PL176930B1

PL176930B1 - Sposób usuwania dwupeptydów z końca aminowego prekursorowych polipeptydów

Info

Publication number: PL176930B1
Application number: PL93300537A
Authority: PL
Inventors: Paul R. Atkinson; Matthew D. Hilton; Peter K. Lambooy
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1992-10-01
Filing date: 1993-09-29
Publication date: 1999-08-31
Also published as: MX9306021A; DE69331371D1; HUT70299A; ES2169036T3; AU4871993A; EP0595476A2; PL300537A1; FI934305A7; NO933503D0; HU9302773D0; DE69331371T2; EP0595476A3; BR9303949A; EP1094118A1; JPH06197759A; CA2107279A1; HU219771B; FI934305L; UA27718C2; IL107123A0

Abstract

1 . Sposób usuwania dwupeptydów z konca aminowego prekursorowych polipeptydów, znamienny tym, ze kontaktuje sie prekursorowy polieptyd z enzymem dDAP w warunkach pozwalajacych na ujawnienie sie aktywnosci dDAP w kierunku sekwencyjnego usuwania dwupeptydów z konca aminowego polipeptydu prekursorowego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania dipeptydów z końca aminowego prekursorowych polipeptydów z użyciem wyodrębnionego enzymu dDAP z Dictyostelium discoideum.

Dictyostelium discoideum jest prymitywnym mikroorganizmem eukariotycznym, potocznie zwanym pleśnią śluzową, lub dokładniej, komórkową pleśnią śluzową. Nazwa ta pochodzi od tego, że jako makroskopowy widok perspektywiczny przedstawia dwa skrajne stany. Podczas aktywnego wzrostu, D. discoidem rośnie jak jednokomórkowa ameba. W tym stadium nie posiada on ścian komórkowych, stąd jego wygląd cienkiej błony (lub śluzu). W okresie głodu, na stałym podłożu, niezależne komórki zlepiają się tworząc kolonie. Taka kolonia wykazuje cechy organizmu wielokomórkowego, gdyż migruje w postaci zwanej ślimakiem a następnie ulega różnicowaniu, w którym tylne komórki formują się w stopkę, przednie komórki tworzą łodyżkę a ze środkowych komórek tworzy się ciało owocujące. Mikroorganizm ten występuje w stanie naturalnym na powierzchni gleby i gnoju. Dziki typ tej ameby odżywia się wyłącznie przez pochłanianie (fagozytozę) całych bakterii. Z tego powodu są one czasem nazywane mięsożernymi. Wyhodowano akseniczne mutanty D.discoideum wykazujące zdolność wzrostu bez ko-hodowli bakterii pokarmowych, pozwalające na ich hodowlę na podłożach rozpuszczalnych.

Dipeptydyloaminopeptydazy (DAP) są enzymami hydrolizującymi przedostatnie wiązanie peptydowe na końcu aminowym, uwalniającymi dwupeptydy z niezablokowanych końców aminowych peptydów i białek. Obecnie znane są cztery klasy dipeptydyloaminopeptydaz (oznaczone symbolami DAP-I, DAP-II, DAP-III i DAP-IV), które rozróżnia się na podstawie ich własności fizycznych i szybkości z jaką katalizują rozszczepianie różnych N-końcowych sekwencji peptydowych. DAP-I jest enzymem o stosunkowo małej specyficzności, katalizującym uwalnianie wielu kombinacji dipeptydowych z niezablokowanych końców aminowych peptydów i białek. Wykazuje niewielką aktywność lub nie wykazuje żadnej aktywności w przypadkach, gdy uwalnianym dwupeptydem jest X-Pro, Arg-X lub Lys-X (gdzie X oznacza

176 930 dowolny aminokwas). DAP-II wykazuje preferencję do tych N-końcowych sekwencji dipeptydowych, które zaczynają się aminokwasem Arg-X lub Lys-X a jest mniej aktywny w stosunku do X-Pro. Enzym ten charakteryzuje się znacznie niższymi szybkościami rozszczepiania w stosunku do innych kombinacji dwupeptydowych. DAP-III wykazuje powinowactwo w stosunku do dwupeptydowych sekwencji N-terminalnych Arg-Arg i Lys-Lys. DAP-IV odznacza się najwyższym stopniem aktywności hydrolitycznej w stosunku do dwupeptydowych sekwencji X-Pro. Enzymy DAP, zwłaszcza DAP-I i DAP-IV okazały się użyteczne w procesach przetwarzania białek. Niniejszy wynalazek dotyczy nowego enzymu DAP z D.discoideum, użytecznego w przetwarzaniu białek rekombinantowych z wydłużeniem aminokwasowym na końcach aminowych o parzystą liczbę reszt aminokwasowych.

W sposobie według wynalazku wykorzystuje się nową, dipeptydyloaminopeptydazę wyizolowaną z komórkowej pleśni śluzowej, Dictyostelium discoideum. Ten nowy enzym DAP, dDAP, wykazuje aktywność nieco podobną do aktywności DAP-I i DAP-III, jednak bardzo różni się od tych enzymów pod względem własności fizycznych i charakterystyki enzymatycznej. Wynalazek obejmuje sposób stosowania enzymu dDAP do usuwania dwupeptydów z N-końca wytwarzanych techniką rekombinacji prekursorowych białek i peptydów. Enzym dDAP może być użyty do usuwania pojedynczych dwupeptydów z N-końca polipeptydów ale można go również zastosować do sekwencyjnego usuwania więcej niż jednego dwupeptydu z N-końca polipeptydów prekursorowych.

W niniejszym opisie oraz w zastrzeżeniach stosowane są następujące terminy i skróty: dDAP- dipeptydyloaminopeptydaza wyizolowana z Dictyostelium discoideum, o optymalnej aktywności przy wartości pH około 3.5 przy zastosowaniu GFpNA jako substratu, posiadająca pierwotną masę cząsteczkową wynoszącą około 225.000 daltonów według oznaczeń wykonanych techniką ultrawirowania analitycznego i masę cząsteczkową podjednostki wynoszącą około 66.000 daltonów według oznaczeń metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowm SDS.

GFpNA - Gly-Phe-p-nitroanilid.

Polipeptyd prekursorowy - poipeptyd wytworzony 'techniką rekombinacji, posiadający parzystą ilość reszt aminokwasowych rozciągających się od końca aminowego żądanego polipeptydu.

Przetworzony polipeptyd - polipeptyd, z którego został usunięty N-terminalny dwupeptyd (lub dwupeptydy), z wytworzeniem żądanego polipeptydu.

RRbNA - Arg-Arg-p-naftyloamid.

Wszystkie skróty aminokwasów użyte z niniejszym ujawnieniu są dopuszczone do stosowania przez Urząd patentowy i znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych, zgodnie z rejestrem federalnym: 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1990).

Enzymem stosowanym w sposobie według wynalazku jest dDAP, dipqgvdyk)aminopeptydaza wyizolowana z komórkowej pleśni śluzowej, Dictyostelium discoideum. Enzym ten odznacza się tym, że rozszczepia niezablokowane sekwencje N-końcowe. Jest to cecha tradycyjnie związana również z enzymami DAP-I i DAP-III, jednak dDAP bardzo różni się od tych enzymów pod względem własności fizycznych i innych właściwości enzymatycznych. Enzym ten wykazuje optymalną aktywność przy wartości pH około 3.5 w reakcji z GFpNA jako substratem i posiada natywną masę cząsteczkową wynoszącą około 225.000 daltonów i masę cząsteczkową podjednostki wynoszącą około 66.000 daltonów. Metodą chromatografii powinowactwa na lektynie wykazano, że enzym dDAP jest prawdopodobnie glikoproteiną. Enzym ten ma zdolność usuwania dwupeptydów z substratów syntetycznych, Gly-Phe-para-nitroanilidu (GFpNA) i Arg-Arg-|3-naftylaniidu (RRBNA) jak również z wielu innych syntetycznych i wytwarzanych techniką rekombinacji polipeptydów.

Znane enzymy DAP-I wyizolowano z wielu różnych zwierząt i tkanek zwierzęcych. Nowy enzym, dDAP, został wyodrębniony z ' brzeczki hodowlanej Dictyostelium discoideum. Do ujawnienia aktywności, enzymu DAP-I wymagają obecności halogenków i środków redukujących. Odczynniki takie jak jodooctan, modyfikujące cysteinowe grupy sulfhydrylowe, inaktywują enzymy DAP-I. Optymalna aktywność DAP-I występuje przy pH między 5 a 6. Enzym dDAP natomiast, wykazuje optymalna aktywność przy pH 3.5 w stosunku do Gly-Phe-pNa lub

176 930

Gly-Arg-pNa jako substratów i wykazuje znaczną aktywność wobec peptydów i białek przy pH 3.5. Enzym dDAP pozbawiony jest znaczącej aktywności przy pH powyżej 6. Nie wymaga on dodawania środków redukujących i wykazuje pełną aktywność w obecności modyfikatorów cysteiny, jodooctanu i czterotionianu. dDAP wykazuje podobieństwo do bydlęcego DAP-I pod tym względem, że nie rozszczepia peptydów z zablokowanymi N-końcami, jednak dDAP, w odróżnieniu od bydlęcego DAP-I jest aktywny w stosunku do substratów posiadających utlenioną metioninę na końcu aminowym. Bydlęcy DAP-I nie ma zdolności rozszczepiania substratów z utlenionymi resztami metioninowymi na końcach aminowych. Ponadto, w odróżnieniu od bydlęcego DAP-I, enzym dDAP z łatwością rozszczepia substrat Arg-Arg-p-naftylamidu.

Zdolność rozszczepiania substratu zawierającego dipeptydylowe końce aminowe Arg-Arg jest bardziej podobna do aktywności enzymów DAP-III pochodzących od ssaków i mikroorganizmów, jednak w piśmiennictwie podaje się, że enzym DAP-III wykazuje optymalną aktywność w alkalicznym zakresie· pH, podczas gdy dDAP najwydajniej funkcjonuje w kwaśnym zakresie pH. Masa cząsteczkowa podjednostki dDAP oznaczona metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS PAGE) wynosi około 66.000 daltonów, natomiast masa cząsteczkowa podjednostki DAP-I wyizolowanej ze ssaków wynosi około 22.000 daltonów.

Enzym dDAP jest najbardziej użyteczny do prowadzenia konwersji polipeptydów prekursorowych na polipeptydy przetworzone. Przykładowo, jeśli żądanym polipeptydem jest- ludzki hormon wzrostu, wystarczy jedynie doprowadzić do ekspresji prekursora tego ludzkiego hormonu wzrostu (w jednym przypadku jest to Met-Asp-ludzki hormon wzrostu) i następnie poddać go działaniu enzymu dDAP,· który odszczepi dwupeptyd Met-Asp, uwalniając żądany przetworzony polipeptyd, ludzki hopmon wzrostu. Taki przetwarzany peptyd nie musi być polipeptydem naturalnym typu dzikiego, co jest częstszym wymogiem przy otrzymywaniu analogów lub półproduktów. Sposób przetwarzania polipeptydów prekursorowych jest również przedmiotem wynalazku.

Do innych polipeptydów prekursorowych, które mogą być przetwarzane przez dDAP należą Met-Arg-hGH (ludzki hormon wzrostu), Met-Tyr-proinsulina, Met-Arg-proinsulma, analog (B28 Lys, B29 Pro) Met-Arg-Proinsuliny, analog (B28 Lys, B29 Pro) Met-Tyr-proinsuliny, analog (B10 Asp, des B28-30) Met-Arg-proinsuliny i analog (B10 Asp, des B28-30) Met-Tyr-proinsuliny. Analog insuliny (B28 Lys, B29 Pro) jest ujawniony w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego EP 90301224.3, a analog insuliny (B10 Asp, desB28-30) jest ujawniony w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego EP 92305678.2. Enzym dDAP może być również stosowany do sekwencyjnego usuwania więcej niż jednego zestawu dwupeptydów z końca aminowego polipeptydów prekursorowych. Przetwarzanie Met-Arg-proinsuliny i analogów Met-Arg-proinsuliny bydlęcą DAP-I jest ujawnione przez Becker’a i wsp. w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5.126.249 wydanym 30 czerwca 1992. Całe to ujawnienie jest włączone do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy.

Zastosowanie enzymu dDAP do usuwania dwupeptydów z białek prekursorowych jest korzystne z tego względu, że optymalna aktywność tego enzymu występuje w kwaśnym zakresie pH, przy którym wiele polipeptydów prekursorowych jest rozpuszczalnych. Ponadto, konwersje niektórych polipeptydów prekursorowych przy pH obojętnym lub wyższym mogą prowadzić do zwiększonego tworzenia się międzyłańcuchowych dimerów dwusiarczkowych lub polimerów substratu, z jednoczesną stratą na wydajności produktów. Zjawisko to, zwane zagęszczeniem dwusiarczkowym (disulfide scrambling) jest szczególnie uciążliwe przy użyciu bydlęcej DAP-I, gdyż DAP-I wymaga dodania do mieszaniny reakcyjnej środków redukujących, takich jak β-merkaptoetanol lub cysteina. Również utlenianie reszt metioninowych przebiega wolniej w kwaśnych zakresach pH. Użycie enzymu pochodzącego z hodowli, wytwarzanego metodą fermentacyjną, jest znacznie bardziej ekonomiczne niż wykorzystanie do produkcji na skalę przemysłową ze źródeł zwierzęcych, gdyż technologia fermentacyjna pozwala na większą stabilność produktu i odtwarzalność enzymu.

Wyeliminowanie enzymów pochodzenia zwierzęcego pozwala na korzystanie ze stałego źródła wysoko oczyszczonej substancji. W wyniku fermentacji D.discoideum Ax3 (ATCC 28368), następnego wirowania, chromatografii aniono-wymiennej, chromatografii i hydrofobo176 930 wej i chromatografii ekskluzyjnej uzyskuje się wysoko oczyszczony roztwór enzymu dDAP, który przechowuje się lub bezpośrednio stosuje do przetwarzania polipeptydów prekursorowych.

Konwersję polipeptydów prekursorowych do przetworzonych polipeptydów prowadzi się w szerokim zakresie temperatur, zakresów pH i czasu. Na ogół reakcję prowadzi się w środowisku wodnym, korzystnie buforowanym w celu doprowadzenia do i utrzymania zakresu pH od około 2.5 do około 5.5. Korzystnie, pH środowiska wynosi od około 3.0 do około 4.5 a najkorzystniej, od około 3.0 do około 3.5. Optimum pH może się nieco zmieniać w ·zależności od substratu. Przykładowo, szybkość przetwarzania-Gly-Phe-pNA i Gly-Arg-pNajest najwyższa przy wartości pH około 3.5, podczas gdy szybkość przetwarzania Met-Asp-hGH jest najwyższa w zakresie od pH około 3.0 do pH około 3.5. Przetwarzanie Arg-Arg-PNA przebiega najszybciej przy pH około 4.5. Specjalista z tej dziedziny wie, że na optymalne pH każdej określonej reakcji będą miały wpływ takie czynniki jak stabilność i rozpuszczalność danego polipeptydu prekursorowego i enzymu. W niektórych przypadkach można użyć środek ułatwiający rozpuszczanie, taki jak mocznik, dodecylosiarczan sodowy, guanidynę.

Reakcja przetwarzania może przebiegać w bardzo szerokim zakresie czasu, od kilku sekund do kilku dni. Korzystnie, reakcję tę prowadzi się w czasie od około minuty do około 24 godzin a najkorzystniej, od około godziny do około 8 godzin. Specjaliści przyznają, że czas reakcji można z łatwością tak dobrać, aby obejmował wszystkie parametry dla żądanego polipeptydu prekursorowego lub przetworzonego polipeptydu.

Temperaturę reakcji przetwarzania również ustala się stosownie do danego substratu. Korzystnie, reakcję prowadzi się w zakresie temperatur od około 15°C do około 45°C. Korzystniej, temperatura reakcji wynosi od około 20°C do około 37°C a najkorzystniej od około 25°C do około 37°C. I tym razem, specjalista z łatwością oceni, że parametry reakcji, takie jak czas, temperatura i pH mogą się zmieniać stosownie do wymagań danego prekursora lub przetworzonego polipeptydu.

W reakcji można stosować wiele różnych buforów. Jedynym wymaganiem jest to, aby utrzymywały żądany zakres pH. Przykłady typowych środków buforujących obejmują fosforan sodowy, octan sodowy, cytrynian sodowy, glicynę i substancje podobne. Korzystnymi środkami buforującymi są octan sodowy, fosforan sodowy i glicyna.

Polipeptydy prekursorowe stosowane w wynalazku na ogół wytwarza się z wykorzystaniem technologii rekombinacji DNA. W tej technologii, przygotowuje się sekwencję nukleotydową kodującą żądany polipeptyd prekursorowy, stosując do tej syntezy standardowe techniki. Na ogół polegają one na otrzymaniu oligonukleotydów zawierających zarówno fragmenty żądanej sekwencji kodującej jak i sekwencji komplementarnych. Oligonukleotydy te tak się projektuje aby fragment sekwencji kodującej częściowo nakładał się z dwoma fragmentami sekwencji komplementarnych i odwrotnie. Następnie oligonukleotydy te paruje się i łączy, wytwarzając żądaną sekwencję genu.

Sekwencję tę wprowadza się następnie do wektora klonującego, w miejscu, w którym możliwa jest ekspresja produktu, dla którego wprowadzany jest kod. Odpowiedni wektor klonujący zawiera co najmniej część sekwencji kontrolnych ekspresji.

Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami nie ograniczającymi jego zakresu.

Przykład I. Fermentacja Dictyostelium discoideum.

Liofilizowane hodowle Dictyostelium discoideum Ax3 uzyskano z muzeum szczepów, American Type Culture Collection W Rockville, Maryland, (numer akcyjny ATCC 28368), Posianoje w kilku gęstościach na płytki agarowe (1.2% Difco Bacto Agar), zawierające pożywkę wyciągu drożdżowego z peptonem o składzie (w g/litr): wyciąg drożdżowy Difco (7.15), Bacto-pepton Difco (14.3), Na2HPOą (0.51) i KH2PO4 (0.49). Do pożywki tej dodano aseptycznie, po oddzielnej sterylizacji, glukozę (10 g/litr końcowego roztworu) i doprowadzono do końcowego pH 6.5 (±0.1) za pomocą NaOH lub H2SO4. Tę samą pożywkę (bez agaru) stosowano do hodowli ciekłych w objętościach poniżej jednego litra. Płytki agarowe inkubowano przez 3 do 5 dni w temperaturze 21°C do 24°C. Z płytek zbierano ostrożnie worki zarodników, tak, aby uniknąć zebrania bakterii pokarmowych (food bacterium) liofilizowanych wraz z hodowlą Ax3 i zaszczepiano je w 3 ml buforowanej pożywki z wyciągiem drożdżowym i peptonem i

176 930 inkubowano przy łagodnym wstrząsaniu w temperaturze 21 -24°C. Następnie namnażano komórki D.discoideum przez seryjne przenoszenie do coraz większych objętości buforowanej pożywki z wyciągiem drożdżowym i peptonem. Każdy etap przeniesienia wykonywano w momencie, gdy gęstość komórek osiągnęła około 2 x 10⁶/mł. W każdym etapie następowało 10-25-krotne rozcieńczenie. Brzeczki zawsze inkubowano· w temperaturze 21 -24°C z łagodnym wstrząsaniem.

Fermentacje z mieszaniem prowadzono na podobnych pożywkach z peptonem sojowym (takim jak pepton Phytone lub Marcor Soy Peptone), w stężeniach od 2 do 14.3 g/litr, stosowanych zamiast Bacto Peptonu, dodawanego do początkowych pożywek z wyciągiem drożdżowym i peptonem. Na ogół, grzybnię zbierano z fermentorów o pojemności roboczej od 10 do 5000 litrów, zaopatrzonych w bełkotki turbinowe Rushtona w ilości od 1 do 3, pracujące z szybkością 40-150 obrotów/minutę. Podczas fermentacji utrzymano temperaturę 22 ± 1°C i napowietrzanie od 0.1 do 0,5 objętości powietrza na objętość ciekłej brzeczki. Przeciwciśnienie utrzymywano na poziomie 20,6 Pa do 34,3 Pa. Niektóre procesy fermentacji prowadzono przy pH utrzymywanym na poziomie 6.4 kwasem siarkowym. W niektórych fermentorach utrzymywano ilość rozpuszczonego tlenu na poziomie wynoszącym 40-60%, regulując szybkość mieszania i napowietrzania. Podczas różnych operacji i fermentacji należy dbać o minimalizację tarcia, gdyż podczas wzrostu, amebowate komórki są pozbawione ścian komórkowych.

Na ogół, mieszane hodowle D.discoideum Ax3 rosną z szybkością podwojenia wzrostu w czasie od 12 do 36 godzin. Ilość rozpuszczonego tlenu obniża się stopniowo (jeśli nie jest kontrolowana), po czym zaczyna wzrastać po pewnym czasie od zahamowania wzrostu gęstości komórkowej. Końcowa gęstość komórek wynosi od 3 x 106/ml do 5 x 10⁷/ml. Transfer tlenu wydaje się ograniczony w hodowlach o niskiej maksymalnej gęstości komórkowej.

Co pewien czas pobierano próbki i wykonywano pomiary gęstości komórkowej i aktywności GF-pNA-zy (przykład 3). Do oznaczania gęstości komórkowych powyżej 5 x 10/ml stosowano komorę Petroffa-Hausera. Na ogół, aktywność hydrolizowania GFpNA zwiększała się miarę trwania fermentacji. Maksymalną aktywność dDAP obserwowano po 2 do 4 dniach od osiągnięcia maksymalnej gęstości komórek. Pełne brzeczki przechowywano w temperaturze 4°C lub zamrażano w temperaturze -20°C a później odmrażano i analizowano aktywność. Wyodrębnianie prowadzono przez oziębianie brzeczki pofermentacyjnej do temperatury poniżej 10°C i odwirowywanie komórek w wirówce o przepływie ciągłym.

Przykład II. Wytwarzanie dDAP

A. Usuwanie komórek, i zatężanie

Pierwsze oczyszczanie dDAP z brzeczki fermentacyjnej Dictyostelium discoideum polega na usunięciu komórek i zatężeniu. Komórki usuwano przez wirowanie w wirówce o przepływie ciągłym typu Western States. Płyn wolny od komórek zatężano około 20-krotnie metodą ultrafiltracji z przepływem stycznym, stosując membranę odcinającą cząsteczki o masie 50.000. Płyn retencyjny usuwano z jednostki ultrafiltracyjnej i jednostkę przepłukiwano 50 mM buforem Tris (pH = 7) w celu odzyskania dodatkowej ilości dDAP. Płyn retencyjny i przemywki łączono. Końcowy koncentrat przechowywano w stanie zamrożenia w temperaturze -20°C przez wiele miesięcy przed dalszym przetwarzaniem.

B. Klarowanie

Zamrożony końcowy koncentrat odmrażano w czasie około 12 godzin w temperaturze pokojowej. Po odmrożeniu koncentrat ten klarowano przed rozpoczęciem etapu pierwszej chromatografii kolumnowej. Klarowanie to prowadzono metodą wirowania i następnej filtracji przez membranę o wielkości porów 5 gm w sklarowanym końcowym koncentracie ustawiano pH na wartość 7.0 i w oczekiwaniu na etap chromatografii aniono-wymiennej (w czasie poniżej 12 godzin) utrzymywano temperaturę tego koncentratu w zakresie 4-10°C.

C. Chromatografia aniono-wymienna

W procesie oczyszczania dDAP, etapem pierwszej chromatografii była chromatografia aniono-wymienna na żywicy Q-Sepharose fast Flow resin (FFQ) firmy Pharmacia. Kolumnę równoważono 50 mM buforem Tris (pH = 7). Sklarowany koncentrat nie zawierający komórek podawano na kolumnę z liniową szybkością przepływu 50 cm/godzinę, w stosunku 60 litrów niezatężonego płynu pofermentacyjnego na litr żywicy. Przy tym stosunku, zawartość białka w

176 930 żywicy wynosiła około 60 g/litr żywicy (ilościowe oznaczenie białka wykonano metodą Pierce’ a dla białka BCA wobec albuminy surowicy bydlęcej jako standardu). Na litr żywicy FFQ podawano około 250 jednostek aktywności dDAP. Przewodnictwo bezkomórkowego koncentratu wynosiło około 5 jednostek mMHOS/cm. Po zakończeniu ładowania próbki na kolumnę, żywicę FFQ przemywano ilością trzech objętości kolumny buforu do równoważenia. Enzym dDAP eluowano z.kolumny w liniowym gradiencie od 0 do 1M NaCl w 50 mM Tris (pH = 7). Kolumnę eluowano ilością 10 objętości kolumny, z szybkością przepływu 50 cm/godzinę. Zbierano frakcje po 0,1 objętości kolumny. Następnie, kolumnę FFQ eluowano trzema objętościami kolumny 1,0 M NaCl w 50 mM Tris (pH = 7). W wycieku monitorowano przewodnictwo i absorbancję przy 280 nm. Aktywność enzymu dDAP we frakcjach oznaczano kolorymetrycznie, przez pomiar rozszczepiania substratu Gly-Phy-para-nitroanilidu GFpNA) przy pH 3.5. Główny zbiór otrzymywano przez połączenie frakcji zawierających około 90% całkowitej eluowanej aktywności dDAP. Enzym dDAP eluowany jest jako pojedynczy pik w objętości stanowiącej około 2 objętości kolumny. Ten główny zbiór zakwaszano do pH 3.5 stosując 10% kwas solny (objętościowo). Zakwaszony zbiór utrzymuje się temperaturze 4°C w czasie krótszym od dwu dni.

D. Chromatografia hydrofobowa

Zakwaszony główny zbiór po kolumnie FFQ oczyszczano następnie metodą chromatografii oddziaływania hydrofobowego (HIC) na żywicy Phenyl Sepharose Fast Flow resin firmy Farmacia. Kolumna miała pojemność wynoszącą 1/3 objętości kolumny do chromatografii aniono-wymiennej. Na litr żywicy podawano około 650 jednostek aktywności a obciążenie białkiem wynosiło 4 g/litr żywicy (jedna jednostka absorbancji przy 280 nm jest równoważna 1 mg/ml białka). Główny zbiór FFQ przygotowywano do załadowania na kolumnę przez dodanie 140 g siarczanu amonowego/litr. Załadunek doprowadzono do pH 3,5. Końcowe przewodnictwo wynosiło około - 90 jednostek mMHOS/cm. Kolumnę HIC równoważono 50mM cytrynianem (pH = 3.5) zawierającym co najmniej 140 mg siarczanu amonowego/litr. Kolumnę ładowano z liniową szybkością przepływu 40 cm/godzinę, po czym przemywano żywicę przynajmniej trzema objętościami kolumny buforu do równoważenia kolumny. Enzym dDAP eluowano z żywicy w liniowym gradiencie od 140 g/litr do 0 g/litr siarczanu amonowego w 50 mM cytrynianie (pH = 3.5) wprowadzanym na kolumnę w ilości 10 objętości kolumny z szybkością 40 cm/godzinę. Następnie kolumnę eluowano co najmniej trzema objętościami kolumny 50 mM cytrynianu (pH = 3.5). Objętość frakcji wynosiła 0.1 objętości kolumny. W wycieku monitorowano przewodnictwo i absorbancję przy 280 nm. Aktywność enzymu dDAP we frakcjach oznaczano przez pomiar rozszczepiania GFpNA przy pH 3.5. Główny zbiór otrzymywano przez połączenie frakcji zawierających około 90% całkowitej eluowanej aktywności dDAP. Enzyma dDAP eluowany jest jako pojedynczy pik w objętości stanowiącej około 2 objętości kolumny. Ten główny wyciek zakwaszano do pH 3.5 stosując 10% kwas solny (objętościowo) lub 10% (wagowo) NaOH. Zbiór z kolumny HIC utrzymywano w temperaturze 4°C w czasie krótszym od jednego dnia przed przystąpieniem do następnego etapu.

E. Chromatografia ekskluzyjna

Główny wyciek z kolumny HIC przerabiano dalej metodą chromatografii ekskluzyjnej (SEC) na Sepharozie HR S-200. Objętość kolumny była dwa razy większa od kolumny HIC. Wysokość złoża wynosiła 78 cm. Główny wyciek po kolumnie HIC przygotowano do chromatografii i na kolumnie SEC przez jego zatężenie w jednostce ultrafiltracyjnej z membraną odcinającą cząsteczki o masie cząsteczkowej 10.000 daltonów. Zatężanie prowadzono do osiągnięcia objętości stanowiącej 2.5% objętości kolumny SEC po czym usuwano płyn retencyjny z jednostki. Jednostkę do ultrafiltracji przemywano 50 mM buforem cytrynianowym (pH = 3.5) w ilości równej 2.5% objętości kolumny SEC. Płyn retencyjny łączono z przemywkami. Końcowy koncentrat doprowadzano do pH 3.5 za pomocą 10% (objętościowo) HCl albo 10% (wagowo-objętościowo) NaOH. Przewodnictwo tego końcowego koncentratu wynosiło około 30 jednostek mMHO/cm. Kolumnę SEC równoważono roztworem zawierającym 50 mM kwasu octowego i 20 mM chlorku sodowego (pH = 3.5) o przewodnictwie około 2 mMHO/cm. Ten końcowy koncentrat podawano na kolumnę SEC z liniową szybkością przepływu 15 cm/godzinę

176 930 i eluowano enzym dDAP jedną objętością kolumny buforu do równoważenia. Objętość frakcji wynosiła 0,02 objętości kolumny. W wycieku monitorowano przewodnictwo i absorbancję przy 280 nm. Aktywność enzymu dDAP we frakcjach oznaczano przez pomiar rozszczepiania GFpNA przy pH 3.5. Główny zbiór otrzymano przez połączenie frakcji zawierających około 90% całkowitej eluowanej aktywności dDAP. Enzym dDAP eluowany jest jako pojedynczy pik w objętości stanowiącej około 0.08 objętości kolumny. Ten główny zbiór z chromatografii SEC może być utrzymywany w temperaturze 4°C przez wiele miesięcy.

Po oczyszczeniu kombinacją chromatografii aniono-wymiennej, chromatografii hydrofobowej i chromatografii ekskluzyjnej otrzymuje się materiał, który podczas elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE) migruje w postaci większego pasma. Pasmo to dochodzi do pozycji na żelu odpowiadającej masie molowej standardowej albuminy surowicy bydlęcej (66 kilodaltonów). To białko barwi się błękitem ISS Pro-blue. Na pasma migracyjne nie ma wpływu obecność lub nieobecność 0.1 M DDT (plus temperatura 100^uC przez 5 minut) podczas przygotowywania próbki. Masę molową podjednostki DAP-I (bydlęcej) wyznaczono metodą SDS-PAGE na około 22.000 daltonów.

Przykład III. Aktywność dDAP

A. Reakcje konwersji .Rozszczepianie GF - pNA

Aktywność dDAP na ogół oznacza się przez śledzenie rozszczepiania chromogennego substratu, Gly-Phe-para-nitroanilidu (GF-pNA). Typowe oznaczenie polega na 11-krotnym rozcieńczeniu enzymu 4 mM roztworem GFpNA doprowadzonym do pH 3.5 do objętości 1.0 ml. Szybkość odszczepiania dwupeptydu GF monitoruje się w temperaturze 37°C przez pomiar absorpcji przy 405 nm. Jednajednostka aktywność daje w tych warunkach zmianę o 0.90 gęstości optycznej OD na minutę. Oznaczenia ilości jednostek/ml prowadzono przyjmując współczynnik ekstynkcji dla wolnego pNA równy 9.9 mM’¹ cm’¹ przy 405 nm.

Profil hamowania aktywności dDAP w stosunku do substratu GFpNA porównano z profilem dla bydlęcego DAP-I, stosując jako środki modyfikujące grupy sulfhydrylowe jodoacetamid i czterotionian potasowy, o których wiadomo, że hamują aktywność DAP-I. Próbki dDAP lub DAP-I ze śledziony bydlęcej inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej w końcowych stężeniach 0,0.5, 5.0 lub 50 mM każdego inhibitora przy pH 7 w 100 mM buforze Tris. Następnie, inkubowaneroztwory rozcieńczano21-krotme za pomocą4 mM GFpNA opH 3.5. Szybkość rozszczepiania monitorowano przez pomiar wzrostu absorbancji przy 405 nm w temperaturze 37°C. Szybkość rozszczepiania GFpNA przez bydlęcą DAP-I zmniejszyła się o ponad 90%. w wyniku działania 5 mM jodoacetamidu i była w 95% hamowana przez 5 mM czterotionian potasowy. Nie było oznak znacznego hamowania enzymu dDAP przez którekolwiek stężenie jodoacetamidu bądź czterotionianu potasowego.

Wartość pH optymalną dla zdolności rozszczepiania GFpNA przez dDAP oznaczano przez doprowadzenie buforu składającego się z 0.5 Tris, fosforanu i cytrynianu za pomocą 10% HCl lub 1Q%c NaOH do różnych wartości pH w zakresie 3-8. Enzym dDAP rozcieńczano 20-krotnie w buforze zawierającym 100 mM cysteaminy i 10 mM BaCl. Bydlęcą DAP-I rozcieńczano 200-krotnie w tym samym buforze. Przygotowywano roztwór substratu GFpNA (4mM) w 2% dimetyloformamidzie. W płytce do mikromianowania łączono 0.025 ml buforu: Tris/fosforan/cytrynian o różnych wartościach pH z 0.1 ml rozcieńczonego enzymu i z 0.1 ml roztworu substratu. Szybkość wzrostu absorpcji przy 410 nm oznaczano na czytniku do płytek w czasie 30 minut. Wyniki wskazują, że optymalne pH dla rozszczepiania GFpNA przez dDAP wynosi 3.5 do 4.0.

2. Rozszczepianie Gly-Arg-pNA

Przygotowano próbki po 4 mM Gly-Arg-pNA (GR-pNA) w 50 mM roztworze kwasu octowego i 50mM buforu glicynowego (pH 5). Do ustawienia różnych wartości pH w zakresie od 5.1 do 2.3 używano HCl lub NaOH. Do 180 μl powyższych, buforowanych roztworów substratu dodawano 5 gl dDAP (49 milijednostek/ml - w · roztworze końcowym). Monitorowano szybkość wzrostu absorbancji przy 410 nm (stosując czytnik do płytek) i tę szybkość wzrostu porównywano z pH roztworu reakcyjnego. Tak, jak w przypadku GFpNA, dla substratu GR-pNA

176 930 optimum pH wynosi około 3.5. Enzym wykazuje niewielką aktywność poniżej pH 2.5 lub powyżej pH 5 w stosunku do tego substratu.

3. Rozszczepianie Arg-Arg-$-naftyloamidu (RR-BNA)

Przygotowywano próbki po 0.25 mM RR-BNA albo 0.25 mM benzyloksykarbonyloRR-BNA (Z-RR-BNA) w buforze 100 mM kwasu octowego (pH 3.5) albo 100 mM cytrynianu (pH 5.0). Do 2 ml roztworu substratu dodawano dDAP albo DAP-I bydlęcy (około 15 milijednostek/ml roztworu). Monitorowano szybkość rozszczepiania przez pomiar wzrostu fluorescencji przy fali 410 nm i fali pobudzenia 340 nm. Bydlęca DAP-I nie rozszczepiała żadnego substratu. Enzym dDAP natomiast efektywnie rozszczepiał substrat RR-BNA, jednak nie miał zdolności rozszczepiania zablokowanej grupy aminowej z substratu Z-RR-BNA, co potwierdza obserwację, że dDAP jest enzymem DAP. Optimum pH dla rozszczepiania RR-BNA oznaczano przez monitorowanie szybkości rozszczepiania RR-BNA w układzie buforowym składającym się z 50 mM kwasu octowego i 50 mM cytrynianu. Ustawiono różne wartości pH stosując HCl lub NaOH. Objętości 1.5 ml dopełniano do 2.0 ml ilością 0.5 ml 1 mM roztworu podstawowego RR-BNA (końcowe stężenie około 0.25 mM). Następnie dodawano dDAP (do około 15 milijednostek/ml) i oznaczano szybkość rozszczepiania. Optymalne pH dla rozszczepiania RR-BNA wynosiło około 4.5 a w całym badanym zakresie pH (3.5 do 5.7) obserwowano znaczną aktywność. Ten zdumiewający wynik wskazuje na to, że dDAP posiada pewne właściwości wspólne z DAP-III.

Specjaliści wiedzą, że optymalne pH dla rozszczepiania substratu zależy nie tylko od enzymu lecz również od samego substratu, to znaczy, budowy usuwanego dipeptydu oraz samej grupy wskaźnikowej. Przykładowo, przy stosowaniu dDAP, dla Gly-Arg-pNA optimum pH wynosi około 3.5 podczas gdy optimum pH dla rozszczepiania Gly-Arg-7-amido-4-metylokumaryny (GR-AMC) wynosi ono około 5, co sugeruje, że rodzaj reportera ma wpływ -na właściwości rozszczepiania.

B. Konwersja syntetycznych oktapeptydów i dekapeptydów:

Oktapeptyd Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu rozpuszczano do stężenia 4 mM za pomocą 50 mM roztworu kwasu octowego (pH = 3.5). Roztwór rozcieńczano w stosunku 1:1 enzymem dDAP (10 milijednostek/ml) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Reakcję hartowano przez 20-krotne rozcieńczenie w 7M roztworze mocznika, zawierającym 1 % kwasu fosforowego. Próbkę analizowano metodą HPLC z odwróconymi fazami. Produkty rozszczepiania porównano ze standardami oktapeptydu, dwupeptydu Met-Asp i heksapeptydu Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu. Enzym dDAp z łatwością usuwa dipeptyd Met-Asp z niezablokowanego końca aminowego oktapeptydu lecz nie może rozszczepiać odkrywającego się dwupeptydu Phe-Pro.

Syntetyczny dekapeptyd Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-ASn-Gln-His-Leu przygotowano w postaci 1.7 mM roztworu podstawowego w 100 mM roztworze glicyny (pH = 3.5). Do 0.5 ml tego roztworu dodano 8 μΐ roztworu dDAP o stężeniu 6.4 milijednostek/ml (w 100 mM roztworze glicydy, pH = 3.5). Co godzinę próbkę tego roztworu wstrzykiwano bezpośrednio do układu HPLC z odwróconymi fazami w celu monitorowania produktów rozszczepiania. Dla porównania niezależnie wstrzykiwano dipeptydy Met-Arg i Met-Tyr oraz peptydy Met-Tyr-Phe-Val-AsnGln-His-Leu i Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu. Enzym dDAP łatwo usuwa dipeptyd Met-Arg z dekapeptydu oraz ujawniający się dipeptyd Met-Tyr. Wskazuje to na fakt, że dDAP może sekwencyjnie usuwać dipeptydy z końca aminowego.

C. Konwersja Met-Asp-ludzkiego hormonu wzrostu

Met-Asp-Iudzki hormon wzrostu (Met-Asp-hGH) wytworzono w postaci nierozpuszczalnego białka w cytoplazmie E.coli. To nierozpuszczalne białko solubilizowano, doprowadzano do struktury drugorzędowej (pofałdowanej) z utworzeniem prawidłowych mostków dwusiarczkowych i oczyszczano metodą chromatografii jono-wymiennej. Następnie, w preparacie wymieniano rozpuszczalnik i doprowadzano odczyn do pH 3.5. Taki Met-Asp-hGH ogrzewano do temperatury 37°C i oznaczano absorbancję przy 280 nm. Enzym dDAP dodawano w ilości 6 milijednostek na mg Met-Asp-hGH. Reakcję konwersji prowadzono w temperaturze 37°C, z mieszaniem, w czasie od około 4 do około 6 godzin. Proces można spowolnić bez szkody przez

176 930 użycie mniejszej ilości enzymu, obniżenie temperatury lub obniżenie stężenia Met-Asp-hGH. Szybkość reakcji można zwiększyć przez dodanie większej ilości enzymu, zwiększenie stężenia Met-Asp-hGH lub zwiększenie temperatury. Przebieg reakcji konwersji śledzono metodą HPLC z odwróconymi fazami. Reakcję kończono przez szybkie dodanie NaOH podczas mieszania do pH i przez dodanie 30% (objętości) acetonitrylu, produkt reakcji wytworzony z ludzkiego hormonu wzrostu po działaniu dDAP poddano wyczerpującym badaniom analitycznym, obejmującym mapowanie peptydów, sekwencjonowanie końca aminowego, spektroskopię masową, analizę aminokwasów i HPLC z odwróconymi fazami. Wszystkie dane wskazują, że pod działaniem dDAP powstaje autentyczny ludzki hormon wzrostu.

D. Konserwacja Met-Arg-ludzkiej proinsuliny

Met-Arg-ludzką proinsulinę (Met-Arg-hPI) wytworzono w postaci nierozpuszczalnego białka w cytoplazmie E.coli. To nierozpuszczalne białko rozpuszczano w 7 M moczniku. Białko to oczyszczono metodą chromatografii jono-wymiennej, następnie poddawano sulfitolizie, wymieniano rozpuszczalnik, doprowadzano do powstania struktury sfałdowanej w celu utworzenia natywnych, charakterystycznych dla produktu naturalnego par wiązań dwusiarczkowych i natywnej struktury trzeciorzędowej. Materiał ten oczyszczano dalej metodą chromatografii z odwróconymi fazami. Formę z utlenioną resztę metionylową [Met(O)-Arg-hPI] przygotowywano przez działanie na Met-Arg-hPI nadtlenkiem wodoru i następnie oczyszczano stosując chromatografię z odwróconymi fazami, po czym liofilizowano.

Stężenie roztworu Met-Arg-hPI wynosiło około 24 mg/ml (w buforze około 20 mM glicyny o pH = 3.5). Około 2.4 mg tego materiału inkubowano w temperaturze pokojowej razem 0.19 milijednostkami dDAP przy pH 3.5. Co pewien czas pobierano próbki, rozcieńczano je 10% kwasem fosforowym i wstrzykiwano do neutralnego układu HPLC z odwróconymi fazami, monitorując zanikanie Met-Arg-hPI albo Met(O)-Arg-hPI z jednoczesnym wytwarzaniem ludzkiej insuliny (hPI). Ponadto, pobierane próbki rozcieńczono odpowiednim rozcieńczalnikiem i metodą HPLC monitorowano pojawianie się dwupeptydów, Met-Arg- albo Met(O)-Arg. W czasie 8 godzin około 60% Met-Arg-hPI przechodziło w hPI. Podobne wyniki nieoczekiwanie uzyskano w doświadczeniach z Met(O)-Arg-hPI, bowiem z tej utlenionej formy Met(O)-Arg-hPI również powstawała ludzka insulina (hPI). Szybkość rozkładu obydwu substratów była podobna. Wynik ten jest nieoczekiwany, ponieważ bydlęcy DAP-I nie rozszczepia Met(O)-X-pochodnych ludzkiej insuliny, gdzie X oznacza Arg, Phe i Tyr. Ponadto wykazano, że dwupeptyd Met-Arg uwalnia się z Met-Arg-hPI stosując metodę analizy HPLC z odwróconymi fazami i porównanie z próbką referencyjną dwupeptydu Met-Arg. W próbkach pochodzących z doświadczeń z substratem Met(O)-Arg-hPI pik pojawiał się w obszarze dwupeptydu Met-Arg. Pik ten może należeć do dwupeptydu Met(O)-Arg. Zdolność enzymu dDAP rozszczepiania utlenionego substratu Met(O)-X jest wyróżniającą, korzystną właściwością technologiczną tego enzymu w stosunku do enzymów niezdolnych do takiego rozszczepienia.

E. Konwersja analogów Met-Arg-ludzkiej proinsuliny

Enzym dDAP został również użyty do wydajnej konwersji sfałdowanego analogu MetArg-proinsuliny (B28 Lys, B29 Pro) oraz sfałdowanego analogu Met-Arg-proinsuliny (B10 Asp, des B28-B30). Reakcje te prowadzono zasadniczo w taki sam sposób jak opisaną powyżej konwersję Met-Arg-hPI.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób usuwania dwupeptydów z końca aminowego prekursorowych polipeptydów, znamienny tym, że kontaktuje się prekursorowy polieptyd z enzymem dDAP w warunkach pozwalających na ujawnienie się aktywności dDAP w kierunku sekwencyjnego usuwania dwupeptydów z końca aminowego polipeptydu prekursorowego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polipeptyd prekursorowy stosuje się prekursor ludzkiej proinsuliny, prekursor ludzkiego hormonu wzrostu i prekursor analogu proinsuliny ludzkiej.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd prekursorowy z enzymem dDAP w czasie od minuty do około 24 godzin.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd prekursorowy z enzymem dDAP w roztworze o wartości pH około 2,5 do około 5,5.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd prekursorowy z enzymem dDAP w roztworze o wartości pH około 3,5.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kontaktuje się polipeptyd prekursorowy z enzymem dDAP w zakresie temperatur od około 15°C do około 45°C.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako odszczepiany N-końcowy dwupeptyd uzyskuje się dwupeptyd zawierający utlenioną metioninę jako aminokwas N-końcowy.