PT758404E - Deteccao de fungos patogenicos usando a reaccao em cadeia com polimerase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DETECÇÃO DE FUNGOS PATOGÉNICOS USANDO A REACÇÃO EM CADEIA COM POLIMERASE" O presente invento está relacionado com a utilização de sequências iniciadoras específicas de espécie, em ensaios de reacção em cadeia com polime-rase, para a detecção de fungos patogénicos e controlo do desenvolvimento de doenças em populações de plantas.

FUNDAMENTO DO INVENTO

As doenças nas plantas causam uma perda considerável de colheitas de ano para ano resultando em prejuízos económicos para os agricultores e ainda, em muitas partes do mundo quebras imprevistas nos abastecimento de alimentos para as populações locais. O alargamento do uso de fungicidas proporcionou uma segurança considerável contra o ataque pelos agente patogénicos de plantas. No entanto, apesar dos gastos de 1 bilião de dólares em fungicidas, as perdas de colheitas a nível mundial avaliaram-se em aproximadamente 10% do valor das colheitas em 1981 (James, 1981; Seed Sei. & Technol. 9:679-685). A gravidade do processo destrutivo da doença depende da agressividade do agente patogénico e da resposta do hospedeiro. Um objectivo da maior parte dos programas de cultura de plantas é o aumento da resistência das plantas hospedeiras à doença. Tipicamente, diferentes tipos de agentes patogénicos interactuam diferencialmente com diferentes variedades do mesmo cultivar e muitas fontes de resistência do hospedeiro apenas protegem contra -2- tipos específicos de agentes patogénicos. Ainda, algumas espécies de agente patogénicos apresentam sinais precoces de sintomas da doença mas causam poucos estragos na cultura. Jones e Clifford (1983; Cereal Diseases, John Wiley) descrevem que se espera a emergência de formas virulentas do agente patogénico na população do agente patogénico como resposta à introdução de resistência nos cultivares hospedeiros e que é portanto necessário controlar as populações de agente patogénicos. Ainda, existem vários casos documentados da evolução de estirpes de fungos que são resistentes a fungicidas particulares. Já em 1981, Fletcher e Wolfe (1981; Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.) afirmam que 24% das populações de míldio polvorolento de cevada da Primavera e 53% de cevada do Inverno apresentaram variação considerável em resposta ao fungicida triadimenol e que a distribuição destas populações variava entre variedades, sendo a variedade mais susceptível a que dava incidência mais elevada de tipos menos susceptíveis. Variação semelhante na sensibilidade dos fungos aos fungicidas foi documentada para o míldio do trigo (também ao triadimenol), Botrytis (ao benomil), Pyrenophora (ao organomercúrio), Pseudocercosporella (aos fungicidas do tipo MBC) e Mycosphaerella fljiensis aos triazóis, para mencionar apenas alguns (Jones e Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983). A nível mundial são cultivadas espécies de cereais que representam uma das fracções importantes da produção mundial de alimentos. Se bem que as perdas de rendimento sejam causadas por muitos agente patogénicos, os agente patogénicos que causam necrose em Septoria e Pseudocercosporella são panticularmente importantes nas principais áreas de cultivo de cereais da Europa e da América do Norte (Jones e clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983). Em particular, a sintomatologia diferencial causada pelos diferentes isolados e espécies destes fungos tomam difícil uma previsão precisa do potencial da perda associada à doença.

Consequentemente, a disponibilidade de técnicas de diagnóstico melhoradas para a identificação rápida e precisa de agente patogénicos específicos será de considerável utilidade para os patologistas de campo.

Quatro espécies de Septoria parasitam as espécies de grão pequeno. Septoria tritici é o agente causador das manchas da folhas e é virulento para o trigo mas também parasita triticale e centeio. Tipicamente provoca necrose da folha. Septoria nodorum é o agente causador de manchas da gluma e parasita o trigo, triticale, centeio e cevada e apesar de estar restringido principalmente às glumas encontra-se também nas lâminas e bainhas das folhas. Septoria avenae é um parasita de aveia, trigo e triticale e Septoria passerinii está restringido à cevada. As doenças causadas por Septoria ocorrem em todas as áreas de cultivo de trigo de nível económico importante. Diferentes doenças provocadas por Septoria ocorrem frequentemente em campos e em plantas individuais, pelo que os sintomas da doença podem ser colectivamente referidos como "complexo Septoria". Tipicamente, as espécies mais comuns encontradas são S. tritici e S. nodorum. De acordo com Wiese (1977; Compendium of Wheat Diseases, Amer. Phytopath. Soc. páginas 42-45), o complexo Septoria presentemente destrói quase 2% da produção anual de trigo a nível mundial, a perda de produção resulta principalmente do não enchimento do grão. Os tratamentos com fungicidas podem salvar até 20% nos casos de infecção grave por Septoria, mas é muitas vezes difícil distinguir as diferentes espécies de Septoria quando do estabelecimento da doença e isto toma difícil a decisão de investir ou não na utilização de fungicida, porque diferentes cultivares apresentam diferentes graus de resistência a várias espécies de Septoria. A doença cercosporelose dos cereais é causada pelo fungo Pseudocercosporella herpotrichoides e está restringida ao colmo basal da planta. Trigo, centeio, cevada e gramíneas são susceptíveis à doença dos estigmas que -4- ocorre nos climas húmidos e frios e é prevalente na Europa, América do Norte e do Sul, África e Austrália. O trigo é a espécie de cereal mais susceptível, mas foram identificados isolados que são também virulentos para outros cereais. A estirpe R do fungo, por exemplo, também foi isolada a partir de centeio e cresce mais lentamente em trigo do que a estirpe W, que também foi isolada a partir de trigo. Se bem que a doença dos estigmas possa matar rebentos ou plantas completas, geralmente causa derrube e/ou resulta numa redução do tamanho e número dos grãos. As perdas de rendimento associadas à doença dos estigmas são ainda mais importantes do que as associadas a Septoria tritici e Septoria nodorum. Medidas de controlo típicas para a doença dos estigmas incluem o tratamento com reguladores de crescimento para fortalecer os intemós e tratamento com fungicida. No entanto, as diferenças de susceptibilidade dos cultivares a diferentes estirpes de fungos toma difícil a eficácia dos tratamentos com fungicidas.

Pintas da folha Sigatoka da bananeira ocorre em duas formas cada uma delas causada por um fungo diferente. A Sigatoka Negra, economicamente importante, é causada por Mycosphaerella fijiensis, enquanto que a Sigatoka Amarela, economicamente menos importante, é causada por Mycosphaerella musicola (Johanson e Jeger, 1993; Mycol. Res. 97:670-674). Sigatoka Negra é o principal problema da produção de banana causando perdas graves de 30% e mais. Devido à ocorrência de resistência a fungicidas em Mycosphaerella fijiensis, a utilização de fungicida deverá ser limitada para evitar a ocorrência de mais resistências. Consequentemente, a disponibilidade de ferramentas de diagnóstico proporcionará um meio importante para a identificação das circunstâncias adequadas à utilização de fungicidas, sem desnecessariamente se correr o risco do desenvolvimento de mais resistências.

Assim, existe a necessidade de desenvolver tecnologia que permita -5- a identificação de estirpes específicas do fungo patogénico no início do processo infeccioso. Ao identificar-se a estirpe específica de um agente patogénico, antes dos sintomas de doença se tomarem evidentes na seara, o agricultor poderá avaliar os efeitos prováveis do desenvolvimento posterior do agente patogénico na variedade da cultura em que foi identificado e poderá escolher um fungicida adequado se tal aplicação for necessária. O presente invento é dirigido a métodos de identificação de diferentes patótipos de fungos patogénicos para plantas. O invento proporciona sequências de DNA que apresentam variabilidade entre diferentes patófitos fúngicos. Tais sequências de DNA são úteis no método do invento, uma vez que podem ser usados para derivar sequências iniciadoras para usar em ensaios de diagnóstico baseados na reacção em cadeia com polimerase. Estas sequências iniciadoras dão origem a fragmentos únicos nas reacções de PCR e podem assim ser usados para identificar a presença ou ausência de patótipos específicos em material da planta hospedeira antes do estabelecimento de sintomas da doença.

Este invento proporciona a possibilidade de avaliar o potencial de destruição numa relação específica variedade de cultura-estirpe de agente patogénico e a utilização racional da variedade de fungicidas disponível. Ainda, pode ser usado para proporcionar informação detalhada sobre o desenvolvimento e disseminação de agente patogénicos específicos em extensas áreas geográficas. O invento proporciona um método de detecção que é especialmente adequado para doenças com uma fase de latência longa, como sejam as causadas por Septoría nodorum ou Septoria tritici em trigo. São também proporcionados estojos úteis na realização prática do invento. Os estojos têm utilização particular na identificação de agente patogénicos Septoria. -6-

DESCR1CÂO DAS FIGURAS

Figura 1. Alinhamento de sequências espaçadoras internas transcritas de Septoria tritici, Sepíoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides estirpe W (duas variantes), Pseudocercosporella herpotrichoides estirpe R, Mycosphaerella fljiensis e Mycosphaerella musicola.

Figura 2. Alinhamento das sequências espaçadoras internas transcritas de Septoria nodorum e Septoria avenae f. sp. triticea.

Figura 3 Alinhamento das sequências espaçadoras internas transcritas de Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme e Microdochium nivale.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona sequências de DNA únicas que são úteis na identificação de patótipos de fungos patogénicos para plantas. Em particular, as sequências de DNA podem ser usadas como sequências iniciadoras em análises baseadas em PCR para identificação de patófitos fúngicos. As sequências de DNA do invento incluem o espaçador interno transcrito ("Internai Transcribed Spacer", ITS) das regiões dos genes do RN A ribossomal de agente patogénicos fúngicos particulares, assim como sequências inciadoras que derivam destas regiões, as quais são capazes de identificar o agente patogénico particular. Estas sequências de DNA ITS de diferentes patótipos, dentro de uma espécie ou género do agente patogénico, que variam entre os diferentes membros da espécie ou género, podem ser usadas para identificar membros específicos. -Ί Α investigação biomédica tem usado técnicas baseadas em PCR, desde há algum tempo e com moderado sucesso, para detectar agente patogénicos em tecidos animais infectados. No entanto, apenas recentemente esta técnica foi aplicada para detectar agente patogénicos de plantas. A presença de Gaumannomyces graminis em trigo infectado foi detectada usando PCR de sequências específicas do genoma mitocondrial do agente patogénico (Schlesser et al, 1991; Applied andEnviron. Microbiol. 57: 553-556) e marcadores de DNA polimórfico amplificado ao acaso (i.e., RAPD) permitiram distinguir numerosas variantes de Gremmeiella abietina, o agente causador de cancro esclerótico em coníferas. Para determinar se um determinado isolado de Pseudocercosporella herpotrichoides, o agente etiológico da doença dos estigmas dos cereais, pertence ao tipo W ou ao tipo R, Poupard et al. (Plant Pathol. (1993) 42(6)873) desenvolveram um teste baseado na reacção em cadeia com polimerase. B. Xue et al. (Physiol. & Mol. Plant. Pathol. (1992) 41, 179-188) desenvolveram um ensaio específico de patófitos utilizando sequências iniciadoras específicas do patótipo para amplificar DNA de L. maculans que é um agente patogénico de plantas causador da doença do carbúncolo das crucíferas. N.A. Tisserat et al. (Phytopathology (1994) 84(5) 478-482) descreveram sequências iniciadoras que podem ser usadas no diagnóstico de doenças dos relvados provocadas por O. herpotricha e O. korrae.

Os genes ribossomais são adequados para usar como alvos de sondas moleculares devido ao seu elevado número de cópias. Apesar da elevada conservação entre sequências de rRNA maduras, as sequências espaçadoras não transcritas e transcritas são geralmente menos conservadas e são portanto adequadas como sequências alvo para a detecção de divergência evolutiva recente. Os genes de rRNA fúngico estão organizados em unidades, cada uma das quais codifica três subunidades maduras de 18S, 5,8S, e 28S respectivamente.

Estas subunidades estão separadas por dois espaçadores internos transcritos, ITS1 e ITS2, de aproximadamete 300 pb (White et al, 1990; Em: PCR Protocols; Eds.: Innes et al; páginas 315-322). Ainda, as unidades de transcrição são separadas por sequências espaçadoras não transcritas (NTSs). As sequências de ITS e NTS são particularmente adequadas para a detecção de patótipos específicos de diferentes fungos patogénicos.

As sequências de DNA do invento derivam de espaçadores internos transcritos (ITS) da região dos genes do RNA ribossómico dos diferentes agente patogénicos de plantas. As sequências de DNA ITS de Septoria de diferentes patótipos, dentro de uma mesma espécie ou género, variam entre os diferentes membros da espécie ou género. Uma vez determinadas as sequências ITS de um agente patogénico, estas sequências podem ser alinhadas com outras sequências ITS. Desta forma, as sequências iniciadoras podem derivar das sequências ITS. Ou seja, as sequências iniciadoras podem ser projectadas com base em regiões dentro das regiões ITS que contêm as maiores diferenças na sequência entre os patófitos fúngicos. Estas sequências e sequências iniciadoras baseadas nestas sequências podem ser usadas para identificar membros patogénicos específicos.

As sequências de DNA particulares descritas são sequências de DNA ITS de Septoria, particularmente sequências de DNA ITS de Septoria nodorum e Septoria tritici Mycosphaerella, particularmente Mycosphaerella fijiensis e Mycosphaerella musicola; Pseudocercosporella, particularmente Pseudocercosporella herpotrichoides, mais particularmente da estirpe W e da estirpe R de Pseudocercosporella herpotrichoides, Fusarium, particularmente são também interessantes F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme e Microdochium nivale.Tais sequências de DNA ITS, assim como sequências iniciadoras com interesse, estão apresentadas em SEQ ID NO: 1-47 e SEQ ID -9- ΝΟ:50-86. As sequências são utilizadas na identificação baseada em PCR dos patótipos com interesse. São do conhecimento geral métodos para usar as sequências iniciadoras do invento na análise por PCR. Por exemplo, ver Patentes US Nos. 4,683,195 e 4,683,202 assim como Schleser et al. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57:553-556. Ver também, Nazar et al. (1991; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39:1-11) que usaram a amplificação por PCR para explorar as diferenças nas regiões ITS de Verticillium albo-atrum e Verticillium dahliae e assim distinguir entre as duas espécies; e Johanson e Jeger (1993; Mycol. Res. 97:670-674) que usaram técnicas semelhantes para distinguir os agente patogénicos da bananeira Mycosphaerella fijiensis e Mycosphaerella musicola.

As sequências de DNA ITS do invento podem ser clonadas a partir de fungos patogénicos por métodos conhecidos. De um modo geral, são conhecidos os métodos para o isolamento de DNA a partir de isolados fúngicos. Ver Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2:17-20; Lee et al. (1990) Fungai Genetics Newsletter 35:23-24; e Lee and Taylor (1990) em: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, lnnes et al, (Eds.); páginas 282-287.

Como alternativa, as regiões ITS com interesse podem ser determinadas por amplificação por PCR. As sequências iniciadoras para amplificar toda a região ITS foram projectadas de acordo com White et al., (1990; Em: PCR Protocols; Eds.: lnnes et al. páginas 315-322) e a sequência ITS amplificada foi subclonada no vector de clonagem pCRII. A sequência subclonada incluiu a ITS esquerda (ITS1), a ITS direita (ITS2) assim como o gene do rRNA 5.8S localizado no centro. Isto foi realizado para Septoria nodorum e Septoria tritici, numerosos isolados de Pseudocercosporella e

Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella musicola, Septoria avenae triticea, F. graminearum, F. culmorum, F. moliniforme e Microdochium nivale.

As sequências ITS foram determinadas e, dentro de cada grupo de agente patogénicos, as sequências foram comparadas para localizar divergências que pudessem ser úteis para testar em PCR para distinguir as diferentes espécies e/ou estirpes. As sequências das regiões ITS que foram determinadas estão apresentadas como SEQ IDs 1 a 6, 47 e 82-86 e também nas Figuras 1, 2 e 3. A partir da identificação das divergências prepararam-se numerosas sequências inciadoras e testaram-se na amplificação por PCR. Os moldes usados para testar amplificação por PCR foram DNA de agente patogénico previamente purificado e subsequentemente DNA isolado a partir de tecido da planta hospedeira infectada. Assim, foi possível identificar pares de sequências iniciadoras que serviram de diagnóstico i.e. que identificaram uma espécie ou estirpe de agente patogénico particular mas não uma outra espécie ou estirpe do mesmo agente patogénico. Combinações de sequências iniciadoras preferidas são capazes de distinguir entre as diferentes espécies ou estirpes no tecido hospedeiro infectado i.e. tecido hospedeiro que foi previamente infectado com uma espécie ou estirpe de agente patogénico específica. O invento descreve numerosas combinações de sequências iniciadoras de diferentes espécies de Septoria com sequências iniciadoras de Mycosphaerella e Fusarium e diferentes estirpes de Pseudocercosporella que satisfazem este critério. As sequências iniciadoras do invento são projectadas com base nas diferenças de sequências entre regiões ITS de fungos. Um mínimo de uma diferença num par de bases entre sequências pode permitir a projecção de uma sequência discriminatória. As sequências iniciadoras projectadas para uma região ITS específica de DNA de fungo pode ser usada em combinação com uma sequência iniciadora feita a partir de uma região de sequência conservada dentro - 11 - da região codificadora do DNA ribossómico para amplificar fragmentos de PCR específicos de espécie. Em geral as sequências iniciadoras deverão ter uma temperatura de fusão teórica entre cerca de 60 e cerca de 70 graus C para se conseguir uma boa sensibilidade e não deverão ter estrutura secundária significativa e sobreposições 3' entre as combinações de sequências iniciadoras. As sequências iniciadoras têm geralmente entre cerca de 5 e 10 bases nucleotí dicas. A utilidade das sequências ITS clonadas para a selecção das sequências iniciadoras destinadas a diagnóstico é largamente devida à sua rápida divergência evolutiva. Por exemplo, encontrou-se que os isolados do tipo W e do tipo R do agente patogénico Pseudocercosporella herpotrichoides possuem sequências ITS divergentes a partir das quais foram desenvolvidas sequências inciadoras para diagnóstico. No entanto, a divergência rápida dentro da sequência ITS é aparente da observação de terem sido identificadas duas variantes diferentes da sequência do tipo W. A identidade da sequência dentro do tipo W foi 99,4%, enquanto que entre os tipos W e R foi de 98,6% sugerindo uma relação evolutiva mais estreita entre as duas variantes W do que a encontrada entre os tipos W e R. Esta relação mais estreita é também aparente da semelhança da patogenicidade para o hospedeiro dos dois isolados com sequências ITS divergentes.

Para além do desenvolvimento de sequências iniciadoras, a partir de sequências derivadas de ITS, para diagnóstico por PCR de isolados fúngicos, o invento também descreve a identificação de sequências iniciadoras a partir de bibliotecas de sequências iniciadoras de RAPD que podem distinguir entre Septoria nodorum e Septoria tritici quando usadas em PCR. As sequências iniciadoras encontradas podem ser adquiridas comercialmente e foram obtidas da

Operem Technologies Incorporate (Alameda, CA). O despiste de DNA genómico de Septoria identificou duas sequências iniciadoras que conseguiram detectar apenas S. tritici e três que conseguiram detectar apenas S. nodorum. O presente invento destina-se a preparar "estojos" contendo os elementos necessários à realização do processo. Tais estojos podem compreender um veículo compartimentado para receber, bem acomodados num curto espaço, um ou mais contentores, tais como tubos ou frascos. Um dos referidos contentores poderá conter sequências iniciadoras de DNA não marcado ou marcado. As sequências iniciadoras de DNA marcado podem estar presentes na forma liofilizada ou num tampão adequado, conforme necessário. Um ou mais contentores poderão conter uma ou mais enzimas ou reagentes a serem utilizados nas reacções de PCR. Estas enzimas podem estar presentes por si sós ou misturadas na forma liofilizada ou em tampões adequados.

Finalmente, o estojo poderá conter todos os elementos adicionais necessários para realizar a técnica do invento, tais como tampões, reagentes de extraeção, enzimas, pipetas, placas, ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleósidos, papel de filtro, materiais para géis, materiais de transferências, consumíveis para autorradiografia e similares.

Os exemplos abaixo mostram, sem limitação, protocolos experimentais típicos que podem ser usados no isolamento de sequências ITS, a selecção de sequências iniciadoras adequadas, ensaio das sequências iniciadoras para testar a eficácia selectiva e de diagnóstico e a utilização de tais sequências iniciadoras para a detecção de doenças e isolamento de fungos. Tais exemplos são proporcionados com fins ilustrativos e não com carácter limitante. -13-

EXEMPLOS

Exemplo 1. Isolados de fungos e extracção de DNA genómico.

Isolados viáveis dos fungos S. nodorum, S. tritici, S. paasseríni, S. glycines, Pseudocercosporella herpotrichoides, Pseudocercosporella aestiva, Mycosphaerella citiri, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis e Mycosphaerella musicola foram adquiridos à American Type Culture Collection. Os isolados de Fusarium culmorum e Fusarium graminearum foram obtidos do Dr. Paul Nelson da Penn State University. Um isolado de Michrodochium nivale (sin. Fusarium nivale) foi recebido da Ciba-Basel e um isolado de Fusarium moniliforme foi recebido do Dr. Loral Castor. Os fungos foram cultivados em 150 ml de caldo de dextrose de batata inoculado com fragmentos de micélio de culturas PDA (Agar de Dextrose de Batata). As culturas foram incubadas num agitador orbital a 28°C durante 7-11 dias. Os micélios foram sedimentados por centrifugação e depois triturados em azoto líquido e o DNA genómico total extraído usando o protocolo de Lee e Taylor (1990; Em: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Eds.: Innes et al.\ páginas 282-287).

Dr. Bruce McDonald da Texas A &M University forneceu DNA genómico de dez isolados de S. nodorum e nove isolados de S. tritici. Dr. Chris de Birmingham University forneceu seis isolados de DNA purificado do fungo Septoria nodorum. DNA genómico purificado de 12 isolados de Pseudocercosporella herpotrichoides foi obtido do Dr. Paul Nicholson do John Innes Centre, Norwich, UK. Seis destes isolados são do tipo W; os outros seis isolados são do tipo R. Estes isolados foram tipados com base na patogenicidade e estudos de RFLP. Andrea Johanson do Natural Resources Institute forneceu DNA genómico de seis isolados de M. musicola, seis isolados de M. fijiensis e um único isolado de Mycosphaerella musae. DNA genómico purificado de - 14-

Septoria avenae f. sp. triticea ATCC#26380 foi fornecido pelo Dr. Peter Ueng da USDA em Beltsville, Maryland.

Tabela 1: Fonte dos isolados testados

Isolado Espécie Orieem Fonte ATCC#24425 S. nodorum Montana ATCC1 XA1.1 S. nodorum Texas B. McDonald2 Xa5A.2 S. nodorum Texas B. McDonald YA3.1 S. nodorum Texas B. McDonald XD2.1 S. nodorum Texas B. McDonald YB2.2 S. nodorum Texas B. McDonald 93HBh6a S. nodorum Oregon B. McDonald 93A3a S. nodorum Oregon B. McDonald 93AYa S. nodorum Oregon B. McDonald 93HBh8a S. nodorum Oregon B. McDonald 93C5a S. nodorum Oregon B. McDonald ATCC#26517 S. tritici Minnesota ATCC BS3 S. nodorum Irlanda C. Caten3 BS6 S. nodorum Irlanda C. Caten BS175 S. nodorum Inglaterra C. Caten BS425 S. nodorum Inglaterra C. Caten alpha'5 S. nodorum França C. Caten m300 S. nodorum Inglaterra C. Caten TKV2a S. tritici Turquia B. McDonald SYK2 S. tritici Síria B. McDonald ISZC36.2 S. tritici Israel B. McDonald CNRC4a. 1 S. tritici Canadá B. McDonald ALAI a S. tritici Argélia B. McDonald ETK1 S. tritici Etiópia B. McDonald GEB2a.l S. tritici Alemanha B. McDonald UK92D2 S. tritici Reino Unido B. McDonald DNBla S. tritici Dinamarca B. McDonald ATCC#38699 S. glycines Illinois ATCC ATCC#22585 S. passerini Minnesota ATCC - 15- - 15- W2 P. herpotrichoides W3 P. herpotrichoides W4 P. herpotrichoides W5 P. herpotrichoides W6 P. herpotrichoides RI P. herpotrichoides R2 P. herpotrichoides R3 P. herpotrichoides R4 P. herpotrichoides R5 P. herpotrichoides R6 P. herpotrichoides ATCC#22116 M. fijiensis ATCC#22115 M. musicola ATCC#24046 M. citri ATCC#62714 M. graminicola PA92 M. fijiensis PNG291 M. fijiensis GH6-3 M. fijiensis TG120 M. fijiensis HSB4 M. fijiensis RT689 M. fijiensis CR548 M. musicola CM 61 M. musicola CU823 M. musicola MQ103 M. musicola CI31 M. musicola CB90 M. musicola BD1-4 M. musae ATCC#44234 Ceratobasidium cereale ATCC# 11404 Drechslera sorokiniana R-5126 F. culmorum R-5106 F. culmorum R-5146 F. culmorum ATCC#42040 P. herpotrichoides-tágo ATCC#62012 P. aestiva Alemanha ATCC#60972 P. herp. var. herp.-cevada Alemanha W1 P.herpotrichoides Reino Unido

Reino Unido Reino Unido Reino Unido Nova Zelândia Itália Bélgica Nova Zelândia Alemanha Suécia Reino Unido Reino Unido Filipinas Filipinas Florida Montana Panamá

Papua Nova Guiné Gana Tonga Honduras

Rarotonga (Ilh.Cook) Costa Rica Camarões

Cuba

Martinica

Costa do Marfim

Colômbia

Barbados

Holanda

Minnesota

Minnesota

Michigan

Finlândia ATCC ATCC ATCC P. Nicholson4 P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson P. Nicholson ATCC ATCC ATCC ATCC A. Johanson5 A. Johanson A. Johanson A. Johanson A.Johanson A.Johanson A. Johanson A.Johanson A.Johanson A. Johanson A.Johanson A.Johanson A.Johanson ATCC ATCC P. Nelson6 P. Nelson P. Nelson R-8417 F. graminearum Itália P. Nelson R-8422 F. graminearum Canadá P. Nelson R-8546 F. graminearum Bulgária P. Nelson 4551 F. moliniforme Indiana L. Castor7 92 M. nivale ----- Ciba Basel8

ATCC#26380 S. avenaef.sp. triticea Minnesota P. Ueng9 1 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA

2Dr. Bruce McDonald, Texas A&M University, USA

3Dr. Chris Caten, Birmingham Universit, UK

4Dr. Paul Nicholson, John Innes Centre, UK

5Dr. Andrea Johanson, Natural Resources Institute, UK 6Dr. Paul Nelson, Penn State University 7Dr. Loral Castor, Ciba Seeds Research, Bloomington, Illinois 8Ciba-Geigy Limited, Basel, Switzerland 9Dr. Peter Ueng, USD A, Beltsville, Maryland

Exemplo 2: Isolamento de regiões espaçadoras internas transcritas (ITS)

Os fragmentos das regiões espaçadoras internas transcritas de aproximadamente 550 pb foram amplificados por PCR a partir de 25 ng de DNA genómico isolado a partir de S. nodorum (ATCC#24425), S. tritici (ATCC#26517), Pseudocercosporella herpotrichoides isolados Rl, R2, W2 e W5, M. fijiensis )ATCC#22115) e M. musicola (ATCC#22115) usando 50 pmoles das sequências iniciadoras ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; SEQ ID NO:38) e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; SEQ ID NO:41). Os PCRs foram realizados como descrito no EXEMPLO 4 excepto as reacções serem feitas em 100 μΐ e a hibridação ser feita a 50°C. Os fragmentos de ITS foram purificados por precipitação com isopropanol de acordo com Maniatis et al. (1982; Molecular Cloning\ Eds.: Maniatis et al.\ páginas 461-462). O DNA foi ressuspenso em 50 μΐ de dH20 e clonado usando o sistema TA Cloning da Invitrogen Corporation (San Diego, CA) (parte no. K2000-01) usando o vector de clonagem pCRII. As sequências de DNA das regiões de ITS foram determinadas - 17- pelo método didesoxi usando o sequenciador automático da Applied Biosystems (Foster City, CA) modelo 373A com as sequências iniciadoras ITS1 (ver sequência atrás), ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'; SEQ ID NO: 39), ITS4 (ver sequência atrás) e as sequências iniciadoras Ml3 universal -20 (5'-GT A A AACG ACGGCC AGT-3SEQ ID NO:48) e reverso (5’-AACAGCTATGACCATG-3'; SEQ ID NO:49). As sequências iniciadoras para ITS, ITS1 (SEQ ID NO:38), ITS2 (SEQ ID NO:39), ITS3 (SEQ ID NO:40) e ITS4 (SEQ ID NO:41) usadas para clonagem das regiões ITS estão descritas detalhadamente em White et al., (1990; Em: PCR Protocols\ Eds.: Innes et al. páginas 315-322).

Ainda, as regiões espaçadoras internas transcritas foram amplificadas por PCR a partir de 25 ng de DNA genómico de S. avevnae f.sp. triticea, M. nivale, F. moniliforme (#4551), F. graminearum isolados R-8417, R-8546 e R-8422 e F. culmorum isolados R-5126, R-5106 e R-5146. Os produtos de PCR foram purificados usando o sistema Wizard DNA Clean-up da Promega (Madison, WI). As sequências de DNA das regiões ITS foram determinadas como descrito atrás usando as sequências iniciadoras ITS1 (SEQ ID NO:38), ITS2 (SEQ ID NO:39), ITS3 (SEQ ID NO:40) e ITS4 (SEQ ID NO:41). As reacções de sequenciação foram combinadas com os três isolados de F. culmorum e F. graminearum para gerar a sequência de consenso para F. culmorum e F. graminearum.

Exemplo 3: Extracção de DNA a partir de folhas de trigo e de bananeira

Extraiu-se DNA a partir de folhas de trigo usando uma versão modificada do protocolo Rapid DNA Extraction do sistema IsoQuick Nucleic Acid Extraction da MicroProbe Corporation (GardenGrove, CA) (cat# MXT-020-100). Os rendimentos típicos foram de 5-10 pg de DNA total a partir de 0,2 g de tecido de folha. Em cada ensaio de PCR usou-se aproximadamente 100 ng de DNA total.

Extracção rápida de DNA modificada:

Antes de usar pela primeira vez o sistema de extracção, os conteúdos do Reagente 2A (20x Concentrado de corante) foram adicionados ao Reagente 2 (Matrix de Extracção). (1) Aproximadamente 0,2 g da amostra de folhas foi adicionado a um tubo eppendorf de 1,5 ml contendo 50 μΐ de solução de lise #1. A amostra de folhas foi triturada com um pistão Kontes. (2) O Reagente 2 foi agitado vigorosamente (Matrix de Extracção). Adicionou-se 350 μΐ do reagente 2 ao lisado de amostra. (3) Adicionou-se 200 μΐ do Reagente 3 (Tampão de Extracção) à amostra. A amostra foi agitada no vortex 20 seg. (4) Microcentriíugação a 12000xg durante 5 min. (5) A fase aquosa (fase superior) foi transferida para um novo tubo de microcentrifuga. Este volume foi tipicamente cerca de 200 μΐ. (6) Adicionou-se 0,lx volumes da fase aquosa do Reagente 4 (Acetato de Sódio) à amostra da fase aquosa. (7) Adicionou-se um volume igual de isopropanol à fase aquosa seguido de agitação com vortex. - 19- 1ftTBUmL"lgJi: (8) Microcentrifugação a 12000xg durante 10 min. (9) O sobrenadante foi rejeitado sem perturbação do sedimento de ácido nucleico. Adicionou-se ao sedimento 0,5 ml etanol a 70% a -20°C. O tubo foi agitado com vortex para misturar. (10) Microcentrifugação a 12000xg durante 5 min. (11) 0 sobrenadante foi rejeitado e o sedimento deixado a secar. (12) O sedimento de ácido nucleico foi dissolvido em 50 μΐ de Reagente 5 (água sem RNAses).

Exemplo 4: Amplificação por reacção em cadeia com polimerase

As reacções em cadeia com polimerase foram realizadas com o sistema GeneAmp da Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, CT; parte no. N808-0009) usando KC1 50 mM, MgCl2 2,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, contendo dTTP, dATP, dCTP e dGTP 100 μΜ cada, sequência iniciadora 50 pM, 2,5 unidades de polimerase Taq e 25 ng de DNA genómico num volume final de 50 μΐ. As reacções decorreram durante 30 ciclos de 15 s a 94°C, 15 s a 50°C, 60°C ou 70°C e 45 s a 72°C num termociclador Perkin-Elmer/Cetus Modelo 9600. Os produtos foram analisados aplicando 20 μΐ de cada amostra de PCR num gel de 1,1-1,2% de agarose seguido de electroforese.

Exemplo 5: Síntese e purificação de oligonucleótidos

Os oligonucleótidos (sequências iniciadoras) foram sintetizados num sintetizador de de DNA Applied Biosystems 380A usando química de B-cianotil-fosforamideto. -20-

Exemplo 6: Selecção de sequências iniciadoras específicas de espécie.

As sequências ITS de S. nodorum, S. tritici, P. herpotrichoides estirpes R e W, M. fijiensis e M. musicola foram alinhadas (Fig.l). As sequências ITS de S. nodorum e S. avenae triticea foram alinhadas (Fig. 2). Também se fez um alinhamento das sequências ITS de F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme e M. nivale (Fig. 3). Sintetizaram-se séries de sequências iniciadoras de acordo com o EXEMPLO 5 com base na análise das sequências alinhadas. As sequências iniciadoras foram projectadas para regiões que continham as maiores diferenças da sequência entre as espécies de fungos para as Figs. 1-2. Na Fig. 3, as sequências foram projectadas para regiões como maior homologia dentro da ITS de Fusarium. Ainda, as sequências ITS1 específicas de genes ribossomais já publicadas (SEQ ID NO:38), ITS2 (SEQ ID NO:39); ITS3 (SEQ ID NO:40) e ITS4 (SEQ ID NO:41) (White et al., 1990; Em: PCR Protocols\ Eds.: Innes et ai. páginas 315-322) foram sintetizadas para serem testadas em combinação com as sequências iniciadoras específicas da região ITS.

Tabela 2: Proieccão de sequências iniciadoras para a deteccão de fungos

Molde da Nome da Sequência iniciadora sequência sequência iniciadora iniciadora S. n odorum JB433 S. nodorum JB434 S. nodorum JB525 S. nodorum JB527 S. tritici JB445 S. tritici JB446 5'ACACTCAGTAGTTTACTACT3' (SEQ ID NO:7) 5TGTGCTGCGCTTCAATA3' (SEQ ID NO:8) 5’GCG ACTTGT GCTGCGCTTCAATA3' (SEQ ID NO:9) 5'CATTACACTCAGTAGTTTACTACT3' (SEQ ID NO: 10) 5'CTGCGTCGGAGTTTACG3' (SEQ ID NO:l 1) 5’CGAGGCTGGAGTGGTGT3’ (SEQ ID NO: 12) -21 - -21 - S. tritici JB526 P. herp. JB536 P. herp. JB537 P. herp. JB538 P. herp. JB539 P. herp. JB540 P. herp. JB541 P. herp. JB542 P. herp. JB543 P. herp. JB544 M. fijiensis JB547 M. fijiensis JB548 M. fijiensis JB442 M. fijiensis JB443 M. fijiensis JB545 M. fijiensis JB546 M. fijiensis JB549 M. fijiensis JB444 M. musicola JB451 M. musicola JB440 M. musicola JB449 M. musicola JB448 M. musicola JB441 M. musicola JB450 M. musicola JB452 18S rDNA ITS1 5.8S rDNA ITS2 5.8S rDNA ITS3 25S rDNA ITS4 S. nodorum JB563 S. nodorum JB564 S. nodorum JB565 Fusarium spp. JB566 5'CCCAGCGAGGCTGGAGTGGTGT3' (SEQID NO: 13) 5'CTGGGGGCTACCCTACTTGGTAG3' (SEQ ID NO: 14) 5'GGGGGCTACCCTACTTGGTAG3' (SEQ ID NO: 15) 5'ACTTGGTAGGGTTTAGAGTCGTCA3’ (SEQ ID NO: 16) 5'CTTCGGTAAGGTTTAGAGTCGTCG31 (SEQ ID NO: 17) 5'GGGGGCCACCCTACTTCGGTAA3' (SEQ ID NO: 18) 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG3' (SEQ ID NO: 19) 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAA3' (SEQ ID NO:20) 5'CCTGTAAAAAATTGGGGGTTA3' (SEQ ID NO:21) 5'GCTGTAAAAAATTGGGGGTTG3' (SEQ ID NO:22) 51 ATTACCGAGTGAGGGCTCACGC3' (SEQ ID NO:23) 5'GTTGCTTCGGGGGCGACCTG3' (SEQ ID NO:24) 5TCGGGGGCGACCTGCCG3' (SEQ ID NO:25) 5'CCGGAGGCCGTCTA3' (SEQ ID NO:26) 5'CCACAACGCTTAGAGACGGAGAC3' (SEQ ID NO:27) 5'CACCCGCACTCCGAAGCGAATT3' (SEQ ID NO:28) 5'GATCCGAGGTCAACCTTTGAATAA3' (SEQ ID NO:29) 5'GGTCAACCTTTGAATAA3' (SEQ ID NO:30) 5'CCTTTGTGAACCACACCT3' (SEQ ID NO:31) 5'CTGCCGGCGAACTT3' (SEQ ID NO: 32) 5'ACCCTGCCGGCGAACTT3' (SEQ ID NO:33) 5'GCGACCCTGCCGGCGAAC3' (SEQ ID NO:34) 5TAGCCGGGAGACTTTGG3' (SEQ ID NO:35) 5TCTGCGTCGGAGTTCC3' (SEQ ID NO:36) 5OCGCGCTCCGGAGCGAAC3' (SEQ ID NO:37) 5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3' (SEQ ID NO:38) 5'GCTGCGTTCTTCATCGATGC3' (SEQ ID NO:39) 5'GCATCGATGAAGAACGCAGC3' (SEQ ID NO:40) 5 'TCCTCCGCTTATT G AT AT GC3' (SEQ ID NO:41) 5'CTTGCCTGCCGGTTGGACAAATT3' (SEQ ID NO:50) 5'CTCAGTAGTTTACTACTGTAAAAGG3' (SEQ ID NO:51) 5'CTTCTGGACGCAAGTGTTTGTTAC3' (SEQ ID NO:52) 5'GTTTTTAGTGGAACTTCTGAGT3' (SEQ ID NO:53)

Fusarium spp. JB567 Fusarium spp. JB568 Fusarium spp. JB569 Fusarium spp. JB570 Fusarium spp. JB571 Fusarium spp. JB572 Fusarium spp. JB573 Fusarium spp. JB574 Fusarium spp. 575 Fusarium spp. JB576 Fusarium spp. JB577 Fusarium spp. JB578 5'CGCAGGAACCCTAAACTCT3' (SEQ ID NO: 54) 5'GCCCGCCGCAGG3' (SEQ ID NO:55) 5'RTWWTTWRTGGAMYYTCTGAGT3' (SEQ ID NO: 56) 5TATGTTGCCTCGGCGG3' (SEQ ID NO:57) 5TAACGATATGTAAATTACTACGCT3' (SEQ ID NO:58) 5'AAGTTGGGGTTTAACGGC3' (SEQ ID NO:59) 5'AGCGAGCCCGCCAC3' (SEQ ID NO:60) 5'CCATTGTGAACGTTACCTATAC3' (SEQ ID NO:61) 5'CGACCAGAGCGAGATGTA3' (SEQ ID NO:62) 5'GTGAACATACCTTATGTTGCC3' (SEQ ID NO:63) 5'GTTGCCTCGGCGGATC3' (SEQ ID NO: 64) 5'CCGCGACGATTACCAG3' (SEQ ID NO:65) NOTA: Fusarium spp. inclui F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme e Michrodochium nivale (sin. F. nivalè)

Exemplo 7: Selecção de sequências iniciadoras para DNA polimórflco amplificado ao acaso (RAPD)

Duas bibliotecas de sequências iniciadoras para RAPD (estojos B e E) de vinte oligonucleótidos cada foram adquiridos à Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA). As sequências iniciadoras foram testadas relativamente à sua capacidade para diferenciar DNA genómico purificado de S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis e M. musicola. As condições de PCR foram essencialmente as mesmas descritas no EXEMPLO 4 excepto o número de ciclos de PCR ter aumentado para 35, a temperatura de hibridação ser de 30°C e apenas 5 picomoles de cada sequência inciadora serem usadas. Foram identificadas cinco sequências inciadoras para RAPD que diferenciaram DNA genómico purificado de S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis e M. musicola. As sequências iniciadoras OPB-12 e OPE-6 produziram um único fragmento quando usadas -23- para amplificar DNA genómico de S. tritici. As sequências iniciadoras OPE-12, OPB-19 e OPE-15 produziram fragmentos únicos a partir de DNA genómico S. nodorum. As sequências iniciadoras OPB-12 e OPE-6 não produziram qualquer amplificação a partir de DNA genómico de S. nodorum, M. fijiensis e M. musicola. As sequências iniciadoras OPE-12, OPB-19 e OPE-15 não amplificaram quaisquer fragmentos de DNA genómico de S. tritici, M. fijiensis ou M. musicola.

Tabela 3: Sequências iniciadoras de RAPD para diagnóstico de Septoría

Fonte de DNA molde Nome da Seauência iniciadora Seauência iniciadora Tamanho aproximado do fragmento amplificado S. tritici OPB-12 5'-CCTTGACGCA-3' (SEQ ID NO:42) 1,3 Kb S. tritici OPE-15 5'-AAGACCCCTC-3' (SEQ ID NO:43) 1,0 Kb S. nodorum OPE-12 5'-TTATCGCCCC-3' (SEQ Π) NO:44) 2,2 Kb S. nodorum OPB-19 5’-ACCCCCGAAG-3' (SEQ ID NO:45) 1,1Kb S. nodorum OPE-15 5'-ACGCACAACC-3' (SEQ ID NO:46) 1,3 Kb

Exemplo 8: Determinação da especificidade das sequências iniciadoras relativamente ao DNA genómico purificado de fungo

Os PCRs foram realizados de acordo com o EXEMPLO 4 usadno diferentes combinações de sequências iniciadoras numa tentativa para amplificar um único fragmento específico de espécie. Os produtos de amplificação por PCR específicos de espécie foram produzidos a partir de sequências iniciadoras projectadas a partir da região ITS entre as subunidades de DNA ribossomal 18S e 25S de cada uma das estirpes de fungo com interesse.

Tabela 4: Sequências iniciadoras derivadas de ITS para diagnóstico por PCR

Fonte de DNA Sequência iniciadora 5' molde

Septoria JB433 (SEQID NO:7) nodorum JB433 (SEQ ID NO:7) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) ITS3 (SEQ ID NO:40) (JB414) JB527 (SEQ ID NO: 10) JB564 (SEQ ID NO:51) JB563 (SEQ ID NO:50)

Septoria tritici JB445 (SEQ ID NO: 11) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) ITS3 (SEQ ID NO:40) (JB414) JB445 (SEQ ID NO: 11) * M.fijiensis JB443 (SEQ ID NO:26) ITS1 (SEQ ID N0.38) (JB410) JB443 (SEQ ID NO:26) ITS3 (SEQ ID NO:40) (JB414) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) M. musicola JB449 (SEQ ID NO:33) JB448 (SEQ ID NO:34) JB448 (SEQ ID NO:34) JB450 (SEQ ID NO:36) P. herp. JB536 (SEQ ID NO: 14)

Seauência iniciadora 3' Tamanho anroximado do fraemento amDlifícado JB434 (SEQ ID NO: 8) 448 pb ITS (SEQ ID NO:41) (JB415) 553 pb JB434 (SEQ ID NO:8) 478 pb JB434 (SEQ ID NO:8) 232 pb* JB525 (SEQ ID NO:9) 458 pb JB565 (SEQ ID NO:52) 480 pb JB (SEQ ID NO:52) 368 pb ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 407 pb JB446 (SEQ ID NO: 12) 345 pb JB446 (SEQ ID NO: 12) 143 pb* JB446 (SEQ ID NO: 12) 204 pb ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 418 pb JB444 (SEQ ID NO:30) 482 pb JB444 (SEQ ID NO:30) 366 pb* JB444 (SEQ ID NO:30) 218 pb* JB (SEQ ID NO:29) 489 pb ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 430 pb ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 449 pb* ITS2 (SEQ ID NO:39) (JB411) 138 pb* ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 390 pb* JB541 (SEQ ID NO: 19) 415 pb" ssSZZ» -25- JB536 (SEQ ID NO: 14) JB537 (SEQ ID NO: 15) JB537 (SEQ ÍD NO:15) JB538 (SEQ ID NO: 16) JB538 (SEQ ID NO: 16) JB536 (SEQ ID NO: 14) JB537 (SEQ ID NO: 15) JB538 (SEQ ID NO: 16) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) JB540 (SEQ ID NO: 18) JB539 (SEQ ID NO: 17) JB540 (SEQ ID NO: 18) JB540 (SEQ ID NO: 18) JB539 (SEQ ID NO: 17) JB539 (SEQ ID NO: 17)

Fusarium spp. JB566 (SEQ ID NO:53) JB566 (SEQ ID NO:53) JB569 (SEQ ID NO:56) JB569 (SEQ ID NO:56) ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) JB566(SEQ ID NO:53) JB569(SEQ ID NO:56) JB570 (SEQ ID NO:57) JB570 (SEQ ID NO:57) JB570(SEQ ID NO:57) JB567 (SEQ ID NO:54) JB567 (SEQ ID NO:54) JB567 (SEQ ID NO:54) JB567 (SEQ ID NO:54) JB568 (SEQ ID NO: 55) JB568 (SEQ ID NO:55) JB568 (SEQ ID NO:55) JB543 (SEQ ID NO:21) 502 pb JB541 (SEQ ID NO: 19) 413 pb+ JB543 (SEQ ID NO:21) 500 pb+ JB541 (SEQ ID NO: 19) 401 pb+ JB543 (SEQ ID NO:21) 488 pb+ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 560 pb+ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 558 pb+ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 546 pb+ JB541 (SEQ ID NO: 19) 482 pb+ JB543 (SEQ ID NO:21) 569 pb+ JB542 (SEQ ID NO:20) 482 pb+ JB544 (SEQ ID NO:22) 569 pb++ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 558 pb^ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 545 pb++ JB542 (SEQ ID NO:20) 413 pb++ JB544 (SEQ ID NO:22) 500 pb++ JB542 (SEQ ID NO:20) 400 pb++ JB544 (SEQ ID NO:22) 487 pb++ ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 430 pb1 JB572(SEQ ID NO:59) 346 pb1 ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 430 pb1 JB572 (SEQ ID NO:59) 346 pb' JB572(SEQ ID NO:59) 485 pb1 JB571 (SEQ ID NO:58) 308 pb2 JB571 (SEQ ID NO:58) 308 pb2 ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 501 pb2 JB571 (SEQ ID NO:58) 379 pb2 JB578 (SEQ ID NO:65) 395 pb2 ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 450 pb2 JB571 (SEQ ID NO:58) 328 pb2 JB572 (SEQ ID NO:59) 366 pb2 JB578 (SEQ ID NO:65) 344 pb2 ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 459 pb2 JB571 (SEQ ID NO:58) 337 pb2 JB572 (SEQ ID NO:59) 375 pb2 -26- JB576 (SEQ ID NO:63) ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 510 pb2 JB576 (SEQ ID NO:63) JB578 (SEQ ID NO:65) 404 pb2 JB577 (SEQ ID NO:64) ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 495 pb2 JB577 (SEQ ID NO:64) JB571 (SEQ ID NO:58) 373 pb2 JB577 (SEQ ID NO:64) JB578 (SEQ ID NO:65) 389 pb2 ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) JB571(SEQ ID NO:58) 447 pb1 ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) JB578(SEQ ID NO:65) 463 pb1 ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) JB575(SEQ ID NO:62) 479 pb1 M. nivale JB569 (SEQ ID NO:56) JB575 (SEQ ID NO:62) 340 pb JB567 (SEQ ID NO:54) JB575 (SEQ ID NO:62) 360 pb JB574 (SEQ ID NO:6I) ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) 520 pb JB574 (SEQ ID NO:61) JB572 (SEQ ID NO:59) 436 pb *... Combinação de sequências iniciadoras que amplificou alguns fragmentos por falsa iniciação mas nenhum com o tamanho do fragmento pretendido. +... Sequências iniciadoras amplificaram o fragmento de tamanho correcto a partir de Pseudocercosporella herpotrichoides tipo R e tipo W. ”+... A combinação de sequências iniciadoras amplificou o fragmento do tamanho correcto apenas a partir de P. herpotrichoides. '... A combinação de sequências iniciadoras amplificou o fragmento do tamanho correcto a partir de F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme e M. nivale. 2... A combinação de sequências iniciadoras amplificou o fragmento com o tamamnho correcto a partir de F. graminearum, F. culmorum e F. moniliforme.

Exemplo 9: Determinação da especificidade das sequências iniciadoras relativamente ao tecido vegetal infectado com fungos DNA genómico total foi isolado a partir de folhas de trigo saudáveis, folhas de trigo infectadas com S. nodorum, folhas de trigo infectadas com S. tritici e folhas de trigo infectadas com S. nodorum e S. tritici usando o protocolo descrito no EXEMPLO 3. Os PCRs foram realizados como descrito no EXEMPLO 4 testando as combinações de sequências iniciadoras referidas no EXEMPLO 8 contra DNA das folhas de trigo. -27- A sequência iniciadora específica de S. tritici JB446 (SEQ ID NO: 12) e ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) amplificou um fragmento de 345 pb a partir de DNA de S. tritici purificado, a partir de tecido de folhas de trigo infectadas com S. tritici e a partir de uma amostra de folhas de trigo infectadas com S. tritici e S. nodorum. A série de sequências iniciadoras não amplificou um fragmento diagnóstico a partir de tecido de folhas de trigo saudáveis nem a partir de tecido de trigo infectado com S. nodorum. De modo semelhante, as sequências iniciadoras específicas de S. tritici JB445 (SEQ ID NO: 11) e ITS4 (SEQ ID NO:41)(JB415) amplificaram um fragmento de 407 pb a partir dos mesmos tecidos tal como a combinação de sequências iniciadoras JB446 (SEQ ID NO: 12) e ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) e foi também diagnóstico.

Resultados de diagnóstico semelhantes foram obtidos com as sequências iniciadoras específicas de S. nodorum JB433 (SEQ ID NO:7) e JB434 (SEQ ID NO:8). As sequências iniciadoras amplificaram um fragmento de 448 pb a partir de tecido de trigo infectado com S. nodorum, a partir de uma amostra de folhas de trigo infectadas com S. nodorum e S. tritici, assim como a partir de DNA genómico purificado de S. nodorum. A combinação de sequências iniciadoras JB433 (SEQ ID NO:7) e JB434 (SEQ ID NO:8) não amplificou quaisquer fragmentos a partir de tecido de trigo saudável, a partir de tecido de trigo infectado com S. tritici ou a partir de DNA genómico purificado de S. tritici. As sequências iniciadoras específicas de S. nodorum JB527 (SEQ ID NO: 10) e JB525 (SEQ ID NO:9) amplificaram um fragmento de 458 pb a partir dos mesmos DNAs genómicos e tecidos de trigo tal como a combinação JB433 (SEQ iD NO:7) e JB434 (SEQ ID NO:8).

As combinações de sequências iniciadoras para P. herpotrichoides apresentadas no EXEMPLO 8 foram testadas por PCR contra os extractos de -28- caules de trigo conforme obtido no Exemplo 12. Os PCRs foram realizados como descrito no EXEMPLO 4 com as seguintes alterações: 35 ciclos foram corridos a 94°C durante 15 seg e 70°C durante 45 seg, MgCl2 1,5-2,5 mM e dNTP 200 μΜ cada. Em cada PCR usou-se 1 μΐ de extracto de trigo. A combinação de sequências iniciadoras JB537 (SEQ ID NO: 15) e JB541 (SEQ ID NO:19) amplificou um fragmento de 413 pb a partir de extracto de trigo infectado com o patótipo tipo W de P. herpotrichoides. Não houve produtos de amplificação na amplificação de extractos de trigo saudáveis nem a partir de extracto de levedura infectados com o patótipo tipo R de P. herpotrichoides. A combinação de sequências iniciadoras JB539 (SEQ ID NO: 17) e JB544 (SEQ ID NO:22) amplificou um fragmento de 487 pb e a combinação de sequências iniciadoras JB540 (SEQ ID NO: 18) e JB542 (SEQ ID NO:20) amplificou um fragmento de 413 pb a partir de trigo infectado com o tipo R mas não a partir de trigo saudável nem a partir de trigo infectado tipo W. DNA genómico total foi também isolado a partir de folhas de banana saudáveis e a partir de folhas de banana infectadas com M. fijiensis usando o protocolo descrito no EXEMPLO 3. Os PCRs foram realizados como descrito no EXEMPLO 4 testando as combinações de sequências iniciadoras para M.fijiensis apresentadas no EXEMPLO 8 contra as folhas de banana.

As sequências iniciadoras específicas de M.fijiensis JB549(SEQ ID NO:29) e ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410) aplificou um fragmento de 489 pb a partir de DNA de M. fijiensis purificado e a partir de tecido de folha de banana infectado com M. fijiensis. A série de sequências iniciadoras não amplificou um fragmento diagnosticante a partir de tecido de folha de banana saudável. As -29- combinações das sequências iniciadoras específicas de M. fijiensis JB443 (SEQ ID NO:26)/ITS4 (SEQ ID NO:41) (JB415) e ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410)/JB444 (SEQ ID NO:30) amplificaram um fragmento de 418 pb e um fragmento de 482 pb, respectivamente, a partir do mesmo DNA genómico e a partir de tecido de folha de banana tal como a combinação de sequências iniciadoras JB549 (SEQ ID NO:29) e ITS1 (SEQ ID NO:38) (JB410).

Exemplo 10: Determinação de reactividade cruzada das sequências iniciadoras específicas de espécie com outras espécies e isolados DNAs genómicos de fungos foram obtidos como descrito no EXEMPLO 1 e testados por PCR, como descrito no EXEMPLO 4, usando as sequências iniciadoras específicas de espécie. Outras espécies de DNA de fungos e isolados foram testadas relativamente à capacidade das sequências iniciadoras específicas de espécie darem reactividade cruzada com elas. A sequência iniciadora específica de S. tritici JB446 (SEQ ID NO:12)e ITS1 (SEQ ID 0:38) (JB410) amplificaram um fragmento de 345 pb a partir de todos os isolados de S. tritici apresentados no EXEMPLO 1. Não houve reactividade cruzada com DNA genómico purificado de S. nodorum, S. glycines ou S. passerini. Nenhuma destas outras espécies de fungos produziu um produto de amplificação com as sequências iniciadoras específicas de S. tritici.

Amplificou-se um fragmento de 448 pb a partir de todos os isolados de S. nodorum apresentados no EXEMPLO 1 usando sequências iniciadoras específicas de S. nodorum JB433 (SEQ ID NO:7) e JB434 (SEQ ID NO: 8). De modo semelhante as sequências iniciadoras específicas de S. nodorum JB527 (SEQ ID NO: 10) e JB525 (SEQ ID NO:9) amplificaram um fragmento de 458 pb a partir de todos os isolados de S. nosorum apresentados no EXEMPLO 1. S. tritici, S. glyclines e S. passerini não produziram quaisque produtos d eamplifícação quando testados com as séries de sequências iniciadoras específicas de S. nodorum JB433 (SEQ ID NO:7) e JB434 (SEQ ID NO:8) ou JB527 (SEQ ID NO:9).

Os PCRs foram realizados usando as condições descritas no EXEMPLO 9, as combinações de sequências iniciadoras específicas de P. herpotrichoides apresentadas no EXEMPLO 8 contra o DNA de outras espécies e isolados apresentados no EXEMPLO 1. A combinação de sequências iniciadoras JB537 (SEQ ID NO: 15) e JB541 (SEQ ID NO: 19) produziram um fragmento de 413 pb a partir dos isolados de P. herpotrichoides tipo W apenas quando testado contra o P. herpotrichoides e os seguintes agente patogénicos de cereais: P. aestiva, C. cereale, P. sorokiniana, S. tritici e S. nodorum. A combinação de sequências iniciadoras JB539(SEQ ID NO: 17) e JB544 (SEQ ID NO:22) amplificaram um fragmento de 487 pb a partir de P. herpotrichoides tipo R apenas quando testado contra os mesmos DNAs. A combinação de sequências iniciadoras JB540 (SEQ ID NO: 18) e JB542 (SEQ ID NO:20) produziu um fragmento de 413 pb a partir do isolado de P. herpotrichoides tipo R apenas quando testados contra os mesmos DNAs.

Exemplo 11: Fontes de trigo infectadas com Pseudocercosporella herpotrichoides

Caules de trigo infectados com a doença dos estigmas foram recebidos do programa de despiste de fungicidas fase lc da Ciba Basle. Plantas de trigo com oito dias de idade foram infectadas com P. herpotrichoides vaporizando com uma suspensão de conídeos (5x105 conídeos/ml) em 0,2% de £gS3£E> -31 -

Tween20 na base dos caules de trigo. Após inoculação, as plantas foram cobertas com plástico e incubados durante um dia a 20°C e 95-100% de humidade relativa. As plantas foram transferidas para uma câmara de crescimento onde foram incubadas durante 4 semanas a 12°C e 60% de humidade relativa. Após esta incubação, as plantas foram transferidas para uma estufa e incubadas a 18°C e 60% de humidade relativa. Retiraram-se amostras de plantas de trigo infectadas com P. herpotrichoides tipo W estirpe 311 às 8-9 semanas pós-infecção, enquanto para as infectadas com o agente patogénico tipo R estirpe 308 as amostras foram colhidas às 9-10 semanas pós-infecção.

Exemplo 12: Extracção de DNA de caules de trigo para testar P. herpotrichoides O DNA extraído a partir de caules de trigo usando o protocolo descrito por Klimyuk et al, (The Plant Journal 3(3):493-494) com algumas modificações. Um corte de 2 cm de caule de trigo feito 0,5 cm acima do colmo basal foi colocado em 160 μΐ de NaOH 0,25M e triturado com um pistão de Kontes até estar completamente macerado. A amostra foi fervida durante 30 s. Adicinou-se à amostra 160 μΐ de HC1 0,25M e 80 μΐ de Tris-HCl 0,5M, pH 8,0/0,25% v/v Nonidet P-40. A amostra foi fervida durante mais 2 mins, depois colocada num banho de gelo e água. Usou-se 1 μΐ de extracto no ensaio de PCR.

Exemplo 13: Incorporação de ensaios de diagnóstico num formato de ensaio colorimétrico quantitativo O ensaio colorimétrico foi realizado de acordo com Nikiforov et al, (PCR Methods and Applications 3:285-291) com as seguintes alterações: 1) 30 μΐ do produto de PCR tipo R e uma mistura de NaCl -32- 3M/EDTA 20 mM foram adicionadas ao poço com a sonda de captura. 50 μΐ do produto de PCR tipo W e a mistura de NaCl 3M/EDTA 20 mM foram usados na reacção de hibridação. 2) O tratamento com exonuclease e a reacção de hibridação foram incubados a 37°C. 3) Usou-se uma diluição de 1:1000 de anticorpo monoclonal anti-biotina acoplado a peroxidase de rábano silvestre (HRP). 4) Após uma incubação de 2 min. com o substrato di-hidrocloreto de O-fenilenodiamina (OPD), adicionou-se 50 μΐ de HC1 3N a cada um dos poços do ensaio. As placas de 96 poços foram lidas a 492 nm e referenciadas a 570 nm usando um leitor de placas de ELISA convencional.

As sequências iniciadoras apresentadas na Tabela 5 foram sintetizadas como descrito no EXEMPLO 5 para serem testadas como sondas de cap tura no ensaio colorimétrico.

Tabela 5: Proieccão de oligonucleótidos sonda para o ensaio colorimétrico

Nome da sonda Molde da sonda de captura de captura ITS2 5,8S rDNA JB541 P. herp. tipo W JB542 P. herp. tipo R JB538' P. herp. tipo W JB539' P. herp. tipo R W130 P. herp. tipo W R130 P. herp. tipo R

Sequência da sonda de captura 5'GCTGCGTTCTTCATCGATGC3' (SEQ ID NO:39) 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG3'(SEQ ID NO: 19) 5'CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAA3' (SEQ ID NO:20) 5'TGACGACTCTAAACCCTACCA3' (SEQ ID NO:66) 5'CGACGACTCTAAACCTTACCG3' (SEQ ID NO:67) 5'ATTCAAGGGTGGAGGTCTGA3' (SEQ ID NO:68) 5'ATTCAAGGGTGGAGGTCTGG3' (SEQ ID NO:69) -33-

JB538'15 P. herp. tipo W •ΓΒ539Ί5 P. herp tipo R JB553 Tipos R & w JB554 Tipos R & W JB555 P.herp. tipo W JB556 P. herp. tipo R JB561 P. herp. tipo R JB562 P. herp. tipo W JB559 P. herp. Tipo W JB560 P. herp. tipo R JB557 P. herp. tipo W JB558 P. herp. tipo R 5'CTCTAAACCCTACCA3' (SEQID NO:70) 5'CTCTAAACCTTACCG3' (SEQ ID N0:71) 5TGTTTCCTCTGGCAG3' (SEQ ID NO:72) 5’CTCAACAGCCGAAGC3' (SEQ ID NO:73) 5'GGGTGGAGGTCTGA3’ (SEQ ID NO:74) 5'GGTGGAGGTCTGG3’ (SEQ ID NO:75) 5TGGAGGTCTGGACCA3' (SEQ ID NO:76) 5TGGAGGTCTGAACCA3' (SEQ ID NO:77) 5'AGGGTGGAGGTCTGA3' (SEQ ID NO:78) 5'AGGGTGGAGGTCTGG3' (SEQ ID NO:79) 5'TTCTCCGAGAGGCCT3' (SEQ ID NO:80) 5'TTCTCCGAGAGGCCO^SEQ_IDJTO^81 )_

As sequências diagnosticantes para S. nodorum JB527 (SEQ ID NO: 10) e JB525 (SEQ ID NO:9) foram integradas no formato de ensaio colorimétrico quantitativo. A sequência iniciadora JB527 (SEQ ID NO: 10) foi sintetizada pela Midland Certified Reagent Company (Midland, Texas) de forma a conter como marca a biotina e o extremo 5' conter quatro ligações intemucleotídicas fosforotioato. A amplificação por PCR como descrita no EXEMPLO 4 usando as sequências iniciadoras JB527 (SEQ ID NO: 10) e JB525 (SEQ ID NO:9) a partir de trigo não infectado ou com um nível baixo médio ou alto de infecção por S. nodorum não deu leituras a A492 ou deu valores baixos, médios ou altos, respectivamente, quando testados colorimetricamente usando a sequência iniciadora ITS2 (SEQ ID NO:39) como sequência sonda de captura do produto de PCR.

As sondas 5' específicas de P. herpotrichoides tipo R, JB539 (SEQ ID NO: 17) e JB540 (SEQ ID NO: 18) e a sonda 5’ específica de P. herpotrichoides tipo W, JB537 (SEQ ID NO: 15), foram também modificadas para conterem uma marca de biotina e quatro ligações fosforotioato intemucleotídicas. Uma versão colorimétrica do ensaio de PCR para P. -34- herpotrichoides tipo R foi desenvolvida usando a sequência iniciadora JB540 (SEQ ID NO: 18) modificada, a sequência iniciadora JB542 (SEQ ID NO:20) e o oligonucleótido de captura JB539'15. Os produtos produzidos na amplificação a partir de trigo infectado com tipo R e a partir de DNA genómico tipo R, usando a sequência iniciadora JB540 (SEQ ID NO: 18) e a sequência iniciadora JB542 (SEQ ID NO:20), produziram valores colorimétricos positivos quando testatados colorimetricamente. Valores colorimétricos positivos foram também obtidos por análise colorimétrica dos produtos de PCR da amplificação usando a sequência iniciadora JB537 (SEQ ID NO: 15) modificada e a sequência iniciadora específica do tipo W JB541 (SEQ ID NO:19) com trigo infectado com tipo W e DNA genómico tipo W quando se usou como oligonucleótido de captura JB538'15. Ainda, a intensidade do ensaio colorimétrico correspondeu à intensidade do fragmento do produto de PCR conforme visualizado num gel de agarose.

Anteriormente, as diferentes espécies de Septoria eram identificáveis por exame ao microscópio e a identificação das diferentes estirpes de Pseudocercosporella foi possível apenas por testes patológicos. De forma semelhante, a identificação sem ambiguidades de Mycosphaerella musicola e Mycosphaerella fijiensis tem sido difícil e mesmo o isolamento de peritécios maduros nem sempre permite identificação precisa (Pons, 1990; Em: Sigatoka Leaf Diseases of Banana, Eds. RA Fullerton and RH Stover, International Network for the Improvement of Banana and Plantain, França). Os estojos de imunodiagnóstico correntemente usados tendo tecnologia de ELISA são normalmente usados para identificar Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides e outros agente patogénicos, mas esta tecnologia não tem precisão, limite de detecção e capacidade para permitir distinguir os diferentes isolados do presente invento. Consequentemente, o desenvolvimento de um teste de DNA para a identificação rápida de diferentes estirpes destes fungos oferece vantagens reais, não só para os taxonomistas de -35- fungos como também para a forma de lidar com a doença e fungicida selectivo usado no campo.

Depósitos

Os depósitos que se seguem foram feitos em 28 de Março, 1994, na Agriculture Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A.: 1. HB101 DH5d (pCRW2-l; SEQ ID NO:3) N° de Acesso NRRL B-21231 2. HB101 DH5d (pCRW5-l; SEQ ID NO:47) N° de Acesso NRRL B-21232 3. E. coli DH5d (pCRSTRITl; SEQ ID NO:l) N° de Acesso NRRL B-21233 4. E. coli DH5d (pCRRl-21; SEQ ID NO:4) N° de Acesso NRRL B-21234 5. E. coli DH5d (pCRSNOD31; SEQ ID NO:2) N° de Acesso NRRL B-21235 -36-

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: Ligon, James M

Beck, James J (ii) TÍTULO DO INVENTO: Detecção de fungos patogénicos usando a reacção em cadeia com polimerase (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 86 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DÉSTINATÁRIO.Ciba-Geigy Corporation (B) RUA: 7 Skyline Drive (C) CIDADE: Hawthome

(D) ESTADO: NY

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 10532 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: US TBA (B) DATA DE ENTREGA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/233,608 (B) DATA DE ENTREGA: 04-ABRIL-1994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR /AGENTE: (A) NOME: Walsh, Andrea C. (B) NÚMERO DE REGISTO:34,988 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/SUMÁRIO: CGC 1739 (íx) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 919-541-8666 (B) TELEFAX: 919-541-8689 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 548 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...548 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Septoria tritici" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGCGAGG GCCTCCGGGT CCGACCTCCA 60 ACCCTTTGTG AACACATCCC GTTGCTTCGG GGGCGACCCT GCCGGGCGCC CCCGGAGGAC 120 CACCAAAAAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTTACGAGT AAATCGAAAC AAAACTTTCA 180 ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT 240 GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC TTTGAACGCA CATTGCGCCC CCTGGTATTC 300 CGGGGGGCAT GCCCGTTCGA GCGTCATTAC ACCACTCCAG CCTCGCTGGG TATTGGGCGT 360 CTTTTCGCGG GGGATCACTC CCCCGCGCGC CTCAAAGTCT CCGGCTGAGC GGTCTCGTCT 420 CCCAGCGTTG TGGCATCACG TCTCGCCGCG GAGTTCACGA GCCCTCACGG CCGTTAAATC 480 ACACCTCAGG TTGACCTCGG ATCGGGTAGG GATACCCGCT GAACTTAAGC ATATCAATAA 540 GCGGAGGA 548 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 583 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Septoria nodorum (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...583 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Septoria nodorum" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CACTCAGTAG TTTACTACTG TAAAAGGGGC 60 TGTTAGTCTG TATAGCGCAA GCTGATGAGC AGCTGGCCTC TTTTATCCAC CCTTGTCTTT 120 TGCGTACCCA CGTTTCCTCG GCAGGCTTGC CTGCCGGTTG GACAAATTTA TAACCTTTTT 180 AATTTTCAAT CAGCGTCTGA AAAACTTAAT AATTACAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG 240 TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA GTGTGAATTG CAGAATTCAG 300 TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCTTGGT ATTCCATGGG GCATGCCTGT 360 TCGAGCGTCA TTTGTACCCT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGG GTGTTTGTCC TCTCCCTAGT 420 GTIITGGACTC GCCTTAAAAT AATTGGCAGC CAGTGTTTTG GTATTGAAGC GCAGCACAAG 480 TCCJCGATTCG TAACAAACAC TTGCGTCCAC AAGCCTTTTT AACTTTTGAC CTCGGATCAG 540 GTAGGGATAC CCGCTGAACT TAAGCATATC AATAAGCGGA GGA 583 -38- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 626 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTÍDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudocercosporella herpotrichoides

(B) ESTIRPE: Estirpe R (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Variante W2-1 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mis_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...626 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Pseudocercosporella herpotrichoides estirpe W (variante W2-1) " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GAACAGACAG CGCCCCGGGA 60 GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCAGGCCGC TCGGAGAAGC 120 CTGGTTCAGA CCTCCACCCT TGAATAAATT ACCTTTGTTG CTTTGGCAGG GCGCCTCGCG 180 CCAGCGGCTT CGGCTGTTGA GTACCTGCCA GAGGACCACA ACTCTTGTTT TTAGTGATGT 240 CTGAGTACT A TATAATAGTT AAAACTTTCA ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG 300 AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC 360 TTTGAACGCA CATTGCGCCC TCTGGTATTC CGGGGGGCAT GCCTGTTCGA GCGTCATTAT 420 AACCACTCAA GCTCTCGCTT GGTATTGGGG TTCGCGTCCT CGCGGCCTCT AAAATCAGTG 480 GCGGTGCCTG TCGGCTCTAC GCGTAGTAAT ACTCCTCGCG ATTGAGTCCG GTAGGTTTAC 540 TTGCCAGTAA CCCCCAATTT TTTACAGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGGA TACCCGCTGA 600 ACTTAAGCAT ATCAATAAGC GGAGGA 626 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 627 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudocercosporella herpotrichoides

(B) ESTIRPE: Estirpe R (ix) C ARACTERÍ STIC AS: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..627, (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Pseudocercosporella herpoírichoides estirpe R" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.4: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GGATAGACAG CGCCCCGGGA 60 GAAATCCTGG GGGCCACCCT ACTTCGGTAA GGTTTAGAGT CGTCGGGCCT CTCGGAGAAG 120 CCTGGTCCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGCAG GGCGCCTCGC 180 GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG 240 TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT 300 GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT 360 CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA 420 TAA.CCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCT TCGCGGCCTC TAAAATCAGT 480 GGCGGTGCCT GTCGGCTCTA CGCGTAGTAA TACTCCTCGC GATTGAGTCC GGTAGGTTTA 540 CTTGCCAGCA ACCCCCAATT TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG 600 AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGA 627 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 534 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mycosphaerella fijiensis (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..534_ (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Mycosphaerella fijiensis" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO.5: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACGCCC GACCTCCAAC 60 CCTTTGTGAA CCACAACTTG TTGCTTCGGG GGCGACCTGC CGTCGGCGGG CGCCCCCGGA 120 GGCCGTCTAA ACACTGCATC TTTGCGTCGG AGTTTAAAAC AAATCGAACA AAACTTTCAA 180 CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG 240 300

AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT TTGGTATTCC -40- GAAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA CCACTCAAGC CTGGCTTGGT ATTGGGCGTC 360 GCGGTTCTTC GCGCGCCTTA AAGTCTCCGG CTGAGCTGTC CGTCTCTAAG CGTTGTGGAT 420 CTTTCAATTC GCTTCGGAGT GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTTATT CAAAGGTTGA 480 CCTCGGATCA GGTAGGGATA CCCGCTGAAC TTAAGCATAT CAATAAGCGG AGGA 534 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 540 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Mycosphaerella musicola (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misc_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..540 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador

Interno Transcrito de Mycosphaerella musicola" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.6: TCCGTAGGTG AACCTGCGGG GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACCCCC GACCTCCAAC 60 CCTTTGTGAA CCACACCTGT TGCTTCGGGG GCGACCCTGC CGGCGAACTT GTCGCCGGGC 120 GCCCCCGGAG GTCTCCTTAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTCCAAACA AATCGGACAA 180 AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA 240 AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCTT 300 TGC5CATTCCG AAGGGCATGC ctgttcgagc GTCATTTCAC CACTCAAGCC TAGCTTGGTA 360 TTGGGCGCCG CGGTGCTCCG CGCGCCCCAA AGTCTCCCGG CTAAGCCGTC CGTCTCTAAG 420 CGTTGTGGAT TTTTCAGTTC GCTCCGGAGC GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTCAAA 480 GGTTGACCTC GGATCAGGTA GGGATACCCG CTGAACTTAA GCATATCAAT AAGCGGAGGA 540 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB433

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO.7:

ACACTCAGTA GTTTACTACT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB434

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.8:

TGTGCTGCGC TTCAATA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB525

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.9: GCGACTTGTG CTGCGCTTCA ATA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB527

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.IO: CATTACACTC AGTAGTTTAC TACT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB455

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 11 :

CTGCGTCGGA GTTTACG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB446

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 12:

CGAGGCTGGA GTGGTGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB526

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 13: CCCAGCGAGG CTGGAGTGGT GT (2) .INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB536

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.14: CTGGGGGCTA CCCTACTTGG TG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB537

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.15: GGGGGCTACC CTACTTGGTA G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB538

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 16: ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ϋ) ΤΊΡO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB539

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 17: CTTCGGTAAG GTTTAGAGTC GTCG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB540

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 18: GGGGGCCACC CTACTTCGGT AA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB541

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO . (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 19: CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB542

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO ϋΙΙΙΙίΙ!1111

-45-

(iv) ANTI-SENTEDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.20: CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB543

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.21: CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB544

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTEDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.22: CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB547

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.23: 22

ATTACCGAGT GAGGGCTCAC GC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB548

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.24: GTTGCTTCGG GGGCGACCTG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB442

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.25: TCGGGGGCGA CCTGCCG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB443

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.26:

CCGGAGGCCG TCTA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:27: 14 -47- (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB545

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.27: CCACAACGCT TAGAGACGGA CAG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB546

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.28: CACCCGCACT CCGAAGCGAA TT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB549

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0.29: GATCCGAGGT CAACCTTTGA ATAA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB444

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.30:

GGTCAACCTT TGAATAA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB451

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.31:

CCTTTGTGAA CCACACCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB440

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.32: CTGCCGGCGA ACTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB449

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.33:

ACCCT GCCGG CGAACTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB448

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0.34:

GCGACCCTGC CGGCGAAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB441

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0.35:

TAGCCGGGAG ACTTTGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB450

(íii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.36:

TCTGCGTCGG AGTTCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica JB452

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.37:

CCGCGCTCCG GAGCGAAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica ITS1

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.38:

TCCGTAGGTG AACCTGCGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica ITS2

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.39:

GCTGCGTTCT TCATCGATGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica ITS3

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.40:

GCATCGATGA AGAACGCAGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica ITS4

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTÍDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.41:

TCCTCCGCTT ATTGATATGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica OPB-12

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO -52- (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:42: CCTTGACGCA 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica OPE-6

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.43: AAGACCCCTC 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica OPE-12

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0.44: TTATCGCCCC 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica OPE-19

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.45: 10

ACCCCCGAAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ED NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica OPE-15

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.46: ACGCACAACC 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 627 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudocercosporella herpotrichoides

(B) ESTIRPE: Estirpe W (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Variante W5-1 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misfeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1...627 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Pseudocercosporella herpotrichoides estirpe W (variante W5-1) " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GAACAGACAG CGCCCTGGGA 60 GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTCGGTAG GGTTTAGAGT CGTCAGGCCT CTCGGAGAAG 120 CCTGGTTCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGCAG GGCGCCTCGC 180 GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG 240 TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT 300 GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT 360 CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA 420 480

TAACCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCC TCGCGGCCTC TAAAATCAGT 540

540 GGCGGTGCCT CTCGGCTCTA CTTGCCAGTA ACCCCCAATT AACTTAAGCA TATCAATAAG 600 627

CGCGTAGTAA TACTCCTCGC GATTGAGTCC GGTAGGTTTA TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG CGGAGGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica Ml3 universal -20

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.48: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: Sequência iniciadora oligonucleotídica M13 universal reverso

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.49: AACAGCTATG ACCATG 16 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB563"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO - 55 - (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.50: CTTGCCTGCC GGTTGGACAA ATT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB564"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.51: CTCAGTAGTT TCTACTGTA AAAGG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB565"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.52: CTTCTGGACG CAAGTGTTTG TTAC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB566"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) N0.53: GTTTTTAGTG GAACTTCTGA GT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico -56- (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB567"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD N0.54: CGCAGGAACC CTAAACTCT 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB568"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.55: GCCCGCCGCA GG 12 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB569"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.56: RTWWTTWRTG GAMYYTCTGA GT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB570"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.57:

TATGTTGCCT CGGCGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB571

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.58: TAACGATATG TAAATTACTA CGCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB572

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.59:

AAGTTGGGGT TTAACGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB573

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.60: AGCGAGCCCG CCAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB574

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.61: CCATTGTGAA CGTTACCTAT AC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB575

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.62:

CGACCAGAGC GAGATGTA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB576

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.63: ' GTGAACATAC CTTATGTTGC C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB577

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD N0.64:

GTTGCCTCGG CGGATC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB578

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.65:

CCGCGACGAT TACCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB538

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.66: TGACGACTCT AAACCCTACC A (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico -60- (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB539"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.67: CGACGACTCT AAACCTTACC G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica W130"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.68: ATTCAAGGGT GGAGGTCTGA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica R130"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.69: ATTCAAGGGT GGAGGTCTGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB539’15"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NOJO: CTCTAAACCC TACCA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB539'15"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.71: CTCTAAACCT TACCG 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB553"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.72: GTGGTCCTCT GGCAG 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB554"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.73: 15

CTCAACAGCC GAAGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB555

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.74:

GGGTGGAGGTCTGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB556

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.75:

GGTGGAGGTC TGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB561

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.76:

TGGAGGTCTG GACCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples -63- (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB562"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.77: TGGAGGTCTG AACCA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /dèsc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB559"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.78: AGGGTGGAGG TCTGA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB560"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.79: AGGGTGGAGG TCTGG 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB557"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.80: TTCTCCGAGA GGCCT 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "Sequência iniciadora oligonucleotídica JB558"

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.81: TTCTCCGAGA GGCCC 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 504 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mis_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1 ..504

Interno Transcrito de Fusarium culmorum (fculm.con)" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.82: GAGGGATCAT TACCGAGTTT ACTRACTCCC AAACCCCTGT GAACDTACCT TATGTTGCCT 60 CG<3CGGATCA GCCCGCGCCC CGTAAAAAGG GACGGCCCGC CGCAGGAACC CTAAACTCTG 120 TTTTTAGTGG AACTTCTGAG TATAAAAAAC AAATAAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT 180 CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA 240 TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG 300 CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCAGCTTGGT GTTGGGAGCT GCAGTCCTGC 360 TGCACTCCCC AAATACATTG GCGGTCACGT CGRAGCTTCC ATAGCGTAGT AATTTACATA 420 TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCYACGCCG TTAAACCCCA ACTTCTGAAT GTTGACCTCG (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador 480 GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAA 504 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 503 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mis_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..503, (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Fusarium graminearum (fgram.con) " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED N0.83: GGATCATTAC CGAGTTTACW SACTCCCAAA CCCCTGTGAA CATACCTTAT GTTGCCTCGG 60 CGGATCAGCC CGCGCCCCGA AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA 120 GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT 180 KCTGGCATCG ATGAAGAACG CASCRAAATG CGATAAGTAA TGTGWATTGC AGAATTCAGT 240 GAATCAWCGA ATCTTTGAAC GCWSATTGCK MCCRCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT 300 CGAGCGTCAT TTCAACCCTC AAGCCCAGVT TGGTGTKGGG GARYTGCAGK CCTRYTKCAC 360 TCCCCAAATA ARTTGGCGGT CACGTCGAAC TTCCATAGCG TAGTAAGTTA CACATCGTTA 420 CTGGTAATCG TCGCGGCTAC GCCGTTAAAC CCCAACTTCT GAATGTTGAC CTCGGATCAG 480 GTAGGAATAC CCGCTGAAGG TAA 503 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ Π) NO:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 353 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mis_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..353, (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Fusarium moniliforme (fmono.con) " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO.84: TCCGTAGGTG AACCTGCGGA TAGGRGTCAT TASMGAGTTT ACWACTSCCA AACCCCTGTG 60 AAYATACCTT ATGTTGCSTC GGCGGATCAG CCCGCGCSCC GTARRAAGGG ACGGCCCGCC 120 GCAGGAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AATAAATCAA 180 GCAGGAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AATAAATCAA 180 240 300 353

AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCA AAATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGYGMCCGC CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTCAAGCC CAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 545 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: mis_feature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..545 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador Interno Transcrito de Microdochium nivale (mnivale.txt)" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0.85: GCGGATCATT ACAGAGTTGC AAAACTCCCT AAACCATTGT GAACGTTACC TATACCGTTG 60 CTTCGGCGGG CGGCCCCGGG GTTTACCCCC CGGRAGYCCC TGGKMCCCAC CGCGGGSGCC 120 MGCCGGAGGT CACCAAACTC TTGATAATTT ATGGCCTCTC TGAGTCTTCT GTACTGAATA 180 AGTCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT 240 GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC 300 GCCCGCCAGC ATTCTGGCGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TTTCAACCAT GAAGCCCCCG 360 GGCTTGTGTT GGGGACCTRC GGCTGCCGCA GGCCCTGAAA AGCAGTGKCG GGCTCGCTGT 420 CGCACCGAGM GTAGTAGSAT ACATCTCGCT CTGGTCGCGC CGCGGGTTCC GGCCGTTAAA 480 CCACCTTTTT AACCCAAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA AGACCCGCTG AACTTACGCA 540 TATCA 5Λ5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 563 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOME/CHAVE: misjeature (B) LOCALIZAÇÃO: 1..563_ (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Sequência de DNA do Espaçador 60 -67-

Intemo Transcrito de Septoria avenae f. sp. triticea ATCC# 26380 (satits.con) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID N0.86:

TCCCGTAGGT GAACCTGCGG CTGTTAGTCT GTATAGCGCA TTGCGTACCC ACGTTTCCTC TAATTTTCAA TCAGCGTCTG GTTCTGGCAT CGATGAAGAA GTGAATCATC GAATCTTTGA TTCGAGCGTC ATTTGTACCC TGTTTGGACT CGCCTTAAAA GTCGCGATTC TTATCAAATA CAGGTAGGAG ACCGCTGACT

AAGGATCATT ACACTCAGTA AGCTGATGAG CAGCTAGCCT GGCAGGCTTG CCTGCCGATT AAAAACTTAA TAATTACAAC CGCAGCGAAA TGCGATAAGT ACGCACATTG CGCCCCTTGG TCAAGCTCTG CTTGGTGTTG TAATTGGCAG CCAGTGTTTT CTTGCGTCCA CAAGCCCTTT TAA

GTTTACTACT GTAAAGGAGG CTTTTATCCA CCCTTGTCTT GGACAAACCT ATAACCTTTT TTTCAACAAC GGATCTCTTG AGTGTGAATT GCAGAATTCA TATTCCATGG GGCATGCCTG GGTGTTTGTC CTCTCCCTAG GGTAYTGAAG CGCAGCACAA TTTAACTTTT GACCTCGGAT 120 180 240 300 360 420 480 540 563

Lisboa, 5 de Abril de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

FIGURAI 1/3

FIGURA 2

FIGURA 3

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de DNA isolada compreendendo uma sequência Espaçadora Interna Transcrita seleccionada do grupo constituído por SEQID NO: 1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:86.
2. 2. Uma sequência iniciadora oligonucleotídica para usar na detecção baseada na amplificação de uma sequência Espaçadora Interna Transcrita, em que a referida sequência iniciadora deriva de uma molécula de DNA da reivindicação 1.
3. 3. A sequência iniciadora oligonucleotídica da reivindicação 2, em que a referida sequência iniciadora é seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NO:7-13 e SEQ ID NOs:50-52.
4. 4. Um par de sequências oligonucleotídicas iniciadoras para usar na detecção baseada na amplificação de uma sequência Espaçadora Interna Transcrita, em que pelo menos uma sequência iniciadora é seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOs:7-13 e SEQ ID NOs:50-52.
5. 5. O par de sequência iniciadoras oligonucleotídicas de acordo com a reivindicação 4, em que uma sequência iniciadora é seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOs: 7-13 e SEQ ID NOs:50-52 e a outra sequência iniciadora é seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NOs:38-41.
6. 6. O par de sequências iniciadoras oligonucleotídicas de acordo com a reivindicação 4, em que o referido par é seleccionado de entre os seguintes pares de sequências oligonucleotídicas: -2- SEQ ID N0:7 e SEQID N0:8; SEQ ID N0:7 e SEQ ID N0:41; SEQ ID N0:8 e SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:52; e SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:52.
7. 7. O par de sequências iniciadoras oligonucleotídicas de acordo com a reivindicação 4, em que o referido par é SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8.
8. 8. O par de sequências iniciadoras oligonucleotídicas de acordo com a reivindicação 5, em que o referido par é seleccionado entre os seguintes pares de sequências iniciadoras: SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:41; SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:40; SEQIDNO. il e SEQ IDNO:41; e SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:38.
9. 9. Um método para a detecção de um fungo patogénico, compreendendo os passos de: (a) isolamento de DNA a partir de uma folha de planta infectada com um agente patogénico; (b) amplificação de uma parte da região Espaçadora Interna Transcrita do referido agente patogénico usando o referido DNA como molde numa reacção em cadeia com polimerase com um par de sequências iniciadoras de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5; e -3- (c) visualização da referida parte amplificada da região Espaçadora Interna Transcrita.
10. 10. O método da reivindicação 9, em que o referido fungo patogénico é seleccionado do grupo constituído por Septoria nodorum, Septoria tritici e Septoria avenae f. sp tritici.
11. 11. Um estojo para a detecçãode Septoria compreendendo um veículo compartimentado de forma a receber dentro, num curto espaço, um ou mais recipientes, um deles contendo a sequência iniciadora de acordo com a reivindicação 2.
12. 12. Um estojo para a detecção de Septoria compreendendo um veículo compartimentado de forma a receber, num espaço curto, um ou mais recipientes, um deles contendo a sequência iniciadora de acordo com a reivindicação 3.
13. 13. Um estojo para a detecção de Septoria compreendendo um veículo compartimentado de forma a receber, num espaço curto, um ou mais recipientes, um deles contendo a sequência iniciadora de acordo com a reivindicação 4.
14. 14. Um estojo para a detecção de Septoria compreendendo um veículo compartimentado de forma a receber, num espaço curto, um ou mais recipientes, um deles contendo a sequência iniciadora de acordo com a reivindicação 5.
15. 15. Um ensaio colorimétrico quantitativo para a detecção de um fungo patogénico, compreendendo os passos de: -4- 1 (a) isolamento do DNA a partir de uma folha de planta infectada com um fungo patogénico; (b) amplificação por PCR de uma parte da sequência Espaçadora Interna Transcrita do referido fungo patogénico usando como molde um par de sequências iniciadoras de acordo com a reivindicação 4 como sequências iniciadoras de diagnóstico; e (c) visualização da referida parte amplificada da sequência Espaçadora Interna Transcrita usando uma sonda de captura seleccionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 19, 20, 39 e 66-81.
16. 16. O ensaio da reivindicação 15, em que as sequências iniciadoras de diagnóstico são SEQ ID NOs: 9 e 10 e em que a sonda de captura é SEQ ID NO:39. Lisboa, 5 de Abril de 2000

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