DE69534933T2

DE69534933T2 - Nachweis von Pilzpathogenen durch Anwendung der polymerase Kettenreaktion

Info

Publication number: DE69534933T2
Application number: DE69534933T
Authority: DE
Inventors: James M. Apex Ligon; James J. Cary Beck
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2015-04-20
Also published as: EP0955381A3; ES2143051T3; EP0955381B1; EP0758404B1; WO1995029260A3; ATE189703T1; CN1072726C; AU2424495A; WO1995029260A2; PL182188B1; BR9507513A; GR3032928T3; RU2161196C2; CN1147276A; EP0955381A2; JPH10501965A; US5955274A; DE69515029D1; PL182002B1; ATE323177T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von artenspezifischen Primern in Polymerasekettenreaktionsassays zur Detektion von pilzlichen Pathogenen. Die Verwendung dieser Primer ermöglicht die Detektion von spezifischen Isolaten von pilzlichen Pathogenen und die Überwachung der Krankheitsentwicklung in Pflanzenpopulationen.
Hintergrund der Erfindung
Krankheiten in Pflanzen verursachen beträchtliche Ertragsverluste von Jahr zu Jahr, die sowohl zu wirtschaftlichen Verlusten für Landwirte als auch zusätzlich in vielen Teilen der Welt zu Engpässen in der Ernährungsversorgung der lokalen Bevölkerung führen. Die weitverbreitete Verwendung von Fungiziden hat eine beträchtliche Sicherheit gegen den Befall mit Pflanzenpathogenen geliefert. Dennoch betragen trotz eines Wertes von 1 Milliarde $ an Ausgaben für Fungizide die Ernteverluste weltweit circa 10 % des Ertragswertes von 1981 (James, 1981; Seed Sci. & Technol. 9:679–685).
Die Schwere des destruktiven Prozesses der Krankheit hängt von der Aggressivität des Pathogens und der Reaktion des Wirts ab. Ein Ziel der meisten Pflanzenzüchtungsprogramme besteht darin, die Resistenz von Wirtspflanzen gegen Krankheit zu erhöhen. Typischerweise Wechselwirken unterschiedliche Rassen von Pathogenen mit unterschiedlichen Sorten der gleichen Kulturpflanzenart unterschiedlich, und viele Quellen für Wirtsresistenz schützen nur gegen spezifische Pathogenrassen. Außerdem zeigen einige Pathogenrassen frühe Zeichen von Krankheitssymptomen, aber verursachen wenig Schädigung in der Kulturpflanze. Jones und Clifford (1983; Cereal Diseases, John Wiley) berichten, dass man erwartet, dass virulente Formen des Pathogens in der Pathogenpopulation als Reaktion auf die Einführung von Resistenz in Wirtssorten auftreten, und dass es deshalb notwendig ist, Pathogenpopulationen zu überwachen. Zusätzlich gibt es mehrere dokumentierte Fälle der Entwicklung von Pilzstämmen, die resistent gegen besondere Fungizide sind. Schon 1981 behaupteten Fletcher und Wolfe (1981; Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.), dass 24 % der Echten Mehltaupopulationen aus Frühjahrsgerste und 53 % aus Wintergerste eine beträchtliche Variation der Reaktion auf das Fungizid Triadimenol zeigten, und dass die Verteilung dieser Populationen zwischen Sorten variierte, wobei die anfälligste Sorte auch das höchste Auftreten von weniger anfälligen Typen ergab. Eine ähnliche Variation der Empfindlichkeit von Pilzen gegen Fungizide wurde für Weizenmehltau (auch gegen Triadimenol), Botrytis (gegen Benomyl), Pyrenophora (gegen Organoquecksilber), Pseudocercosporella (gegen Fungizide vom MBC-Typ) und Mycosphaerella fijiensis gegen Triazole dokumentiert, um nur einige zu nennen (Jones und Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983).
Getreidearten werden weltweit kultiviert und stellen einen Hauptanteil der Weltnahrungsmittelproduktion dar. Obwohl Ertragsverluste durch viele Pathogene verursacht werden, sind die nekrotisierenden Pathogene Septoria und Pseudocercosporella besonders wichtig in den Hauptgetreideanbaugebieten von Europa und Nordamerika (Jones und Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983). Insbesondere macht die differentielle Symptomatik, die durch unterschiedliche Isolate und Arten dieser Pilze verursacht wird, die genaue voraussagende Bestimmung von potentiellen Krankheitsverlusten schwierig. Entsprechend wird die Verfügbarkeit von verbesserten diagnostischen Techniken zur schnellen und genauen Identifizierung spezifischer Pathogene von beträchtlichem Nutzen für Feldpathologen sein.
Vier Septoria-Arten befallen die kleinen Getreidearten. Septoria tritici ist der Verursacher für Blattflecken und ist virulent an Weizen, aber befällt auch Triticale und Roggen. Es verursacht typischerweise Blattnekrose. Septoria nodorum ist der Verursacher für Braunfleckigkeit und ist parasitisch an Weizen, Triticale, Roggen und Gerste und wird, obwohl es hauptsächlich auf Spelzen beschränkt ist, auch an Blattspreiten und -scheiden gefunden. Septoria avenae ist parasitisch an Hafer, Weizen und Triticale, und Septoria passerinii ist auf Gerste beschränkt. Septoria-Krankheiten treten bei jedem Weizen auf, der in Gebieten mit wirtschaftlich bedeutenden Mengen wächst. Unterschiedliche Septoria-Krankheiten treten häufig gleichzeitig innerhalb von Feldern und auf individuellen Pflanzen auf, wobei diese Krankheitssymptome kollektiv als der "Septoria-Komplex" bezeichnet werden. Typischerweise sind die am häufigsten gefundenen Arten S. tritici und S. nodorum. Gemäß Wiese (1977; Compendium on Wheat Diseases, Amer. Phytopath. Soc., S. 42–45) zerstört der Septoria-Komplex derzeit beinahe 2 % des jährlichen Weizens der Welt, wobei der Ernteverlust hauptsächlich das Ergebnis von beeinträchtigter Kornfüllung ist. Fungizidbehandlungen können bis zu 20 % in Fällen von schwerer Septoria-Infektion einsparen, aber es ist häufig schwierig, zwischen den unterschiedlichen Septoria-Arten beim Einsetzen der Infektion zu unterscheiden, und dies macht die Entscheidung schwierig, ob man in die Fungizidverwendung investiert oder nicht, weil unterschiedliche Sorten unterschiedliche Grade an Resistenz gegen die verschiedenen Septoria-Arten aufzeigen.
Die Halmbruchkrankheit des Getreides wird durch den Pilz Pseudocercosporella herpotrichoides verursacht und ist auf den Basishalm der Pflanze beschränkt. Weizen, Roggen, Hafer und andere Gräser sind anfällig für die Halmbruchkrankheit, die in kühlen, feuchten Klimazonen auftritt und in Europa, Nord- und Südamerika, Afrika und Australien vorherrscht. Weizen ist die anfälligste Getreideart, aber Isolate wurden identifiziert, die auch virulent an anderen Getreidearten sind. Der R-Stamm des Pilzes wurde zum Beispiel auch aus Roggen isoliert und wächst langsamer auf Weizen als der W-Stamm, der aus Weizen isoliert wurde. Obwohl die Halmbruchkrankheit Schößlinge oder Pflanzen vollständig töten kann, verursacht sie gewöhnlicher ein Umlegen und/oder führt zu einer Reduzierung von Korngröße und -anzahl. Ertragsverluste, die mit der Halmbruchkrankheit verbunden sind, sind von noch größerer Höhe als diejenigen, die mit Septoria tritici und Septoria nodorum verbunden sind. Typische Bekämpfungsmaßnahmen für die Halmbruchkrankheit schließen die Behandlung mit Wachstumsregulatoren zur Stärkung von Stengelgliedern und die Fungizidbehandlung ein. Jedoch macht die unterschiedliche Anfälligkeit von Sorten gegen unterschiedliche Stämme des Pilzes die vorhersagbare Effizienz von Fungizidbehandlungen schwierig.
Die Sigatoka-Blattfleckenkrankheit der Banane tritt in zwei Formen auf, von denen jede durch einen unterschiedlichen Pilz verursacht wird. Das wirtschaftlich bedeutende Black Sigatoka wird durch Mycosphaerella fijiensis verursacht, wohingegen das weniger wirtschaftlich bedeutende Yellow Sigatoka durch Mycosphaerella musicola verursacht wird (Johanson und Jeger, 1993; Mycol. Res. 97:670–674). Black Sigatoka ist das Hauptproblem der Banane, was schwere Verluste von 30 % und mehr verursacht. Aufgrund des Auftretens von Fungizidresistenz bei Mycosphaerella fijiensis sollte die Fungizidverwendung am besten beschränkt werden, um das weitere Auftreten von Resistenz zu verhindern. Entsprechend wird die Verfügbarkeit diagnostischer Werkzeuge ein wichtiges Mittel zur Identifizierung der geeigneten Umstände liefern, unter denen Fungizide ohne unnötiges Risiko für die Entwicklung weiterer Resistenz verwendet werden können.
Somit besteht eine reale Notwendigkeit zur Entwicklung von Technologie, die die Identifizierung spezifischer Rassen von pathogenen Pilzen frühzeitig im Infektionsprozeß erlauben wird. Durch Identifizierung der spezifischen Rasse eines Pathogens, bevor Krankheitssymptome im Anbaubestand offensichtlich werden, kann der Landwirt die wahrscheinlichen Wirkungen der weiteren Entwicklung des Pathogens in der Anbausorte bewerten, in der es identifiziert wurde, und kann ein geeignetes Fungizid wählen, falls eine solche Ausbringung als notwendig erachtet wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Identifizierung unterschiedlicher Pathotypen von pflanzenpathogenen Pilzen gerichtet. Die Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, die Variabilität zwischen unterschiedlichen pilzlichen Pathotypen zeigen. Solche DNA-Sequenzen sind nützlich im Verfahren der Erfindung, da sie verwendet werden können, um Primer zur Verwendung in diagnostischen Assays auf Polymerasekettenreaktion-(PCR)-Basis herzuleiten. Diese Primer erzeugen besondere Fragmente in PCR-Reaktionen, in denen die DNA-Matrize durch spezifische pilzliche Pathotypen bereitgestellt wird, und können somit zur Identifizierung der Gegenwart oder Abwesenheit spezifischer Pathotypen in Wirtspflanzenmaterial vor dem Einsetzen von Krankheitssymptomen verwendet werden.
Diese Erfindung stellt die Möglichkeit der Bewertung einer potentiellen Schädigung in eine spezifische Beziehung zwischen Anbausorte und Pathogenstamm und der vernünftigen Verwendung des vielfältigen Waffenarsenals an Fungiziden, das verfügbar ist, bereit. Außerdem kann sie verwendet werden, um ausführliche Informationen zur Entwicklung und zum Ausbreiten von spezifischen Pathogenrassen über ausgedehnte geografische Gebiete verwendet werden.
In der Durchführung der Erfindung nützliche Kits werden ebenfalls bereitgestellt. Die Kits finden eine besondere Verwendung in der Identifizierung von Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R.
Beschreibung der Figuren
1: Angleichung der intern transkribierten Spacer-Sequenzen aus Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm W (zwei Sorten), Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R, Mycosphaerella fijiensis und Mycosphaerella musicola.
2: Angleichung der intern transkribierten Spacer-Sequenzen aus Septoria nodorum und Septoria avenae f.sp. triticea.
3: Angleichung der intern transkribierten Spacer-Sequenzen aus Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme und Microdochium nivale.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Hier beschrieben werden besondere DNA-Sequenzen, die nützlich in der Identifizierung unterschiedlicher Pathotypen von pflanzenpathogenen Pilzen sind. Insbesondere können die DNA-Sequenzen als Primer in der PCR-basierten Analyse zur Identifizierung von pilzlichen Pathotypen verwendet werden. Diese DNA-Sequenzen schließen den intern transkribierten Spacer (ITS) der ribosomalen RNA-Genregionen von besonderen pilzlichen Pathogenen sowie Primer ein, die aus diesen Regionen abgeleitet sind, die das besondere Pathogen identifizieren können. Diese ITS-DNA-Sequenzen aus unterschiedlichen Pathotypen innerhalb einer Pathogenart oder -gattung, die zwischen den unterschiedlichen Mitgliedern der Art oder Gattung variieren, können zur Identifizierung dieser spezifischen Mitglieder verwendet werden.
Biomedizinische Forscher haben PCR-basierte Techniken seit einiger Zeit und mit mäßigem Erfolg verwendet, um Pathogene in infizierten tierischen Geweben zu detektieren. Erst kürzlich wurde diese Technik jedoch zur Detektion von Pflanzenpathogenen eingesetzt. Die Gegenwart von Gaumannomyces graminis in infiziertem Weizen wurde unter Verwendung von PCR für Sequenzen detektiert, die spezifisch für das mitochondriale Pathogengenom sind (Schlesser et al., 1991; Applied and Environ. Microbiol. 57:553–556), und statistisch amplifizierte polymorphe DNA-Marker (d.h. RAPD) konnten zahlreiche Rassen von Gremmeniella abietina, dem Verursacher für Sklerroderris-Krebs in Koniferen, unterscheiden.
Ribosomale Gene sind geeignet zur Verwendung als molekulare Sondenziele wegen ihrer hohen Kopiezahl. Trotz der hohen Konservierung zwischen reifen rRNA-Sequenzen sind die nicht-transkribierten und transkribierten Spacer-Sequenzen gewöhnlich schlecht konserviert und sind deshalb geeignet als Zielsequenzen zur Detektion einer kürzlichen Evolutionsdivergenz. Pilzliche rRNA-Gene sind in Einheiten organisiert, die jeweils drei reife Untereinheiten von 185, 5.8S bzw. 28S codieren. Diese Einheiten sind durch zwei intern transkribierte Spacer, ITS1 und ITS2, mit circa 300 bp getrennt (White et al., 1990; PCR Protocols; Hrsg. Innes et al., S. 315–322). Zusätzlich sind die Transkriptionseinheiten durch nicht-transkribierte Spacer-Sequenzen (NTSs) getrennt. Die ITS- und NTS-Sequenzen sind besonders geeignet zur Detektion von spezifischen Pathotypen von unterschiedlichen pilzlichen Pathogenen.
Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen sind aus dem intern transkribierten Spacer (ITS) der ribosomalen RNA-Genregion unterschiedlicher Pflanzenpathogene. Die ITS-DNA-Sequenzen aus unterschiedlichen Pathotypen innerhalb einer Pathogenart oder -gattung variieren zwischen den unterschiedlichen Mitgliedern der Art oder Gattung. Sobald die ITS-Sequenzen eines Pathogens bestimmt sind, können diese Sequenzen mit anderen ITS-Sequenzen angeglichen werden. Auf diese Weise können Primer aus den ITS-Sequenzen abgeleitet werden. Das heißt Primer können auf Basis von Regionen innerhalb der ITS-Regionen geschaffen werden, die die größten Sequenzunterschiede unter den pilzlichen Pathotypen enthalten. Diese Sequenzen und Primer auf Basis dieser Sequenzen können zur Identifizierung spezifischer Pathogenmitglieder verwendet werden.
Besondere hier beschriebene DNA-Sequenzen schließen ITS-DNA-Sequenzen aus Septoria ein, insbesondere Septoria nodorum und Septoria tritici; Mycosphaerella, insbesondere Mycosphaerella fijiensis und Mycosphaerella musicola; Pseudocercosporella, insbesondere Pseudocercosporella herpotrichoides, ganz besonders für den W-Stamm und den R-Stamm von Pseudocercosporella herpotrichoides; Fusarium, insbesondere F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme und Microdochium nivale. Solche ITS-DNA-Sequenzen sowie Primer von Interesse sind in SEQ ID NO: 1–47 und SEQ ID NO: 50–86 angegeben. Die Sequenzen finden Verwendung in der PCR-basierten Identifizierung der Pathotypen von Interesse.
Verfahren zur Verwendung der Primer-Sequenzen der Erfindung in der PCR-Analyse sind allgemein fachbekannt. Siehe z.B. US-PSen 4,683,195 und 4,683,202 sowie Schlesser et al. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57:553–556. Siehe auch Nazar et al. (1991; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39:1–11), die die PCR-Amplifikation zur Untersuchung von Unterschieden in den ITS-Regionen von Verticillium albo-atrum und Verticillium dahliae und dadurch zur Unterscheidung zwischen den zwei Arten verwendeten; und Johanson und Jeger (1993; Mycol. Res. 97:670–674), die ähnliche Techniken zur Unterscheidung der Bananenpathogene Mycosphaerella fijiensis und Mycosphaerella musicola verwendeten.
ITS-DNA-Sequenzen können aus pilzlichen Pathogenen durch fachbekannte Verfahren kloniert werden. Allgemein sind die Verfahren zur Isolierung von DNA aus pilzlichen Isolaten bekannt. Siehe Raeder & Broda (1985), Letters in Applied Microbiology 2:17–20; Lee et al. (1990), Fungal Genetics Newsletter 35:23–24 und Lee und Taylor (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innes et al. (Hrsg.), S. 282–287.
Alternativ können die ITS-Regionen von Interesse durch PCR-Amplifikation bestimmt werden. Primer zur Amplifikation der gesamten ITS-Region wurden gemäß White et al. konstruiert (1990; PCR Protocols; Hrsg. Innes et al., S. 315–322), und die amplifizierte ITS-Sequenz wurde in den pCRII-Klonierungsvektor subkloniert. Die subklonierte Sequenz schloß das linkshändige ITS (ITS1), das rechthändige ITS (ITS2) sowie das zentral befindliche 5.8S rRNA-Gen ein. Dies erfolgte für Septoria nodorum und Septoria tritici, zahlreiche Pseudocercosporella-Isolate und Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella musicola, Septoria avenae triticea, F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme und Microdochium nivale.
Die ITS-Sequenzen wurden bestimmt, und innerhalb jeder Pathogengruppe wurden die Sequenzen verglichen, um Unterschiede zu lokalisieren, die nützlich zur PCR-Untersuchung zur Unterscheidung der unterschiedlichen Arten und/oder Stämme sein könnten. Die Sequenzen der ITS-Regionen, die bestimmt wurden, sind als SEQ ID NOs: 6, 47 und 82–86 und auch in 1, 2 und 3 gezeigt. Aus der Identifizierung von Unterschieden wurden zahlreiche Primer synthetisiert und in der PCR-Amplifikation getestet. Für die PCR-Amplikationsuntersuchung verwendete Matrizen waren zuerst gereinigte Pathogen-DNA und anschließend DNA, die aus infiziertem Wirtspflanzengewebe isoliert wurde. Somit war es möglich, Primer-Paare zu identifizieren, die diagnostisch waren, d.h. die eine besondere Pathogenart oder einen besonderen Pathogenstamm identifizierten, aber keine andere Art oder keinen anderen Stamm des gleichen Pathogens. Bevorzugte Primer-Kombinationen können zwischen den unterschiedlichen Arten oder Stämmen in infiziertem Wirtsgewebe unterscheiden, d.h. Wirtsgewebe, das zuvor mit einer spezifischen Pathogenart oder einem spezifischen Pathogenstamm infiziert wurde.
Diese Erfindung stellt Primer-Kombinationen bereit, die dieses Kriterium für unterschiedliche Stämme von Pseudocercosporella erfüllen, insbesondere für Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R. Die Primer der Erfindung werden auf Basis von Sequenzunterschieden unter den pilzlichen ITS-Regionen konstruiert. Ein minimaler Unterschied von einem Basenpaar zwischen den Sequenzen kann die Konstruktion eines unterscheidenden Primers erlauben. Primer, die für eine ITS-Region einer spezifischen pilzlichen DNA geschaffen wurden, können in Kombination mit einem Primer verwendet werden, der zu einer konservierten Sequenzregion innerhalb der codierenden Region der ribosomalen DNA gemacht wurde, um artenspezifische PCR-Fragmente zu amplifizieren. Allgemein sollten Primer eine theoretische Schmelztemperatur zwischen circa 60 und circa 70°C haben, um eine gute Empfindlichkeit zu erreichen, und sollten frei von signifikanter Sekundärstruktur und 3'-Überlappungen zwischen Primer-Kombinationen sein. Primer haben allgemein wenigstens circa 5 bis circa 10 Nukleotidbasen.
Der Nutzen von klonierten ITS-Sequenzen für die Selektion von Primern für diagnostische Zwecke beruht weitgehend auf ihrer schnellen evolutionären Divergenz. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Isolate des Pathogens Pseudocercosporella herpotrichoides vom W-Typ und R-Typ divergente ITS-Sequenzen haben, aus denen diagnostische Primer entwickelt wurden. Jedoch ist die schnelle Divergenz innerhalb der ITS-Sequenz ersichtlich aus der Beobachtung, dass zwei unterschiedliche Sequenzvarianten des W-Typs identifiziert wurden. Die Sequenzidentität innerhalb des W-Typs betrug 99,4 %, wohingegen diejenige zwischen W- und R-Typen 98,6 % betrug, was eine engere evolutionäre Beziehung zwischen den zwei W-Varianten nahelegt, als sie zwischen den W- und den R-Typen gefunden wurde. Diese engere Beziehung ist auch aus ihrer ähnlichen Wirtepathogenität der zwei Isolate mit divergenten ITS-Sequenzen ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht leicht die Herstellung von "Kits", die die zur Durchführung des Verfahrens notwendigen Elemente enthalten. Ein solches Kit kann einen Träger umfassen, der kompartimentiert ist, um darin in enger Abgrenzung ein oder mehrere Behältermittel wie Reagenzgläschen oder Fläschchen aufzunehmen. Eines der Behältermittel kann unmarkierte oder detektierbar markierte DNA-Primer enthalten. Die markierten DNA-Primer können in lyophilisierter Form oder in einem geeigneten Puffer nach Bedarf vorhanden sein. Ein oder mehrere Behältermittel können ein oder mehrere Enzyme oder Reagenzien zur Verwendung in PCR-Reaktionen enthalten. Diese Enzyme können als solche oder in Gemischen, in lyophilisierter Form oder in geeigneten Puffern vorhanden sein.
Schließlich kann das Kit alle zusätzlichen Elemente enthalten, die notwendig zur Durchführung der Technik der Erfindung sind, wie Puffer, Extraktionsreagenzien, Enzyme, Pipetten, Platten, Nukleinsäuren, Nukleosidtriphosphate, Filterpapier, Gelmaterialien, Transfermaterialien, Autoradiographiematerialien und dergleichen.
Die nachfolgenden Beispiele zeigen ohne Beschränkung typische experimentelle Protokolle, die in der Isolierung von ITS-Sequenzen, in der Selektion geeigneter Primer-Sequenzen, in der Untersuchung von Primern auf selektive und diagnostische Wirksamkeit und in der Verwendung solcher Primer für die Detektion von Krankheit und pilzlichem Isolat verwendet werden können. Solche Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung bereitgestellt.
Beispiele
Beispiel 1: Pilzliche Isolate und genomische DNA-Extraktion
Lebensfähige pilzliche Isolate von S. nodorum, S. tritici, S. passerini, S. glycines, Pseudocercosporella herpotrichoides, Pseudocercosporella aestiva, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis und Mycosphaerella musicola wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Fusarium culmorum- und Fusarium graminearum-Isolate wurden von Dr. Paul Nelson von der Penn State University erhalten. Ein Isolat von Microdochium nivale (Synonym Fusarium nivale) wurde von Ciba (Basel) erhalten, und ein Isolat von Fusarium moniliforme wurde von Dr. Loral Castor erhalten. Pilze wurden in 150 ml Kartoffeldextrosebouillon kultiviert, die mit Myzelfragmenten aus PDA-(Kartoffel-Dextrose-Agar)-Kulturen geimpft waren. Die Kulturen wurden in einem Rundschüttler bei 28°C für 7–11 Tage inkubiert. Myzel wurde durch Zentrifugieren pelletiert und dann in flüssigem Stickstoff gemahlen und vollständige genomische DNA unter Verwendung des Protokolls von Lee und Taylor extrahiert (1990; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Hrsg. Innes et al., S. 282–287).
Dr. Bruce McDonald von der Texas A&M University lieferte genomische DNA aus zehn Isolaten von S. nodorum und neun Isolaten von S. tritici. Dr. Chris Caten von der Birmingham University lieferte sechs Isolate von gereinigter pilzlicher DNA aus Septoria nodorum. Gereinigte genomische DNA aus 12 Isolaten von Pseudocercosporella herpotrichoides wurde von Dr. Paul Nicholson vom John Innes Centre, Norwich, UK, erhalten. Sechs dieser Isolate sind vom W-Typ; die anderen sechs Isolate sind vom R-Typ. Diese Isolate wurden auf Basis von Pathogenitäts- und RFLP-Studien typisiert. Andrea Johanson vom Natural Resources Institute lieferte genomische DNA von sechs Isolaten von M. musicola, von sechs Isolaten von M. fijiensis und von einem einzelnen Isolat von Mycosphaerella musae. Gereinigte genomische DNA von Septoria avenae f.sp. triticea ATCC #26380 wurde von Dr. Peter Ueng vom USDA, Beltsville, Maryland, bereitgestellt. Tabelle 1: Quellen für Testisolate

1 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA
2 Dr. Bruce McDonald, Texas A&M University, USA
3 Dr. Chris Caten, Birmingham University, UK
4 Dr. Paul Nicholson, John Innes Centre, UK
5 Dr. Andrea Johanson, Natural Resources Institute, UK
6 Dr. Paul Nelson, Penn State University
7 Dr. Loral Castor, Ciba Seeds Research, Bloomington, Illinois
8 Ciba-Geigy Limited, Basel, Schweiz
9 Dr. Peter Ueng, USDA, Beltsville, Maryland

Beispiel 2: Isolierung der intern transkribierten Spacer-(ITS)-Regionen
Die intern transkribierten Spacer-Regionsfragmente mit circa 550 bp wurden aus 25 ng von genomischer DNA PCR-amplifiziert, die aus S. nodorum (ATCC #24425), S. tritici (ATCC #26517), Pseudocercosporella herpotrichoides Isolate R1, R2, W2 und W5, M. fijiensis (ATCC #22115) und M. musicola (ATCC #22115) unter Verwendung von 50 pmol der Primer ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3', SEQ ID NO: 38) und ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3', SEQ ID NO: 41) isoliert wurde. PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, außer daß die Reaktionen in 100 μl erfolgten und das Verschmelzen bei 50°C durchgeführt wurde. Die ITS-Fragmente wurden durch Isopropanolausfällung gemäß Maniatis et al.
(1982; Molecular Cloning; Hrsg. Maniatis et al.; S. 461–462) gereinigt. Die DNA wurde in 50 μl dH₂O resuspendiert und unter Verwendung des TA Cloning Kit (Teile Nr. K2000-01) von Invitrogen Corporation (San Diego, CA) unter Verwendung des pCRII-Klonierungsvektors kloniert. Die DNA-Sequenzen der ITS-Regionen wurden durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des automatisierten Sequenzers Modell 373A von Applied Biosystems (Foster City, CA) mit den Primern ITS1 (siehe obige Sequenz), ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'; SEQ ID NO: 39), ITS4 (siehe obige Sequenz) und dem Primer M13 universell –20 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'; SEQ ID NO: 48) und dem reversen Primer (5'-AACAGCTATGACCATG-3'; SEQ ID NO: 49) bestimmt. Die ITS-Primer ITS1 (SEQ ID NO: 328), ITS2 (SEQ ID NO: 39), ITS3 (SEQ ID NO: 40) und ITS4 (SEQ ID NO: 41), die für die Klonierung der ITS-Regionen verwendet wurden, sind ausführlich in White et al. dargestellt (1990; PCR Protocols; Hrsg. Innes et al., S. 315–322).
Zusätzlich wurden die intern transkribierten Spacer-Regionen aus 25 ng genomischer DNA aus S. avenae f.sp. triticea, M. nivale, F. moniliforme (#4451), F. graminearum Isolate R-8417, R-8546 und R-8422, und F. culmorum Isolate R-5126, R-5106 und R-5146, PCR-amplifiziert. PCR-Produkte wurden unter Verwendung des Wizard DNA Clean-up Kit von Promega (Madison, WI) gereinigt. Die DNA-Sequenzen der ITS-Regionen wurden wie oben beschrieben unter Verwendung der Primer ITS1 (SEQ ID NO: 38), ITS2 (SEQ ID NO: 39), ITS3 (SEQ ID NO: 40) und ITS4 (SEQ ID NO: 41) bestimmt. Sequenzierungsreaktionen wurden mit den drei Isolaten aus F. culmorum und F. graminearum kombiniert, um eine Konsensus-Sequenz für F. culmorum und F. graminearum zu erzeugen.
Beispiel 3: DNA-Extraktion aus Weizen- und Bananenblättern
DNA wurde aus Weizenblättern unter Verwendung einer modifizierten Version des Rapid DNA Extraction-Protokolls aus dem IsoQuick Nucleic Acid Extraction-Kit (Katalog # MXT-020-100) von MicroProbe Corporation (Garden Grove, CA) extrahiert. Typische Ausbeuten betrugen 5–10 μg von gesamter DNA aus 0,2 g Blattgewebe. Circa 100 ng gesamte DNA wurden in jedem PCR-Test verwendet.
Modifizierte rasche DNA-Extraktion
Vor der erstmaligen Verwendung des Kits wurden die gesamten Inhalte von Reagens 2A (20-faches Farbstoffkonzentrat) zu Reagens 2 (Extraktionsmatrix) gegeben.

(1) Circa 0,2 g Blattprobe wurden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben, das 50 μl Probenpuffer A und 50 μl #1 Lyselösung enthielt. Die Blattprobe wurde mit einem Kontes-Pistill gemahlen.
(2) Reagens 2 (Extraktionsmatrix) wurde kräftig geschüttelt. 350 μl Reagens 2 wurden zum Probenlysat gegeben.
(3) 200 μl Reagens 3 (Extraktionspuffer) wurden zur Probe gegeben. Die Probe wurde für 20 s verwirbelt.
(4) Mikrozentrifugieren mit 12.000 × g für 5 min.
(5) Die wäßrige Phase (obere Schicht) wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dieses Volumen betrug typischerweise circa 200 μl.
(6) 0,1 × Volumen der wäßrigen Phase von Reagens 4 (Natriumacetat) zur Probe der wäßrigen Phase.
(7) Ein gleiches Volumen Isopropanol wurde zur Probe der wäßrigen Phase gegeben, gefolgt von Verwirbeln.
(8) Mikrozentrifugieren mit 12.000 × g für 10 min.
(9) Der Überstand wurde ohne Störung des Nukleinsäurepellets verworfen. 0,5 ml von 70 %igem Ethanol bei –20°C wurden zum Pellet gegeben. Das Röhrchen wurde zum Vermischen verwirbelt.
(10) Mikrozentrifugieren mit 12.000 × g für 5 min.
(11) Der Überstand wurde verworfen und das Pellet trocknen gelassen.
(12) Das Nukleinsäurepellet wurde in 50 μl Reagens 5 (RNase-freies Wasser) gelöst.

Beispiel 4: Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion
Polymerasekettenreaktionen wurden mit dem GeneAmp Kit von Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, CT; Teile Nr. N808-0009) unter Verwendung von 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, enthaltend 100 μM von jeweils TTP, dATP, dCTP und dGTP, 50 pM Primer, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 25 ng genomische DNA in einem Endvolumen von 50 μl, durchgeführt. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen von 15 s bei 94°C, 15 s bei 50°C, 60°C oder 70°C und 45 s bei 72°C in einem Thermozykler Perkin-Elmer/Cetus Modell 9600 durchgeführt. Die Produkte wurden durch Auftragen von 20 μl jeder PCR-Probe auf ein 1,1–1,2 %iges Agarosegel analysiert und elektrophoretisch behandelt.
Beispiel 5: Synthese und Reinigung von Oligonukleotiden
Oligonukleotide (Primer) wurden an einem DNA-Syntheseautomaten Applied Biosystems 380A unter Verwendung von B-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert.
Beispiel 6: Selektion von artenspezifischen Primern
Die ITS-Sequenzen von S. nodorum, S. tritici, P. herpotrichoides Stämme R und W, M. fijiensis und M. musicola wurden angeglichen (1). Die ITS-Sequenzen von S. nodorum und S. avenae triticea wurden angeglichen (2). Eine Angleichung erfolgte auch für die ITS-Sequenzen aus F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme und M. nivale (3). Sätze von Primern wurden gemäß Beispiel 5 auf Basis der Analyse der angeglichenen Sequenzen synthetisiert. Primer wurden zu Regionen konstruiert, die die größten Sequenzunterschiede unter den Pilzarten für 1–2 enthielten. In 3 wurden Primer zu Regionen höchster Homologie innerhalb des ITS für Fusarium konstruiert. Zusätzlich wurden die veröffentlichten ribosomalen genspezifischen Primer ITS1 (SEQ ID NO: 38), ITS2 (SEQ ID NO: 39), ITS3 (SEQ ID NO: 40) und ITS4 (SEQ ID NO: 41) (White et al., 1990; PCR Protocols; Hrsg. Innes et al., S. 315–322) zur Untersuchung in Kombination mit den für die ITS-Region spezifischen Primern synthetisiert.
Tabelle 2: Primer-Konstruktion für pilzliche Detektion
Fußnote: Fusarium spp. schließt F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme und Microdochium nivale (Synonym F. nivale) ein.
Beispiel 7: Selektion von zufällig amplifizierten polymorphen DNA-(RAPD)-Primern
Zwei RAPD-Primerbibliotheken (Kits B und E) mit jeweils zwanzig Oligonukleotiden wurden von Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA) erworben. Die Primer wurden auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung zwischen gereinigter genomischer DNA aus S. nodorum, S. tritica, M. fijiensis und M. musicola untersucht. Die PCR-Bedingungen waren im wesentlichen die gleichen wie in Beispiel 4 beschrieben, außer dass die Anzahl der PCR-Zyklen auf 35 erhöht wurde, die Verschmelzungstemperatur 30°C betrug und nur 5 pmol jedes Primers verwendet wurden. Fünf RAPD-Primer wurden identifiziert, die zwischen gereinigter genomischer DNA aus S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis und M. musicola differenzieren. Primer OPB-12 und OPE-6 erzeugten ein einzelnes Fragment bei Amplifikation mit genomischer DNA aus S. tritici. Primer OPE-12, OPB-19 und OPE-15 erzeugten einzelne Fragmente aus genomischer DNA von S. nodorum. Primer OPB-12 und OPE-6 erzeugten keine Amplifikationsprodukte aus genomischer DNA von S. nodorum, M. fijiensis und M. musicola. Primer OPE-12, OPB-19 und OPE-15 amplifizierten keine Fragmente aus genomischer DNA von S. tritici, M. fijiensis oder M. musicola.
Tabelle 3: RAPD-Primer für die Septoria-Diagnose
Beispiel 8: Bestimmung der Primer-Spezifität für gereinigte pilzliche genomische DNA
PCR-Reaktionen wurden gemäß Beispiel 4 unter Verwendung unterschiedlicher Primer-Kombinationen in einem Versuch durchgeführt, ein einzelnes artenspezifisches Fragment zu amplifizieren. Artenspezifische PCR-Amplifikationsprodukte wurden aus Primern erzeugt, die aus der ITS-Region zwischen den 18S und 25S ribosomalen DNA-Untereinheiten jedes pilzlichen Stammes von Interesse geschaffen wurden. Tabelle 4: Aus ITS stammende diagnostiche PCR-Primer

* Primer-Kombination amplifizierte einige Fragmente durch falsches Priming, aber keine hatten die Größe des gewünschten Fragments.
+ Primer amplifizierte das Fragment der richtigen Größe aus Pseudocercosporella herpotrichoides vom sowohl R-Typ als auch W-Typ.
++ Primer-Kombination amplifizierte das Fragment der richtigen Größe allein aus dem R-Typ von P. herpotrichoides.
1 Primer-Kombination amplifizierte das Fragment der richtigen Größe aus F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme und M. nivale.
2 Primer-Kombination amplifizierte das Fragment der richtigen Größe aus F. graminearum, F. culmorum und F. moniliforme.

Beispiel 9: Bestimmung der Primer-Spezifität für mit Pilzen infiziertes Pflanzengewebe
Gesamte genomische DNA wurde aus gesunden Weizenblättern, mit S. nodorum infizierten Weizenblättern, mit S. tritici infizierten Weizenblättern und mit sowohl S. nodorum als auch S. tritici infizierten Weizenblättern unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls isoliert. PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei die in Beispiel 8 aufgeführten Primer-Kombinationen gegen DNA aus den Weizenblättern getestet wurden.
Der S. tritici-spezifische Primer JB446 (SEQ ID NO: 12) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410) amplifizierten ein 345 bp-Fragment aus gereinigter S. tritici-DNA, aus mit S. tritici infiziertem Weizenblattgewebe und aus einer mit sowohl S. tritici als auch S. nodorum infizierten Weizenblattprobe. Der Primersatz amplifizierte kein diagnostisches Fragment aus gesundem Weizenblattgewebe noch aus mit S. nodorum infiziertem Weizengewebe. In ähnlicher Weise amplifizierten die S. tritici-spezifischen Primer JB445 (SEQ ID NO: 11) und ITS4 (SEQ ID NO: 41) (JB415) ein 407 bp-Fragment aus den gleichen Geweben wie die Primer-Kombination JB446 (SEQ ID NO: 12) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410) und waren auch diagnostisch.
Ähnliche diagnostische Ergebnisse wurden mit den S. nodorum-spezifischen Primern JB433 (SEQ ID NO: 7) und JB434 (SEQ ID NO: 8) erhalten. Die Primer amplifizierten ein 448 bp-Fragment aus mit S. nodorum infiziertem Weizengewebe, aus einer von sowohl S. nodorum als auch S. tritici befallenen Weizenblattprobe sowie aus gereinigter genomischer DNA von S. nodorum. Die Primer-Kombination JB433 (SEQ ID NO: 7) und JB434 (SEQ ID NO: 8) amplifizierte keine Fragmente aus gesundem Weizengewebe, aus mit S. tritici infiziertem Weizengewebe oder aus gereinigter genomischer DNA von S. tritici. Die S. nodorum-spezifischen Primer JB527 (SEQ ID NO: 10) und JB525 (SEQ ID NO: 9) amplifizierten ein 458 bp-Fragment aus den gleichen genomischen DNAs und Weizengeweben wie die Kombination aus JB433 (SEQ ID NO: 7) und JB434 (SEQ ID NO: 8).
Die in Beispiel 8 aufgeführten Primer-Kombinationen aus P. herpotrichoides wurden gegen die Extrakte aus Weizenstengeln, wie sie in Beispiel 12 erhalten wurden, durch PCR getestet. PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben mit den folgenden Veränderungen durchgeführt: 35 Zyklen wurden bei 94°C für 15 s und 70°C für 45 s durchgeführt, und 1,5–2,5 mM MgCl₂ und 200 μM von jedem dNTP wurden verwendet. 1 μl Weizenextrakt wurde in jeder PCR-Reaktion verwendet.
Die Primer-Kombination JB537 (SEQ ID NO: 15) und JB541 (SEQ ID NO: 19) amplifizierte ein 413 bp-Fragment aus mit dem Pathotyp vom W-Typ von P. herpotrichoides infiziertem Weizenextrakt. Keine Amplifikationsprodukte wurden aus der Amplifikation mit gesundem Weizenextrakt noch aus mit dem Pathotyp vom R-Typ von P. herpotrichoides infiziertem Weizenextrakt erzeugt.
Die Primer-Kombination JB539 (SEQ ID NO: 17) und JB544 (SEQ ID NO: 22) amplifizierte ein 487 bp-Fragment, und die Primer-Kombination JB540 (SEQ ID NO: 18) und JB542 (SEQ ID NO: 20) amplifizierte ein 413 bp-Fragment aus infiziertem Weizen vom R-Typ, aber nicht aus gesundem Weizen noch aus infiziertem Weizen vom W-Typ.
Vollständige genomische DNA wurde auch aus gesunden Bananenblättern und aus mit M. fijiensis infizierten Bananenblättern unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls isoliert. PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei die in Beispiel 8 aufgeführten Primer-Kombinationen aus M. fijiensis gegen DNA aus den Bananenblättern getestet wurden.
Der M. fijiensis-spezifische Primer JB549 (SEQ ID NO: 29) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410) amplifizierten ein 489 bp-Fragment aus gereinigter M. fijiensis-DNA und auch aus mit M. fijiensis infiziertem Bananenblattgewebe. Der Primer-Satz amplifizierte kein diagnostisches Fragment aus gesundem Bananenblattgewebe. Die M. fijiensis-spezifischen Primer-Kombina tionen JB443 (SEQ ID NO: 26)/ITS4 (SEQ ID NO: 41) (JB415) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410)/JB444 (SEQ ID NO: 30) amplifizierten ein 418 bp-Fragment bzw. ein 482 bp-Fragment aus der gleichen genomischen DNA und Bananenblattgewebe wie die Primer-Kombination aus JB549 (SEQ ID NO: 29) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410).
Beispiel 10: Bestimmung der Kreuzreaktivität von artenspezifischen Primern mit anderen Arten und Isolaten
Gereinigte pilzliche genomische DNAs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten und durch PCR wie in Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung der artenspezifischen Primer getestet. Andere pilzliche DNA-Arten und Isolate wurden auf die Fähigkeit der artenspezifischen Primer zur Kreuzreaktion mit ihnen getestet.
Der S. tritica-spezifische Primer JB446 (SEQ ID NO: 12) und ITS1 (SEQ ID NO: 38) (JB410) amplifizierten ein 345 bp-Fragment aus allen der in Beispiel 1 aufgeführten S. tritici-Isolate. Es gab keine Kreuzreaktivität mit gereinigter genomischer DNA von S. nodorum, S. glycines oder S. passerini. Keine dieser anderen pilzlichen Arten erzeugte ein Amplifikationsprodukt mit den S. tritici-spezifischen Primern.
Ein 448 bp-Fragment wurde aus all den in Beispiel 1 aufgeführten S. nodorum-Isolaten unter Verwendung der S. nodorum-spezifischen Primer JB433 (SEQ ID NO: 7) und JB434 (SEQ ID NO: 8) amplifiziert. In ähnlicher Weise amplifizierten die S. nodorum-spezifischen Primer JB527 (SEQ ID NO: 10) und JB525 (SEQ ID NO: 9) ein 458 bp-Fragment aus all den in Beispiel 1 aufgeführten S. nodorum-Isolaten. S. tritici, S. glycines und S. passerini erzeugten keine Amplifikationsprodukte bei Untersuchung mit einem beliebigen aus den S. nodorum-spezifischen Primer-Sätzen JB433 (SEQ ID NO: 7) und JB434 (SEQ ID NO: 8) oder JB527 (SEQ ID NO: 10) und JB525 (SEQ ID NO: 9).
PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen, der in Beispiel 8 aufgeführten P. herpotrichoides-spezifischen Primer-Kombinationen gegen die anderen pilzlichen DNA-Arten und der in Beispiel 1 aufgeführten Isolate durchgeführt.
Die Primer-Kombination JB537 (SEQ ID NO: 15) und JB541 (SEQ ID NO: 19) erzeugte ein 415 bp-Fragment nur aus den P. herpotrichoides-Isolaten vom W-Typ bei Untersuchung gegen die P. herpotrichoides-Isolate und die folgenden Getreidepathogene: P. aestiva, C. cereale, P. sorokiniana, S. tritici und S. nodorum. Die Primer-Kombination JB539 (SEQ ID NO: 17) und JB544 (SEQ ID NO: 22) amplifizierte ein 487 bp-Fragment aus dem P. herpotrichoides- Isolat vom R-Typ nur bei Untersuchung gegen die gleichen DNAs. Die Primer-Kombination JB540 (SEQ ID NO: 18) und JB542 (SEQ ID NO: 20) erzeugte ein 413 bp-Fragment aus dem P. herpotrichoides-Isolat vom R-Typ nur bei Untersuchung gegen die gleichen DNAs.
Beispiel 11: Quellen für mit Pseudocercosporella herpotrichoides infizierten Weizen
Mit Halmbruchkrankheit infizierte Weizenstengel wurden aus dem Fungiziddurchmusterungsprogramm der Stufe 1c von Ciba (Basel) erhalten. Acht Tage alte Weizenpflanzen wurden mit P. herpotrichoides durch Sprühen einer Konidiensuspension (5 × 10⁵ Konidien/ml) in 0,2 % Tween 20 auf die Basis der Weizenstengel infiziert. Nach der Beimpfung wurden die Pflanzen mit Kunststoff abgedeckt und für einen Tag bei 20°C und 95–100 % relativer Feuchtigkeit inkubiert. Die Pflanzen wurden in eine Wachstumskammer überführt, wo sie für vier Wochen bei 12°C und 60 % relativer Feuchtigkeit inkubiert wurden. Nach dieser Inkubation wurden die Pflanzen in ein Gewächshaus überführt und bei 18°C und 60 % relativer Feuchtigkeit inkubiert. Von Weizenpflanzen, die mit dem P. herpotrichoides-Stamm 311 vom W-Typ infiziert waren, wurden Proben 8–9 Wochen nach der Infektion entnommen, während die mit dem Pathogen vom Stamm 308 vom R-Typ infizierten 9–10 Wochen nach der Infektion geerntet wurden.
Beispiel 12: DNA-Extraktion aus Weizenstengeln für den P. herpotrichoides-Test
DNA wurden aus Weizenstengeln unter Verwendung des von Klimyuk et al. beschriebenen Protokolls (The Plant Journal 3(3):493–494) mit einigen Modifikationen extrahiert. Ein 2 cm-Weizenstengel, 0,5 cm oberhalb des Basishalms abgeschnitten, wurde in 160 μl 0,25 M NaOH gegeben und mit einem Kontes-Pistill bis zum vollständigen Aufschluß gemahlen. Die Probe wurde für 30 s gekocht. 160 μl 0,25 M HCl und 80 μl 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0/0,25 % V/V Nonidet P-40 wurden zur Probe hinzugegeben. Die Probe wurde für weitere 2 min gekocht und dann in ein Eiswasserbad gegeben. 1 μl Extrakt wurde im PCR-Test verwendet.
Beispiel 13: Aufnahme diagnostischer Tests in ein quantitatives kolorimetrisches Testformat
Der kolorimetrische Test wurde gemäß Nikiforov et al. (PCR Methods and Applications 3:285–291) mit den folgenden Veränderungen durchgeführt:

1) 30 μl des PCR-Produkts vom R-Typ und 3 M NaCl/20 mM EDTA-Mischung wurden zur Capture-Primer-Vertiefung gegeben. 50 μl des PCR-Produkts vom W-Typ und 3 M NaCl/20 mM EDTA-Mischung wurden in der Hybridisierungsreaktion verwendet.
2) Die Exonukleasebehandlung und Hybridisierungsreaktion wurden bei 37°C inkubiert.
3) Eine 1:1000-Verdünnung eines monoklonalen Anti-Biotin-Meerettich-Peroxidase-(HRP)-Antikörpers wurde verwendet.
4) Nach einer 2-minütigen Inkubation mit dem O-Phenylendiamindihydrochlorid-(OPD)-Substrat wurden 50 μl 3 N HCl in jede Testvertiefung gegeben. Platten mit 96 Vertiefungen wurden unter Verwendung eines herkömmlichen ELISA-Plattenlesegeräts bei 492 nm ausgelesen, mit einer Referenz bei 570 nm.

Die in Tabelle 5 aufgeführten Primer wurden wie in Beispiel 5 beschrieben zur Untersuchung als Capture-Primer für den kolorimetrischen Test synthetisiert.
Tabelle 5: Capture-Primer-Konstruktion für den kolorimetrischen Test
Die diagnostischen Primer aus S. nodorum JB527 (SEQ ID NO: 10) und JB525 (SEQ ID NO: 9) wurden in das quantitative kolorimetrische Testformat integriert. Der Primar JB527 (SEQ ID NO: 10) wurde von Midland Certified Reagent Company (Midland, Texas) synthetisiert, so dass er einen Biotin marker enthielt und das 5'-Ende vier internukleotidische Thiophosphatbindungen enthielt. PCR-Amplifikation wie in Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung der modifizierten Primer JB527 (SEQ ID NO: 10) und JB525 (SEQ ID NO: 9) aus gesundem, mit S. nodorum niedrig-, mittel- und hochinfiziertem Weizen erzeugte keine, geringe, mittlere bzw. hohe A₄₉₂-Werte bei kolorimetrischer Untersuchung unter Verwendung des ITS2-Primers (SEQ ID NO: 39) als PCR-Produkt-Capture-Primer.
Die für P. herpotrichoides vom R-Typ spezifischen 5'-Primer JB539 (SEQ ID NO: 17) und JB540 (SEQ ID NO: 18) und der für P. herpotrichoides vom W-Typ spezifische 5'-Primer JB537 (SEQ ID NO: 15) wurden auch modifiziert, so dass sie eine Biotinmarkierung und vier internukleotidische Thiophosphatbindungen enthielten. Eine kolorimetrische Version des PCR-Tests für P. herpotrichoides vom R-Typ wurde unter Verwendung des modifizierten Primers JB540 (SEQ ID NO: 18), des Primers JB542 (SEQ ID NO: 20) und des Capture-Primers JB539'15 entwickelt. Die aus der Amplifikation von infiziertem Weizen vom R-Typ und aus genomischer DNA vom R-Typ unter Verwendung des modifizierten Primers JB540 (SEQ ID NO: 18) und des Primers JB542 (SEQ ID NO: 20) erzeugten Produkte lieferten positive kolorimetrische Werte bei kolorimetrischer Untersuchung. Positive kolorimetrische Werte wurden auch durch kolorimetrische Analyse der PCR-Produkte aus der Amplifikation unter Verwendung des modifizierten Primers JB537 (SEQ ID NO: 15) und des W-Typ-spezifischen Primers JB541 (SEQ ID NO: 19) mit infiziertem Weizen vom W-Typ und genomischer DNA vom W-Typ erhalten, wenn JB538'15 als Capture-Primer verwendet wurde. Außerdem entsprach die Intensität des kolorimetrischen Signals der Fragmentintensität des PCR-Produkts, wie es an einem Agarosegel visualisiert wurde.
Zuvor waren die unterschiedlichen Septoria-Arten durch Untersuchung unter dem Mikroskop identifizierbar, und die Identifizierung der unterschiedlichen Pseudocercosporella-Stämme war nur durch pathologische Untersuchungen möglich. In ähnlicher Weise war die eindeutige Identifizierung von Mycosphaerella musicola und Mycosphaerella fijiensis schwierig, und selbst die Isolierung von reifen Perithezien erlaubt nicht immer eine genaue Identifizierung (Pons, 1990; Sigatoka Leaf Spot Diseases of Banana, Hrsg. RA Fullerton und RH Stoyer, International Network for the Improvement of Banana and Plantain, Frankreich). Derzeitige immundiagnostische Kits, die die ELISA-Technologie verwenden, werden routinemäßig zur Identifizierung von Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides und anderen Pathogenen verwendet, aber dieser Technologie fehlt die Genauigkeit, die Nachweisgrenze und die Fähigkeit zur Unterscheidung unterschiedlicher Isolate der vorliegenden Erfindung. Als Ergebnis bietet die Entwicklung eines DNA-Tests für die rasche Identifizierung unterschiedlicher Stämme dieser Pilze reale Vorteile nicht nur für Pilztaxonomen, sondern auch für die Krankheitsbekämpfung und selektive Fungizidverwendung auf dem Feld.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf ihre spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es einsichtig sein, daß zahlreiche Variationen, Modifikationen und weitere Ausführungsformen möglich sind, und entsprechend müssen alle solche Variationen, Modifikationen und Ausführungsformen als im Umfang der vorliegenden Erfindung befindlich betrachtet werden.
Hinterlegungen

Die folgenden Hinterlegungen wurden am 28. März 1994 bei dem Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, vorgenommen:

1. HB101 DH5d (pCRW2-1; SEQ ID NO: 3)	Eingangsnummer NRRL B-21231
2. HB101 DH5d (pCRW5-1; SEQ ID NO: 47)	Eingangsnummer NRRL B-21232
3. E. coli DH5d (pCRSTRIT1; SEQ ID NO: 1)	Eingangsnummer NRRL B-21233
4. E. coli DH5d (pCRR1-21; SEQ ID NO: 4)	Eingangsnummer NRRL B-21234
5. E. coli DH5d (pCRSNOD31; SEQ ID NO: 2)	Eingangsnummer NRRL B-21235

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül mit der Sequenz von SEQ ID NO:4, worin das isolierte DNA-Molekül eine intern transkribierte Spacer-Sequenz umfasst.
Paar von Oligonukleotidprimern zur Verwendung in der Detektion auf Amplifikationsbasis von Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R, ausgewählt aus den folgenden Primer-Paaren: SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:18 und SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:18 und SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:18 und SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:20; und SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:22.
Verfahren zur Detektion des pilzlichen Pathogens Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Isolieren von DNA aus einem mit einem Pathogen infizierten Pflanzenblatt; (b) Amplifizieren eines Teils der intern transkribierten Spacer-Region des Pathogens unter Verwendung der DNA als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion mit einem Paar von Primern gemäß Anspruch 2; und (c) Visualisieren des amplifizierten Teils der intern transkribierten Spacer-Region.
Kit, das einen Träger umfasst, der kompartimentiert ist, um darin in enger Abgrenzung ein oder mehrere Behältermittel aufzunehmen, worin eines der Behältermittel ein Paar von Primern gemäß Anspruch 2 enthält.
Quantitativer kolorimetrischer Test zur Detektion des pilzlichen Pathogens Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R, umfassend die folgenden Schritte: (a) Isolieren von DNA aus einem mit dem pilzlichen Pathogen infizierten Pflanzenblatt; (b) PCR-Amplifizieren eines Teils der intern transkribierten Spacer-Sequenz des pilzlichen Pathogens unter Verwendung eines Paars von Primern gemäß Anspruch 2 als diagnostische Primer; (c) Visualisieren des amplifizierten Teils der intern transkribierten Spacer-Sequenz unter Verwendung eines Capture-Primers, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NOs: 67, 69, 71, 72, 73, 75, 76, 79 und 81 besteht; und (d) Korrelieren der Intensität des in Schritt (c) erhaltenen, visuellen kolorimetrischen Signals mit der Menge an amplifizierter intern transkribierter Spacer-Sequenz und somit Quantifizieren der vorhandenen Menge von Pseudocercosporella herpotrichoides Stamm R.
Test gemäß Anspruch 5, worin die diagnostischen Primer SEQ ID NOs: 18 und 20 sind und worin der Capture-Primer SEQ ID NO:71 ist.