PL182002B1 - Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PL - Google Patents
Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PLInfo
- Publication number
- PL182002B1 PL182002B1 PL95316962A PL31696295A PL182002B1 PL 182002 B1 PL182002 B1 PL 182002B1 PL 95316962 A PL95316962 A PL 95316962A PL 31696295 A PL31696295 A PL 31696295A PL 182002 B1 PL182002 B1 PL 182002B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- type
- primer
- nucleic acid
- sequences
- Prior art date
Links
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241001533598 Septoria Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 224
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 84
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 70
- 241000736122 Parastagonospora nodorum Species 0.000 claims description 68
- 241001360088 Zymoseptoria tritici Species 0.000 claims description 47
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 47
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 claims description 23
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 229940004975 interceptor Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 abstract description 33
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 25
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 abstract description 19
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 241000682843 Pseudocercosporella Species 0.000 abstract description 7
- 241000131448 Mycosphaerella Species 0.000 abstract description 3
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 164
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 164
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 164
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 86
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 44
- 241001668536 Oculimacula yallundae Species 0.000 description 43
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 42
- 241000087479 Pseudocercospora fijiensis Species 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 241000184297 Pseudocercospora musae Species 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 14
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 description 10
- 241001459558 Monographella nivalis Species 0.000 description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 10
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 101100073099 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) its3 gene Proteins 0.000 description 8
- 241000787361 Parastagonospora avenae Species 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 6
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 6
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241001568757 Elsinoe glycines Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000234295 Musa Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 4
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 4
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000331248 Helgardia aestiva Species 0.000 description 3
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001290235 Ceratobasidium cereale Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000319049 Mycosphaerella musae Species 0.000 description 2
- 241000144610 Oculimacula acuformis Species 0.000 description 2
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 2
- 239000005846 Triadimenol Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- BAZVSMNPJJMILC-UHFFFAOYSA-N triadimenol Chemical compound C1=NC=NN1C(C(O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 BAZVSMNPJJMILC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N 0.000 description 1
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-3-ylmethyl(trimethyl)azanium Chemical compound C1=CC=C2C(C[N+](C)(C)C)=CNC2=C1 IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWXGSYPUMWKTBR-UHFFFAOYSA-N 4-carbazol-9-yl-n,n-bis(4-carbazol-9-ylphenyl)aniline Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2N1C1=CC=C(N(C=2C=CC(=CC=2)N2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC=C32)C=2C=CC(=CC=2)N2C3=CC=CC=C3C3=CC=CC=C32)C=C1 AWXGSYPUMWKTBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241001264169 Dendrobium moniliforme Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000308375 Graminicola Species 0.000 description 1
- 241000593551 Gremmeniella abietina Species 0.000 description 1
- 101000837344 Homo sapiens T-cell leukemia translocation-altered gene protein Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 235000003805 Musa ABB Group Nutrition 0.000 description 1
- 108700010674 N-acetylVal-Nle(7,8)- allatotropin (5-13) Proteins 0.000 description 1
- 240000000905 Nymphoides indica Species 0.000 description 1
- 235000017590 Nymphoides indica Nutrition 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000533218 Phaeosphaeria avenaria f. sp. tritici Species 0.000 description 1
- 235000015266 Plantago major Nutrition 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000228453 Pyrenophora Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100028692 T-cell leukemia translocation-altered gene protein Human genes 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 240000002033 Tacca leontopetaloides Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 241001123668 Verticillium dahliae Species 0.000 description 1
- 241000587986 Zasmidium citri-griseum Species 0.000 description 1
- 241001360087 Zymoseptoria passerinii Species 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N benzoxaprofen Natural products N=1C2=CC(C(C(O)=O)C)=CC=C2OC=1C1=CC=C(Cl)C=C1 MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 244000000037 crop pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- OTYNBGDFCPCPOU-UHFFFAOYSA-N phosphane sulfane Chemical compound S.P[H] OTYNBGDFCPCPOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Izolowana czasteczka DNA, zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowa- nego Przerywnika wybrana z grupy, skladajacej sie z SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2 oraz SEK NR ID: 86. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA, zawierająca sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów.
Wynalazek jest stosowany do wykrywania patogenów grzybów przy zastosowaniu specyficznych dla poszczególnych gatunków starterów, w testach z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy. Użycie starterów umożliwia wykrywanie specyficznych izolatów patogenów grzybowych i śledzenie rozwoju choroby w populacji roślinnej.
Choroby roślin powodują z roku na rok istotne obniżenie plonów, prowadzące w rezultacie do zubożenia ekonomicznego rolników, jak i dodatkowo w wielu częściach świata do niedoborów w dostarczaniu żywności dla lokalnych populacji. Szerokie zastosowanie fungicydów dostarczyło znaczącej ochrony przeciw atakowi patogenów roślinnych. Jednakże pomimo wydatków na fungicydy równowartości 1 biliona $, światowe straty plonów wzrosły do około 10% wartości plonów w 1981 r. (James, 1981; Seed Sci. & Technol. 9: 679-685.
Ostrość procesu niszczącego choroby zależy od agresywności patogenu i odpowiedzi gospodarza. Jednym z celów większości programów hodowlanych jest zwiększenie odporności gospodarza roślinnego na chorobę. Jednak wiele źródeł odporności gospodarza chroni go jedynie
182 002 przed określonymi rodzajami patogenu, ponieważ różne rodzaje patogenów oddziaływująw różny sposób z różnymi odmianami tego samego gatunku rośliny uprawnej. Ponadto, niektóre rodzaje patogenów wykazują wczesne objawy choroby, ale powodują niewielkie zniszczenie plonów. Jones i Clifford (1983; Cereal Diseases, John Wiley) donoszą, że wzrost liczebności formy wirulentnej patogenu w populacji patogenu jest spodziewany w odpowiedzi na wprowadzenie oporności do odmian hodowlanych gospodarza, a zatem jest konieczne śledzenie populacji patogenów. Dodatkowo istnieje szereg udokumentowanych przypadków ewolucji szczepów grzybowych, które są oporne na poszczególne fungicydy. Już w 1981 Fletcher i Wolfe (1981; Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.) zauważyli, że 24% populacji proszkowej pleśni z jęczmienia jarego i 53% z jęczmienia ozimego wykazywało znaczące różnice w odpowiedzi na fungicyd triadimenol oraz, że rozkład tych populacji jest zróżnicowany dla różnych odmian, przy czym najbardziej podatna odmiana daje również najwyższy zasięg niż mniej wrażliwe rodzaje. Podobne zróżnicowanie wrażliwości grzybów na fungicydy udokumentowano dla pleśni pszenicy (również na triadimenol), Botrytis (na benomyl), Pyrenophora (na związek rtęcioorganiczny), Pseudocercosporella (na fungicydy typu MBC) i Mycosphaerella fijiensis na triazole, żeby wspomnieć tylko kilka (Jones and Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983).
Zboża są uprawiane na całym świecie i reprezentują główną część produkcji spożywczej. Jakkolwiek straty w plonach są powodowane przez wiele patogenów, patogeny wywołujące nekrozę, Septoria i Pseudocercosporella, są szczególnie ważne w głównych obszarach uprawy zbóż Europy i Ameryki Północnej (Jones and Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983). W szczególności, rozmaitość objawów powodowanych przez różne izolaty i gatunki tych grzybów czyni bardzo trudnym dokładne przewidywanie potencjalnych strat powodowanych przez chorobę. W konsekwencji, dostępne ulepszone sposoby diagnozowania do szybkiej i dokładnej identyfikacji specyficznych patogenów będą bardzo przydatne dla badaczy patogenów upraw.
Cztery gatunki Septoria są pasożytami gatunków o małych ziarnach. Septoria tritici jest czynnikiem powodującym plamistość liści i jest wirulentny wobec pszenicy, ale również pasożytuje na pszenżycie i na życie. Typowo powoduje on nekrozę liści. Septoria nodorum jest czynnikiem sprawczym plamistości plewy kłosowej i jest pasożytem pszenicy, pszenżyta, żyta i jęczmienia i jakkolwiek głównie ogranicza się do plewy kłosowej, jest również znajdywany na liściach i osłonach liściowych. Septoria avenae jest pasożytem owsa, pszenicy i pszenżyta, a Septoria passerinii ogranicza się do jęczmienia. Choroby wywołane przez Septoria występują na wszystkich obszarach uprawy pszenicy mających znaczenie ekonomiczne. Różne choroby wywołane przez Septoria często występująna polach i na pojedynczych roślinach jednocześnie i określa się je jako „kompleks Septoria”. Typowo, najczęściej występującymi gatunkami są S. tritici i S. nodorum. Według Wiese (1977; Compendium of Wheat Diseases, Amer. Phytopath. Soc. strony 42-45), „kompleks Septoria” w chwili obecnej niszczy rocznie około 2% światowej pszenicy, przy czym straty w plonach są wynikiem uszkodzonego wnętrza ziaren. Traktowanie fungicydami może uratować do 20% w przypadkach poważnych infekcji Septoria, ale czasami trudno jest odróżnić od siebie różne gatunki Septoria na początku infekcji i to czyni trudnym decyzję czy inwestować, czy też nie w użycie fungicydów ze względu na to, iż różne odmiany hodowlane wykazują różny stopień odporności na różne gatunki Septoria.
Choroba oczkowatej plamistości zbóż jest powodowana przez grzyba Pseudocercosporella herpotrichoides i ogranicza się do nasady łodygi rośliny. Pszenica, żyto, jęczmień i inne trawy są wrażliwe na oczko watąplamistość, która ma miej sce w chłodnych, wilgotnych klimatach i j est dominująca w Europie, Ameryce Północnej i Południowej, Afryce i Australii. Pszenica jest najbardziej podatnym gatunkiem zboża, ale zidentyfikowano izolaty wirulentne w stosunku do innych zbóż. Przykładowo szczepy R grzybów były również izolowane z żyta i rosły wolniej na pszenicy niż szczepy W, które były izolowane z pszenicy. Jakkolwiek oczkowata plamistość może całkowicie zabijać pędy korzeniowe lub rośliny, częściej powoduje kładzenie się i/lub prowadzi do zmniejszenia rozmiaru i ilości ziarna. Straty plonów związane z oczkowatą plamistością są nawet większych rozmiarów niż te związane z Septoria tritici i Septoria nodorum. Typowa kontrola brana pod uwagę przy oczkowatej plamistości obejmuje traktowanie regulatorami
182 002 wzrostu dla wzmocnienia międzywęźli i działanie fungicydami. Jednakże różna podatność odmian hodowlanych na różne szczepy grzybów czyni przewidywanie skuteczności działania fungicydami trudnym.
Sigatoka - plamistość liści bananowca występuje w dwóch formach, z których każda jest powodowana przez innego grzyba. Ważna z punktu widzenia ekonomicznego Sigatoka Czarna jest powodowana przez Mycosphaerella fijiensis, podczas gdy mniej znacząca Sigatoka Żółta jest powodowana przez Mycosphaerella musicola (Johanson i Jeger, 1993; Mycol. Res. 97: 670-674). Sigatoka Czarna stanowi największy problem przy uprawie bananów, powodując poważne 30% i wyższe straty. Z powodu występowania u Mycosphaerella fijiensis oporności na fungicydy, użycie fungicydów powinno być ograniczone dla zapobiegania dalszego rozprzestrzeniania się oporności. W konsekwencji, dostępność narzędzi diagnostycznych dostarczy ważnych środków do identyfikacji odpowiednich warunków stosowania fungicydów, bez konieczności ryzykowania rozwoju dalszej oporności.
A zatem istnieje realna potrzeba rozwoju technologii, która pozwoli na identyfikację specyficznych rodzajów patogenów grzybów we wczesnym etapie procesu infekcji. Poprzez identyfikację specyficznych rodzajów patogenu, zanim pojawią się wyraźne symptomy choroby w uprawach, rolnik może oszacować prawdopodobne skutki dalszego rozwoju patogenu w odmianie uprawy, w której został on zidentyfikowany i wybrać odpowiedni fungicyd, jeżeli takie stosowanie uzna się za konieczne.
Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka DNA zawiera sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybranąz grupy, składającej się z SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2 oraz SEK NR ID: 86.
Starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika jest wybrany, zgodnie z wynalazkiem, z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 i SEK NR ID: 50 do 52.
Para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika według wynalazku jest wybrana z grupy, obejmującej SEK NR ID: 7 do 13, SEK NR ID: 50 do 52 oraz SEK NR ID: 38 do 41.
Korzystnie według wynalazku, para starterów oligonukleotydowych jest wybrana z grupy, składającej się z następujących par starterów:
SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8,
SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 8 i SEK NR ID: 38,
SEK NR ID: 8 i SEK NR ID: 40,
SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 10,
SEK NR ID: 11 i SEK NR ID: 12,
SEK NR ID: 51 i SEK NR ID: 52 oraz
SEK NR ID: 50 i SEK NR ID: 52, przy czym szczególnie korzystnie jest określona SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8.
Para starterów oligonukleotydowych według wynalazku jest również korzystnie wybrana z grupy, składającej się z następujących par starterów:
SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 40,
SEK NR ID: 11 i SEK NR ID: 41 oraz
SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 38.
Sposób wykrywania patogenu grzybowego według wynalazku polega na tym, że (a) izoluje się DNA z liścia zainfekowanego patogenem, (b) powiela się część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika takiego patogenu przy zastosowaniu tego DNA jako matrycy w reakcji łańcuchowej polimerazy z następującymi parami starterów:
SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8,
182 002
SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 10,
SEKNRID: 11 i SEK NR ID: 12,
SEK NR ID: 51 i SEK NR ID: 52 oraz
SEK NR ID: 50 i SEK NR ID: 52 albo z parą starterów, w której jeden starter jest wybrany z grupy, obejmującej SEK NR ID: 7 do 13 i SEK NR ID: 50 do 52, a drugi starter jest wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 38 do 41, oraz (c) wizualizuje się tak powieloną część regionu Transkrybowanego Wewnętrznego Przerywnika.
Sposób według wynalazku jest korzystnie stosowany do wykrywania patogenów grzybowych wybranych spośród grupy, obejmującej Septoria nodorum, Septoria tritici i Septoria arenae f. sp. triticea.
Zestaw do wykrywania Septoria według wynalazku zawiera nośnik umieszczony w bliskim sąsiedztwie jednego lub większej liczby pojemniczków i charakteryzuje się tym, że jeden z pojemniczków zawiera starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu, bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika, który jest wybrany z grupy, obejmującej SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2 oraz SEK NR ID: 86.
Korzystnie, zestaw według wynalazku zawiera starter wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 i SEK NR ID: 50 do 52 albo zawiera parę starterów oligonukleotydowych, w której jeden starter jest wybrany zgrupy, składającej się z SEKNRID: 7 do 13 i SEKNRID: 50 do 52, a drugi starter jest wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 38 do 41.
Sposób ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów według wynalazku polega na tym, że (a) izoluje się DNA z liścia rośliny zainfekowanej grzybowym patogenem, (b) powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy część sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika tego grzybowego patogenu, zastosowanąjako matryca z parą starterów, przy czym para starterów jest parą starterów diagnostycznych i jest wybrana z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 oraz SEK NR ID: 50 do 52 oraz (c) wizualizuje się powieloną część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika przy zastosowaniu startera wyłapującego wybranego z grupy, obejmującej SEKNRID: 19, 20,39166-81.
Korzystnie, w sposobie ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów według wynalazku startery diagnostyczne są wybrane z SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 10, a starterem wyłapującym jest starter określony SEK NR ID: 39.
Wynalazek jest stosowany do identyfikacji różnych typów patogenów wśród grzybów patogennych dla roślin. Sekwencje DNA, które wykazują zróżnicowanie pomiędzy różnymi typami grzybowych patogenów, mogąbyć stosowane przy wytwarzaniu starterów do zastosowania w testach diagnostycznych, opierających się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Startery te wytwarzają unikalne fragmenty w reakcjach PCR, w których matrycowy DNA jest dostarczany przez specyficzne rodzaje patogenów grzybowych i mogąbyć zatem użyte do identyfikacji obecności lub braku obecności specyficznych rodzajów patogenów w materiale z gospodarza roślinnego zanim pojawią się objawy choroby.
Zidentyfikowanie rodzaju patogenu w materiale z gospodarza roślinnego pozwala na ocenę potencjalnego uszkodzenia przy oddziaływaniu specyficznej odmiany rośliny uprawnej z patogenem i rozsądnego zastosowania szerokiego asortymentu dostępnych fungicydów. Ponadto, pozwala na uzyskanie szczegółowej informacji o rozwoju i rozprzestrzenianiu się specyficznych rodzajów patogenu na rozległych obszarach geograficznych. Sposób wykrywania patogenu grzybowego według wynalazku jest szczególnie przydatny przy chorobach z długą fazą utajoną, szczególnie takich jak wywoływane przez Septoria nodorum lub Septoria tritici u pszenic i może być odpowiednio stosowany wobec Mycosphaerella fijiensis u bananowców. Szczególnie też przydatne sązestawy do wykrywania patogenów, według wynalazku, przy identyfikacji różnych patogenów.
182 002
Opis figur.
Figura 1. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides szczep W (dwa warianty), Pseudocercosporella herpotrichoides szczep R, Mycosphaerella fijiensis oraz Mycosphaerella musicola.
Figura 2. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Septoria nodorum i Septoria avenae f.sp. triticea.
Figura 3. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme i Microdochium nivale.
Unikalne sekwencje DNA, według wynalazku, są stosowane przy identyfikacji różnych rodzajów patogenów wśród grzybów patogennych dla roślin, w szczególności są stosowane jako startery w analizie opartej o PCR. Sekwencje DNA według wynalazku obejmują Wewnętrzny Transkrybowany Przerywnik (ITS, ang. Intemal Transcribed Spacer) z regionó genu dla rybosomalnego RNA pochodzącego z poszczególnych patogenów. Te sekwencje DNA ITS z różnych typów patogenów w obrębie gatunku lub rodzaju różnią się między różnymi przedstawicielami gatunków lub rodzajów i z tego powodu, mogą być stosowane do identyfikacji tych poszczególnych przedstawicieli.
Od pewnego czasu i z umiarkowanymi sukcesami badacze w dziedzinie biomedycyny stosowali techniki opierające się o PCR przy wykrywaniu patogenów w zainfekowanych tkankach zwierzęcych. Jednakże dopiero ostatnio techniki te zostały zastosowane do wykrywania patogenów roślin. Obecność Gaumannomyces graminis w zainfekowanej pszenicy została wykryta przy zastosowaniu reakcji PCR dla sekwencji specyficznych dla genomu mitochondrialnego patogenu (Schlesser i wsp., 1991, Applied and Environ. Microbiol. 57: 553-556), a wzór uzyskany dla losowo powielonego polimorficznego DNA (tj. RAPD, ang. random amplified polymorphic DNA) umożliwił rozróżnienie różnych typów Gremmeniella abietina, sezonowego czynnika stwardniałych narośli rakowatych u drzew iglastych.
Geny rybosomalne są odpowiednie do zastosowania jako sekwencje docelowe dla sond molekularnych z powodu ich wysokiej liczby kopii. Pomimo dużego stopnia konserwacji między sekwencjami dojrzałego rRNA, nie transkrybowane i transkrybowane sekwencje przerywników są zwykle słabo konserwowane, a zatem są odpowiednimi sekwencjami docelowymi dla wykrywania zróżnicowania mającego miejsce na niedawnym etapie ewolucji. Grzybowe geny rRNA są zorganizowane w jednostki, z których każda koduje trzy dojrzałe podjednostki odpowiednio, 18S, 5.85 i 28S. Podjednostki te są rozdzielone przez dwa wewnętrzne transkrybowane przerywniki, ITS1 i ITS2, o długości około 300 bp (White et al., 1990, W: PCR Protocols; Eds.: Innes et al.; strony 315-322). Dodatkowo, jednostki transkrypcyjne są oddzielone poprzez nie transkrybowane sekwencje przerywników (NTS, ang. non-transctibed spacer). Sekwencje ITS i NTS są szczególnie przydatne do wykrywania specyficznych rodzajów różnych grzybowych patogenów.
Sekwencje DNA według wynalazku pochodzą z Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika (ITS) z regionu genu dla rybosomalnego RNA. Sekwencje DNA z różnych typów patogenów w obrębie gatunków lub rodzajów patogenów różnią się pomiędzy różnymi przedstawicielami rodzaju lub gatunku. Kiedy sekwencje ITS patogenu zostajązidentyfikowane, sekwencje te mogą być zestawione z innymi sekwencjami ITS. W ten sposób na podstawie sekwencji ITS można utworzyć startery. To znaczy, startery mogą być zaplanowane w oparciu o te regiony w obrębie regionów ITS, które zawierająnajwiększe różnice w sekwencji pomiędzy typami patogenów grzybowych. Sekwencje te i startery opierające się na tych sekwencjach mogą być stosowane do identyfikacji specyficznych przedstawicieli patogenów.
Konkretne sekwencje DNA będące przedmiotem zainteresowania obejmują sekwencje DNA ITS z Septoria, a w szczególności Septoria nodorum i Septoria tritici; Mycosphaerella, szczególnie Mycosphaerella fijiensis i Mycosphaerella musicola; Pseudocercosphorella, dokładniej Pseudocercosporella herpotrichoides, a jeszcze dokładniej ze szczepu W i szczepu R Pseudocercosporella herpotrichoides, Fusarium, a w szczególności F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme i Microdochium nivale. Takie sekwencje DNA ITS, jak również startery
182 002 będące przedmiotem zainteresowania, sąpodane w SEKNR ID: 1-47 oraz SEK NR ID: 50-86. Sekwencje znajdują zastosowanie przy identyfikacji w oparciu o PCR typów patogenów będących przedmiotem zainteresowania.
Sposoby stosowania sekwencji starterów według wynalazku sądobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowo, patrz Patenty USA Nr 4,683,195 i 4,683,202, jak również Schlesser i wsp. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57:553-556. Patrz również, Nazar i wsp. (1991; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39:1-11), który stosuje powielanie przy użyciu PRC dla zbadania różnic w regionach ITS Verticillium albo-atrum i Verticillium dahliae, a zatem rozróżnienia pomiędzy dwoma gatunkami; oraz Johanson i Jeger (1993; Mycol. Res. 97: 670-674), którzy zastosowali podobny sposób dla rozróżnienia patogenów bananowca Mycosphaerella fijiensis i Mycospharella musicola.
Sekwencje DNA ITS według wynalazku mogąbyć klonowane z grzybowych patogenów metodami znanymi w tej dziedzinie. W ogólności znane są sposoby izolowania DNA z izolatów grzybów. Patrz, Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2: 17-20; Lee i wsp. 1990) Fungal GeneticsNewsletter 35:23-24; i Lee i Taylor (1990) W: PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications, Innes et al. (Eds); strony 282-287. Alternatywnie, regiony ITS będące przedmiotem zainteresowania mogąbyć ustalone poprzez powielanie PCR. Startery do powielania całego regionu ITS zostały zaprojektowane zgodnie z White i wsp. (1990; W: PCR Protocols; Eds.: Innes et al. pages 315-322), a zwielokrotnione sekwencje ITS były klonowane w wektorze do klonowania pCRII. Klonowane sekwencje obejmowały lewy ITS (ITS 1), prawy ITS (ITS2), jak również centralnie położony gen 5,8S rRNA. Zostało to przeprowadzone dla Septoria nodorum i Septoria tritici; licznych izolatów Pseudocercosporella i Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella musicola; Septoria avenae triticea, F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme i Microdochium nivale.
Sekwencje ITS zostały ustalone i sekwencje w obrębie każdej grupy patogenu porównano celem zlokalizowania różnic, które mogłyby być użyteczne przy testowaniu różnych gatunków lub/i szczepów z zastosowaniem PCR. Sekwencje regionów ITS, które zostały ustalone, sąpokazane jako Sekwencje o NR ID od 1 do 6,47 i 82-86, a także na figurach 1,2 i 3. Na podstawie identyfikacji różnic, dokonano syntezy licznych starterów i testowano je w reakcji powielania PCR. Matrycami stosowanymi przy testowaniu powielania poprzez PCR były, najpierw oczyszczony DNA patogenu, a potem DNA izolowany z zainfekowanej tkanki gospodarza roślinnego. A zatem było możliwe zidentyfikowanie pary starterów, które były diagnostyczne, to jest które identyfikowały jeden specyficzny gatunek lub szczep patogenu, ale nie inny gatunek lub szczep tego samego patogenu. Korzystna kombinacj a starterów była w stanie odróżnić dwa różne gatunki lub szczepy w zainfekowanej tkance gospodarza tj. tkance gospodarza, która była uprzednio infekowana specyficznym gatunkiem lub szczepem.
Wynalazek dostarcza licznych kombinacji starterów, które spełniają to kryterium dla różnych gatunków Septoria, Mycosphaerella i Fusarium oraz różnych szczepów Pseudocercosporella. Startery według wynalazku są zaprojektowane w oparciu o różnice sekwencji pomiędzy grzybowymi regionami ITS. Różnica przynajmniej jednej pary zasad pomiędzy sekwencjami pozwala na zaprojektowanie rozróżniającego startera. Startery zaprojektowane dla specyficznych regionów ITS z grzybowego DNA mogąbyć stosowane w kombinacji ze starterem utworzonym dla regionu o sekwencji konserwowanej w obrębie regionu, kodującego rybosomalne DNA, celem powielania poprzez PCR fragmentów specyficznych gatunkowo. Generalnie, startery powinny mieć teoretyczną temperaturę topnienia pomiędzy około 60 do około 70 stopni C dla osiągnięcia dobrej czułości i nie powinny posiadać znaczących struktur drugorzędowych, a także końce 3' w kombinacji starterów nie powinny na siebie zachodzić. Startery mają na ogół długość około 5 do 10 nukleotydów.
Przydatność sklonowanych sekwencji ITS przy wyborze starterów do celów diagnostycznych wynika w dużej mierze z ich szybkiego różnicowania się w czasie ewolucji. Przykładowo, stwierdzono, że izolaty typu W i R patogenu Pseudocercosporella herpotrichoides mają zróżnicowane sekwencje ITS, na podstawie czego opracowano diagnostyczne startery. Jednakże, szybkie
182 002 powstawanie różnic w obrębie sekwencji ITS jest wyraźne także na podstawie obserwacji, że zidentyfikowano dwa warianty sekwencji typu W. Identyczność sekwencji w obrębie typu W była 99,4%, podczas gdy pomiędzy typami W i R była 98,6% sugerując bliższy związek ewolucyjny pomiędzy dwoma wariantami W, niż stwierdzony między typami W i R. Ten bliższy związek jest również widoczny z podobnej patogenności dla gospodarza dwóch izolatów z odmiennymi sekwencjami ITS.
Dodatkowo, oprócz opracowania na podstawie sekwencji pochodzących z ITS starterów dla diagnozowania izolatów grzybowych opartych o PCR, wynalazek obejmuje również identyfikację starterów z bibliotek starterów RAPD, które, gdy są zastosowane w reakcji PCR, mogą rozróżniać pomiędzy Septoria nodorum i Septoria tritici. Przeszukiwane startery są handlowo dostępne i były otrzymane z Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA). Przeszukiwanie genomowego DNA Septoria doprowadziło do zidentyfikowania dwóch starterów, które miały zdolność wykrywania jedynie S. tritici i trzech, które były zdolne do wykrywania tylko S. nodorum.
Zidentyfikowanie starterów pozwala na wytworzenie „zestawów”, zawierających elementy niezbędne do przeprowadzenia procesu identyfikacji. Takie zestawy zawierają nośnik umieszczony tak, aby w bliskości znalazł się jeden lub więcej pojemniczków, korzystnie takich jak probówki czy buteleczki. Jeden z takich pojemniczków zawiera niewyznakowane lub możliwe do wykrycia wyznakowane startery DNA. Startery są obecne w postaci zliofilizowanej lub, jeżeli trzeba, znajdująsię w odpowiednim buforze. Jeden lub więcej pojemniczków może zawierać jeden lub więcej enzymów lub odczynników, które mająbyć zastosowane w reakcjach PCR. Enzymy te mogą być obecne same lub w mieszaninach, w postaci zliofilizowanej lub w odpowiednich buforach.
Wreszcie zestaw może zawierać wszystkie dodatkowe elementy, konieczne do przeprowadzenia sposobu według wynalazku, takie jak bufory, odczynniki do ekstrakcji, enzymy, pipety, płytki, kwasy nukleinowe, trifosforany nukleotydów, bibułę filtracyjną, materiały do żeli, materiały do przenoszenia na filtry, materiały do autoradiografii i temu podobne.
Poniższe przykłady pokazują, bez ograniczenia, typowe protokoły doświadczalne, które mogą być stosowane przy izolacji sekwencji ITS, wyborze odpowiednich sekwencji starterów, testowania starterów pod kątem skuteczności selektywnej i diagnostycznej oraz zastosowanie takich starterów do wykrywania choroby i izolatu grzybowego.
Przykład 1. Izo laty grzybowe i ekstrakcja genomowego DNA
Żywotne izolaty grzybowe S. nodorum, S. tritici, S. passerini, S. glycines, Pseudocercosporella herpotrichoides, Pseudocercosporella aestiva, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis i Mycospaerella musicola otrzymano z kolekcji American Type Culture Collection. Izolaty Fusarium culmorum i Fusarium graminearum otrzymano od Dr Paula Nelsona z Uniwersytetu Penn State. Izolat z Michrodochium nivale (syn. Fusarium nivale) został otrzymany z Ciba-Basel, a izolat Fusarium moniliforme został otrzymany od Dr Loral Castor. Grzyby hodowano w 150 ml podłoża Potato Dextrose Broth zaszczepionego fragmentami grzybni z hodowli na PDA (Potato Dextrose Agar). Hodowle inkubowano w orbitalnej wytrząsarce w 28°C przez 7-11 dni. Grzybnie były osadzane poprzez wirowanie, a następnie mielenie w ciekłym azocie i totalny DNA genomowy ekstrahowany przy zastosowaniu protokołu według Lee i Taylor (1990; W: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Wyd.: Innes et al.; strony 282-287).
Dr Bruce McDonald z Uniwersytetu Teksas A & M dostarczył genomowy DNA z 20 izolatów S. nodorum i dziewięciu izolatów S. tritici. Dr Chris Caten z Uniwersytetu Birmingham dostarczył sześciu oczyszczonych grzybowych DNA z izolatów Septoria nodorum. Oczyszczony genomowy DNA z 12 izolatów Pseudocercosporella herpotrichoides otrzymano od Dr Paula Nicholsona z John Innes Centre, Norwich, Wielka Brytania. Sześć z tych izolatów było typu W; pozostałe sześć izolatów było typu R. Izolaty te były typowane na podstawie patogenności i badań RFLP. Andrea Johanson z Natural Resources Institute dostarczyła DNA genomowy z sześciu izolatów M. Musicola, sześciu izolatów M. fijiensis i jednego izolatu z Mycosphaerella musae. Oczyszczony DNA genomowy z Septoria avenae f. sp. triticea ATCC#26380 był dostarczony przez Dr Petera Uenga z USDA w Beltsville, Maryland.
182 002
Tabela 1
Źródło testowanych izolatów
| Izolat | Gatunek | Pochodzenie | Źródło |
| 1 | 2 | __________________3__________________ | 4 |
| ATCC#24425 | X nodorum | Montana | ATCC 1 |
| ΧΑ1.1 | S. nodorum | Teksas | 2 B. McDonald |
| XaSA2 | S. nodorum | Teksas | B. McDonald |
| YA3.1 | S. nodorum | Teksas | B. McDonald |
| XD2.1 | S. nodorum | Teksas | B. McDonald |
| YB2.2 | S. nodorum | Teksas | B. McDonald |
| 93HBh6a | S. nodorum | Oregon | B. McDonald |
| 93A3a | S. nodorum | 0 regon | B. McDonald |
| 93AYa | S. nodorum | Oregon | B. McDonald |
| 93HBh8a | S. nodorum | Oregon | B. McDonald |
| 93C5a | S. nodorum | Oregon | B. McDonald |
| ATCC#26517 | S. tritici | Minnesota | ATCC |
| BS3 | S. nodorum | Irlandia | C. Caten3 |
| BS6 | S. nodorum | Irlandia | C. Caten |
| BS175 | S. nodorum | Anglia | C. Caten |
| B5425 | S. nodorum | Anglia | C. Caten |
| alpha'5 | S. nodorum | Francja | C. Caten |
| m300 | S. nodorum | Anglia | C. Caten |
| TKV2a | S. tritici | Turcja | B. McDonald |
| SYK2 | S. tritici | Syria | B. McDonald |
| ISZC36.2 | S. tritici | Izrael | B. McDonald |
| CNRC4a.l | S. tritici | Kanada | B. McDonald |
| ALAla | S. tritici | Algieria | B. McDonald |
| ETKI | S. tritici | Etiopia | B. McDonald |
| GEB2a.l | S. tritici | Niemcy | B. McDonald |
| UK92D2 | S. tritici | Wlk. Brytania | B. McDonald |
| DNBla | S. tritici | Dania B. | B. McDonald |
| ATCC#38699 | S. glycines | Illinois | ATCC |
| ATCC#22585 | S. passerini | Minnesota | ATCC |
| ATCC#42040 | P. herpotrichoides - pszenica | ATCC | |
| ATCC#62012 | P. aestiva | Niemcy | ATCC |
| ATCC#60972 | P. herp.var.herp.- jęczmień | Niemcy | ATCC |
| W1 | P. herpotrichoides | Wlk. Brytania | 4 P. Nicholson |
| W2 | P. herpotrichoides | Wlk. Brytania | P. Nicholson |
| W3 | P. herpotrichoides | Wlk. Brytania | P Nicholson |
| W4 | P herpotrichoides | Wlk. Brytania | P. Nicholson |
| W5 | P. herpotrichoides | Newa Zelandia | P. Nicholson |
| W6 | P. herpotrichoides | Włochy | P. Nicholson |
| RI | P. herpotrichoides | Belgia | P. Nicholson |
| R2 | P. herpotrichoides | Nowa Zelandia | P. Nicholson |
182 002
Tbela 1 - ci
| 1 | 2 | 3 | 4 1 |
| R3 | P. herpotrichoides | Niemcy | P. Nicholson |
| R4 | P. herpotrichoides | Szwecja | P. Nicholson |
| R5 | P herpotrichoides | Wlk. Brytania | P. Nicholson |
| R6 | P. herpotrichoides | Wlk. Brytania | P. Nicholson |
| ATCC#22116 | Ki. fijiensis | Filipiny | ATCC |
| ATCC#22115 | Ki. musicola | Filipiny | ATCC |
| ATCC#24046 | Ki. citri | Floryda | ATCC |
| ATCC#62714 | Ki. graminicola | Montana | ATCC |
| PA92 | Ki fijiensis | Panama | ATI 5 A.Johanson |
| PNG291 | Ki. fijiensis | Papua Nowa Gwinea | A.Johanson |
| GH6-3 | Ki. fijiensis | Ghana | A.Johanson |
| TG 120 | Ki. fijiensis | Tonga | A.Johanson |
| HSB4 | Ki. fijiensis | Honduras | A.Johanson |
| RT689 | M. fijiensis | Rarotonga Wyspy Cook'a | A.Johanson |
| CR548 | Ki. musicola | Kosta Rica | A. Johanson |
| CM61 | Ki. musicola | Kamerun | A.Johanson |
| CU823 | Ki musicola | Kuba | A. Johanson |
| MQ103 | Ki. musicola | Martynika | A. Johanson |
| C131 | M. musicola | Wybrzeże Kości Słoniowej | A.Johanson |
| CB90 | Ki. musicola | Kolumbia | A.Johanson |
| BD1-4 | M. musae | Barbados | A.Johanson |
| ATCC#44234 | Ceratobasidium cereale | Holandia | ATCC |
| ATCC# 11404 | Drechslera sorokiniana | Minnesota | ATCC |
| R-5126 | F. culmorum | Minnesota | P. Nelson |
| R-5106 | F. culmorum | Michigan | P. Nelson |
| R-5146 | F. culmorum | Finlandia | P. Nelson |
| R-8417 | F. graminearum | Włochy | P. Nelson |
| R-8422 | F. graminearum | Kanada | P. Nelson |
| R-8546 | F. graminearum | Bułgaria | P. Nelson |
| 4551 | F. moniliforme | Indiana | , 7 L. Castor |
| 92 | Ki. nivale | — | g Ciba Basel |
| ATCC#26380 | S. avenae fi sp. triticea | Minnesota | P. Ueng9 |
1 Kolekcja American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA 2 Dr. Bruce McDonald, Uniwersytet Teksas A&M, USA 3 Dr Chris Caten, Uniwersytet Birmingham, UK 4 Dr Paul Nicholson, John Innes Centre, UK 5 Dr Andrea Johanson, Natural Resources Institute, UK 6 Dr Paul Nelson, Uniwersytet Penn State 7 Dr Loral Castor, Ciba Seeds Research, Bloomington, Illinois 8 Ciba-Geigy Limited, Basel, Switzerland 9 Dr Peter Ueng, USDA, Beltsville, Maryland
Przykład 2. Izolacja regionów wewnętrznego transkrybowanego przerywnika (ITS)
Fragmenty regionu wewnętrznego transkrybowanego przerywnika o długości około 550 bp były powielane poprzez reakcję PCR z 25 ng DNA genomowego wyizolowanego z S. nodorum (ATCC#24425), S. tritici (ATCC#26517), izolatów Rl, R2, W2 i W5 z Pseudocercosporella
182 002 herpotrichoides, M. fijiensis (ATCC#22115) oraz M. musicola (ATCC#22115) przy zastosowaniu 50 pmoli startera ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; SEK NR ID: 38) i ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; SEK NR ID: 41). Reakcje PCR wykonywano jak opisano w przykładzie 4, z tą różnicą, że reakcje przeprowadzano w 100 μΐ, a przyłączenie starterów przeprowadzano w 50°C. Fragmenty ITS oczyszczano poprzez wytrącanie izopropanolem według Maniatis i wsp. (1982; Molecular Cloning; Wyd.: Maniatis et. al.; strony 461-462). DNA zawieszano w 50 μΐ dH2O i klonowano, stosując zestaw TA Cloning Kit (part no. K2000-O1) z Invitrogen Corporatiońs (San Diego, CA) z użyciem wektora do klonowania pCRII. Sekwencje DNA regionów ITS ustalano poprzez zastosowanie metody dideoksy z użyciem automatycznego urządzenia do sekwencjonowania firmy Applied Biosystems (Foster City, CA), model 373A, oraz starterów ITS1 (patrz sekwencja powyżej), ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'; SEK NR ID: 39), ITS4 (patrz sekwencja powyżej) oraz starterów M13: uniwersalnego -20 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'; SEK NR ID: 48) i Reverse (5'-AACAGCTATGACCATG-3'; SEK NR ID: 49). Startery dla ITS: ITS1 (SEK NR ID: 38), ITS2 (SEK NR ID: 39), ITS3 (SEK NR ID: 40) i ITS4 (SEK NR ID: 41) używane do klonowania regionów ITS są wyszczególnione w White i wsp. (1990; W: PCR Protocols; Eds.: Innes i wsp., str. 315-322).
Dodatkowo, regiony wewnętrznego transkrybowanego przerywnika były powielane poprzez reakcję PCRz 25 ng genomowego DNA z S. avenae f. sp. triticea, M. nivale, F. moniliforme (#4551), izolatówR-8417,R-8546 andR-8422 F. graminearum oraz izolatówR-5126, R25 5106 i R-5146 F. culmorum. Produkty PCR oczyszczano zestaw Wizard DNA Cleanup firmy Promega(Madison, WI). Sekwencje DNA regionów ITS ustalano, jak opisano powyżej, używając starterów ITS1 (SEKNR ID: 38), ITS2 (SEK NR ID: 39), ITS3 (SEKNR ID: 40) iITS4 (SEK NR ID: 41). Reakcje sekwencj onowania były kombinowane z trzema izolatami z F. culmorum i F. graminearum dla ustalenia sekwencji największej zgodności dla F. culmorum i F. graminearum.
Przykład 3. Ekstrakcja DNA z liści pszenicy i bananowca
DNA ekstrahowano z liści pszenicy stosując zmodyfikowaną wersję protokołu Raqaid DNA Extraction z zestawu IsoQuick Nucleic Acid Extraction Kit (cat# ΜΧΤ-020-100) firmy MicroProbe Corporation's (Garden Grove, CA). Typowa wydajność wynosiła 5-10 pg całkowitego DNA z 0,2 g tkanki liściowej. W każdym teście PCR używano około 100 ng całkowitego DNA.
Zmodyfikowana szybka ekstrakcja DNA:
Przed zastosowaniem zestawu po raz pierwszy, całą zawartość odczynnika Reagent 2A (20 x Dye Concentrate) dodawano do odczynnika Reagent 2 (Extraction Matrix).
(1) Około 0,2 g próbki liścia dodawano do 1,5 ml probówki Eppendorfa, zawierającej 50 μΐ buforu A i 50 μΐ roztworu do lizy #1. Próbka liścia była rozdrabniana w moździeżu Kontes.
(2) Odczynnik 2 (Reagent 2; Extraction Matrix) był energicznie mieszany. 350 μΐ odczynnika 2 dodawano do lizatu próbki.
(3) Do próbki dodawano 200 μΐ odczynnika 3 (Reagent 3; Extraction Buffer). Próbka była mieszana na worteksie przez 20 sek.
(4) Wirowanie w mikro wirówce przy 12000 x g przez 5 min.
(5) Fazę wodną (górną warstwę) przenoszono do nowej probówki do mikrowirówki. Objętość wynosiła zwykle około 200 μΐ.
(6) Do fazy wodnej dodawano 0,1 x objętość fazy wodnej odczynnika 4 (Reagnet 4; Sodium Acetate).
(7) Do fazy wodnej dodawano równą objętość izopropanolu, po czym próbkę mieszano na worteksie.
(8) Wirowanie w mikrowirówce przy 12000 x g przez 10 min.
(9) Supematant odrzucano nie naruszając osadu kwasu nukleinowego. Do osadu dodawano 0,5 ml 70% etanolu o temp. -20°C. Probówki były mieszane na worteksie.
(10) Wirowanie w mikrowirówce przy 12000 x g przez 5 min.
(11) Supematant odrzucano, a osad pozostawiano do wyschnięcia.
(12) Osad kwasu nukleinowego rozpuszczano w 50 μΐ odczynnika 5 (Reagnet 5; RNasefree water).
182 002
Przykład 4. Powielanie DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy
Reakcje łańcuchowe polimerazy prowadzono przy użyciu zestawu GeneAmp Kit z firmy Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, CT; nr kat. N808-0009), stosując 50 mM KC1,2,5 mM MgCl2,10 mM Tris-HCl, pH 8,3, zawierający 100 μΜ każdego: TTP, dATP, dCTP i dGTP, 50 pM startera, 2,5 jednostek polimerazy Taq i 25 ng genomowego DNA w końcowej objętości 50 μΐ. Reakcje prowadzono przez 30 cykli: 15 sek. w 94°C, 15 sek. w 50°C, 60°C lub 70°C.i 45 sek. w 72°C w termocyklerze firmy PerkinElmer/Cetus Model 9600. Produkty analizowano poprzez nakładanie 20 μΐ każdej próbki PCR na 1,1-1,2% żel agarozowy i przeprowadzenie elektroforezy.
Przykład 5. Synteza i oczyszczanie oligonukleotydów
Oligonukleotydy (startery) były syntetyzowane w syntetyzatorze DNA Applied Biosystems 380A przy użyciu chemii β-cyjanotylo-fosforamidytu.
Przykład 6. Wybór starterów specyficznych gatunkowo
Zestawiono sekwencje ITS S. nodorum, S. tritici, szczepówR i W P. herpotrichoides, M. fijiensis i M. musicola (fig.l). Zestawiono sekwencje ITS S. nodorum i S. avenae. triticea (fig. 2). Zestawienie zostało również wykonane dla sekwencji ITS F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme oraz M. nivale (fig. 3). Zestaw starterów zsyntetyzowano zgodnie z przykładem 5, w oparciu o analizę zestawionych sekwencji. Zaprojektowano startery dla regionów, zawierających największe różnice sekwencji pomiędzy gatunkami grzybów z figur 1-2. Na figurze 3 przedstawiono zaprojektowane startery dla regionów o najwyższej homologii w obrębie ITS dla Fusarium. Ponadto zsyntetyzowano opublikowane, specyficzne dla rybosomalnych genów, startery ITS1 (SEK NR ID: 38), ITS2 (SEK NR ID: 39), ITS3 (SEK NR ID: 40) i ITS4 (SEK NR ID: 41) (White i wsp., 1990; W: PCRProtocols; Wyd.: Innes i wsp., strony 315-322) celem wykonania testu w kombinacji ze starterami specyficznymi dla regionu ITS.
Tabela 2
Zaprojektowane startery do wykrywania grzybów
| Matryca dla startera | Nazwa startera | Sekwencja startera |
| 1 | 2 | 3 |
| S. nodorum | JB433 | 5’ ACACTCAGTAGTTTACTACT 3' (SEK NR ID: 7) |
| S. nodorum | JB434 | 5' TGTGCTGCGCTTCAATA 3' (SEK NR ID: 8) |
| S. nodorum | JB525 | 5' GCGACITGTGCTGCGCTTCAATA 3' (SEK NR ID: 9) |
| S. nodorum | JB527 | 5' CATTACACTCAGTAGTTTACTACT 3' (SEK NR ID:10) |
| S. tritici | JB445 | 5' CTGCGTCGGAGTTTACG 3' (SEK NR ID:11) |
| S. tritici | JB446 | 5' CGAGGCTGGAGTGGTGT 3’ (SEK NR ID:12) |
| S. tritici | JB526 | 5' CCCAGCGAGGCTGGAGTGGTGT 3' (SEK NR ID: 13) |
| P. herp. | JB536 | 5' CTGGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3' (SEK NR ID: 14) |
| P. herp. | JB537 | 5' GGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3' (SEK NR ID: 15) |
| P. herp. | JB538 | 5' ACTTGGTAGGGTTTAGAGTCGTCA 3' (SEK NR ID:16) |
| P. herp. | JB539 | 5' CTTCGGTAAGGTTTAGAGTCGTCG 3' (SEK NR ID: 17) |
| P. herp. | JB540 | 5' GGGGGCCACCCTACTTCGGTAA 3' (SEK NR ID:18) |
182 002
Tabela 2 - ciąg dalszy
| 1 | 2 | ____________________________________________3__ |
| P. herp. | JB541 | 5' CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG 3' (SEK NR ID: 19) |
| P. herp. | JB542 | 5' CCACTGAI I I IAGAGGCCGCGAA 3' (SEK NR ID: 20) |
| P. herp. | JB543 | 5' CCTGTAAAAAATTGGGGGTTA 3' (SEK NR ID: 21) |
| P. herp. | JB544 | 5' CCTGTAAAAAATTGGGGGTTG 3' (SEK NR ID: 22) |
| M. fijiensis | JB547 | 5' ATTACCGAGTGAGGGCTCACGC 3' (SEK NR ID: 23) |
| M. fijiensis | JB548 | 5' GTTGCTTCGGGGGCGACCTG 3' (SEK NR ID: 24) |
| M. fijiensis | JB442 | 5' TCGGGGGCGACCTGCCG 3' (SEK NR ID: 25) |
| M. fijiensis | JB443 | 5' CCGGAGGCCGTCTA 3' (SEK NR ID: 26) |
| M. fijiensis | JB545 | 5’ CCACAACGCTTAGAGACGGACAG 3’ (SEK NR ID: 27) |
| M. fijiensis | JB546 | 5' CACCCGCACTCCGAAGCGAATT 3' (SEK NR ID: 28) |
| M. fijiensis | JB549 | 5' GATCCGAGGTCAACCTTTGAATAA 3' (SEK NR ID: 29) |
| M. fijiensis | JB444 | 5’ GGTCAACCTTTGAATAA 3' (SEK NR ID: 30) |
| M. musicola | JB451 | 5' CCTTTGTGAACCACACCT 3' (SEK NR ID: 31) |
| M. musicola | JB440 | 5' CTGCCGGCGAACTT 3' (SEK NR ID: 32) |
| M. musicola | JB449 | 5' ACCCTGCCGGCGAACTT 3' (SEK NR ID: 33) |
| M. musicola | JB448 | 5' GCGACCCTGCCGGCGAAC 3' (SEK NR ID: 34) |
| M. musicola | JB441 | 5' TAGCCGGGAGACTTTGG 3' (SEK NR ID: 35) |
| M. musicola | JB450 | 5' TCTGCGTCGGAGTTCC 3' (SEK NR ID: 36) |
| M. musicola | JB452 | 5' CCGCGCTCCGGAGCGAAC 3' (SEK NR ID: 37) |
| 18S rDNA | ITS1 | 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3' (SEK NR ID: 38) |
| 5.8S rDNA | ITS2 | 5’ GCTGCGTTCTTCATCGATGC 3' (SEK NR ID: 39) |
| 5.8S rDNA | ITS3 | 5' GCATCGATGAAGAACGCAGC 3' (SEK NR ID: 40) |
| 25S rDNA | ITS4 | 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' (SEK NR ID: 41) |
| S. nodorum | JB563 | 5' CTTGCCTGCCGGTTGGACAAATT 3' (SEK NR ID: 50) |
| S. nodorum | JB564 | 5' CTCAGTAGTTTACTACTGTAAAAGG 3' (SEK NR ID: 51) |
| S. nodorum | JB565 | 5' CTTCTGGACGCAAGTGTTTGTTAC 3' (SEK NR ID: 52) |
| Fusarium spp. | JB566 | 5' Gl I I I IAGTGGAACTTCTGAGT 3’ (SEKNR ID; 53) |
182 002
Tabela 2 - ciąg dalszy
| 1 | 2 | 3 |
| Fusarium spp. | JB567 | 5' CGCAGGAACCCTAAACTCT 3' (SEK NR ID: 54) |
| Fusarium spp. | JB568 | 5' GCCCGCCGCAGG 3’ (SEK NR ID: 55) |
| Fusarium spp. | JB569 | 5' RTWWTTWRTGGAMYYTCTGAGT 3' (SEK NR ID: 56) |
| Fusarium spp. | JB570 | 5' TATGTTGCCTCGGCGG 3' (SEK NR ID: 57) |
| Fusarium spp. | JB571 | 5' TAACGATATGTAAATTACTACGCT 3' (SEK NR ID: 58) |
| Fusarium spp. | JB572 | 5' AAGTTGGGGTTTAACGGC 3' (SEK NR ID: 59) |
| Fusarium spp. | JB573 | 5' AGCGAGCCCGCCAC 3' (SEK NR ID: 60) |
| Fusarium spp. | JB574 | 5' CCATTGTGAACGTTACCTATAC 3' (SEK NR ID: 61) |
| Fusarium spp. | JB575 | 5' CGACCAGAGCGAGATGTA 3' (SEK NR ID: 62) |
| Fusarium spp. | JB576 | 5' GTGAACATACCTTATGTTGCC 3' (SEK NR ID: 63) |
| Fusarium spp. | JB577 | 5' GTTGCCTCGGCGGATC 3' (SEK NR ID: 64) |
| Fusarium spp. | JB578 | 5' CCGCGACGATTACCAG 3' (SEK NR ID: 65) |
Uwaga: Fusarium spp. obejmuje E graminearum, F. culmorum, E moniliforme i Microdochium nivale (syn. F. nivale).
Przykład 7. Wybór starterów do losowego powielania polimorficznych DNA (RAPD)
Dwie biblioteki starterów do RAPD (zestawy B i E), każdązłożonąz dwudziestu oligonukleotydów, otrzymano z Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA). Startery testowano pod kątem ich zdolności do różnicowania oczyszczonych genomowych DNA z S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis i M. musicola. Warunki PCR były zasadniczo takie same, jak opisano w przykładzie 4, z tą różnicą, że liczbę cykli zwiększono do 35, temperatura przyłączania startera była 30°C i użyto jedynie 5 pikomoli każdego ze starterów. Zidentyfikowano pięć starterów do RAPD, które różnicowały oczyszczony genomowy DNA z S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis i M. musicola. Startery OPB-12 i OPE-6 wytwarzały pojedynczy fragment przy powielaniu genomowego DNA S. tritici. Startery ΟΡΕ-12, OPB-19 i ΟΡΕ-15 wytwarzały pojedynczy fragment na genomowym DNA S. nodorum. Startery OPB-12 and OPE-6 nie dawały żadnego produktu powielania na genomowym DNA z S. nodorum, M. fijiensis i M. musicola.
Tabela 3
Startery RAPD do diagnozowania Septoria
| Źródło matrycowego powielonego DNA | Starter | Sekwencja startera | Przybliżona wielkość fragmentu |
| S. tritici | OPB-12 | 5'-CCTTGACGCA-3' (SEK NR ID: 42) | 1,3 kb |
| S. tritici | OPE-6 | 5'-AAGACCCCTC-3' (SEK NR ID: 43) | 1,0 kb |
| S. nodorum | OPE-12 | 5'-TTATCGCCCC-3' (SEK NR ID: 44) | 2,2 kb |
| S. nodorum | OPB-19 | 5'-ACCCCCGAAG-3' (SEK NR ID: 45) | 1,1 kb |
| S. nodorum | OPE-15 | 5'-ACGCACAACC-3' (SEK NR ID: 46) | 1,3 kb |
182 002
Przykład 8. Określenie specyficzności startera wobec oczyszczonego genomowego DNA grzybów
Reakcje PCR wykonywano według przykładu 4, stosując różne kombinacje starterów z zamiarem powielenia pojedynczego fragmentu specyficznego gatunkowo. Specyficzne gatunkowo produkty powielania w reakcji PCR były wytwarzane ze starterów zaprojektowanych dla regionu ITS pomiędzy podjednostkami 18S i 25S rybosomalnego DNA dla każdego szczepu grzybowego, będącego przedmiotem zainteresowania.
Tabela 4
Stastery diagnostyczne do PCR pochodzące z ITS
| Źródło matrycowego DNA | Starter 5' | Starter 3' | Przybliżona wielkość amplifikowanego fragmentu |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Septoria nodorum | JB433 (SEK NR ID: 7) | JB434 (SEK NR ID: 8) | 448 bp |
| JB433 (SEK NR ID: 7) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 553 bp | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB434 (SEK NR ID: 8) | 478 bp | |
| ITS3 (SEK NR ID: 40) (JB414) | JB434 (SEK NR ID: 8) | 232 bp* | |
| JB527 (SEK NR ID: 10) | JB525 (SEK NR ID: 9) | 458 bp | |
| JB564 (SEK NR ID: 51) | JB565 (SEK NR ID: 52) | 480 bp | |
| JB563 (SEK NR ID: 50) | JB565 (SEK NR ID: 52) | 368 bp | |
| Septoria tritici | JB445 (SEK NR ID: 11) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 407 bp |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB446 (SEK NR ID: 12) | 345 bp | |
| ITS3 (SEK NR ID: 40) (JB414) | JB446(SEKNR ID: 12) | 143 bp* | |
| JB445 (SEK NR ID: 11) | JB446(SEKNR ID: 12) | 204 bp | |
| M. fijiensis | JB443 (SEK NR ID: 26) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 418 bp |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB444 (SEK NR ID: 30) | 482 bp | |
| JB443 (SEK NR ID: 26) | JB444 (SEK NR ID: 30) | 366 bp* | |
| ITS3 (SEK NR ID: 40) (JB414) | JB444 (SEK NR ID: 30) | 281 bp* | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB549(SEK NR ID: 29) | 489 bp | |
| M musicola | JB449 (SEK NR ID: 33) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 430 bp |
| JB448 (SEK NR ID: 34) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 449 bp* | |
| JB448 (SEK NR ID: 34) | ITS2 (SEK NR ID: 39) (JB411) | 138 bp* | |
| JB450 (SEK NR ID: 36) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 390 bp* | |
| P. herpotrichoides | JB536(SEKNR ID: 14) | JB541 (SEK NR ID: 19) | 415 bp' |
| JB536(SEKNR ID: 14) | JB543 (SEK NR ID: 21) | 502 bp' | |
| JB537 (SEK NR ID: 15) | JB541 (SEK NR ID: 19) | 413 bp' | |
| JB537 (SEK NR ID: 15) | JB543 (SEK NR ID: 21) | 500 bp' | |
| JB538 (SEK NR ID: 16) | JB541 (SEK NR ID: 19) | 401 bp' | |
| JB538 (SEK NR ID: 16) | JB543 (SEK NR ID: 21) | 488 bp' | |
| JB536 (SEK NR ID: 14) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 560 bp' | |
| JB537(SEK NR ID: 15) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 558 bp' | |
| JB538 (SEK NR ID: 16) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 546 bp' | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB541 (SEK NR ID: 19) | 482 bp' | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB543 (SEK NR ID: 21) | 569 bp | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB542 (SEK NR ID: 20) | 482 bp | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB544 (SEK NR ID: 22) | 569 bp | |
| JB540(SEKNR ID: 18) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 558 bp | |
| JB539 (SEK NR ID: 17) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 545 bp | |
| JB540 (SEK NR ID: 18) | JB542 (SEK NR ID: 20) | 413 bp | |
182 002
Tabela 4 - ciąg dalszy
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| P. herpotrichoides | JB540 (SEK NR ID: 18) | JB544 (SEK NR ID: 22) | 500 bp~ |
| JB539 (SEK NR ID: 17) | JB542 (SEK NR ID: 20) | 400 bp^ | |
| JB539 (SEKNRID: 17) | JB544 (SEK NR ID: 22) | 487 bpw | |
| Fusarium spp. | JB566 (SEK NR ID: 53) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 430 bp‘ |
| JB566 (SEK NR ID: 53) | JB572 (SEK NR ID: 59) | 346 bp' | |
| JB569 (SEK NR ID: 56) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 430 bp' | |
| JB569 (SEK NR ID: 56) | JB572 (SEK NR ID: 59) | 346 bp' | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB572(SEKNR ID: 59) | 485 bp' | |
| JB566 (SEK NR ID: 53) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 308 bp2 | |
| JB569 (SEK NR ID: 56) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 308 bp2 | |
| JB570 (SEK NR ID: 57) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 501 bp2 | |
| JB570 (SEK NR ID: 57) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 379 bp2 | |
| JB570 (SEKNRID: 57) | JB578 (SEK NR ID: 65) | 395 bp2 | |
| JB567 (SEK NR ID: 54) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 450 bp2 | |
| JB567 (SEK NR ID: 54) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 328 bp2 | |
| JB567 (SEK NR ID: 54) | JB572 (SEK NR ID: 59) | 366 bp2 | |
| JB567 (SEK NR ID: 54) | JB578 (SEK NR ID: 65) | 344 bp2 | |
| JB568 (SEKNRID: 55) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 459 bp2 | |
| JB568 (SEK NR ID: 55) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 337 bp2 | |
| JB568 (SEK NR ID: 55) | JB572 (SEK NR ID: 59) | 375 bp2 | |
| JB576 (SEK NR ID: 63) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 510 bp2 | |
| JB576 (SEK NR ID: 63) | JB578 (SEK NR ID: 65) | 404 bp2 | |
| JB577 (SEK NR ID: 64) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 495 bp2 | |
| JB577 (SEK NR ID: 64) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 373 bp2 | |
| JB577 (SEK NR ID: 64) | JB578 (SEK NR ID: 65) | 389 bp2 | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB571 (SEK NR ID: 58) | 447 bp2 | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB578 (SEK NR ID: 65) | 463 bp2 | |
| ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) | JB575 (SEKNRID: 62) | 479 bp2 | |
| Λί. nivale | JB569(SEKNRID: 56) | JB575 (SEK NR ID: 62) | 340 bp |
| JB567 (SEK NR ID: 54) | JB575 (SEK NR ID: 62) | 360 bp | |
| JB574 (SEK NR ID: 61) | ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) | 520 bp | |
| JB574 (SEK NR ID: 61) | JB572 (SEK NR ID: 59) | 436 bp |
♦ ...Kombinacja starterów powielała pewne fragmenty poprzez nieprawidłowe przyłączenie startera, pczy czym żadne z nich nie miały żądanej wielkości.
©. Startery powielały fragment o właściwej wielkości zarówno w typie R, jaki i w typie W Pseudocercosporella herpotrichoides.
©..Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości jedynie w typie R P. herpotrichoides.
1 ... Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości w F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme i M. nivale.
2 ... Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości w F. graminearum, F. culmorum i F. moniliforme.
Przykład 9. Ustalenie specyficzności starterów wobec tkanek roślinnych infekowanych przez grzyby
Całkowity genomowy DNA izolowano ze zdrowych liści pszeniny, liści pszenicy infekowanych S. nodorum, liści pszenicy infekowanych S. tritici oraz liści pszeniny infekowanych zarówno S. nodorum, jak i S. tritici, stosując protokół opisany w przykładzie 3. Reakcje PCR wykonywano, jak opisano w przykładzie 4, testując kombinacje starterów wymienionych w przykładzie 8, z DNA z liści pszenicy.
Startery specyficzne dla S. tritici, JB446 (SEKNRID: 12) i ITS1 (SEK NR ID: 3 8) (JB410) powielały fragment o wielkości 345 bp z oczyszczonego DNA S. tritici, z tkanki liściowej pszeni
182 002 cy infekowanej S. tritici i z próbki tkanki liściowej pszenicy infekowanej zarówno S. tritici, jak i S. nodorum. Zestaw starterów nie powielał fragmentu diagnostycznego ze zdrowej tkanki liściowej ani z tkanki pszenicy infekowanej S. nodorum. Podobnie, startery specyficzne dla S. tritici, JB445 (SEK NR ID: 11) i ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) powielały fragment o wielkości 407 bp z tych samych tkanek, co kombinacja starterów JB446 (SEK NR ID: 12) i ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) i również były diagnostyczne.
Podobnie diagnostyczne wyniki otrzymano dla starterów specyficznych dla S. nodorum, JB443 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8). Startery powielały fragment o wielkości 448 bp z tkanki liściowej pszenicy infekowanej S. nodorum, z próbki tlanki liściowej infekowanej zarówno S. nodorum, jak i S. tritici, S. nodorum, jak również z oczyszczonego genomowego DNA S. nodorum. Kombinacja starterów JB443 (SEKNR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8 nie powielała żadnego fragmentu ze zdrowej tkanki liściowej, z tkanki pszenicy infekowanej S.tritici, ani z oczyszczonego genomowego DNA S. tritici. Startery specyficzne dla S. nodorum, JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9), powielały fragment o wielkości 458 z tego samego genomowego DNA i tkanek pszenicy, co kombinacja JB433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8).
Kombinację starterów dla P. herpotrichoides, wymienionych w przykładzie 8, testowano wobec ekstraktów z łodyg pszenicy tak, jak w przykładzie 12. Reakcje PCR wykonywano, jak opisano w przykładzie 4, z następującymi zmianami: 35 cykli prowadzono w 94°C przez 15 sek. i 70°C przez 45 sek., stosowano 1,5-2,5 mM MgCl2 i 200 μΜ każdeg dNTP. W każdej reakcji PCR używano 1 μΐ ekstraktu pszenicy.
Kombinacja starterów JB537 (SEK NR ID: 15)andJB541 (SEK NR ID: 19) powielała fragment o długości 413 bp w ekstrakcie pszenicy infekowanej typem W patogenu P. herpotrichoides. Żaden produkt powielania nie był wytwarzany przy powielaniu w ekstrakcie ze zdrowej pszenicy, ani w ekstrakcie z pszenicy infekowanej typem R patogenu P. herpotrichoides.
Kombinacja starterów JB539 (SEK NR ID: 17) i JB544 (SEK NR ID: 22) powielała fragment o długości 487 bp, a kombinacja starterów JB540 (SEK NR ID: 18) i JB542 (SEKNR ID: 20) powielała fragment o długości 413 bp w ekstrakcie pszenicy infekowanej typem R, ale nie ze zdrowej pszenicy lub pszenicy infekowanej typem W.
Całkowity genomowy DNA izolowano również ze zdrowych liści bananowca i z liści bananowca infekowanych M. fijiensis przy użyciu protokołu opisanego w przykładzie 3. Reakcje PCR wykonywano jak w przykładzie 4, testując kombinację starterów specyficznych dla M. fijiensis, wymienionych w przykąłzie 8, wobec liści bananowca.
Startery specyficzne dla M. fijiensis: JB549 (SEK NR ID: 29) i ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) powielały fragment o długości 489 bp na oczyszczonym DNA M. fijiensis i tkance liściowej bananowca infekowanej M. fijiensis. Zestaw starterów nie powielał fragmentu diagnostycznego ze zdrowej tkanki liściowej bananowca. Kombinacja starterów specyficznych dlaM. fijiensis JB443 (SEK NR ID: 26)/ITS4 (SEKNR ID: 41) (JB415) i ITS1 (SEKNR ID: 38) (JB410)/JB444 (SEK NR ID: 30) powielała fragment o długości odpowiednio, 418 bp i 482 bp, na tym samym genomowym DNA i tkance liściowej bananowca, co kombinacja starterów (SEK NR ID: 20) i ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410).
Przykład 10. Badanie reakcj i krzyżowej starterów specyficznych gatunkowo z innymi gatunkami i izolatami.
Oczyszczony genomowy DNA grzybowy otrzymano, jak opisano w przykładzie 1 i testowano w reakcji PCR, jak opisano w przykładzie 4, stosując startery specyficzne gatunkowo. Testowano DNA z innych gatunków grzybów i izolatów pod kątem krzyżowego reagowania z nimi starterów specyficznych gatunkowo.
Startery specyficzne dla S. tritici, JB446 (SEKNR ID: 12) i ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) powielały fragment o wielkości 345 bp dla wszystkich izolatów S. tritici wymienionych w przykładzie 1. Nie było reakcji krzyżowej z oczyszczonym genomowym DNA z S. nodorum, S. glycines lub S. passerini. Żaden z tych innych gatunków grzybów nie wytwarzał produktu powielania ze starterami specyficznymi dla S. tritici.
182 002
Fragment o wielkości 448 bp był powielany dla wszystkich izolatów S. nodorum wymienionych w przykładzie 1 przy zastosowaniu starterów specyficznych dla S. nodorum JB 433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8). Podobnie, startery specyficzne dla S. nodorum JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9) powielały fragment o wielkości 458 bp we wszystkich izolatach S. nodorum wymienionych w przykładzie 1.
S. tritici, S. glycines i S. passerini nie wytwarzały żadnego produktu powielania, gdy były testowane z jednym z zestawów starterów specyficznych dla S. nodorum: bądź JB433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8), bądź JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9).
Reakcje PCR przeprowadzano stosując warunki opisane w przykładzie 9, z kombinacją starterów specyficznych dla P. herpotrichoides opisanych w przykładzie 8, z DNA innych gatunków grzybów i izolatów, wymienionych w przykładzie 1.
Kombinacja starterów JB537 (SEKNRID: 15) i JB541 (SEKNRID: 19) dawała fragment o wielkości 413 z izolatów P. herpotrichoides typu W jedynie w przypadku testowania wobec izolatów P. herpotrichoides i następujących patogenów zbóż: P. aestiva, C. cereale, P. sorokiniana, S. tritici i S. nodorum. Kombinacja starterów JB53 9 (SEKNRID: 17) i JB544 (SEKNRID: 22) powielała fragment o wielkości 487 bp z izolatu P. herpotrichoides typu R jedynie wtedy, gdy była testowana wobec tych samych DNA. Kombinacja starterów JB540 (SEK NR ID: 18) i JB542 (SEK NR ID: 20) powielała fragment o wielkości 413 bp z izolatu P. herpotrichoides typu R jedynie wtedy, gdy była testowana wobec tych samych DNA.
Przykład 11. Źródła pszenicy infekowanej Pseudocercosporella herpotrichoides
Łodygi pszenicy infekowane oczkowatąplamistościąotrzymano z etapu Ic programu przesiewowego dla fungicydów z Ciba Basie. Ośmiodniowe rośliny pszenicy infekowano P. herpotrichoides poprzez rozpylenie zawiesiny konidiów (5 χ 105 konidiów/ml) w 0,2% Tween 20 u nasady łodyg pszenicy. Po inokulacj i, rośliny pokrywano plastykiem i inkubowano przez j eden dzień w 20°C i przy względnej wilgotności 95-100%. Rośliny przenoszono do komory hodowlanej, gdzie były inkubowane przez cztery tygodnie w 12°C i przy względnej wilgotności 60%. Po takiej inkubacji, rośliny przenoszono do szklarni i inkubowano w 18°C i przy względnej wilgotności 60%. Z roślin pszenicy infekowanych szczepem 311 P. herpotrichoides typu W pobierano próbki po 8-9 tygodniach po iniekcji, podczas gdy te infekowane szczepem 308 patogenu typu R zbierano po 9-10 tygodniach po infekcji.
Przykład 12. Ekstrakcja DNA z łodyg pszenicy do testu na P. herpotrichoides
DNA ekstrahowano z łodyg pszenicy stosując protokół opisany przez Klimyuk i wsp. (The Plant Journal 3 (3): 493-494) z pewnymi modyfikacjami. 2 cm skrawki łodygi, ścięte 0,5 cm powyżej nasady łodygi umieszczano w 16010,25 MNaOH i rozcierano stosując moździerz Kontes pestle, aż do całkowitego zmacerowania. Próbkę gotowano przez 30 sek. Do próbki dodawano 16010,25 M HCI i 8010,5 M Tris-Cl, pH 8,0/0,25% obj./obj. Nonidet P-40. Próbka była gotowana przez dodatkowe 2 min., a następnie umieszczana w lodowej łaźni wodnej. W każdym teście PCR używano 1 1 ekstraktu.
Przykład 13. Włączenie testów diagnostycznych do ilościowych testów kolorymetrycznych
Test kolorymetryczny wykonywano zgodnie z Nikiforov i wsp. (PCR Methods and Applications 3: 285-291), z następującymi zmianami:
1) 3 0μ1 produktu PCR typu R i mieszaninę 3 M NaCl/20 mM EDTA dodawano do studzienki ze starterem wyłapującym. 50 μΐ produktu PCR typu W i mieszaninę 3 M NaCl/20 mM EDTA używano w reakcji hybrydyzacji.
2) Działanie egzonukleazą i reakcję hybrydyzacji prowadzono w 37°C.
Użyto rozcieńczenia 1:1000 monoklonalnych przeciwciał przeciw kompleksowi bioty na-peroksydaza chrzanu (HRP).
4) Po 2 min inkubacji z substratem dichlorowodorkiem O-fenylenodiaminy (OPD), do każdej studzienki testowej dodawano 50 μΐ 3N HCI. Odczyt z płytek z 96 studzienkami był wykonywany przy 492 nm, z odniesieniem do 570 nm, stosując standardowy czytnik płytek ELISA.
Startery zebrane w tabeli 5 były syntetyzowane tak, jak opisano w przykładzie 5, do testowania jako startery wyłapujące w teście kolorymetrycznym.
182 002
Tabela 5
Projekt startera wyłapującego do testu kolorymetrycznego
| Nazwa Startera | Matryca dla Startera | Sekwencja Startera |
| ITS2 | 5.8S rDNA | 5'GCTGCGTTCTTCATCGATGC3' (SEK NR ID:39) |
| JB541 | P.herp. typ W | 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG3' (SEK NR ID:19) |
| JB542 | P.herp. typ R | 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAA3'(SEK NR ID:20) |
| JB5381 | P.herp. typ W | 5TGACGACTCTAAACCCTACCA3' (SEK NR ID:66) |
| JB539’ | P.herp. typ R | 5'CGACGACTCTAAACCTTACCG3' (SEK NR ID:67) |
| W 130 | P.herp. typ W | 5'ATTCAAGGGTGGAGGTCTGA3' (SEK NR ID:68) |
| R130 | P.herp. typ R | 5'ATTCAAGGGTGGAGGTCTGG3' (SEK NR ID:69) |
| JB538’ | P.herp. typ 15 W | 5’CTCTAAACCCTACCA3' (SEK NR ID:70) |
| JB539' | P.herp. typ 15R | 5'CTCTAAACCTTACCG3' (SEK NR ID:71) |
| JB553 | typy R& W | 5'GTGGTCCTCTGGCAG3' (SEK NR ID:72) |
| JB554 | typy R& W | 5'CTCAACAGCCGAAGC3' (SEK NR ID:73) |
| JB555 | P.herp. typ W | 5'GGGTGGAGGTCTGA3' (SEK NR ID:74) |
| JB556 | P.herp. typ R | 5'GGTGGAGGTCTGG3' (SEK NR ID:75) |
| JB561 | P.herp. typ R | 5TGGAGGTCTGGACCA3' (SEK NR ID:76) |
| JB562 | P.herp. typ W | 5TGGAGGTCTGAACCA3' (SEK NR ID:77) |
| JB559 | P.herp. typ W | 5'AGGGTGGAGGTCTGA3' (SEK NR ID:78) |
| JB560 | P.herp. typ R | 5'AGGGTGGAGGTCTGG3' (SEK NR ID:79) |
| JB557 | P.herp. typ W | 5TTCTCCGAGAGGCCT3' (SEK NR ID:80) |
| JB558 | P.herp. typ R | 5TTCTCCGAGAGGCCC3' (SEK NR ID:81) |
Startery diagnostyczne dla S. nodorum: JB527 (SEK NR ID: 10) i JB 525 (SEK NR ID: 9) włączono do ilościowego testu kolorymetrycznego. Starter JB527 (SEK NR ID: 10) był syntetyzowany przez Midland Certified Reagent Complany (Midland, Teksas) tak, aby zawierał piętno biotynowe oraz aby zawierał na końcu 5' cztery wewnątrznukleotydowe wiązania fosforowosiarkowe. Reakcję powielania PCR prowadzono, jak opisano w przykładzie 4, stosując zmodyfikowane startery: JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9), dla pszenicy zdrowej i infekowanej S. nodorum w stopniu niewielkim, średnim i dużym, dającej odpowiednio zerowe, niskie, średnie i wysokie wartości A492 w prowadzonych testach kolorymetrycznych przy zastosowaniu startera ITS2 (SEK NR ID: 39) jako startera wyłapującego produkt PCR.
182 002
Startery z końca 5' specyficzne dla typu R P. herpotrichoides, JB539 (SEK NR ID: 17) i JB540 (SEK NR ID: 18) oraz starter z końca 5' specyficzny dla typu W P. herpotrichoides JB537 (SEK NR ID: 15), były również modyfikowane tak, aby zawierały piętno biotynowe oraz cztery wewnątrznukleotydowe wiązania fosforowosiarkowe. Opracowano kolorymetryczną wersję testu PCR dla typu R P. herpotrichoides, stosując zmodyfikowany starter JB540 (SEK NR ID: 18), starter JB542 (SEKNRID: 20) i starter wyłapujący JB539' 15. Produkty wytwarzane poprzez powielanie z pszenicy infekowanej typem R i z genomowego DNA stosując zmodyfikowany starter JB540 (SEK NR ID: 18) i starter JB542 (SEKNR ID: 20) dawały pozytywne wartości kolorymetryczne w czasie testów kolorymetrycznych. Pozytywne wartości kolorymetryczne otrzymywano również poprzez analizę kolorymetryczną produktów PCR z procesu powielania przy zastosowaniu zmodyfikowanego startera JB537 (SEK NR ID: 15) i specyficznego dla typu W startera JB541 (SEKNRID: 19) dla pszenicy infekowanej typem W i genomowego DNA typu W, gdy JB538' 15 był używany jako starter wyłapujący. Ponadto, intensywność sygnału kolorymetrycznego pozostawała w zgodności z intensywnością fragmentu będącego produktem PCR, uwidacznianego w żelu agarozowym.
Uprzednio, różne gatunki Septoria można było identyfikować poprzez badanie mikroskopowe, a identyfikacja różnych szczepów Pseudocercosporella była możliwa jedynie poprzez testy patologiczne. Podobnie, nie zostawiająca wątpliwości identyfikacja Mycosphaerella musicola i Mycosphaerella fijiensis była trudna i nawet izolacja dojrzałych peritecjów nie zawsze pozwalała na dokładną identyfikację (Pons, 1990; W. Sigatoka Leaf Spot Diseases of Banana, Wyd. R.A. Fullerton and R.H. Stover, International NetWork for the lmprovemenr of Banana and Plantain, France). Obecnie zestawy immunodiagnostyczne stosujące technikę ELISA są rutynowo stosowane do identyfikacji Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercoporella herpotrichoides i innych patogenów, ale technologia ta jest pozbawiona dokładności, granic wykrywania i zdolności rozróżniania różnych izolatów bieżącego wynalazku. W konsekwencji, rozwój testu DNA do szybkiej identyfikacji różnych szczepów tych grzybów przynosi realne korzyści nie tylko dla badaczy taksonomii grzybów, ale również dla postępowania przy chorobach i wybiórczego stosowania fungicydów w uprawach.
Jakkolwiek niniejszy wynalazek został opisany w odniesieniu do specyficznego wykonania, będzie uznane, że możliwe są liczne odmiany, modyfikacje oraz inne wykonania i, zgodnie z tym, wszystkie takie odmiany, modyfikacje i wykonania uważa się za pozostające w zakresie niniejszego wynalazku.
Depozyty
Następujące depozyty zostały złożone 28 marca 1994 w kolekcji Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.:
1. HB101 DHSd(pCRW2-l; SEKNRID: 3)
2. HB101 DHSd(pCRWS-l; SEKNRID: 47)
3. E. coli DHSd(pCRSTRITI; SEK NR ID: 1)
4. E. coli DHSd(pCRRI-21; SEK NR ID: 4)
5. E. coli DHSd(pCRSNOD31; SEK NR ID: 2)
Nr Dostępu NRRL B-21231 Nr Dostępu NRRL B-21232 Nr Dostępu NRRL B-21233 Nr Dostępu NRRL B-21234 Nr Dostępu NRRL B-21235
182 002
ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) WNIOSKUJĄCY: Ligon, James M Beck, James J (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Wykrywanie patogenów grzybowych przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 86 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRES: Ciba-Geigy Corporation (B) ULICA: 7 Skyline Drive (C) MIASTO: Hawthome (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD: 10532 (v) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:
(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) DANE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US TBA (B) DATA ZAREJESTROWANIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/233,608 (B) DATA ZAREJESTROWANIA: 4 kwietnia 1994 (viii) INFORMACIE O PEŁNOMOCNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Walsh, Andrea C.
(B) NUMER REJESTRACJI: 34,988 (C) ODNOŚNIK/NUMER SPRAWY: CGC 1739 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
182 002 (A) TELEFON: 919-541-8666 (B) TELEFAKS: 919-541-8689 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 548 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1... 548 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnę trznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria tritici (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR1:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | GGGATCATTA | CCGAGCGAGG | GCCTCCGGGT | CCGACCTCCA | 60 |
| ACCCTTTGTG | AACACATCCC | GTTGCTTCGG | GGGCGACCCT | GCCGGGCGCC | CCCGGAGGAC | 120 |
| CACCAAAAAA | CACTGCATCT | CTGCGTCGGA | GTTTACGAGT | AAATCGAAAC | AAAACTTTCA | 180 |
| ACAACGGATC | TCTTGGTTCT | GGCATCGATG | AAGAACGCAG | CGAAATGCGA | TAAGTAATGT | 240 |
| GAATTGCAGA | ATTCAGTGAA | TCATCGAATC | TTTGAACGCA | CATTGCGCCC | CCTGGTATTC | 300 |
| CGGGGGGCAT | GCCCGTTCGA | GCGTCATTAC | ACCACTCCAG | CCTCGCTGGG | TATTGGGCGT | 360 |
| CTTTTCGCGG | GGGATCACTC | CCCCGCGCGC | CTCAAAGTCT | CCGGCTGAGC | GGTCTCGTCT | 420 |
| CCCAGCGTTG | TGGCATCACG | TCTCGCCGCG | GAGTTCACGA | GCCCTCACGG | CCGTTAAATC | 480 |
| ACACCTCAGG | TTGACCTCGG | ATCGGGTAGG | GATACCCGCT | GAACTTAAGC | ATATCAATAA | 540 |
GCGGAGGA 548 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 583 base pairs (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Septoria nodorum (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1...583 (D) Pozostałe informacje: /hote= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria tritici (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:2:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | AGGATCATTA | CACTCAGTAG | TTTACTACTG | TAAAAGGGGC | 60 |
| TGTTAGTCTG | TATAGCGCAA | GCTGATGAGC | AGCTGGCCTC | TTTTATCCAC | CCTTGTCTTT | 120 |
| TGCGTACCCA | CGTTTCCTCG | GCAGGCTTGC | CTGCCGGTTG | GACAAATTTA | TAACCTTTTT | 180 |
| AATTTTCAAT | CAGCGTCTGA | AAAACTTAAT | AATTACAACT | TTCAACAACG | GATCTCTTGG | 240 |
| TTCTGGCATC | GATGAAGAAC | GCAGCGAAAT | GCGATAAGTA | GTGTGAATTG | CAGAATTCAG | 300 |
| TGAATCATCG | ?ATCTTTGAA | CGCACATTGC | GCCCCTTGGT | ATTCCATGGG | GCATGCCTGT | 360 |
| TCGAGCGTCA | TTTGTACCCT | CAAGCTCTGC | TTGGTGTTGG | GTGTTTGTCC | TCTCCCTAGT | 420 |
| GTTTGGACTC | GCCTTAAAAT | AATTGGCAGC | CAGTGTTTTG | GTATTGAAGC | GCAGCACAAG | 480 |
| TCGCGATTCG | TAACAAACAC | TTGCGTCCAC | AAGCCTTTTT | AACTTTTGAC | CTCGGATCAG | 540 |
| GTAGGGATAC | CCGCTGAACT | TAAGCATATC | AATAAGCGGA | GGA | 583 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 626 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie
182 002 (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO :
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B) SZCZEP: Szczep R (C) INDYWIDUALNY IZOLAT: Wariant W2-1 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1..626 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu W (wariant W2-1) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:3:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | AGGATCATTA | ATAGAGCAAT | GAACAGACAG | CGCCCCGGGA | 60 |
| GAAATCCTGG | GGGCTACCCT | ACTTGGTAGG | GTTTAGAGTC | GTCAGGCCGC | TCGGAGAAGC | 120 |
| CTGGTTCAGA | CCTCCACCCT | TGAATAAATT | ACCTTTGTTG | CTTTGGCAGG | GCGCCTCGCG | 180 |
| CCAGCGGCTT | CGGCTGTTGA | GTACCTGCCA | GAGGACCACA | ACTCTTGTTT | TTAGTGATGT | 240 |
| CTGAGTACTA | TATAATAGTT | AAAACTTTCA | ACAACGGATC | TCTTGGTTCT | GGCATCGATG | 300 |
| AAGAACGCAG | CGAAATGCGA | TAAGTAATGT | GAATTGCAGA | ATTCAGTGAA | TCATCGAATC | 360 |
| TTTGAACGCA | CATTGCGCCC | TCTGGTATTC | CGGGGGGCAT | GCCTGTTCGA | GCGTCATTAT | 420 |
| AACCACTCAA | GCTCTCGCTT | GGTATTGGGG | TTCGCGTCCT | CGCGGCCTCT | AAAATCAGTG | 480 |
| GCGGTGCCTG | TCGGCTCTAC | GCGTAGTAAT | ACTCCTCGCG | ATTGAGTCCG | GTAGGTTTAC | 540 |
| TTGCCAGTAA | CCCCCAATTT | TTTACAGGTT | GACCTCGGAT | CAGGTAGGGA | TACCCGCTGA | 600 |
| ACTTAAGCAT | ATCAATAAGC | GGAGGA | 626 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 627 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie
182 002 (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO :
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B) SZCZEP: Szczep R (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1..627 (D) POZOSTAŁE INFORMACJE : /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu R (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:4:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | AGGATCATTA | ATAGAGCAAT | GGATAGACAG | CGCCCCGGGA | 60 |
| GAAATCCTGG | GGGCCACCCT | ACTTCGGTAA | GGTTTAGAGT | CGTCGGGCCT | CTCGGAGAAG | 120 |
| CCTGGTCCAG | ACCTCCACCC | TTGAATAAAT | TACCTTTGTT | GCTTTGGCAG | GGCGCCTCGC | 180 |
| GCCAGCGGCT | TCGGCTGTTG | AGTACCTGCC | AGAGGACCAC | AACTCTTGTT | TTTAGTGATG | 240 |
| TCTGAGTACT | ATATAATAGT | TAAAACTTTC | AACAACGGAT | CTCTTGGTTC | TGGCATCGAT | 300 |
| GAAGAACGCA | GCGAAATGCG | ATAAGTAATG | TGAATTGCAG | AATTCAGTGA | ATCATCGAAT | 360 |
| CTTTGAACGC | ACATTGCGCC | CTCTGGTATT | CCGGGGGGCA | TGCCTGTTCG | AGCGTCATTA | 420 |
| TAACCACTCA | AGCTCTCGCT | TGGTATTGGG | GTTCGCGTCT | TCGCGGCCTC | TAAAATCAGT | 480 |
| GGCGGTGCCT | GTCGGCTCTA | CGCGTAGTAA | TACTCCTCGC | GATTGAGTCC | GGTAGGTTTA | 540 |
| CTTGCCAGCA | ACCCCCAATT | TTTTACAGGT | TGACCTCGGA | TCAGGTAGGG | ATACCCGCTG | 600 |
| AACTTAAGCA | TATCAATAAG | CGGAGGA | 627 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 534 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Mycosphaerella fijiensis
182 002 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA : 1..534 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Mycosphaerella fijiensis (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:5:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACGCCC GACCTCCAAC
CCTTTGTGAA CCACAACTTG TTGCTTCGGG GGCGACCTGC CGTCGGCGGG CGCCCCCGGA
GGCCGTCTAA ACACTGCATC TTTGCGTCGG AGTTTAAAAC AAATCGAACA AAACTTTCAA
CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG
AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT TTGGTATTCC
GAAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA CCACTCAAGC CTGGCTTGGT ATTGGGCGTC gcGgttcttc gcgcgcctta aagtctccgg ctgagctgtc cgtctctaag cgttgtggat
CTTTCAATTC GCTTCGGAGT GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTTATT CAAAGGTTGA
CCTCGGATCA GGTAGGGATA CCCGCTGAAC TTAAGCATAT CAATAAGCGG AGGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 540 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Mycosphaerella musicola (ix) CECHY :
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1...540 (D) Pozostałe informacje : /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Mycosphaerella musicola
120
180
240
300
360
420
480
534
182 002 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:6:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGG | GGGATCATTA | CCGAGTGAGG | GCTCACCCCC | GACCTCCAAC | 60 |
| CCTTTGTGAA | CCACACCTGT | TGCTTCGGGG | GCGACCCTGC | CGGCGAACTT | GTCGCCGGGC | 120 |
| GCCCCCGGAG | GTCTCCTTAA | CACTGCATCT | CTGCGTCGGA | GTTCCAAACA | AATCGGACAA | 180 |
| AACTTTCAAC | AACGGATCTC | TTGGTTCTGG | CATCGATGAA | GAACGCAGCG | AAATGCGATA | 240 |
| AGTAATGTGA | ATTGCAGAAT | TCAGTGAATC | ATCGAATCTT | TGAACGCACA | TTGCGCCCTT | 300 |
| TGGCATTCCG | AAGGGCATGC | CTGTTCGAGC | GTCATTTCAC | CACTCAAGCC | TAGCTTGGTA | 360 |
| TTGGGCGCCG | CGGTGCTCCG | CGCGCCCCAA | AGTCTCCCGG | CTAAGCCGTC | CGTCTCTAAG | 420 |
| CGTTGTGGAT | TTTTCAGTTC | GCTCCGGAGC | GCGGGTGGCC | GCGGCCGTTA | AATCTTCAAA | 480 |
| GGTTGACCTC | GGATCAGGTA | GGGATACCCG | CTGAACTTAA | GCATATCAAT | AAGCGGAGGA | 540 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB433 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:7:
ACACTCAGTA GTTTACTACT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB434 ii) IPOTETYCZNA: Nie iv) NTYSENSOWNA: Nie
182 002 xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:8:
TGTGCTGCGC TTCAATA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :9:
i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB525 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:9:
GCGACTTGTG CTGCGCTTCA ATA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB527 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:10:
CATTACACTC AGTAGTTTAC TACT
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB445 iii) IPOTETYCZNA: Nie iv) NTYSENSOWNA: Nie xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:11:
CTGCGTCGGA GTTTACG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :12:
i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB446 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:12:
CGAGGCTGGA GTGGTGT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB526 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:13:
CCCAGCGAGG CTGGAGTGGT GT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB536 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:14:
CTGGGGGCTA CCCTACTTGG TAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB537 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 002 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:15:
GGGGGCTACC CTACTTGGTA G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB538 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:16:
ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB539 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:17:
CTTCGGTAAG GTTTAGAGTC GTCG
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB540 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:18:
GGGGGCCACC CTACTTCGGT AA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB541 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:19:
CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB542 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:20:
CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB543 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:21:
CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT A (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB544 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 002 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:22:
CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB547 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:23:
ATTACCGAGT GAGGGCTCAC GC 22 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB548 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:24:
GTTGCTTCGG GGGCGACCTG 20
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 base pairs (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB442 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:25:
TCGGGGGCGA CCTGCCG 17 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 base pairs (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA . liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB443 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:26:
CCGGAGGCCG TCTA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB545 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:27:
CCACAACGCT TAGAGACGGA CAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :28:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB546 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:28:
CACCCGCACT CCGAAGCGAA TT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :29:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB549 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 002 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:29:
GATCCGAGGT CAACCTTTGA ATAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :30:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB444 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:30:
GGTCAACCTT TGAATAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :31:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB451 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:31:
CCTTTGTGAA CCACACCT
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :32:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB440 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:32:
CTGCCGGCGA ACTT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :33:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB449 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:33:
ACCCTGCCGG CGAACTT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :34:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB448 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:34:
GCGACCCTGC CGGCGAAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :35:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB441 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:35:
TAGCCGGGAG ACTTTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :36:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB450 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 002 (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 36:
TCTGCGTCGG AGTTCC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :37:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI;
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy J8452 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:37:
CCGCGCTCCG GAGCGAAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :38:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy ITS1 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:38:
TCCGTAGGTG AACCTGCGG
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :39:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy ITS2 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 39:
GCTGCGTTCT TCATCGATGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :40:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy ITS3 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 40:
GCATCGATGA AGAACGCAGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :41:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 002 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy ITS4 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:41:
TCCTCCGCTT ATTGATATGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 42:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPB-12 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 42:
CCTTGACGCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 43:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy OPE-6 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 002 (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:43:
AAGACCCCTC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :44:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPE-12 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 44:
TTATCGCCCC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 45:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPE-19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:45:
ACCCCCGAAG
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 46:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy OPE-15 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 46:
ACGCACAACC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :47:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 627 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B) STRAIN: Szczep W (C) POJEDYNCZY IZOLAT: Wariant W5-1 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA : 1..627 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu W (wariant W5-1)
182 002 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:47:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | AGGATCATTA | ATAGAGCAAT | GAACAGACAG | CGCCCTGGGA | 60 |
| GAAATCCTGG | GGGCTACCCT | ACTTCGGTAG | GGTTTAGAGT | CGTCAGGCCT | CTCGGAGAAG | 120 |
| CCTGGTTCAG | ACCTCCACCC | TTGAATAAAT | TACCTTTGTT | GCTTTGGCAG | GGCGCCTCGC | 180 |
| GCCAGCGGCT | TCGGCTGTTG | AGTACCTGCC | AGAGGACCAC | AACTCTTGTT | TTTAGTGATG | 240 |
| TCTGAGTACT | ATATAATAGT | TAAAACTTTC | AACAACGGAT | CTCTTGGTTC | TGGCATCGAT | 300 |
| GAAGAACGCA | GCGAAATGCG | ATAAGTAATG | TGAATTGCAG | AATTCAGTGA | ATCATCGAAT | 360 |
| CTTTGAACGC | ACATTGCGCC | CTCTGGTATT | CCGGGGGGCA | TGCCTGTTCG | AGCGTCATTA | 420 |
| TAACCACTCA | AGCTCTCGCT | TGGTATTGGG | GTTCGCGTCC | TCGCGGCCTC | TAAAATCAGT | 480 |
| GGCGGTGCCT | CTCGGCTCTA | CGCGTAGTAA | TACTCCTCGC | GATTGAGTCC | GGTAGGTTTA | 540 |
| CTTGCCAGTA | ACCCCCAATT | TTTTACAGGT | TGACCTCGGA | TCAGGTAGGG | ATACCCGCTG | 600 |
| AACTTAAGCA | TATCAATAAG | CGGAGGA | 627 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 48:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Uniwersalny 20 oligonukleotydowy starter M13 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 48:
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 49:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Uniwesalny odwrócony (reverse) starter oligonukleotydowy Ml 3 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 49:
AACAGCTATG ACCATG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :50:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB563 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:50:
CTTGCCTGCC GGTTGGACAA ATT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :51:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB564 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:51:
CTCAGTAGTT TACTACTGTA AAAGG
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 52:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Oligonukleotyd JB565 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:52:
CTTCTGGACG CAAGTGTTTG TTAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :53:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB566 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:53:
GTTTTTAGTG GAACTTCTGA GT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :54:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB56 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:54:
CGCAGGAACC CTAAACTCT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 55:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB568 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:55:
GCCCGCCGCA GG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :56:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB569 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:56:
RTWWTTWRTG GAMYYTCTGA GT
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 57:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB570 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:57:
TATGTTGCCT CGGCGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :58:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB571 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:58:
TAACGATATG TAAATTACTA CGCT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :59:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB572 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:59:
AAGTTGGGGT TTAACGGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 60:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB 573 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:60:
AGCGAGCCCG CCAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :61:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB574 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:61:
CCATTGTGAA CGTTACCTAT AC
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :62:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis= Starter oligonukleotydowy JB575 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:62:
CGACCAGAGC GAGATGTA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :63:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB576 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:63:
GTGAACATAC CTTATGTTGC C (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :64:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB577 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:64:
GTTGCCTCGG CGGATC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :65:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI:. pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB578 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:65:
CCGCGACGAT TACCAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :66:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB538 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 66:
TGACGACTCT AAACCCTACC A
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 67:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB539' iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:67:
CGACGACTCT AAACCTTACC G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :68:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy W130 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:68:
ATTCAAGGGT GGAGGTCTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :69:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy R130 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 69:
ATTCAAGGGT GGAGGTCTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :70:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB539'15 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:70:
CTCTAAACCC TACCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :71:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis= Starter oligonukleotydowy JB53915 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:71:
CTCTAAACCT TACCG
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :72:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB553 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR :72:
GTGGTCCTCTGGCAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 73:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Starter oligonukleotydowy JB554 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 73:
CTCAACAGCC GAAGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 74:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB555 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 74:
GGGTGGAGGTCTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :75:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Starter oligonukleotydowy JB556 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 75:
GGTGGAGGTC TGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 76:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB561 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 76:
TGGAGGTCTG GACCA
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 77:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Starter oligonukleotydowy JB562 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:77:
TGGAGGTCTG AACCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 78:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB559 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 78:
AGGGTGGAGGTCTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 79:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 002 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB560 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:79:
AGGGTGGAGG TCTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :80:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB557 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:80:
TTCTCCGAGA GGCCT 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :81:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Starter oligonukleotydowy JB558 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 81:
TTCTCCGAGA GGCCC 15
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 82:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 504 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1...504 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium culmorum (fculm.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:82:
| GAGGGATCAT | TACCGAGTTT | ACTRACTCCC | AAACCCCTGT | GAACDTACCT | TATGTTGCCT | 60 |
| CGGCGGATCA | GCCCGCGCCC | CGTAAAAAGG | GACGGCCCGC | CGCAGGAACC | CTAAACTCTG | 120 |
| TTTTTAGTGG | AACTTCTGAG | TATAAAAAAC | AAATAAATCA | AAACTTTCAA | CAACGGATCT | 180 |
| CTTGGTTCTG | GCATCGATGA | AGAACGCAGC | AAAATGCGAT | AAGTAATGTG | AATTGCAGAA | 240 |
| TTCAGTGAAT | CATCGAATCT | TTGAACGCAC | ATTGCGCCCG | CCAGTATTCT | GGCGGGCATG | 300 |
| CCTGTTCGAG | CGTCATTTCA | ACCCTCAAGC | CCAGCTTGGT | GTTGGGAGCT | GCAGTCCTGC | 360 |
| TGCACTCCCC | AAATACATTG | GCGGTCACGT | CGRAGCTTCC | ATAGCGTAGT | AATTTACATA | 420 |
| TCGTTACTGG | TAATCGTCGC | GGCYACGCCG | TTAAACCCCA | ACTTCTGAAT | GTTGACCTCG | 480 |
| GATCAGGTAG | GAATACCCGC | TGAA | 504 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :83:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 503 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
182 002 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1..5.03 (D) Pozostałe informacje : /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium graminearum (fgram.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:83:
| GGATCATTAC | CGAGTTTACW | SACTCCCAAA | CCCCTGTGAA | CATACCTTAT | GTTGCCTCGG | 60 |
| CGGATCAGCC | CGCGCCCCGA | AAGGGACGGC | CCGCCGCAGG | AACCCTAAAC | TCTGTTTTTA | 120 |
| GTGGAACTTC | TGAGTATAAA | AAACAAATAA | ATCAAAACTT | TCAACAACGG | ATCTCTTGGT | 180 |
| KCTGGCATCG | ATGAAGAACG | CASCRAAATG | CGATAAGTAA | TGTGWATTGC | AGAATTCAGT | 240 |
| GAATCAWCGA | ATCTTTGAAC | GCWSATTGCK | MCCRCCAGTA | TTCTGGCGGG | CATGCCTGTT | 300 |
| CGAGCGTCAT | TTCAACCCTC | AAGCCCAGVT | TGGTGTKGGG | GARYTGCAGK | CCTRYTKCAC | 360 |
| TCCCCAAATA | ARTTGGCGGT | CACGTCGAAC | TTCCATAGCG | TAGTAAGTTA | CACATCGTTA | 420 |
| CTGGTAATCG | TCGCGGCTAC | GCCGTTAAAC | CCCAACTTCT | GAATGTTGAC | CTCGGATCAG | 480 |
| GTAGGAATAC | CCGCTGAAGG | TAA | 503 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 84:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 353 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1...353 (D) Pozostałe informacje : /uwaga = Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium moniliforme (fmono.con)
182 002 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:84:
| TCCGTAGGTG | AACCTGCGGA | TAGGRGTCAT | TASMGAGTTT | ACWACTSCCA | AACCCCTGTG | 60 |
| AAYATACCTT | ATGTTGCSTC | GGCGGATCAG | CCCGCGCSCC | GTARRAAGGG | ACGGCCCGCC | 120 |
| GCAGGAACCC | TAAACTCTGT | TTTTAGTGGA | ACTTCTGAGT | ATAAAAAACA | AATAAATCAA | 180 |
| AACTTTCAAC | AACGGATCTC | TTGGTTCTGG | CATCGATGAA | GAACGCAGCA | AAATGCGATA | 240 |
| AGTAATGTGA | ATTGCAGAAT | TCAGTGAATC | ATCGAATCTT | TGAACGCACA | TTGYGMCCGC | 300 |
| CAGTATTCTG | GCGGGCATGC | CTGTTCGAGC | GTCATTTCAA | CCCTCAAGCC | CAG | 353 |
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 85:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 545 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1...545 (D) Pozostałe informacje : Zuwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Microdochium nivale (mnivale.txt) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:85:
| GCGGATCATT | ACAGAGTTGC | AAAACTCCCT | AAACCATTGT | GAACGTTACC | TATACCGTTG | 60 |
| CTTCGGCGGG | CGGCCCCGGG | GTTTACCCCC | CGGRAGYCCC | TGGKMCCCAC | CGCGGGSGCC | 120 |
| MGCCGGAGGT | CACCAAACTC | TTGATAATTT | ATGGCCTCTC | TGAGTCTTCT | GTACTGAATA | 180 |
| AGTCAAAACT | TTCAACAACG | GATCTCTTGG | TTCTGGCATC | GATGAAGAAC | GCAGCGAAAT | 240 |
| GCGATAAGTA | ATGTGAATTG | CAGAATTCAG | TGAATCATCG | AATCTTTGAA | CGCACATTGC | 300 |
| GCCCGCCAGC | ATTCTGGCGG | GCATGCCTGT | TCGAGCGTCA | TTTCAACCAT | CAAGCCCCCG | 360 |
| GGCTTGTGTT | GGGGACCTRC | GGCTGCCGCA | GGCCCTGAAA | AGCAGTGKCG | GGCTCGCTGT | 420 |
| CGCACCGAGM | GTAGTAGSAT | ACATCTCGCT | CTGGTCGCGC | CGCGGGTTCC | GGCCGTTAAA | 480 |
| CCACCTTTTT | AACCCAAGGT | TGACCTCGGA | TCAGGTAGGA | AGACCCGCTG | AACTTACGCA | 540 |
TATCA
545
182 002 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 86:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 563 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA : 1...563 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria avenae
f. sp. tricicea ATCC# 26380 (satits.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 86:
| TCCCGTAGGT | GAACCTGCGG | AAGGATCATT | ACACTCAGTA | GTTTACTACT | GTAAAGGAGG | 60 |
| CTGTTAGTCT | GTATAGCGCA | AGCTGATGAG | CAGCTAGCCT | CTTTTATCCA | CCCTTGTCTT | 120 |
| TTGCGTACCC | ACGTTTCCTC | GGCAGGCTTG | CCTGCCGATT | GGACAAACCT | ATAACCTTTT | 180 |
| TAATTTTCAA | TCAGCGTCTG | AAAAACTTAA | TAATTACAAC | TTTCAACAAC | GGATCTCTTG | 240 |
| GTTCTGGCAT | CGATGAAGAA | CGCAGCGAAA | TGCGATAAGT | AGTGTGAATT | GCAGAATTCA | 300 |
| GTGAATCATC | GAATCTTTGA | ACGCACATTG | CGCCCCTTGG | TATTCCATGG | GGCATGCCTG | 360 |
| TTCGAGCGTC | ATTTGTACCC | TCAAGCTCTG | CTTGGTGTTG | GGTGTTTGTC | CTCTCCCTAG | 420 |
| TGTTTGGACT | CGCCTTAAAA | TAATTGGCAG | CCAGTGTTTT | GGTAYTGAAG | CGCAGCACAA | 480 |
| GTCGCGATTC | TTATCAAATA | CTTGCGTCCA | CAAGCCCTTT | TTTAACTTTT | GACCTCGGAT | 540 |
CAGGTAGGAG ACCGCTGACT TAA
563
182 002
182 002
182 002
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Izolowana cząsteczka DNA, zawierająca sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybraną z grupy, składającej się z SEKNRID: 1, SEKNRID: 2 oraz SEKNRID: 86.
- 2. Starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 i SEK NR ID: 50 do 52.
- 3. Para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrana z grupy, obejmującej SEK NR ID: 7 do 13, SEK NR ID: 50 do 52 oraz SEK NR ID: 38 do 41.
- 4. Para starterów oligonukleotydowych według zastrz. 3, znamienna tym, że jest wybrana z grupy, składającej się z następujących par starterów:SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8,SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 41,SEK NR ID: 8 i SEK NR ID: 38,SEK NR ID: 8 i SEK NR ID: 40,SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 10,SEK NR ID: 11 i SEK NR ID: 12,SEK NR ID: 51 i SEK NR ID: 52 orazSEK NR ID: 50 i SEK NR ID: 52.
- 5. Para starterów oligonukleotydowych według zastrz. 3, znamienna tym, że jest określona SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8.
- 6. Para starterów oligonukleotydowych według zastrz. 3, znamienna tym, że jest wybrana z grupy, składającej się z następujących par starterów:SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 41,SEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 40,SEK NR ID: 11 i SEK NR ID: 41 orazSEK NR ID: 12 i SEK NR ID: 38.
- 7. Sposób wykrywania patogenu grzybowego, znamienny tym, że (a) izoluje się DNA z liścia zainfekowanego patogenem, (b) powiela się część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika takiego patogenu przy zastosowaniu tego DNA jako matrycy w reakcji łańcuchowej polimerazy z następującymi parami starterów:SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 8,SEK NR ID: 9 i SEK NR ID: 10,SEK NR ID: 11 i SEK NR ID: 12,SEK NR ID: 51 i SEK NR ID: 52 orazSEK NR ID: 50 i SEK NR ID: 52182 002 albo z parą starterów, w której jeden starterjest wybrany z grupy, obejmującej SEKNRID: 7 do 13 i SEKNRID: 50 do 52, a drugi starter jest wybrany z grupy, składającej się z SEKNRID: 38 do 41, oraz (c) wizualizuje się tak powieloną część regionu Transkrybowanego Wewnętrznego Przerywnika.
- 8. Sposób według zastrz 7, znamienny tym, że patogen grzybowy jest wybrany spośród grupy, obejmującej Septoria nodorum, Septoria tritici i Septoria avenaef. sp. triticea
- 9. Zestaw do wykrywania Septoria, zawierający nośnik umieszczony w bliskim sąsiedztwie jednego lub większej liczby pojemniczków, znamienny tym, że jeden z pojemniczków zawiera starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu, bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrany z grupy, obejmującej SEK NR ID: 1, SEK NR ID: 2 oraz SEK NR ID: 86.
- 10. Zestaw do wykrywania Septoria według zastrz, 9, znamienny tym, że starterjest wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 i SEK NR ID: 50 do 52.
- 11. Zestaw do wykrywania Septoria według zastrz, 9, znamienny tym, że zawiera parę starterów oligonukleotydowych, w której jeden starterjest wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 i SEKNRID: 50 do 52, a drugi starterjest wybrany z grupy, składającej się z SEK NR ID: 38 do 41.
- 12. Sposób ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów, znamienny tym, że (a) izoluje się DNA z liścia rośliny zainfekowanej grzybowym patogenem, (b) powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy część sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika tego grzybowego patogenu, zastosowaną] ako matryca z parą starterów, przy czym para starterów jest parą starterów diagnostycznych i jest wybrana z grupy, składającej się z SEK NR ID: 7 do 13 oraz SEK NR ID: 50 do 52 oraz (c) wizualizuje się powieloną część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika przy zastosowaniu startera wyłapującego wybranego z grupy, obejmującej SEK NR ID: 10, 20,391 66-81.
- 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że startery diagnostyczne są wybrane z SEK NR ID: 9 i SEKNRID: 10, a starterem wyłapującym jest starter określony SEK NR ID: 39. * * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/233,608 US5585238A (en) | 1994-04-25 | 1994-04-25 | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| PCT/US1995/004712 WO1995029260A2 (en) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL316962A1 PL316962A1 (en) | 1997-02-17 |
| PL182002B1 true PL182002B1 (pl) | 2001-10-31 |
Family
ID=22877959
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95316962A PL182002B1 (pl) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PL |
| PL95342643A PL182188B1 (pl) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Pseudocercosporella herpotrichoides oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL |
| PL95342644A PL182212B1 (pl) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95342643A PL182188B1 (pl) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Pseudocercosporella herpotrichoides oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL |
| PL95342644A PL182212B1 (pl) | 1994-04-25 | 1995-04-19 | Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5585238A (pl) |
| EP (2) | EP0758404B1 (pl) |
| JP (1) | JPH10501965A (pl) |
| CN (1) | CN1072726C (pl) |
| AT (2) | ATE189703T1 (pl) |
| AU (1) | AU699766B2 (pl) |
| BR (1) | BR9507513A (pl) |
| CA (1) | CA2185560A1 (pl) |
| DE (2) | DE69515029T2 (pl) |
| DK (1) | DK0758404T3 (pl) |
| ES (1) | ES2143051T3 (pl) |
| GR (1) | GR3032928T3 (pl) |
| PL (3) | PL182002B1 (pl) |
| PT (1) | PT758404E (pl) |
| RU (1) | RU2161196C2 (pl) |
| WO (1) | WO1995029260A2 (pl) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585238A (en) * | 1994-04-25 | 1996-12-17 | Ciba-Geigy Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6180339B1 (en) | 1995-01-13 | 2001-01-30 | Bayer Corporation | Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi |
| DE19615934C1 (de) * | 1996-04-22 | 1997-10-02 | Martin Ludwig Dr Niessen | Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium Graminearum in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial |
| US5792611A (en) * | 1996-05-23 | 1998-08-11 | Natural Resources Canada, Canadian Forest Service | Detection of plant pathogenic fungi |
| US6326485B1 (en) * | 1996-07-26 | 2001-12-04 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Assay for perkinsus in shellfish |
| US5874221A (en) * | 1996-08-28 | 1999-02-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Species specific method for the PCR detection of phythophthora |
| US5814453A (en) * | 1996-10-15 | 1998-09-29 | Novartis Finance Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US5800997A (en) * | 1996-11-01 | 1998-09-01 | Novartis Finance Corporation | Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| CA2270665A1 (en) * | 1996-11-11 | 1998-05-22 | Novartis Ag | Use of biosensors to diagnose plant diseases |
| ATE320506T1 (de) * | 1997-05-02 | 2006-04-15 | Us Gov Health & Human Serv | Nukleinsäuren zur erkennung von aspergillus spezien |
| US5827695A (en) * | 1997-08-04 | 1998-10-27 | Novartis Finance Corporation | Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6080543A (en) * | 1997-12-08 | 2000-06-27 | E. & J. Gallo Winery | Detection of fungal pathogens |
| US6358680B1 (en) * | 1998-02-20 | 2002-03-19 | Syngenta Participations Ag | Detection of wheat and barley fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6248519B1 (en) * | 1998-03-11 | 2001-06-19 | E & J Gallo Winery | Detection of fermentation-related microorganisms |
| US6387652B1 (en) * | 1998-04-15 | 2002-05-14 | U.S. Environmental Protection Agency | Method of identifying and quantifying specific fungi and bacteria |
| FR2781812B1 (fr) * | 1998-07-30 | 2002-12-20 | Lallemand Sa | Procede d'identification specifique de levures |
| DE19840531C2 (de) * | 1998-08-28 | 2003-05-15 | Roboscreen Ges Fuer Molekulare | Mit Nukleinsäuren beschichtete Reaktionsräume, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| US6221595B1 (en) | 1999-03-01 | 2001-04-24 | Syngenta Participations Ag | Detection of Monilinia spp. using the polymerase chain reaction |
| US6469156B1 (en) | 1999-04-20 | 2002-10-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Rapid and sensitive method for detecting histoplasma capsulatum |
| CA2374878C (en) | 1999-05-28 | 2014-10-14 | Innogenetics N.V. | Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens |
| US6319673B1 (en) * | 1999-08-10 | 2001-11-20 | Syngenta Participations Ag | PCR-based detection and quantification of Tapesia yallundae and Tapesia acuformis |
| JP2003506066A (ja) * | 1999-08-10 | 2003-02-18 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | Ｔａｐｅｓｉａｙａｌｌｕｎｄａｅ及びＴａｐｅｓｉａａｃｕｆｏｒｍｉｓの、ＰＣＲに基づく検出および定量 |
| GB2354764A (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-04 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of microorganisms in plant material |
| US6485907B1 (en) * | 2000-01-11 | 2002-11-26 | Syngenta Participations Ag | PCR-based detection of Rhizoctonia cerealis |
| US6287779B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | E. & J. Gallo Winery | Detection of fermentation-related microorganisms |
| CN1436248A (zh) * | 2000-06-16 | 2003-08-13 | 辛根塔参与股份公司 | 利用聚合酶链式反应对球腔菌属的检测 |
| US6645720B2 (en) * | 2001-03-09 | 2003-11-11 | Syngenta Participations Ag | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6846631B2 (en) * | 2001-09-24 | 2005-01-25 | Syngenta Participations Ag | Detection of Fusarium species infecting corn using the polymerase chain reaction |
| EP1438429B1 (en) * | 2001-09-26 | 2009-11-18 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health & Human Services | Nucleic acids for the identification of fungi and methods for using the same |
| ES2193862B1 (es) * | 2001-12-20 | 2005-03-01 | Universidad De Cordoba | Metodo para el analisis molecular de la diversidad genetica en razas de fusarium oxysporum f. sp. ciceris mediante rep-pcr. |
| ES2193861B1 (es) * | 2001-12-20 | 2005-03-01 | Universidad De Cordoba | Metodo para la identificacion molecular de fusarium oxysporum f. sp. ciceris y sus razas patogenicas 0,5 y 6 mediante pcr especifica. |
| US20040166492A1 (en) * | 2002-02-05 | 2004-08-26 | Engel Stacia R. | Quantitative detection of dekkera and saccharomyces |
| AU2003230759A1 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-20 | Syngenta Participations Ag | Detection of wheat and barley fungal pathogens which are resistant to certain fungicides using the polymerase chain reaction |
| RU2233888C1 (ru) * | 2002-12-15 | 2004-08-10 | Дальневосточный государственный медицинский университет | Способ обнаружения микроорганизма "montezuma" |
| CA2561145C (en) | 2004-03-30 | 2014-10-28 | Monsanto Technology Llc | Methods for controlling plant pathogens using n-phosphonomethylglycine |
| EP2019687B1 (en) | 2006-03-29 | 2014-03-19 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| DE102007010311A1 (de) * | 2007-02-23 | 2008-08-28 | Thines, Marco, Dr. | Organismusspezifisches hybridisierbares Nucleinsäuremolekül |
| RU2465332C1 (ru) * | 2011-08-08 | 2012-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции |
| CN104630369B (zh) * | 2015-02-13 | 2016-02-24 | 湖南农业大学 | 水稻恶苗病菌的pcr检测方法 |
| CN104846094A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-08-19 | 青岛农业大学 | 草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用 |
| BR112020025276A2 (pt) | 2018-07-17 | 2021-03-09 | Bayer Sas | Métodos biológicos para controlar fungos fitopatogênicos |
| JP7399451B2 (ja) * | 2019-10-02 | 2023-12-18 | 国立大学法人九州大学 | バラタナゴ類の判別方法及び判別キット |
| RU2735911C1 (ru) * | 2020-06-01 | 2020-11-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова" | Способ идентификации гриба Heterobasidion annosum |
| CN113637788B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-09-20 | 贵州茅台酒股份有限公司 | 一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法 |
| CN115838639B (zh) * | 2022-12-17 | 2024-02-13 | 昆明理工大学 | 白茅种子内生真菌df101及其应用 |
| CN116790779A (zh) * | 2023-08-14 | 2023-09-22 | 广东美格基因科技有限公司 | 一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US5447848A (en) * | 1986-01-22 | 1995-09-05 | Amoco Corporation | Detection of campylobacter with nucleic acid probes |
| CA2025181A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting fungi |
| US5126239A (en) * | 1990-03-14 | 1992-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| US5585238A (en) * | 1994-04-25 | 1996-12-17 | Ciba-Geigy Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
-
1994
- 1994-04-25 US US08/233,608 patent/US5585238A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-19 EP EP95918255A patent/EP0758404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-19 AT AT95918255T patent/ATE189703T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 AU AU24244/95A patent/AU699766B2/en not_active Ceased
- 1995-04-19 ES ES95918255T patent/ES2143051T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-19 RU RU96122886/13A patent/RU2161196C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 DE DE69515029T patent/DE69515029T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-19 WO PCT/US1995/004712 patent/WO1995029260A2/en not_active Ceased
- 1995-04-19 BR BR9507513A patent/BR9507513A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-04-19 PL PL95316962A patent/PL182002B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 CN CN95192707A patent/CN1072726C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-19 AT AT99109266T patent/ATE323177T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 PL PL95342643A patent/PL182188B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 JP JP7527703A patent/JPH10501965A/ja active Pending
- 1995-04-19 PL PL95342644A patent/PL182212B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-04-19 US US08/722,187 patent/US5955274A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-19 CA CA002185560A patent/CA2185560A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-19 DK DK95918255T patent/DK0758404T3/da active
- 1995-04-19 DE DE69534933T patent/DE69534933T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-19 PT PT95918255T patent/PT758404E/pt unknown
- 1995-04-19 EP EP99109266A patent/EP0955381B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-03-10 GR GR20000400624T patent/GR3032928T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL182188B1 (pl) | 2001-11-30 |
| DK0758404T3 (da) | 2000-07-24 |
| EP0955381A3 (en) | 2003-06-11 |
| AU2424495A (en) | 1995-11-16 |
| DE69515029D1 (de) | 2000-03-16 |
| WO1995029260A3 (en) | 1995-12-28 |
| BR9507513A (pt) | 1997-09-02 |
| GR3032928T3 (en) | 2000-07-31 |
| PL316962A1 (en) | 1997-02-17 |
| EP0758404A1 (en) | 1997-02-19 |
| EP0955381A2 (en) | 1999-11-10 |
| US5585238A (en) | 1996-12-17 |
| CN1072726C (zh) | 2001-10-10 |
| CN1147276A (zh) | 1997-04-09 |
| DE69515029T2 (de) | 2000-09-21 |
| CA2185560A1 (en) | 1995-11-02 |
| US5955274A (en) | 1999-09-21 |
| WO1995029260A2 (en) | 1995-11-02 |
| JPH10501965A (ja) | 1998-02-24 |
| EP0758404B1 (en) | 2000-02-09 |
| ATE189703T1 (de) | 2000-02-15 |
| PT758404E (pt) | 2000-06-30 |
| ES2143051T3 (es) | 2000-05-01 |
| EP0955381B1 (en) | 2006-04-12 |
| DE69534933T2 (de) | 2006-09-07 |
| AU699766B2 (en) | 1998-12-17 |
| DE69534933D1 (de) | 2006-05-24 |
| PL182212B1 (pl) | 2001-11-30 |
| RU2161196C2 (ru) | 2000-12-27 |
| ATE323177T1 (de) | 2006-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL182002B1 (pl) | Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PL | |
| US5800997A (en) | Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction | |
| US5827695A (en) | Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction | |
| US5874221A (en) | Species specific method for the PCR detection of phythophthora | |
| AU744803B2 (en) | Detection of wheat and barley fungal pathogens using the polymerase chain reaction | |
| US5814453A (en) | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction | |
| US6485907B1 (en) | PCR-based detection of Rhizoctonia cerealis | |
| US20030190658A1 (en) | Diagnostics for the detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli, causal agent of bacterial fruit blotch in melons | |
| US6733972B2 (en) | Detection of mycosphaerella using the polymerase chain reaction | |
| AU765083B2 (en) | Detection of (monilinia) spp. using the polymerase chain reaction | |
| AU6440500A (en) | Pcr-based detection and quantification of tapesia yallundae and tapesia acuformis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20051231 |
|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070419 |