.1.1^3,7]decylen, X⁷ oznacza (C3.6)alkilen, oksa(C4-io)alldlen lub X⁶-X⁷-X⁸-, gdzie X⁷ oznacza fenylen, cyklo(C3-6)alkilen lub piperydynylen, a X⁶ i X⁸ oznaczają wiązanie lub (C1.3) alkilen, przy czym gdy Z oznacza grupę aminową to wówczas X⁶ ma znaczenie inne niż wiązanie, X² oznacza oznacza -NHC(O) O -C(O)-, -C(O)NH- lub -NH-C(O)-, X⁴ oznacza -C(O)-, -C(O) O - lub -N(RhC(O)O-, gdzie R* oznacza atom wodoru lub (Ci-4)alkil, X³ oznacza (Ćj-s) alkilen lub -Χ^Χ¹-, gdzie X⁹ oznacza wiązanie lub (Ci.e) alkilen, a Χ^ισ oznacza piperazynylen, piperydynylen lub perhydro-7H-diazepinylen, a X⁵ oznacza wiązanie lub (Ci-2)alkilen, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2. 2. Związek według zastrz. 1, w którym X⁴ oznacza grupę -C(O)- lub -C(O)O-.
3. 3. Związek według zastrz. 2, w którym Y oznacza cyklopentylen, cykloheksylen lub cyklooktylen.
4. 4. Związek według zastrz. 1 albo 3, w którym X³ oznacza 1,4-piperazynylen, 1,4piperydylen, l,4-perhydro-7H-l,4-diazepinylen lub X⁹-X¹⁰-, gdzie X⁹ oznacza metylen, a X¹⁰ oznacza 1,4-piperydylen, a X⁴ oznacza -C(O)- lub -C(O)O-; albo X³ oznacza (Ci^jalkilen, a X⁴ oznacza -NHC(O) O - lub -N(CH₃)C(O) O -.
5. 5. Związek według zastrz. 3, w którym X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza cyklooktylen.
6. 6. Związek według zastrz. 5, który stanowi bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, ewentualnie w postaci bischlorowodorku lub chlorowodorku.
7. 7. Związek według zastrz. 5, który stanowi bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan) cis-l,5-cyklooktylenu w postaci bischlorowodorku.
8. 8. Związek według zastrz. 5, który stanowi bis(4-guanidynobenzylokarbamoilometyloaminokarboksylan) cis-l,5-cyklooktylenu w postaci bistrifluorooctanu.
9. 9. Związek według zastrz. 5, który stanowi bis[4-(4-guanidynofenyloacetylo)-l-piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu.
10. 10. Związek według zastrz. 5, wybrany z grupy obejmującej:

    bis {4-[4-(2-aminoetylo)benzylokarbamoilo]-l -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(5-aminopentylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -yłokarbonyloamino]butyloaminokarboksylan} cis1,5-cyklooktylenu, bis[4-(6-aminoheksylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminometylo]-1 -piperydynokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-(perhydro-7H-l,4diazepino)karboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-aminometylobicyklo[2.2.2]okt-l-ylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis[4-(5-amino-2-pentenylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-aminobutylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-[2-(2-aminoetoksy)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cykłooktylenu,

    183 552 bis [4- (trans-4-aminometylocykloheksyloaminoformyloksy) -1-piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis{N-2-(trans-4-aminometylocykloheksyloaminoformyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan} cis-l,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-aminometylobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis{N-2-(trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminoformyloksy)etylo-N-metyloaminokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis [4- (trans-4-aminometylocykloheksylometyloaminoformyloksy)-1 -piperydynokarboksylan] cis-l,5-cyklooktylenu, bis{4-[3-(4-guanidynofenylo)propionylo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[2-(l-amidynopiperyd-4-ylo)etylokarbamoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylokarbonylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu, bis{4-[4-(2-aminoetylo)fenyloacetylo]-l -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-(4-(2-aminoetylo)benzoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-[4-(l-aminoprop-2-ylo)benzoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-[3-(l-amidynopiperyd-4-ylo)propionoilo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[3 -(4-amidynofenylo)propionoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis{4-[4-(2-aminoetylo)piperyd-1 -ylokarbonylo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis {4-[trans-4-(2-aminoetylo)cykloheksylokarbonylo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis{4-[trans-4-(2-aminoetylo)cykloheksyloacetylo]-l-piperazynokarboksylan} cis-1,5cyklooktylenu, bis {4-[2-(4-amidynofenylo)etylokarbamoilo]-1 -piperazynokarboksylan} cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(l-amidynopiperyd-4-yloacetylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(l-amidynopiperyd-4-ylometylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynofenyloacetylo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynobenzoiloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-1,5-cyklooktylenu, bis[4-(4-amidynopiperyd-l-ylokarbonyloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-

    1,5-c yklooktylenu i bis[4-(4-guanidynofenylokarbonyloaminometylo)-1 -piperydynokarboksylan] cis-1,5cyklooktylenu.
11. 11. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza cykloheksylen.
12. 12. Związek według zastrz. 11, który stanowi bis(4-guanidynobenzylokarbamoilo- metyloaminokarboksylan) trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu w postaci bistrifluorooctanu.
13. 13. Związek według zastrz. 11, wybrany z grupy obejmującej :

    bis[4-(trans-4-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan] trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu, bis {4-[4-(aminometylo)piperyd-1 -ylokarbonyloaminometylo]-1 -piperydynokarboksylan} trans-1,4-cykloheksylenodimetylenu i bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,4-cykloheksylenodimetylenu.
14. 14. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza cykloheksylen.
15. 15. Związek według zastrz. 14, wybrany z grupy obejmującej :

    bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu trans-1,4cykloheksanodikarboksylowego i

    183 552 bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksyamid] kwasu 1,2-cykloheksanodikarboksylowego.
16. 16. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza wiązanie, a Y oznacza 4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylen.
17. 17. Związek według zastrz. 16, który stanowi bis [4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)1-piperazynokarboksylan) trans-2,6-(4,8-dioksabicyklo[3.3.0]oktylenu).
18. 18. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza bicyklo[2.2.2]okt-5-enylen.
19. 19. Związek według zastrz. 18, który stanowi bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylan] trans-2,3-bicyklo[2.2.2]okt-5-enylenodimetylenu.
20. 20. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza tetracyklo[3.3.1.1^3,7]decylen.
21. 21. Związek według zastrz. 20, wybrany z grupy obejmującej :

    bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan] cis-1,5-tetracyklo[3.3.1.1^3,7]decylenodimetylenu i bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksyamid] kwasu cis-l,5-tetracyklo[3.3.1. l^3,7]dekanodioctowego.
22. 22. Związek według zastrz. 4, w którym X⁵ oznacza metylen, a Y oznacza bicykle[2.2.2]oktylen.
23. 23. Związek według zastrz. 22, który stanowi bis[4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo) 1 -piperazynokarboksylan] 1,4-bicyklo[2.2.2]oktylenodimetylenu.
24. 24. Nowe związki cykliczne o ogólnym wzorze

    R²Y-R³ w którym R i R niezależnie oznaczają Ζ-Χ -X -X -X -X -, gdzie Z oznacza grupę aminową lub guanidynową; Y oznacza cyklo (Có-i o) alkilen; X¹ oznacza (C3.6) alkilen lub X⁶-X⁷-X-, gdzie X⁷ oznacza fenylen lub cyklo(C3-6)alkilen, X⁶ oznacza wiązanie lub (Ci-2)-alkilen, a X⁸ oznacza wiązanie lub (Ci.2)alkilen, przy czym gdy Z oznaczą grupę aminową, to wówczas X⁶ ma znaczenie inne niż wiązanie; X² oznacza -NHC(O)-, X³ oznacza piperazynylen, X⁴ oznacza -C(O)O-, a X⁵ oznaczą wiązanie, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
25. 25. Związek według zastrz. 24, w którym Y oznaczą cykloheksylen lub cyklooktylen.
26. 26. Związek według zastrz. 25, w którym X³ oznaczą 1,4-piperazynylen.
27. 27. Związek według zastrz. 26, w którym Y oznacza cyklooktylen.
28. 28. Związek według zastrz. 27, który stanowi 4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-lpiperazynokarboksylan cis-5-[4-(4-trans-aminometylocykloheksylometylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy) ] cyklooktylu.
29. 29. Związek według zastrz. 28, wybrany z grupy obejmującej:

    4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(5-aminopentylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy]cyklooktylu,

    4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan cis-5- [4- (4-aminobutylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy] -cyklooktylu,

    4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-l-piperazynokarboksylan cis-5-[4-(3-aminopropylokarbamoilo)piperazyn-l-yloformyloksy]cyklooktylui

    4-(4-guanidynobenzylokarbamoilo)-1 -piperazynokarboksylan cis-5-[4-(6-aminoheksylokarbamoilo)piperazyn-1 -yloformyloksy]cyklooktylu.
30. 30. Środek farmaceutyczny, zwłaszcza do leczenia immunologicznych stanów zapalnych, zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera związek cykliczny o ogólnym wzorze [Z-X'-X²-X³-X⁴-X⁵]₂Y w którym Z oznacza grupę aminową, guanidynową lub amidynową; Y oznacza cyklo (C4-io)alkilen, 4, 8-dioksabicyklo [3. 3. 0] oktylen, bicyklo[2.2.2]oktylen, 2,3

    183 552 bicyklo[2.2.2]okt-5-enylen lub tetracyklo[3.3.1.1³’⁷]decylen, X¹ oznacza (Cs^jalkilen, oksa(C4.6)alkilen lub -X⁶-X⁷-X⁸-, gdzie X⁷ oznacza fenylen, cyklo(C3.6)-alkilen lub piperydynylen, a X⁶ i X⁸ oznaczają wiązanie lub (Ci_₃) alkilen, przy czym gdy Z oznaczą grupę aminową, to wówczas X⁶ ma znaczenie inne niż wiązanie, X² oznacza oznacza -NHC(O)O-, C(O)-, -C(O)NH- lub -NH-C(O)-, X⁴ oznacza -C(O)-, -C(O) O - lub -N(R')C(O)O- gdzie R¹ oznacza atom wodoru lub (Ci-4)alkil, X³ oznacza (Ci-gjalkilen lub -X-X -, gdzie X oznacza wiązanie lub (Cj-ń) alkilen, a X¹⁰ oznacza piperazynylen, piperydynylen lub perhydro-7Hdiazepinylen, a X³ oznacza wiązanie lub (C].2)alkilen, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli.
31. 31. Środek farmaceutyczny według zastrz. 30, znamienny tym, że stanowi roztwór zawierający ten związek cykliczny w stężeniu 0,01 - 30 mg/ml.

    * * *