PL181776B1 - Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych - Google Patents

Abstract

1. Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, znamienny tym, że mieszaninę racemiczną aminokwasu poddaje się estryfikacji a otrzymany ester aminokwasu poddaje się reakcji ze związkami organicznymi zawierającymi grupę blokującą azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupę tertbu- tyloksykarbonylową, 9-fluorenykmietokss'Tarbonylowąlub benzyloksykarbonylową, następnie prowadzi się selektywną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego z mieszaniny racemicznej estru przy użyciu enzymu, w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego przy pH 4-10, w temperaturze 10-50°C, rozdziela się powstałą mieszaninę L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego zaś ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w środowisku kwaśnym lub zasadowym.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, zwłaszcza pochodnych aminokwasów aromatycznych przez hydrolizę enzymatyczną ich estrów. Enancjomery te stosuje się do syntezy peptydów.

Optycznie czyste pochodne aminokwasów aromatycznych są poszukiwanym surowcem farmaceutycznym wykorzystywanym bądź jako leki (3,4-dihydroksyfenyloalanina, 3-hydroksyfenyloalanina), bądź do syntez aktywnych biologicznie analogów peptydowych. Okazuje się, że wprowadzanie takich nienaturalnych pochodnych aminokwasowych do struktury peptydu może powodować podwyższenie jego aktywności biologicznej i/lub wydłużać czas działania i/lub umożliwiać podanie doustne leku poprzez zmniejszenie podatności na enzymatyczną hydrolizę.

181 776

Ogromny postęp w badaniach podstawowych i aplikacyjnych peptydów spowodował wzrost zapotrzebowania na enancjomery pochodnych aminokwasowych, które mogą być zastosowane w syntezie peptydów. W chwili obecnej najczęściej stosowanymi pochodnymi w syntezie peptydów są pochodne aminokwasów z chronioną grupą aminową przy pomocy grup tertbutyloksykarbonylowej (Boc), 9-fluorenylometoksykarbonylowej (Fmoc) lub benzyloksykarbonylowej (Cbz).

Większość nienaturalnych aminokwasów można otrzymywać tanimi i dogodnymi metodami w postaci mieszanin racemicznych. Czyste enancjomery otrzymywać można przez rozdział takich mieszanin. Jedną z metod rozdziału racematów jest zastosowanie enzymów, które dzięki stereospecyficzności przekształcają tylko jeden z izomerów obecnych w mieszaninie umożliwiając jej rozdział. Dotychczas znane z polskich opisów patentowych nr 104 294 i 122 795, z niemieckiego opisu patentowego nr 2215853 oraz z europejskiego opisu patentowego nr 0171862 enzymatyczne metody rozdziału mieszanin racemicznych polegały na selektywnej hydrolizie estrów aminokwasów z wolną grupą aminową lub selektywnej deacylacji acyloaminokwasów. W wyniku tego procesu otrzymywano L-aminokwas oraz ester lub pochodną acylową D-aminokwasu. Zastosowanie takich enancjomerów do syntezy peptydów wymaga przeprowadzenia szeregu następnych pracochłonnych i kosztownych reakcji prowadzących do blokowania grupy α-aminowej.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymywanie przy użyciu enzymów, enancjomerów pochodnych aminokwasowych z zablokowaną grupą aminową.

Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych z zabezpieczoną grupą α-aminową według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje:

1) syntezę estrów racemicznych aminokwasów,

2) wprowadzenie grupy blokującej azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupy Fmoc, Boc lub Cbz,

3) enzymatyczną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego, której końcowym produktem jest łatwa do rozdzielenia znanymi metodami mieszanina L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego,

4) hydrolizę w obecności roztworu kwasu lub zasady estrów D-aminokwasów N-chronionych.

Syntezę estrów racemicznych pochodnych aminokwasów przeprowadza się znanymi metodami, korzystnie przy użyciu alkoholi alifatycznych zawierających od 1 do 6 atomów węgla w cząsteczce, korzystnie od 1 do 2 atomów węgla. Grupę blokującą azotu wprowadza się znanymi metodami stosując związki organiczne zawierające grupy blokujące azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie zawierające grupy Fmoc, Boc lub Cbz, najkorzystniej pirowęglan ditertbutylu, chlorek 9-fluorenylometoksykarbonylu lub chlorek benzyloksykarbonylu. Hydrolizę enzymatyczną odpowiednich estrów prowadzi się w środowisku będącym mieszaniną wody i rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą takich jak np. dimetyloformamid i acetonitryl lub nie mieszających się z wodą takich jak np. octan etylu i dichlorometan. Zawartość wody w mieszaninie wynosi od 5 do 95%. pH mieszaniny reakcyjnej utrzymuje się w zakresie od 4 do 10, korzystnie od 7 do 10, przy pomocy roztworów buforowych lub roztworów wodorotlenków metali lub roztworów kwasów. Hydrolizę enzymatyczną prowadzi się w temperaturze od 10 do 50°C przy użyciu enzymów, korzystnie enzymów proteolitycznych pochodzenia zwierzęcego, korzystnie chymotrypsyny lub pankreatyny lub enzymów proteolitycznych wytwarzanych przez mikroorganizmy korzystnie proteazy Pronase E (Streptomyces griseus).Enzym rozpuszcza się w mieszaninie reakcyjnej lub stosuje się enzym immobilizowany na nośniku o rozwiniętej powierzchni. Po enzymatycznej hydrolizie mieszaniny racemicznej aminokwasów z chronioną grupą α-aminową wydziela się znanymi metodami, np. ekstrakcyjnie nie zhydrolizowany enzymatycznie ester D-aminokwasu N-chronionego, a następnie wydziela się pozostały w mieszaninie reakcyjnej L-aminokwas N-chroniony. Ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w obecności

181 776 roztworów wodorotlenków np. wodorotlenku sodowego lub kwasów np. kwasu solnego w celu otrzymania D-aminokwasu N-chronionego.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymywanie optycznie czystych aminokwasów, w których azot α-aminowy jest chroniony grupami blokującym Fmoc, Boc lub Cbz, mających zastosowanie do syntez peptydów bez dalszych operacji blokowania. Zmniejsza to niebezpieczeństwo racemizacji produktu i zapewnia dostępność czystych enancjomerów aminokwasów niebiałkowych z chronioną grupąα-aminową do syntezy analogów peptydowych.

Sposobem według wynalazku można otrzymywać zwłaszcza enancjomery L i D aminokwasów aromatycznych N-chronionych, a zwłaszcza pochodnych fenyloalaniny modyfikowanych przez podstawienie pierścienia aromatycznego grupami hydroksylowymi, metoksylowymi, metylowymi, aminowymi, nitrowymi, cyjanowymi, halogenowymi jak np. chloro-, bromo-, fluoro-, jodo-, jak też α-metylowych pochodnych aminokwasów aromatycznych oraz ich analogów takich jak np. kwas 3- fenylomlekowy, 3-hydroksyfenylomlekowy itp.

Przykład 1. Przeprowadzono estryfikację D,L-meta-tyrozyny metanolem pod wpływem chlorku tionylu. Otrzymany chlorowodorek estru metylowego D,L-meta-tyrozyny rozpuszczano w octanie etylu, dodawano trietyloaminę, mieszaninę schładzano na łaźni z lodem i wkraplano pirowęglan ditertbutylu [(Boc)₂O] w celu zablokowania grupy α-aminowej, po czym pozostawiono na 10 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukiwano mieszaninę reakcyjną wodą, warstwę organiczną osuszano nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowywano rozpuszczalnik. Powstały produkt rekrystalizowano z n-heksanu. Otrzymany ester metylowy tertbutyloksykarbonylo-D,L-meta-tyrozyny (10 mmoli, 2,95 g) rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (20% acetonitrylu) o pH 8,2, dodawano α-chymotrypsynę (2 mg). Reakcję prowadzono w temperaturze 30°C przez 1 godz. utrzymując pH na poziomie 8,2 przy pomocy 0,1 N NaOH. Następnie ekstrahowano ester metylowy tertbutyloksykarbonylo-D-meta-tyrozyny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego uzyskując czystą tertbutyloksykarbonylo-D-meta-tyrozynę z 94% wydajnością (czystość 98,6%).

Pozostałość po reakcji zawierającą tertbutyloksykarbonylo-L-meta-tyrozynę zakwaszano przy użyciu 10% roztworu kwasu solnego i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Do pozostałości dodawano n-heksan i pozostawiano na 12 godzin w temperaturze 4°C. Wytrącony osad odsączano, przemywano n-heksanem, w wyniku czego otrzymywano tertbutyloksykarbonylo-L-meta-tyrozynę z wydajnością 96% (czystość 99,2%).

Przykład 2. D,L-para-chlorofenyloalaninę przeprowadzono w ester metylowy analogicznie jak w przykładzie 1, następnie blokowano grupę α-aminową w reakcji z chlorkiem 9-fluorenylometoksykarbonylowym (Fmoc-Cl) w następujący sposób: chlorowodorek estru aminokwasu otrzymany po reakcji estryfikacji rozpuszczano w octanie etylu, dodawano 10% roztwór wodorowęglanu sodowego do uzyskania pH ok. 9, a następnie wkraplano roztwór Fmoc-Cl w octanie etylu. Reakcję prowadzono aż do całkowitego podstawienia grupy α-aminowej (brak niebieskiego zabarwienia w próbie ninhydrynowej). Następnie przepłukiwano mieszaninę reakcyjną roztworem HCl i wodą, warstwę organiczną osuszano nad bezwodnym siarczanem solu i odparowywano rozpuszczalnik. Powstały produkt rekrystalizowano z n-heksanu. Następnie 10 mmoli produktu rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (30% acetonitrylu) o pH 8,5, dodawano a-chymotrypsynę zawieszoną na żelu krzemionkowym (2 g) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godz. utrzymując pH na poziomie 8,5 przy pomocy 0,1 N NaOH. Po 1,5 godz. reakcji odsączono enzym zawieszony na żelu, a z mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano ester metylowy fluorenylometoksykarbonylo-D-para-chlorofenyloalaniny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem kwasu solnego uzyskując czystą fluorenylometoksykarbonylo-D-para-chlorofenyloalaninę z 96% wydajnością (czystość 96,9%).

181 776

Pozostałość po reakcji zawierającą fłuorenyłometoksykarbonylo-L-para chlorofenyloalaninę zakwaszano, i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Do pozostałości dodawano n-heksan i pozostawiano na noc w lodówce. Wytrącony osad odsączano, przemywano n-heksanem, w wyniku czego otrzymywano fluorenylometoksykarbonylo-L-parachlorofenyloalaninę z wydajnością 97% (czystość 99%).

Przykład 3. D,L-orto-metylofenyloalaninę przeprowadzono w ester etylowy i zabezpieczono grupę α-aminową analogicznie jak w przykładzie 1, z tym, że do estryfikacji stosowano zamiast metanolu bezwodny alkohol etylowy. 5 mmoli otrzymanego estru etylowego tertbutyloksykarbonylo-D,L-orto-metylofenyloalaniny rozpuszczono w 15 ml octanu etylu i mieszano z 15 ml roztworu 5 mg proteazy Pronase E (Streptomyces griseus) w buforze fosforanowym o pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Po 20 godz. reakcji rozdzielano warstwę organiczną i wodną. Z warstwy organicznej odparowywano rozpuszczalnik, a otrzymany ester pochodnej D-aminokwasu hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego, uzyskując terbutyloksykarbonylo-D-orto-metylofenyloalaninę z wydajnością 92% (czystość 98%). Warstwę wodną po reakcji zakwaszano i ekstrahowano octanem etylu. Po odparowaniu rozpuszczalnika i rekrystalizacji otrzymywano tertbutyloksykarbonylo-L-orto-metylofenyloalaninę z 95% wydajnością (czystość 99%).

Przykład 4. D,L-meta-fluorotyrozynę przeprowadzono w ester metylowy analogicznie jak w przykładzie 1, następnie zabezpieczono grupę α-aminową analogicznie jak w przykładzie 1, z tym, że zamiast pirowęglanu tertbutyloksykarbonylu stosowano chlorek benzyloksykarbonylu. 5 mmoli otrzymanego estru etylowego benzyloksykarbonylo-D,L-meta fluorotyrozyny rozpuszczono w 15 ml octanu etylu i mieszano z 15 ml rotworu 15 mg pankreatyny w buforze fosforanowym o pH 8,9 w temperaturze pokojowej. Po 24 godz. reakcji rozdzielano warstwę organiczną, i wodną. Z warstwy organicznej odparowywano rozpuszczalnik, a otrzymany ester pochodnej D-aminokwasu hydrolizowano roztworem wodorotlenku sodowego, uzyskując benzyloksykarbonylo-D-meta-fluorotyrozynę z wydajnością 94% (czystość 98%). Warstwę wodną po reakcji zakwaszano i ekstrahowano octanem etylu. Po odparowaniu rozpuszczalnika i rekrystalizacji otrzymywano benzyloksykarbonyło-L-meta-fluorotyrozynę z 93% wydajnością (czystość 99%).

Przykład 5. D,L-leucynę przeprowadzano w ester metylowy i wprowadzano grupę blokującą analogicznie ja w przykładzie 2. Następnie 10 mmoli produktu rozpuszczano w 30 ml mieszaniny wody z acetonitrylem (40% acetonitrylu) o pH 8,5, dodawano α-chymotrypsynę zawieszoną na żelu krzemieniowym (5 g) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 godz. utrzymując pH na poziomie 8,8 przy pomocy 0,1 N NaOH. Po 1,5 godz. reakcji odsączano enzym zawieszony na żelu, a z mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano ester metylowy fluorenylometoksykarbonylo-D-leucyny octanem etylu. Otrzymany ester hydrolizowano roztworem kwasu solnego uzyskując czystą fluorenylometoksykarbonylo-D-leucynę z 93% wydajnością (czystość 98,5%). Pozostałość po reakcji zawierającą fluorenylometoksykarbonylo-L-leucynę zakwaszano, i ponownie ekstrahowano octanem etylu. Uzyskany ekstrakt przemywano wodą i odparowywano. Po rekrystalizacji otrzymywano fluorenylometoksykarbonylo-L-leucynę z wydajnością 90% (czystość 99%).

181 776

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób enzymatycznego otrzymywania enancjomerów pochodnych aminokwasowych, znamienny tym, że mieszaninę racemiczną aminokwasu poddaje się estryfikacji a otrzymany ester aminokwasu poddaje się reakcji ze związkami organicznymi zawierającymi grupę blokującą azot α-aminowy estru aminokwasu, korzystnie grupę tertbutyloksykarbonylową, 9-fluorenylometoksykarbonylową lub benzyloksykarbonylową, następnie prowadzi się selektywną hydrolizę estru L-aminokwasu N-chronionego z mieszaniny racemicznej estru przy użyciu enzymu, w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego przy pH 4-10, w temperaturze 10-50°C, rozdziela się powstałą mieszaninę L-aminokwasu N-chronionego oraz estru D-aminokwasu N-chronionego zaś ester D-aminokwasu N-chronionego poddaje się hydrolizie w środowisku kwaśnym lub zasadowym.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do estryfikacji mieszaniny racemicznej aminokwasu stosuje się alkohole alifatyczne zawierające do 6 atomów węgla, zwłaszcza alkohol metylowy i etylowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z pirowęglanem ditertbutylu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z chlorkiem 9-fluorenylometoksykarbonylu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ester aminokwasu poddaje się reakcji z chlorkiem benzyloksykarbonylu.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako enzym stosuje się proteazy zwierzęce, korzystnie α-chymotrypsynę lub pankreatynę.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako enzym stosuje się proteazy pochodzenia mikrobiologicznego, korzystnie proteazę Pronase E (Streptomyces griseus).
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się enzym rozpuszczony w mieszaninie reakcyjnej.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się enzym immobilizowany na nośniku o rozwiniętej powierzchni.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się acetonitryl, dimetyloformamid, chlorek metylenu, octan etylu.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH środowiska reakcji utrzymuje się w zakresie 7-10.