PL176595B1 - Środek leczniczy w postaci koncentratu z nasion selera i sposób otrzymywania środka leczniczego w postaci koncentratu z nasion selera - Google Patents

Abstract

1 Srodek leczniczy w postaci koncentratu ekstraktu z nasion se- lera, do leczenia dolegliwosci zapalnych, znamienny tym, ze srodek leczniczy zawiera mieszanine zwiazków butyloftalidu reprezento­ wanego pikiem A na fig 2, sedanolidu reprezentowanego pikiem B na fig 2 i sedanenolidu reprezentowanego pikiem C na fig 2, w któ­ rym reszte stanowi czwarty skladnik reprezentowany obszarem D na fig 2 i w którym stosunek sedanolid, butyloftalid, sedanenolid czwa­ rty skladnik wynosi 1 15 41 11 odpowiednio 5 Sposób otrzymywania srodka leczniczego w postaci koncen­ tratu z nasion selera do leczenia dolegliwosci zapalnych, w którym ekstrahuje sie nasiona selera rozpuszczalnikiem organicznym zdol­ nym do wyekstrahowania rozpuszczalnych skladników z nasion se­ lera, usuwa sie stala pozostalosc i odpedza rozpuszczalnik, znamienny tym, ze prowadzi sie etapy, w których a) kontaktuje sie rozdrobnione nasiona selera z rozpuszczalnikiem organicznym, zdo­ lnym do ekstrahowania rozpuszczalnych skladników z nasion selera, korzystnie etanolem, wyekstrahowujac ekstrahowalne skladniki, (b) usuwa sie staly materii z mieszaniny otrzymanej po etapie (a), (c) usuwa sie rozpuszczalnik oraz material lotny przez zatezanie ekstra­ ktu, po czym pozostalosc po etapie c) dalej zateza sie w warunkach destylacji prózniowej, prowadzac monitoring chromatograficzny co najmniej jednego skladnika sposród butyloftalidu, sedanolidu i seda- nenolidu, do otrzymania koncentratu o skladzie przedstawionym pi­ kami A, B i C oraz obszarem D na fig 2, na której pik A reprezentuje butyloftalid, pik B reprezentuje sedanolid, pik C reprezentuje seda- nenolid a obszar D reszte skladników pozostalych po zatezaniu, o stosunku sedanolid, butyloftalid, sedanenolid czwarty skladnik wy­ noszacym 1 15 41 11 odpowiednio FIG 2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek leczniczy w postaci koncentratu z nasion selera, który może być stosowany do leczenia stanów zapalnych takich jak zapalenie stawów i bólu związanego z tymi stanami oraz sposób otrzymywania koncentratu z nasion selera.

Choroby kości i stawów takie jak artretyzm i reumatyzm stanowią poważny problem zdrowotny. Artretyzm oznacza zapalenie stawów i w rzeczywistości dotyczy ponad 100 chorób reumatycznych, w których więcej niż jeden staw jest w stanie zapalnym. Schorzenia reumatyczne, obejmująnie tylko zapalenie stawów, ale choroby, w których występująbóle i dolegliwości układu mięśniowo-kostnego, stawów, mięśni, więzadeł, ścięgien i kaletek. Objawy reumatyczne mogą być klasyfikowane jako stany zapalne lub zwyrodnieniowe, ale czasami jest to mniej odróżnialne niż sugeruje nazewnictwo. Jest tak dlatego, że staw uszkodzony przez chorobę zapalną, jest bardziej podatny na czynniki zwyrodnieniowe, a zatem objawy, które pojawiają się jako zwyrodnieniowe mogą być utożsamiane z zapaleniem. Stąd objawy reumatyczne mogą faktycznie prezentować liczne typy chorób. W dodatku, schorzenia reumatyczne mogą występować razem z innymi chorobami. Ta złożoność powoduje, że diagnoza jest trudna do postawienia. Szerzej jest to omówione w literaturze (1) wskazanej w przypisach.

Trudność diagnozowania wykazana jest w ostatnich rozważaniach poświęconych temu złożonemu problemowi przez Webba i Nasha w 1990 roku (2) i odnosi się do kompleksowego klasyfikowania według American Rheumatism Association. Tak więc, leczenie choroby reumatycznej jest złożone. Złożoność tę przedstawił Kremer (3) w 1990 roku, który omawia tradycyjne leczenie reumatoidalnych zapaleń stawów i proponuje modyfikacje oraz stosowanie połączonej chemioterapii w oparciu o podejście eksperymentalne. Komplikacje dotyczące leczenia odnoszą się także do innych chorób reumatycznych takich jak zapalenie stawów i kości.

Artretyzm może być utożsamiany także z czynnikami zakaźnymi takimi jak bakterie, grzyby i wirusy. I tak istnieje gonokokowe zapalenie stawów, gruźlicze zapalenie stawów, syfilistyczne zapalenie stawów, zapalenie pochodzenia grzybowego i zapalenie pochodzenia wirusowego. Istnieje także zapalenie wielostawowe i wirusowe zapalenie stawów a także zapalenie wielostawowe o nieznanej etiologii, w znaczącym stopniu związane z łączeniami stawowymi kręgosłupa, stawami krzyżowo-biodrowymi i przykręgowymi tkankami miękkimi. Istnieje choroba stawów na tle nerwowym, która stanowi postępujące zwyrodnienie stawów, klasyfikowane pod różnymi formami zapalenia stawów, które obejmują także wapnienie chrząstek. Wapnienie chrząstek definiuje się jako obecność soli wapnia w chrząstkowych strukturach w więcej niż jednym stawie. Obecności kryształów soli wapnia w płynie stawowym towarzyszą przewlekłe zapalenia błony maziowej, które traktowano podobnie jak chondrokalcynozę stawową (1).

Reumatoidalne zapalenie stawówjest chorobąogólnoustrojowąo nieustalonej przyczynie, prowadzącądo powstania ekspresji przeciwciał przeciw własnym antygenom. Odkrycia kliniczne i patologiczne oraz wynikająca niesprawność są wynikiem przewlekłego zapalenia błon maziowych. Zapalna i rozrostowa błona maziowa przyczynia się do niszczenia chrząstki. Wydaje się, że rezydujące w mazi komórki makrofaga oraz typu fibroblastów stają się aktywne i uwalniają czynnik pośredniczący w reakcji zapalnej. Ponadto, reumatoidalne zapalenie stawów wy4

176 595 daje się być zaostrzane przez immunologicznie stymulowany dopływ monocytów/makrofagów i leukocytów do płynu maziowego.

Istnieją również odmiany objawów reumatoidalnego zapalenia stawów (1). Dodatkowo, pojawia się problem jak zdefiniować lub ocenić stopień aktywności choroby. Złożoność rozwoju i stopień aktywności choroby zostały przedstawione w ostatnim artykule Van der Heijde’a i wsp., 1990(4).

Zapalenie kości i stawów, zwyrodnieniowa choroba stawów dotycząca chrząstki stawowej, zaczyna się prawdopodobnie w drugiej dekadzie życia. Może to być uważane za reakcję na starzenie, ale może być też przyspieszone przez nieznane przyczyny. Zważywszy, że reumatoidalne zapalenie stawów ma swój początek w reakcj i zapalnej, która może prowadzić do zniszczenia chrząstki stawowej, to zapalenie stawów i kości jest inicjowane zniszczeniem lub brakiem naprawy chrząstki stawowej. Może to prowadzić do zapalenia stawów, ale rzadko do cech patologicznych imitujących cechy reumatoidalnego zapalenia stawów. Ponadto, w następstwie owrzodzenia chrząstki, pojawia się tworzenie nowych kości na krawędzi chrząstki stawowej. Te krawędziowe narośla kostne są charakterystycznymi kośćmi “nadmiernymi”. Zmiany kostne, dotyczą także powstawania torbieli różnych rozmiarów, poniżej stawu i przemodelowania kości podchrząstkowej (1).

Jak przy reumatoidalnym zapaleniu stawów, istnieją także odmiany objawów zapalenia stawów i kości, takie jak zapalenie ścięgna pochodzenia wapniowego i zapalenie kaletki, co jest najbardziej ogólnąprzyczynąosadzania wapnia w ścięgnach obrotowych i zapalenia kaletki, która zamyka worki maziowe umieszczone w miejscu tarcia skóry, wiązadeł, ścięgien, mięśni i kości. Te zaś stanowią grupę reumatyzmu niestawowego (1).

Skaza moczanowa reprezentuje grupę chorób genetycznych i pociąga za sobą zaburzenia metabolizmu lub wydalania puryny, co może być identyfikowane jako hyperuric-acicemia (zwiększone stężenie kwasu moczowego we krwi). Zatem skaza moczanowa jest zbiorem rozmaitego rodzaju zaburzeń i różne stany choroby prowadzą do wspólnej cechy - trwałego nadmiernego stężenie kwasu moczowego we krwi. Ponadto, nadmierne stężenie kwasu moczowego we krwi może pojawić się w następstwie chemioterapii przy chorobach o charakterze nowotworowym, na skutek niszczenia tkanki i w rezultacie do przeciążenia kwasem moczowym w wyniku zwiększenia puryn (1).

Kwas moczowy nie jest toksyczny w swojej rozpuszczalnej postaci, ale wywołuje problemy, gdy zostanie wytrącony w postaci moczanu sodu przy pH 7,4 lub jako kwas moczowy w kwaśnym moczu. Wytrącenie kwasu moczowego w postaci moczanu sodu może pojawić się w każdej tkance i dawać guzek dnawy z rozerwaniem i zniszczeniem tkanki, zaśjego wytrącenie się w nerkach może powodować różne stopnie upośledzenia nerkowego. Jego wytrącanie się w postaci mikrokryształów w tkankach maziowych i przestrzeniach prowadzi do ostrego zapalenia stawów, znanego także jako dnawe zapalenie stawów:

Nadmierne stężenie kwasu moczowego we krwi i dnawe zapalenie stawów, zostały także zaobserwowane jako towarzyszące transplantacji serca (5).

Dnawe zapalenie stawów jest zatem zapaleniem stawów wywołanym przez kryształy moczanu (kryształy moczanu jednosodowego). Mechanizmy, w których kryształy moczanu jednosodowego (MSUC) prowadzą do zapalenia błony maziowej i niszczenia stawów nie są całkowicie wyjaśnione. Niemniej jednak, arachidyny uważa się za ważne czynniki pośredniczące w zapalnych odpowiedziach i są produkowane jako reakcja na MSUC (6). Podwyższone skupienia arachidyn zostały znalezione w dnawym płynie błony maziowej (7, 8), prostalgandynie (PGE2), które pobudzająresorpcję kości (9) i w kwasach hydroksyeikozatetrenowych produkowanych przez komórki maziowe wystawione na działanie MSUC (10-14). Ponadto, stwierdzono obecność leukotrienu B4, który pobudza infiltrację krwinek białych obojętnochłonnych (15). Wydaje się, że stopień ograniczenia etapu produkcji arachidyn prowadzi do produkcji enzymów fosfolipazy, które rozszczepiają kwasy tłuszczowe i błony fosfolipidowe (16). Enzymy te są produkowane przez monocyty i krwinki białe obojętnochłonne pobudzone przez MSUC za pośrednictwem fosfolipazy aktywującej proteiny, która może być inhibitowana przez kolchi176 595 cynę i indometacynę (16). Nie zostało wyjaśnione czy jest to czy nie, bezobjawowa skaza moczanowa, w rozumieniu mechanizmów obronnych, które poprzedzają reumatyczne zapalenie stawów i zapalenie stawów i kości. W tym odniesieniu, godnym zainteresowania jest to, że nadmierne stężenie kwasu moczowego we krwi nie jest chorobą ale czynnikiem ryzyka dla skazy moczanowej i wieńcowej choroby serca (17). W dodatku, MSUC może być obecny w płynie maziowym pod nieobecność nadmiernego stężenia kwasu moczowego we krwi (1, 18, 19), utrudniając diagnozę skazy moczanowej.

Proponowano różne metody dotyczące leczenia dolegliwości zapalnych, ale spotkały się one tylko z częściowym sukcesem jak opisał Sany (23). Na przykład w odniesieniu do gośćca przewlekłego postępującego proponowano różne terapie, które obejmują bądź wolno działające leki, które działają głównie ale nie wyłącznie na makrofagi (np. sole złota) lub na komórki T CD4+ (np. penicylamina D), bądź środki immunostymulujące (np. Lemamisole) lub leki immunosupresyjne takie jak środki alkilujące i antymetabolity. Proponowane były aspiryna jako środek przeciwbólowy i NSAIDS (niesterydowe leki przeciwzapalne), a także proponowany był metotreksan opisany przez Kremera (3). Wszystkie te terapie pociągająza sobą efekty uboczne o różnej ostrości.

Omówienie tego zagadnienia można także znaleźć w przypisach (19), (16), (24), (18), (25), (17), (27), (4) i (5).

Leczenie skazy moczanowej stwarza poważne problemy. Stosowanie środków przeciwzapalnych, fenylobutazonu lub indometacyny może powodować bóle głowy i objawy żołądkowojelitowe (mdłości, wymioty, bóle brzucha i biegunkę), ale w mniejszym stopniu niż w przypadku kolchicyny, która może także wywołać leukopoenię. Glukokortykoid lub ACTH daj ^różnorodne reakcje i istnieje wysoka zbieżność niezwiązanych efektów (1).

Problem ten próbowano rozwiązać w różny sposób, między innymi poprzez wykorzystanie produktów pochodzenia roślinnego. Japoński opis patentowy JP 11^7915, opisuje induktor nadtlenku dysmustazy (SOD) zawierający ekstrakty selera i lubczyka ogrodowego, które mogą być wyekstrahowane przez destylację z parą wodną lub organicznymi rozpuszczalnikami metodami periodycznymi lub ciągłymi. Otrzymany ekstraktjest stosowany w dowolnym stężeniu lub w postaci suchej substancji. Do ekstraktu może być dodawany środek powierzchniowo czynny lub laktoza.

Francuski opis patentowy nr 2611502 opisuje wyciąg z korzeni roślin rodziny Umbelliferae. Ekstrakt ten ma działanie moczopędne, sercowo-naczyniowe, przeciwbólowe i przeciwzapalne. Korzenie ekstrahowano alkoholowym rozpuszczalnikiem i suszono do proszku lub używano jako środek konserwujący. Surowy ekstrakt sporządzony z korzeni selera, który zawiera proszek zmieszany ze środkiem zagęszczającym takimjak skrobia lub guma arabska, wykazywał działanie przeciwzapalne.

Japoński opis patentowy JP 1257155 opisuje przeciwutleniacz żywności, zawierający sproszkowany wyciąg rośliny należącej do rodziny Umbelliferae.

Japońskie opisy patentowe JP 57056416 i 587058327 opisująpłyny do płukania ust zawierające alkoholowy ekstrakt z selera.

Japońskie zgłoszeniowe opisy patentowe 63-90505 i 63-90506 opisująnowy polisacharyd otrzymany z kłącza Bupleurum falcatum należącego do roślina z rodziny Umbelliferae i skutecznego jako środek leczniczy w odniesieniu do chorób autoimmunizacyjnyc-h takich jak reumatyzm stawowy, zapalenie tarczycy i przewlekle zapalenie nerek.

Wyciągi z nasion selera Apium graveolens (rodzina Umbelliferae) posiadająwłasności farmakologiczne w zakresie od wiatropędnych, moczopoędnych, wywołujących miesiączkę (czynniki, które pomagają w zaburzeniach miesiączkowych) do działania dezynfekcyjnego. W dodatku, ekstrakty te są także uważane jako pomocne w leczeniu bronchitów, astmy, wątroby i zaburzeń śledziony, zapaleń, reumatyzmu, zapalenia stawów i skazy moczanowej (28,29,30). Te właściwości terapeutyczne wyciągów z nasion selera sąpowszechnie przypisywane olejkom eterycznym w ekstraktach. Olejki eteryczne są w zasadzie olejkami lotnymi i objętościowo stanowią 1 - 2% wagowo nasion. Można je otrzymać w wyniku destylacji z parą wodną (31). Skład

ΥΊ6> 595 tych olejków eterycznych został ustalony na drodze chromatografii gazowej jak opisuje McLeod i wsp. (32) oraz Salzer (33). Podstawowymi składnikami olejku są węglowodory terpenowe limonen i β-selinen, które razem stanowią około 80% całego olejku. Reszta jest złożona z innych węglowodorów terpenowych i związków, które nadają charakterystyczny zapach olejkowi selerowemu, na przykład ftalanu butylu (31). Dane naukowe pokazują, że zarówno ekstrakt wodny jak i w 80% etanolu z łodygi selera mają właściwości przeciwzapalne jak opisuje Lewis i wsp. (34) i Ali Hindawi i wsp. (35).

W odniesieniu do tradycyjnej alkoholowej ekstrakcji selera, polegała ona na ekstrakcji nasion selera 95% etanolem dopóki wszystkie składniki selera rozpuszczalne w etanolu nie zostały wyekstrahowane. Po filtracji usuwającej rozdrobnione materiały, rozpuszczalne składniki często były stosowane jako środki terapeutyczne na bazie olejków lotnych.

W odniesieniu do olejku selerowego lub surowych ekstraktów selera, głównymi olejkami eterycznymi są związki takie jak sedanolid, sedanenolid, butylftalid, bezwodnik sedadonowy i kwas sedadonowy. Poza nimi olejek selerowy zawiera inne składniki takie jak dekstrolimonen i seskwiterpeny oraz inne komponenty i nie zawsze jest możliwe obliczenie poszczególnych dawek dla pacjentów, którym podaje się olejek selerowy jako środek leczniczy. Nie jest możliwe również monitorowanie stężeń poszczególnych składników olejku selerowego stosowanego jako środek leczniczy. Stosowanie olejku selerowego jako środka leczniczego może również powodować niepożądane działanie uboczne, i nie zawsze jest on skuteczny.

Celem wynalazku było uzyskanie skutecznego środka(ów) leczniczego do leczenia chorób lub dolegliwości zapalnych jak również chorób, schorzeń lub dolegliwości powodowanych kumulowaniem się kwasu moczowego w organizmie, który mógłby być również stosowany w leczeniu gruczolistości obejmującej rozwój komórek w wyściółce macicy w jamie ciała powodujący reakcje zapalne, a który charakteryzowałby się stałym składem i dawał powtarzalne wyniki w ustalanych z góry dawkach.

Według wynalazku środek leczniczy do leczenia dolegliwości zapalnych jest w postaci koncentratu ekstraktu z nasion selera i charakteryzuje się tym, że zawiera mieszaninę związków butyloftalidu reprezentowanego pikiem A na fig. 2, sedanolidu reprezentowanego pikiem B na fig. 2 i sedanenolidu reprezentowanego pikiem C na fig. 2 oraz czwarty składnik reprezentowany obszarem D na fig. 2, w którym to środku leczniczym stosunek sedanolid:butyloftalid:sedanenolid:czwarty składnik wynosi 1:15:41:11 odpowiednio.

Środek leczniczy według wynalazku korzystnie podaje się w połączeniu z wypełniaczem farmaceutycznie dopuszczalnym, korzystnie fosforanem wapnia w ilości 5 - 95% wagowo.

Wynalazek obejmuje również sposób otrzymywania środka leczniczego w postaci koncentratu z nasion selera do leczenia dolegliwości zapalnych, w którym w poszczególnych etapach:

a) kontaktuje się rozdrobnione nasiona selera z rozpuszczalnikiem organicznym, zdolnym do ekstrahowania rozpuszczalnych składników z nasion selera, korzystnie z etanolem, wyekstrahowując ekstrahowalne składniki; (b) usuwa się stały materiał z mieszaniny otrzymanej po etapie (a); (c) usuwa się rozpuszczalnik oraz materiał lotny przez zatężenie ekstraktu, po czym (d) pozostałość po etapie c) dalej zatęża się w warunkach destylacji próżniowej, prowadząc monitoring chromatograficzny co najmniej jednego składnika spośród butyloftalidu, sedanolidu i sedanenolidu, i otrzymuje się koncentrat o składzie przedstawionym pikami A, B i C oraz obszarem D na fig. 2, na której pik A reprezentuje butyloftalid, pik B reprezentuje sedanolid, pik C reprezentuje sedanenolid a obszar D resztę składników pozostałych po zatężaniu, o stosunku sedanolid:butyloftalid:sedanenolid:czwarty składnik wynoszącym 1:15:41:11 odpowiednio.

Etap (d) dalszego zatężania prowadzi się w standardowych warunkach destylacji próżniowej, to znaczy pod ciśnieniem 0,1 do 40 hPa i w odpowiadającej temu ciśnieniu temperaturze, otrzymując ciekły lepki koncentrat.

Na początku, przed etapem (a) rozgniata się nasiona selera, zwykle do wielkości odpowiadającej przeciętnej średnicy około 1,5 x 1,55 mm i grubości 0,5 mm, i ewentualnie dalej do otrzymania drobnych cząsteczek o przeciętnej średnicy 0,1 - 0,2 mm. Rozgniecione nasiona selera

176 595 zawiesza się w rozpuszczalniku organicznym w stosunku około 1 kg nasion na objętość rozpuszczalnika organicznego 5 litrów do 16 litrów.

Jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik z grupy obejmującej alkohol, aceton, chlorek metylenu, benzen, chloroform, glikole, eter i oleje organiczne. Jak podano powyżej korzystnym rozpuszczalnikiem organicznym jest etanol. Można stosować etanol o stężeniu w zakresie pomiędzy 95% do 98%. Alternatywnie można stosować etanol o stężeniu 99,99%.

Korzystnie w etapie kontaktowania rozgniecionych nasion selera z rozpuszczalnikiem organicznym miesza się rozgniecione nasiona selera z rozpuszczalnikiem organicznym w warunkach powolnego mieszania, aż do całkowitego wyekstrahowania ekstrahowalnych składników. Następnie etap oddzielania nierozpuszczalnego materiału roślinnego z mieszaniny zawierającej nierozpuszczalny materiał roślinny korzystnie prowadzi się przez filtrację. Na ogół stosuje się filtr o wielkości porów w zakresie pomiędzy około 0,2 do 10 mikrometrów.

Etap usuwania rozpuszczalnika organicznego prowadzi się do utraty 50% wagi ekstraktu, otrzymując nielotną pozostałość zawierającą butyloftalid, sedanenolid i sedanolid, którą dalej zatęża się do koncentratu o składzie przedstawionym na fig. 2 w proporcji sedanolid:butyloftalid:sedanenolid:czwarty składnik 1:15:41:11 odpowiednio.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się skuteczny przeciwbólowy środek leczniczy, z którego sporządza się kompozycje. Środek ten zwykle łączony jest z wypełniaczem lub nośnikiem w postaci stałej lub ciekłej, w zależności od pożądanej postaci leku. W przypadku postaci stałej korzystnym wypełniaczemjest fosforan wapnia dodawany w ilości 5 - 95% wagowo. Możliwe są również inne wypełniacze.

Zastosowanie takiego środka terapeutycznego zapewnia następujące korzyści co wynika z poniższej części eksperymentalnej:

(a) określona reakcja terapeutyczna lub odpowiedź na dawkę mogą być obliczone dla każdego pacjenta;

(b) stężenia każdego indywidualnego związku sedanolidu, sedanenolidu i butyloftalidu w płynach ciała takich jak krew można monitorować dla wskazanego powyżej celu;

(c) środek terapeutyczny według wynalazku jest bardzo skuteczny; i (d) po podaniu pacjentowi nie występują żadne niepożądane działania uboczne.

W sposobie według wynalazku jako materiał wyjściowy stosuje się nasiona selera. Odpowiednie odmiany nasion selera obejmują odmiany francuską, chińską i indyjską, przy czym korzystna jest indyjska odmiana selera.

Nasiona selera korzystnie rozdrabnia się na proszek. Można to osiągnąć dowolnym ze znanych sposobów. Dla stosunkowo małej masy nasion selera odpowiedni do miażdżenia jest moździerz i tłuczek.

Alternatywnie materiał roślinny może być zmiażdżony lub zmielony w młynie kulowym, młynie talerzowym lub innych odpowiednich środkach rozdrabniania materiału roślinnego. Początkowo nasiona selera, które mogą mieć przeciętne wymiary 1,5 x 1,55 mm i grubość 0,5 mm można sproszkować do otrzymania miałko rozdrobnionych cząsteczek o przeciętnej średnicy 0,1 - 0,2 mm.

Po rozdrobnieniu, rozdrobnione nasiona mogą być zawieszone w odpowiednim rozpuszczalniku dobranym z grupy zawierającej alkohol, aceton, chlorek metylenu, benzen, chloroform, glikole łącznie z glikolem propylenowym, eterem i odpowiednimi olejami organicznymi. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest alkohol. Korzystnym alkoholem jest etanol o stężeniu 95 - 98% (obj./obj.). Korzystny stosunek nasion do etanolu wynosi 1 kg nasion na 16 litrów etanolu, ale stosunek może dochodzić do 1 kg nasiona na 5 litrów etanolu.

Jednak zgodnie z wynalazkiem, mimo, że możliwe jest stosowanie alkoholu o stężeniu 95 - 98%, bardziej skuteczne w sposobie według wynalazkujest użycie alkoholu absolutnego lub alkoholu redestylowanego w stężeniu 95 - 98%. Korzystne stężenie alkoholu wynosi 99,99%.

Zawiesinę można poddać powolnemu mieszaniu dopóty, aż składniki ulegające ekstrakcji w nasionach selera zostaną w pełni wyekstrahowane wybranym rozpuszczalnikiem. Temperatura ekstrakcji może być różna, ale korzystnajest temperatura pokojowa. Można stosować wyższe

176 595 temperatury ekstrakcji. Ekstrakcja może zachodzić w układzie zamkniętym takim jak zbiorniki o różnych pojemnościach. Czas ekstrakcji może być różny w zależności od stanu nasion selera, ale korzystny czas może dochodzić do ośmiu dni.

Następnie usuwa się rozdrobniony materiał roślinny. Korzystnie rozdrobniony materiał roślinny usuwa się przez filtrację i/lub sedymentację, chociaż można również stosować odwirowanie. Dogodnie, ekstrakt przesącza się na filtrach o średnicy porów w zakresie od 0,2 do 10 mikrometrów, korzystniej 4-5 mikrometrów. Można stosować dwa lub więcej filtrów w szeregu. Proces filtrowania można wspomóc przez zastosowanie zwiększonego ciśnienia lub przez zastosowanie próżni.

Ekstrakt, z którego usunięto rozdrobniony materiał roślinny może następnie być zatężony dla usunięcia rozpuszczalnika lub ewentualnej wody, z pozostawieniem nielotnej pozostałości. Rozpuszczalnik może być oddestylowany z ekstraktu za pomocą ciepła, próżni i/lub ciśnienia. Gdy rozpuszczalnikiem jest etanol, temperatura destylacji może być różna, ale korzystnie wynosi 50 - 60°C.

W korzystnym wykonaniu, początkowy ekstrakt można sporządzić jako ekstrakt alkoholowy w proporcji 1 do 10 (tj. 1 kg ekstraktu alkoholowego sporządza się z 10 kg nasion).

Ekstrakt alkoholowy dalej zatęża się pod próżnią tak, że ma miejsce 50% utrata wagi na skutek usunięcia etanolu i wody z otrzymanej lepkiej cieczy lub koncentratu. Dogodnie z 10 kg nasion uzyskuje -się. 0,5 kg koncentratu. Proporcja ta na ogół wynosi 1 do 20.

Warunki destylacji próżniowej są dobrze znane. Zwykle ciśnienie obniża się do 0,1 - 40 hPa. Wielkość ciśnienia warunkuje wysokość temperatury i do prowadzącego proces należy ustalenie właściwej temperatury, przy uwzględnieniu możliwości aparaturowych i wrażliwości destylowanego materiału.

Przyjmuje się, że butyloftalid, sedanonolid i sedanolid (oba w cis i trans postaciach znane jako olejki eteryczne, które głównie pochodzą od roślin) imitują reakcję fizjologiczną istotnych kwasów tłuszczowych i ich analogów prostaglandynowych. Takie kwasy tłuszczowe zawierają szereg n-6 pochodzący.od kwasu linolowego i szereg n-3 pochodzący od kwasu α-linolenowego jak omówiono w opracowaniu Horrobina i Manku str. 22 - 24 pod tytułem “Clinical Biochemistry ofEEA” zamieszczonym- w Essential Fatty Acids Pathophysiology and Roles in Clinical Medicine (36).

Gdy środek leczniczy według wynalazku podaje się pacjentom cierpiącym na dolegliwości zapalne drogą doustną lub drogą iniekcji wyżej wymienionych związków, powoduje się podwyższenie takich samych lub podobnych kwasów tłuszczowych we krwi uzyskując obniżenie urazowego bólu. Istotne kwasy tłuszczowe związane sąz regulowaniem funkcji całego organizmu.

Środek leczniczy według wynalazku korzystnie może być wprowadzony na rynek w postaci kompozycj i farmaceutycznej dogodnie w postaci sproszkowanej, która może być suszona pod próżnią i może zawierać fosforan dwuwapniowy lub inne odpowiednie wypełniacze.

Odpowiednie kompozycje środka leczniczego z wypełniaczem mogązawierać 5-95% wagowo wypełniacza. Korzystnie, wypełniacz włączany jest do kompozycji w ilości co najmniej 50% wagowo w przeliczeniu na całą kompozycję a najkorzystniej w ilości co najmniej 75% wagowo.

Jako inne wypełniacze, które mogą być stosowane w połączeniu ze środkiem leczniczym według wynalazku, można wymienić krzemionkę, dekstrany, glukozę lub inne odpowiednie węglowodany. Jednak korzystny jest fosforan dwuwapniowy.

Właściwości koncentratu ekstraktu z nasion selera otrzymanego sposobem według wynalazku oznaczano jak przedstawiono poniżej.

Spektrofotometria ekstraktu etanolowego

Olejki eteryczne są rozpuszczalne w alkoholu i absorbująUV wrejonie 190 - 214 nm (37). Zatem dla wykazania obecności olejków eterycznych w ekstrakcie alkoholowym przeprowadza się spektrofotometrię UV. Dane uzyskane w poniższym przedstawionym przykładzie I pokazują że maksymalna absorpcja koncentratu ekstraktu w 80% alkoholu (np. etanolu) wynosi 200 nm w rozcieńczeniu 1:25 000.

176 595

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) koncentratu ekstraktu etanolowego

Bazując na metodologii HPLC opisanej w Applications of HPLC in Biochemistry przez Fallona A, Bootha R F G i Bella L D, str. 193 - 196 (37), w przykładzie II wykazano obecność trzech (3) głównych wartości szczytowych olejków eterycznych w koncentracie i związane z nimi profile. Obecne są wartości szczytowe A, B i C, a w przykładzie III opisano warunki preparatywnej HPLC w celu wyodrębniania i oczyszczania olejków o wartościach szczytowych A, B i C. Po wyodrębnieniu czystych związków można oznaczyć wagę a stąd stężenie tych olejków eterycznych w ekstrakcie etanolowym i można oznaczyć koncentrat.

Spektrofotometria olejków eterycznych (A, B i C)

Opisana w przykładzie IV spektrofotometria czystych olejków eterycznych (A, B i C) w 80% etanolu wykazała, że nie było innych pików absorpcji w rejonie widzialnym a jedynie charakterystyczny profil U.V. taki jak przedstawiony w przykładzie I. To znaczy, wtej czystej postaci (przykład IV), stwierdzono pik absorpcji przy 280 nm i maksymalną absorpcję przy 191 -192 nm.

Spektrofotometria masowa magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i analiza w podczerwieni

Na podstawie wykonanej w poniższym przykładzie V spektrofotometrii masowej (MS), magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i analizy w podczerwieni (IR) zidentyfikowano te trzy piki kwasów tłuszczowych/olejków jako n-butyloftalid, sedanenolid i sedanolid.

Ekstrakt

Przeprowadzono próby pilotażowe na podstawie których oznaczono, że do badań biomedycznych ulgi od bólu reumatycznego może być stosowany 80% roztwór etanolowy, zawierający 34 mg suchej masy/ml koncentratu ekstraktu etanolowego.

Profil HPLC 34 mg/ml koncentratu ekstraktu w etanolu przedstawiono w poniższym przykładzie VI. Stosunek pików A, B i C względem siebie może być obliczony z wysokości tych pików'.

Tak więc B/A = 9,50 C/A = 26,25 C/B = 2,76

Stąd ze stosunków B/A i C/A można obliczyć stężenia tych plików w przeliczeniu na całkowitą ilość ciał stałych w koncentracie i w rozcieńczonym ekstrakcie (34 mg/ml).

Zatem w warunkach rozcieńczonego ekstraktu w etanolu 34 mg/ml:

1:9,5:26,25

A = (1:36,75) x 34 = 1,008 mg

B = (9,5:36,75) x 34 = 8,789 mg

C = (26,25:36,75) x 34 = 24,286 mg/34,083 mg

W przykładzie III, ze znanego stężenia piku C (piki A, B i C sąpodobne) obliczone stężenia kwasów tłuszczowych/olejów A, B i C i obszaru D za pomocą wysokości pików pokazanych w przykładzie VI.

Tak więc A = 0,5 mg/ml B = 7,5 mg/ml C = 20,5 mg/ml

28,5 mg/ml

Obszar “D” musi zatem wynosić 34 - 28,5 mg = 5,5 mg/ml

A zatem stosunek A, B, C, D = 1:15:41:11 Kwasy tłuszczowe w osoczu

Ponieważ wiele kwasów tłuszczowych naturalnie występuje w krwi ludzkiej, pobrano próbki krwi przed i po spożyciu 80% nalewki etanolowej zawierającej 34 mg/ml koncentratu ekstraktu lub w postaci kapsułki zawierającej 68 mg koncentratu ekstraktu. Wyniki były podobne, w obu przypadkach poziomy we krwi tych trzech (3) szczególnych kwasów tłuszczowych/olejków i innych kwasów tłuszczowych były podniesione, a następnie zanikły w ciągu ponad 3 godzin do

176 595 poziomów mniejszych niż w czasie zero tj. zanim podano ekstrakt. Ponadto osocze krwi współ-chromatografowane z czystymi kwasami tłuszczowymi/olejami A, B i C wykazały identyczność pomiędzy kwasami tłuszczowymi/olejami we krwi i w ekstraktach (przykład VII).

Biologiczne badania pilotażowe

Badania pilotażowe prowadzono z 15 ochotnikami w wieku 33 - 83 lat z medycznie zdiagnozowanym bólem reumatycznym trwającym od 10 ± 8,5 lat, o charakterze ciągłym lub z przerwami, stosując w badaniach kwestionariusz ze skalą bólu według McGilla. Ochotnicy byli oceniani przez cztery następujące po sobie 3 tygodniowe okresy, po których przerwano podawanie koncentratu ekstraktu i pozwolono powrócić do badań z ich własnej woli. W 12 tygodniu, ochotnicy wykazali statystyczne zmniejszenie zwykle odczuwanego bólu, nazywanego w dalszej części opisu “zwykłym” bólem (t = 4,2 p <0,001) i aktualnie, to znaczy w danej chwili, odczuwanego bólu nazywanego w dalszej części opisu “aktualnym” bólem (t = 5,23, p < 0,001). Zmniejszenie bólu było zależne od czasu-dawki (r = -0,90,0,001 <p <0,01). Również zwykły ból i aktualny ból były skorelowane odwrotnie proporcjonalnie (r = -0,90,0,C^01 <p <0,01). Podobnie, miało miejsce statystycznie znaczące zmniejszenie liczby obszarów ciała zwykle i aktualnie doświadczających ból (p< 0,001) (nazywanych skrótowo “zwykłym” i “aktualnym” obszarem ciała) co było skorelowane ze zmniejszeniem “zwykłego” bólu (0,001 <p<0,01) i “aktualnego” bólu (0,02 <p <0,05). Po ponownym przystąpieniu do badań przeciętny poziom bólu wynosił 70% pierwotnego poziomu bólu. Opóźnienie czasowe przy ponownym przystąpieniu do badań wynosiło 2-57 dni. Obniżenie zwykłego bólu, aktualnego bólu, obszarów ciała zwykle i aktualnie doświadczających ból ustalono według tego samego wzoru jak w pierwszej części badań. Standardowa biochemia krwi i hematologia były normalne.

Reakcja na dawką

W oparciu o badania pilotażowe ulga w bólu od zapalenia stawów i bólu reumatycznego, z uprzednio zsumowanych korelacji i z przykładu III tj. aktualnego bólu została skorelowana ze zwykłym bólem i obszarami ciała doświadczającymi ból przez ponad 12 tygodni. Wówczas ilość ekstraktu spożyta w 3,6 i 12 tygodniu mogła być wykreślona w funkcj i zmniej szenia aktualnego bólu (fig. 33). Fig. 34 przedstawia ekstrapolację wykresu w odniesieniu do ekstraktu, ile powinno być skonsumowane do osiągnięcia zerowego poziomu bólu.

I tak: ekstrakt 34 mg/ml w 80% etanolu, 2 ml/dziennie = 68 mg ekstraktu/dzień = 1428 mg/3 tygodnie = 2856 mg/6 tygodni = 5712 mg/12 tygodni

Ekstrapolacja dała 11400 mg do osiągnięcia zero bólu.

1. W ciągu 12 tygodni dawka ta wynosiła 958,33 mg/tydzień lub 136 mg/dzień.

2. Do osiągnięcia ulgi bez bólu w ciągu 1 tygodnia dawka ta wyniosłaby 958,33 x 12 = 11500 mg/tydzień lub 1642,85 mg/dzień lub 841,42 mg/dwa razy dziennie

16-42,85 mg koncentratu ekstraktu nasion selera w proporcji 1:20 jest uważane za maksymalną dawkę dzienną.

W niniej szym badaniu stosowana była minimalna dawka, która wynosiła 68 mg/dzień koncentratu ekstraktu nasion selera w proporcji 1:20.

Stosunek pików A, B i C pochodzi z oznaczenia wyżej wymienionego preparatu ekstraktu i przykładu VI. Ze stężenia tych pików w 80% roztworze etanolowym obliczono ekstrakt do badań 34 mg/ml. Takie same obliczenia można przeprowadzić dla maksymalnej pojedynczej dawki 821,42 mg.

A = 22,35 mg B = 212,34 mg C = 586,73 mg

821,42 mg

176 595

Podobnie jak piki A, B i C z przykładu VI można oznaczyć czyste związki i obszar D. Stąd można obliczyć stężenie kwasów tłuszczowych/olejów A, B, C i obszar D.

Tak więc, A = 12,2 mg/ml B = 181,2 mg/ml C = 495,3 mg/ml

788,6 mg/ml obszar D wynosi 821,42 - 788,6 = 32,82 mg/ml

Przykłady

Przykład I.

Spektrofotometria U. V. i widzialna koncentratu ekstraktu w etanolu Metoda oznaczania

Pomiar zakresu długości fali 900-185 imi

Sposób pomiaru (ABS)

Skala fotometryczna AB3S-O-1)

Czas odpowiedzi 1 sek

Szerokość szczeliny 2nm

Rozszerzenie skali długości fali 20 nm/cm

Szybkość przeglądu 20 nm (1) Komplet komórek absorpcji wypełnionych rozpuszczalnikiem po stronie próbki i stronie odniesienia (stosowano komórki kwarcu) (2) Ustalone warunki pomiaru były następujące:

Startowa długość fali *?(^0 - > do 1

Sposób pomiaru (AB S - > stłumienia)

Czas odpowiedzi 1 - > <^<^j^<^vi^^<^zi

Szerokość szczeliny 2 - > ^i^^c^ź^^ii^y

Rozszerzenie skali długości fali 20 - > foimańi karty

Szybkość przeglądu 60 - > i^^y^ł^ł^c^i^c- przeglądu

Sposób rej estracj i rej estracj a - > wyłączeme

Komplet SEQ dla otrzymania widma bez korekty tła

Źródło światła Wybrana aampa - > auoo

Skala fotometryczna 0 - > skaaa - > 100 - >skala (0 - > skala - > 1 - > skala)

Korygująca długość fali 900 - > korekta tła - > 185 - > korekta tła włączenie (X_t - λ₂) mn zaświecenie lampy (3) Naciśnięcie przycisku SCAN dla rozpoczęcia korekty tła.

Przy UNDER CORR zapalenie lampy. Korektę tła przeprowadza się przy długości fali w zakresie od 900 do 185 nm.

Z otrzymanego diagramu spektrofotometrii widzialnej i UV pokazanego na fig. 1 widać, że ekstrakt z nasion selera według wynalazku ma maksymalną absorpcję przy 200 nm w rozcieńczeniu 1 do 25.000.

Przykład II.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa koncentratu ekstraktu w etanolu ((analityczna)

HPLC ekstraktu w etanolu prowadzono stosując pojedynczą pompę i kolumnę analityczną C₁₈. Jako eluent stosowano mieszaninę 48% acetonitrylu i 52% wody, pH 7,0, szybkość przepływu 0,5 ml/min, szybkość karty 5 mm/min, absorpcja 203 nm i skala 0,01 pełne odchylenie.

Figura 2 przedstawia chromatogram 1 μΐ ekstraktu w etanolu w rozcieńczeniu 1 do 10. Przedmiotem zainteresowania są piki olejku eterycznego A, B i C.

Dołączone są również fig. 3 - 5 przedstawiają/s zakresy absorpcji olejków eterycznych A, B i C.

176 595

Figura 3 przedstawia chromatogram ekstraktu w etanolu w rozcieńczeniu 1 do 200 pokazując utratę piku A przy 252 nm i zmniejszenie wielkości piku B.

Figura 4 przedstawia chromatogram ekstraktu w etanolu w rozcieńczeniu 1 do 50 pokazując utratę piku A i zmniejszenie piku B i C przy 280 nm.

Figura 5 przedstawia chromatogram ekstraktu w etanolu w rozcieńczeniu 1 do 50 pokazując utratę pików A i B i prawie całkowitą utratę piku C przy 340 nm.

Pokazuje to, że piki ekstraktu w tym profilu absorpcji UV (przykład II) są związane z olejkami eterycznymi a nie zjakimikolwiek zanieczyszczeniami w ekstrakcie etanolowym. Obszar D jak pokazały fig. 3-5 odpowiada tej części śladu absorpcji, który nie obejmuje pików A, B i C.

Przykład III.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (preparatywna)

Ekstrakt rozcieńczono w stosunku 1 do 10 mieszaniną 48% acetonitrylu i 52% wody, pH 7,0. Otrzymany czarny osad wyekstrahowano następnie heksanem 1 do 20. Heksan usunięto pod próżnią w wyparce obrotowej. Dało to zielony olej, który następnie naniesiono na kolumnę preparat>ywiąC₁₈ HPLC stosując jako bufor 48% acetonitrylu i 52% wody.

Szybkość przepływu 5 m//min.

Skala 0,4 pdne odchylenie

Szybkość karty 5 nm//mm.

Absorpcja 203 i/

Pierwsze wyodrębnienie 3 pików A, B, C fig. 6 wykazuje, że piki B i C wymagają ponownej chromatografii. Tak więc, fig. 7 pokazuje ponownie chromatografowany pik C a fig. 8 pokazuje ponownie chromatografowany pik B. Te trzy piki (ABC) oczyszczono. Roztwory z pików A, B i C następnie zatężono pod obniżonym ciśnieniem w wyparce obrotowej do sucha i zważono i ponownie rozpuszczono w 80% etanolu do analitycznej HPLC jak uprzednio opisana w przykładzie II.

Przykład IV.

Spektrofotometria kwasów tłuszczowych pików A, B i C.

Spektrofotometrię w obu rejonach widzialnym i UV prowadzono jak uprzednio opisano w przykładzie I.

Nie stwierdzono absorpcji w widzialnym rejonie widma, W rejonie UV pik A miał maksymum absorpcji przy 190nm,pikB 191 nmipikC 192 nm. Zostało to pokazane na fig. 9-11.

Przykład V.

Spektrometria masowa, magnetyczny rezonans jądrowy i spektrometria w podczerwieni

Przykład ten obejmuje dalszą charakterystykę molekularną przedstawioną na fig. 12 -17 uprzednio opisanych pików A, B i C. Bardziej szczegółowo fig. 12-17 przedstawiaj ją jednoczesną charakterystykę próbki piku A, piku B i piku C za pomocą spektrometrii masowej (MS), magnetycznego rezonansujądrowego (NMR) i spektrometrii w podczerwieni (IS). Fig. 12 przedstawia analizę MS piku A. Wyraźnie widoczna jest struktura butyloftalidu. Fig. 13 przedstawia NMR tego samego piku A, potwierdzaj ąc wnioski wyciągnięte z MS i pokazuj e obecność w przybliżeniu 70% sedanenolidu i 30% n-butyloftalidu.

Figura 14 przedstawia analizę MS piku B. I znowu wyraźnie widoczna jest struktura butyloftalidu. Jest to potwierdzone na fig. 1, przez NMR tego samego piku B, który pokazuje, że obecny jest butyloftalid. Fig. 16 przedstawia analizę MS piku C. Pokazuje ona, że obecny jest sedanolid. Dalsza analiza strukturalna za pomocą spektroskopii w podczerwieni przedstawiona na fig. 17 potwierdza wnioski pochodzące z MS.

Przykład VI.

Analityczna HPLC koncentratu ekstraktu alkoholowego rozcieńczonego 80% etanolem do stężenia ciał stałych 34 mg/ml

Analityczną HPLC przeprowadzono tak jak opisano w przykładzie II.

Figury 18-21 pokazują liniowązależność wysokości pików od objętości stosowanej próbki. Próbka stanowiła ekstrakt w etanolu rozcieńczony do 34 mg/ml, który dalej rozcieńczono 1 do 10 dla analizy HPLC.

176 595

Tak więc, na fig. 18 - 20 pik 1 odpowiada próbce 2 μΐ, pik 2 odpowiada próbce 1 μΐ, pik 3 odpowiada próbce 4 pl, pik 4 odpowiada próbce 3 μΐ a pik 5 odpowiada próbce 5 μ!

Na podstawie tych danych można skonstruować krzywą, kalibracyjną jak pokazana na fig. 21 i oznaczyć stężenia odpowiednich składników.

Przykład VII.

Poziomy kwasów tłuszczowych w osoczu krwi przed i po spożyciu ekstraktu

Analityczną HPLC przeprowadzono tak jak opisano w przykładzie II.

Próbki krwi pobrano w czasie zero a następnie w różnych przedziałach czasowych po spożyciu ekstraktu. Próbki krwi 5,0 ml pobierano przez nakłucie żyły do probówek powleczonych EDTA i wirowano do otrzymania osocza.

Osocze następnie rozcieńczano w stosunku 1:2 80% etanolem dla wytrącenia białek i pozostawienia kwasów tłuszczowych w roztworze. 0,1 ml porcje osocza uzupełniono do 0,5 ml 80% etanolem. Dodano 0,5 ml 48% acetonitrylu otrzymując współczynnik całkowitego rozcieńczenia dla osocza 20. Wówczas pobrano 1,0 (j do analizy.

Figura 22. Badanie w czasie zero wykazało obecność trzech naturalnie występujących pików w osoczu (A, B i C). Po przyjęciu ekstraktu w etanolu (340 mg) pik C znalazł się poza skalą, stąd zastosowano 20 krotne rozcieńczenie.

Figura 23. Osobnik 1; w czasie zero, 20 krotne rozcieńczenie osocza. Pik C pozostał, ale piki A i B były niewykrywalne po tym stężeniu.

Figura 24. Osobnik 1; 20 minut po spożyciu ekstraktu wykazał 108% zwiększenie piku C.

Figura 25. Osobnik 1; 70 minut po spożyciu ekstraktu wykazał 33% redukcję piku C.

Figura 26. Osobnik 1; 3 godziny po spożyciu ekstraktu wykazał nieobecność piku C.

Figura 27. Osobnik 2; w czasie zero i 35 minut po spożyciu 136 mg koncentratu ekstraktu. Pik A zwiększył się o 50%, pik B zwiększył się o 60% a pik C zwiększył się o 62%.

Figura 28. Osobnik 3; w czasie zero i 1,0 godziny po spożyciu 136 mg ekstraktu. Pik A zwiększył się o 50%, pik B zwiększył się o 68% i pik C zwiększył się o 85%.

Figura 29. Osobnik 4; w czasie zero i 85 minut po spożyciu ekstraktu. Tylko piki B i C są obecne i zostały zredukowane o 50%.

Figura 30. Osobnik 5; w czasie zero i 3 godziny po spożyciu ekstraktu. Tylko piki B i C są obecne i zostały zredukowane o 40%.

Figura 31 przedstawia HPLC śladów osocza po lewej stronie i ekstraktu po prawej stronie wykazujące obecność pików A, B, C i obszaru D.

Figura 32 przedstawia HPLC śladów mieszaniny ekstraktu i osocza, które były razem chromatografowane wykazując obecność pików A, B i C i obszaru D.

Wyniki te pokazują, że chociaż w czasie zero stężenia pików A, B i C różniły się dla różnych osobników, wszystkie pokrywały się ze wzorem - wzrost po spożyciu ekstraktu i po 3 godzinach obniżenie do poniżej wartości odpowiadającej czasowi zero.

Piki A, B i C osocza sąpodobne, jeśli nie identyczne z pikami ekstraktu w znaczeniu czasu retencji na kolumnie C₁₈. Również czyste związki w ekstrakcie i osoczu fig. 31, współchromatografowane jak pokazano na fig. 32.

Przykład VIII.

Pilotażowe badania biomedyczne w uldze bólu przy bólu reumatycznym

1. Rozważania statystyczne

1.1. Choroba reumatyczna

Reumatyzm reprezentuje ponad 100 typów chorób reumatycznych i występujące objawy mogą się manifestować same i/lub w powiązaniu z innymi chorobami. Ta złożoność może utrudniać klasyfikację choroby reumatycznej, jej leczenie i diagnozę. Zatem diagnozę uważano za zmienną i była ona kontrolowana/brana pod uwagę przez ochotników akceptujących przystąpienie do badań diagnozowanych przez poszczególnych lekarzy specj alistyczny ch oraz praktykujących lekarzy ogólnych, a także przez samo-diagnozowanie, gdy diagnozy były oczywiste.

176 595

1.2. Ból

Głównym wspólnym czynnikiem w chorobie reumatycznej jest ból z zaatakowanego obszaru ciała. Stosowano zatem standardowy kwestionariusz skali bólu McGilla opracowany dla oceny klinicznej, ilościowej miary bólu. Indeks stopnia bólu można oceniać statystycznie oraz dla indywidualnych porównań. Poza tym, kwestionariusz został skonstruowany tal, że te same pytania są zadawane w różny sposób w szeregu krzyżowych pytań sprawdzających odpowiedzi za pomocą analizy statystycznej.

1.3. Kontrola placebo

Ból jest zmienny co należy rozumieć, że może występować z przerwami lub może być ciągły. Mierzono zatem poprzez interview ocenę “zwykłego” bólu i obszarów ciała zwykle doświadczających ból jak również “aktualny” ból i obszary ciała aktualnie doświadczające ból. Zatem, jeśli efekt placebo był nieobecny lub ograniczony, wówczas zwykły ból i obszary ciała zwykle doświadczające ból powinny znacznie zmniejszać się z czasem i być skorelowane. Oznacza to, że placebo nie działa retrospektywnie. Podobnie, znaczące obniżenie zwykłego bólu z czasem powinno być skorelowane ze znaczącym zmniejszeniem aktualnego bólu. Również, znaczące zmniejszenie aktualnego bólu z czasem powinno być skorelowane ze znaczącym zmniejszeniem obszarów ciała aktualnie doświadczających ból. Ponadto, znaczące zmniejszenie obszarów ciała zwykle doświadczających ból z czasem powinno być skorelowane ze znaczącym zmniejszeniem obszarów ciała aktualnie doświadczających ból.

1.4. Kontrola

Z uwagi na zmienne omówione w punktach 1.1 i 1.3 byłoby trudne, jeśli nie niemożliwe, ustalenie kontrolnej grupy ochotników'. Można to obejść dzięki ochotnikom pełniącym funkcję swojej własnej kontroli. Osiąga się to przez ocenę na początku badania doświadczanego bólu.

1.5. Skuteczność

Skuteczność jest istotąpomiaru zachowania się produktu. Produkt może mieć skuteczność od niskiej do wysokiej. Oznacza to, że dla produktów o niskiej skuteczności, w których tylko niewielu pacjentów reaguje na leczenie, wymaganajest duża liczba osobników do przeprowadzenia badań dla określenia tych, którzy najbardziej skorzystali. Przy skutecznym produkcie, potrzebnych jest niewielu osobników do wykazania skuteczności.

1.6. Projekt badań

Rozpatrywano badania krzyżowego podawania (jedna grupa) lub podwójnego krzyżowego podawania (2 grupy), w których ochotnicy najednym etapie pobieraliby placebo, a w następnym etapie produkt aktywny. Jednakże, ponieważ nie wiadomo, czy istnieje placebo o tym samym smaku co produkt aktywny, a także czasokres i sposób działania składnika(ów) aktywnych nie jest dokładnie znany (wymywanie) nie można było ustalić punktów badania krzyżowego. Zaprojektowano zatem długotrwałe badania, w których pierwszą partię badań powtórzono, gdy poproszeni ochotnicy powrócili do badań po zaprzestaniu przyjmowania ekstraktu. Tym sposobem razem z rozważaniami statystycznymi (sekcja 3) skontrolowano działanie placebo i można było oznaczyć skuteczność.

W sumie 15 ochotników oceniano za pomocą kwestionariusza McGill. Na początku badania pobrano 5 ml próbkę krwi do analizy biochemicznej. Ochotnikom dano 3 tygodniową porcję koncentratu ekstraktu w postaci nalewki w 80% etanolu w stężeniu 34 mg/ml. Jeden (1,0 ml) 2 x dziennie przyjmowano w małej ilości wody. Pod koniec 3 tygodnia, ochotników oceniano jak opisano poprzednio i postępowanie powtórzono przez następne 3 tygodnie (razem 6 tygodni). Następnie ochotnikom podano 6 tygodniowy zapas koncentratu ekstraktu i przeprowadzono następną ocenę pod koniec tego 6 tygodnia (razem 12 tygodni). Wówczas ochotnicy zaprzestali przyjmowanie ekstraktu w etanolu i jeśli życzyli sobie powrócić do badań, zgłaszali się i powtarzali pierwszą część badań (2x3 tygodnie).

2. Wyniki z 12 tygodni (0, 3, 6, 12 tygodni)

Badano grupę złożonąz 15 ochotników, która w większości przypadków (93%) była medycznie zdiagnozowanajako mająca bóle artretyczne lub reumatyczne łącznie z zapaleniem

176 595 stawów i kości, osteoporozą i dna. Ból występował przez około 10 lat jako ból przerywany lub ciągły i większość ochotników próbowała różnych metod dla uzyskania ulgi w bólu. Ból oraz brak mobilności stawów przeciwdziałały wypełnianiu obowiązków domowych, różnym hobby i aktywności zawodowej.

Ogólna percepcja bólu u ochotników była podobna do doświadczanego bólu reumatycznego/artretycznego. Wskazywało to, że ochotnicy ci doświadczali ból przez długo okres czasu.

Przeciętny wiek ochotników umieszczał ich w wyższej grupie występowania zaburzeń artretyczno reumatycznych. Aktualne leczenie, o ile stosowano, dla każdego z ochotników przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

1. Bez lekarstw	9
2. Witaminy	1
3. Środki przeciwbólowe	3 (BP lub Panadol)
4. Hormony	1 (Estrogen)
5. Środki przeciwzapalne	1 (Inderel)

Tabela 2

Czas (w tygodniach)
Intensywność aktualnego bólu	0	3	6	12	Σ
EX = Rozdzierający	0	0	0	0	0
HOR = Straszny	1	1	0	1	3
DIST = Niepokojący	1	2	1	1	5
DC = Dający uczucie niewygody	7	2	6	1	16
M = Łagodny	4	8	3	8	23

r = -0,972 p> 0,001 <0,01

Interpretacja

Korelacja pomiędzy aktualną intensywnością bólu i całkowitą sumą (Σ) ochotników przez 12 tygodni jak przedstawiono w tabeli 2 i na fig. 33 jest statystycznie znacząca. Szansa taka jest mniejsza niż 1na 100 przypadków. Pokazuje to, że intensywność aktualnego bólu u ochotników ma tendencję zmniejszającą się w ciągu 12 tygodni przy zastosowaniu koncentratu ekstraktu w etanolu (skuteczność zależna od czasu).

Analiza statystycznajest spłaszczona w stosunku do skuteczności ekstraktu w etanolu, ponieważ ochotnicy bez bólu nie byli brani pod uwagę.

Tabela 3

Tygodnie	Σ Ból Zwykły	X2	P	Σ Ból Aktualny	X2	P
0	496,4			298,7
3	354,2	40,7	<0,001	212,8	24,7	<0,001
6	252,2	29,4	<0,001	189,6	2,5	>0,1
12	261,5	0,34	>0,5	125	33,4	<0,001

r = 0,917 p>0,02<0,05

176 595

Interpretacja

Jak pokazują dane przedstawione na fig. 34 i tabeli 3 nastąpił znaczący spadek wskaźnika całkowitego zwykłego bólu po 3 i 6 tygodniach w stosunku do siebie i tygodnia 0, podczas gdy w 12 tygodniu nie było następnego zmniejszenia. Aktualny ból również wykazał znaczne zmniejszenie w 3 tygodniu i był podobny do bólu po 6 tygodniach z dalszym znaczącym zmniejszeniem w 12 tygodniu w stosunku do tygodnia 6. Prawdopodobieństwo, że zdarzyło się to przez przypadek jest mniejsza niż 1 do 1000 przypadków.

Istnieje również znacząca korelacja pomiędzy obniżeniem wskaźnika bólu zwykłego i aktualnego. Zatem, w miarę jak zwykły ból zmniejsza się po 12 tygodniach, to samo dzieje się z aktualnym bólem. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia jest mniejsze niż 5 do 100 przypadków.

Interpretacja

Wskaźnik bólu dla każdego przypadku w 3, 6 i 12 tygodniu został przekształcony przez wyrażenie go jako stosunku względnego bólu na początku badania, w tygodniu 0, jak przedstawiono w tabeli 4. Zatem każdy ochotnik pełnił funkcję swojej własnej kontroli:

Indeks bólu w 3,6 lub 12 tygodniu

Wskaźnik bólu w tygodniu 0

Tabela 4

Skala bólu McGilla
	Kontrola bólu zwykłego	1± 0,33	Kontrola bólu aktualnego	1±0,36
Przypadek	3 tygodnie	6 tygodni	12 tygodni	3 tygodnie	6 tygodni	12 tygodni
1	0,38	0,60	0,68	0,47	0,10	0,56
2	2,27	0,57	0	2,27	0,57	0
3	0,53	0,15	0,10	0,11	0	0
4	0	0,26	0,46	0	0,26	0,46
5	0,30	0,08	0	0,10	0	0
6	0,60	0,40	0,28	0,14	0,40	0
7	0,87	0,36	0,62	1,3	0,57	-
8	1,00	0,79	0,60	0	0,15	0
9	0,77	0,81	0,57	0,57	0,82	0,18
10	0,82	0,78	0,81	0,84	0,82	0,86
11	0,42	0,44	0,20	0,62	0	0,10
12	1,02	0,86	0,89	1,0	0,91	0,90
13	1,10	0,94	0,82	1,1	1,10	0,85
14	0,95	0,78	0,79	0,36	0,80	0,52
15	0,28	0,19	0,33	0	0,06	0
X*	0,76	0,53	0,48	0,59	0,43	0,32
±sd	±0,51	±0,28	±0,30	±0,61	±0,37	±0,34
x	0,53		0,55	0,40	0,50	0,55
±sd	±0,28		±0,25	±0,25	±0,30	±0,29

X ± sd = wszystkie obserwacje ** .

X ± sd = wszystkie obserwacje minus obserwacje > 1 i zero

176 595

Tabela 5

Wskaźnik zwykłego bólu	3 tygodnie	6 tygodni	12 tygodni
Y	P	't	P	't	P
X±sd*	1,53	>0,05 <0,1	4,20	<0,001	4,52	<0,001
X±sd**	3,82	<0,001	-	-	4,10	<0,001
Wskaźnik
obecnego bólu
X±sd’	2,24	>0,02 <0,5	4,28	<0,001	5,23	<0,001
X±sd*’	3,46	>0,001 <0,01	3,85	<0,01	3,21	>0,001 <0,01

Interpretacja

Interpretacja danych przedstawionych w tabeli 5, będzie opisana poniżej.

Zwykły ból

Analiza parametryczna za pomocątestu Y pokazuj e, że w tygodniu 3 jest 4 niereaguj ących i średnia wskaźnika bólu i nie różni się znacząco od bólu wtygodniu 0. W tygodniu 6 niereagujący reagują i tu nie ma znaczącego zmniejszenia średniego wskaźnika bólu, który jest podobny do bólu po 12 tygodniach. Przypadkowo zdarzenie takie mogłoby mieć miejsce w mniej niż 1 na 1000 przypadków.

Jeśli nie weźmie się pod uwagę niereagujących a reagujący bez bólu przez 3 tygodnie i reagujący bez bólu przez 12 tygodni nie są wzięci pod uwagę, to oznacza znaczące zmniejszenie wskaźnika bólu szczątkowego w ciągu 3 tygodni i 12 tygodni. Przypadkowo może to mieć miej sce w mniej niż 1 na 1000 przypadków.

Ból aktualny

Wystąpiło znaczące zmniejszenie średniego wskaźnika bólu wtygodniu 3, który jest podobny do bólu w tygodniu 6 i tygodniu 12. Przypadkowo może to się zdarzyć w mniej niż 5 na 100 do mniej niż 1 na 1000 przypadków. Jeśli reagujący bez bólu w 3,6 i 12 tygodniu nie są wzięci pod uwagę, to ma miejsce znaczące zmniejszenie średniej wskaźnika bólu. Przypadkowo może to się zdarzyć w mniej niż 1 na 100 do mniej niż 1 na 1000 przypadków.

Tabela 6

Tygodnie	Zwykłe obszary ciała	Y	P	Aktualne obszary ciała	Y	P
0	3 ±1,91 n = 77			2,15 ± 1,2 n = 68
3	1,9±1,1 n = 53	4,2	<0,001	1,48 ±0,63 n = 27	3,5	<0,001
6	1,59 ± 0,81 n = 45	5,6	<0,001	1,26 ±0,64 n = 27	4,7	<0,001
12	1,7 ±0,77 n = 45	5,4	<0,001	1,27 ±0,56 n = 33	5,0	<0,001

Interpretacja

W odniesieniu do danych pokazanych na fig. 35 i tabeli 6, nastąpiło znaczące zmniejszenie średniej liczby obszarów ciała zwykle i aktualnie doświadczających ból w ciągu 3 tygodni, które było podobne do bólu w 6 i 12 tygodniu. Przypadkowo to może się zdarzyć w mniej niż 1na 1000 przypadków.

Występuje tu także znacząca współzależność pomiędzy zmniejszeniem średniej liczby obszarów ciała zwykle i aktualnie doświadczających ból przez ponad 12 tygodni. To może zdarzyć się przypadkowo w mniej niż 1 na 1000 przypadków.

176 595

Tabela 7

Tygodnie	Średnia obszarów ciała	Suma całkowita wskaźnika bólu
	Zwykła	Zwykła
0	3	496,4
3	1,9	354,2
6	1,59	252,2
12	1,7	261,5

r = 0,973 p >0,001 <0,01

Interpretacja

W odniesieniu do danych pokazanych na fig. 36 i tabeli 7, współzależność pomiędzy częściami ciała zwykle doświadczającymi ból i zwykłym wskaźnikiem bólu jest znaczna. Przypadkowo to może zdarzyć się w mniej niż 1 na 100 przypadków i pokazuje, że liczba obszarów ciała zwykle doświadczających ból zmniejsza się, a zatem zmniejsza się wskaźnik zwykłego bólu.

Tabela 8

Tygodnie	Średnia obszarów ciała	Suma całkowita wskaźnika bólu
	Obecna	Obecna
0	2,15	298,7
3	1,48	212,2
6	1,26	189,6
12	1,27	125,0

r = 0,915 p> 0,002 <0,05

Interpretacja

W odniesieniu do danych pokazanych na fig. 37 i tabeli 8, współzależność pomiędzy obszarami ciała aktualnie doświadczającymi ból a aktualnym bólemjest znacząca. Może się to zdarzyć przypadkowo w mniej niż 5 na 100 przypadków. To pokazuje, że w miarę jak liczba obszarów ciała obe/nis doświadczających ból zmniejsza się, to wskaźnik bólu obecnego też się zmniejsza.

3. Uzupełmepśe chnieych po ponownym wej śc-u do badać f>o przeowie ieczenia ekstrakkom etanolu w ciągu 12 tygodni

Całkowita liczba 7 chętnych nie przystąpiła do dalszych badań.

Trzech chętnych przerwało bez powodu, jeden chętny miał nawrot do medycznego problemu i przerwał. Dwóch chętnych nie odczuwało bólu przez 57 dni i nie wyrażało chęci do ponownego wejścia do badań. W ciągu 57 dni po przerwie leczenia ekstraktem w etanolu, ośmiu chętnych wróciło do badań.

Po przerwie leczenia koncentratem ekstraktu w etanolu w ciągu 12 tygodni, ośmiu chętnych powiadomiło prowadzącego, że wyrażająchęć do ponownego rozpoczęcia leczenia ekstraktem w etanolu. Dotychczas prowadzony kwestionariusz oceny bólu zamknięto i następny rozpoczęto od tygodnia 0. Ból obecny w pierwszym tygodniu został wyrażonyjako % pierwotnego bólu obecnego (pierwotny tydzień 0 na początku badań). Liczba dni z bólem wzrosła od chwili przerwania leczenia ekstraktem w etanolu i została zanotowana i wyrażona jako stosunek dni przed ponownym rozpoczęciem pobierania ekstraktu w etanolu. Dane te są przedstawione na fig. 38 i tabeli 9.

176 595

Tabela 9

Obecność pierwotnego obecnego bólu %	Stosunek dni rozwoju bólu/rozpoczęcia stosowania ekstraktu w etanolu
60	42/29 = 0,86
100	14/28 = 0,50
51	13/15 = 0,87
95	21/36 = 0,58
39	29/36 = 0,80
100	7/46 = 0,15

Interpretacja

Jeżeli rozwój bólu obecnego zaczyna być zbliżony rozmiarami do bólu pierwotnego, stosunek wynosi 0,5. Oznacza to, że ochotnicy tolerują ból przez taki sam czas, jaki jest potrzebny do rozwoju bólu. Niższy % bólu obecnego jest odniesiony do bólu pierwotnego w czasie rozpoczęcia badań, dalej opóźnienie czasowe w ponownym wejściu do badańjest większe niż czas do rozwoju bólu na tym poziomie.

To pokazuje, że prośba o ponowne wejście do badań nie opiera się na efekcie placebo.

Średni czas wzrostu bólu wynosi 23 ± 17,4 dni, w przedziale 9-57 dni.

Średni czas na ponowne wejście do badań wynosi 34 ± 15,5, w przedziale 9-57 dni.

Stosunek = 0,68.

Tak więc średnio, chętni będą tolerować 70% pierwotnego bólu doświadczonego przed ponownym wejściem do badań.

Liczba ochotników bez bólu pozostawia niekompletne dane dla analiz parametrycznych. Tak więc, powstały analizy nieparametryczne.

Ból po ponownym wejściu do badań.

Tabela 10

Skala bólu McGilla
	Czas (w tygodniach)
Tydzień 12	Tydzień 0	Tydzień 0 X2	Tydzień 0 P
Zwykły ból	99,3	137,5	14,7	<0,001
Aktualny ból	36,6	116,3	186,0	<0,001
Zwykłe obszary ciała	34	47	4,97	>0,02 <0,05
Aktualne obszary ciała	11	40	76,4	<0,001

Interpretacja

W odniesieniu do danych z tabeli 10, dla ośmiu ochotników, zwykły i obecny ból i obszary ciała zwykle i aktualnie doświadczające ból w 12 tygodniu przed przerwaniem leczenia ekstraktem w etanolu znacząco zmniejszyły się w stosunku do ponownego wejścia do badań (tydzień zerowy). Tak więc, nastąpił znaczący wzrost bólu i obszarów ciała doświadczających ból po przerwaniu leczenia ekstraktem w etanolu. Przypadkowo może to się zdarzyć w mniej niż 5 na 100 do mniej niż 1 na 1000 przypadków.

Uzupełnienie po ponownym wejściu do badań.

176 595

Tabela 11

Skala bólu McGilla
Ból	Tydz. 0	Tydz. 3	Tydz. 6	Tydz. 3	Tydz. 6	Tydz. 3	Tydz. 6
Zwykły	137,5	85,3	60,7	19,8	7,1	<0,001	<0,001
Obecny	116,3	39,2	25,6	51,1	4,7	<0,001	> 0,02 < 0,05
UBA	47	22	19	13,3	0,4	<0,001	0,5
PBA	40	5	13	30,6	12,8	<0,001	<0,001

UBA = całkowita liczba obszarów ciała, które zwykle doświadczają ból

PBA = całkowita liczba aktualnych obszarów ciała (obszarów ciała, które aktualnie doświadczają ból)

Interpretacja

W odniesieniu do danych zawartych w tabeli 11, występuje znaczące zmniejszenie bólu obecnego i zwykłego w 3 tygodniu i dalsze znaczące zmniejszenie w 6 tygodniu. Przypadkowo to może się zdarzyć w mniej niż 1 na 1000 przypadków.

Ma miejsce zatem znaczące zmniejszenie obszarów ciała zwykle i aktualnie doświadczających ból w 3 tygodniu. Przypadkowo to może się zdarzyć w mniej niż 1na 1000 przypadków.

Przez 6 tygodni, nie zanotowano dalszego zmniejszenia obszarów ciała zwykle doświadczających ból, podczas gdy nastąpiło zwiększenie obszarów ciała aktualnie doświadczających ból, ale cały czas znacząco mniej (p <0,001) niż podczas zerowego tygodnia.

Znaczące zmniej szenie bólu i obszarów doświadczających ból podlega temu samemu wzorowi co w pierwszej części badań. Wzrost w 6 tygodniu obszarów ciała aktualnie doświadczających ból jest ciągle znacząco mniejszy niż ból w zerowym tygodniu i wskazuje na zwalczenie bólu przez stosowanie ekstraktu w etanolu.

Tabela 12

Czas (w tygodniach/tydz.)	Zwykły ból (UP)
0	262,4
3	130,1
6	97,2
12	99,3
0	137,5
3	85,3
6	52,6

Interpretacja

W tabeli 12 i na fig. 39 pokazano graficzne przedstawienie bólu zwykłego ośmiu ochotników z pierwszej części badań (0,3,6 i 12 tygodni). Przedstawia to statystyczne analizy McGilla Pain Rating Index dla aktualnego bólu.

Tabela 13

Czas (w tygodniach/tydz.)	Aktualny ból (PP)
0	144,6
3	83,2
6	26,5
12	36,6
0	110,0
3	29,2
6	13,7

176 595

Interpretacja

Na figurze 40 i w tabeli 13 przedstawiono graficznie ból obecny dla ośmiu ochotników z pierwszej części badań (0,3,6 i 12 tygodni) i ponownie wejście do badań (0,3 i 6 tygodni). Przedstawia to statystyczne analizy McGilla Pain Rating Index dla aktualnego bólu.

Tabela 14

Czas (w tygodniach/tydz.)	Zwykłe obszary ciała (UBA)
0	109
3	31
6	24
12	34
0	47
3	20
6	16

Interpretacja

Na figurze 41 i w tabeli 14 przedstawiono graficznie obszary ciała zwykle doświadczające ból u ośmiu ochotników z pierwszej części badań (0,3,6 i 12 tygodni) i ich ponowne wejście do badań (0, 3 i 6 tygodni). Przedstawia to statystyczna analiza McGilla Pain Rating Index dla obszarów ciała zwykle doświadczających ból.

Tabela 15

Czas (w tygodniach/tydz.)	Aktualne obszary ciała (PBA)
0	48
3	24
6	7
12	11
0	40
3	6
6	13

Interpretacja

Na figurze 42 i w tabeli 15 przedstawiono graficznie obszary ciała aktualnie doświadczające ból ośmiu ochotników z pierwszej części badań (0,3,6 i 12 tygodni) i ponowne wejście do badań (0,3 i 6 tygodni). Przedstawia to statystyczna analiza McGilla Pain Rating Index dla obszarów ciała aktualnie doświadczających ból.

4. Biochemia Krwi

Dane zawarte w tabeli 16 przedstawiająanalizy biochemiczne osocza krwi, przy czym próbki krwi były pobrane od nieposzczących osobników i zebrane w fiolkach EDTA, co ograniczało zakres analiz. Tym niemniej początkowe próbki osocza mogą być porównane z próbkami pobranymi w czasie, kiedy ochotnicy przyjmowali ekstrakt w etanolu. Można wywnioskować, że ekstrakt nie oddziałowuje na funkcje nerek i wątroby.

176 595

Tabela 16

Biochemia krwi
Fosforany	W normie	Sód	W normie
Całkowite białka	W normie	Chlorek	W normie
Albumina	W normie	Wodorowęglan	W normie
Globulina	W normie	Glukoza	W normie
Cholesterol	W normie	Całkowita bilirubina	W normie
Trójglicerydy	W normie	Sprzężona bilirubina	W normie
Mocznik	W normie	Gamma GT	W normie
Keratynina	W normie	GPT	W normie
Moczany	W normie	GOT	W normie

Jeden z ochotników przy początkowej ocenie miał podwyższony poziom glukozy, gamma GT, GPT i GOT, co pozostało podwyższone w 3,6,12 i 18 tygodniu. Ochotnikowi temu zalecono wizytę u lekarza. Diagnoza wykazała cukrzycę i powrót sarkoidozy. Ta osoba nie uczestniczyła w dalszych próbkach.

U jednego z ochotników ze skazą moczanową przy początkowej ocenie wyniki wykazały podniesiony poziom mocznika, keratyniny i moczanu wskazujące na zaburzenie pracy nerek. Ale wróciły do normalnego zakresu w 3 tygodniu i pozostały w normalnym zakresie w 6 i 12 tygodniu. Ta osoba nie uczestniczyła w dalszych badaniach.

Tabela 17

Biochemia krwi
Sód	W normie	ALT (SGPT)	W normie
Potas	W normie	AST (SGOT)	W normie
Chlorek	W normie	LDH	W normie
Wodorowęglan	W normie	Wapno	W normie
Inne aniony	W normie	Przystosowanie do albumin	W normie
Glukoza	W normie	Fosforany	W normie
Mocznik	W normie	Całkowite białka	W normie
Keratynina	W normie	Albumina	W normie
Moczan	W normie	Globulina	W normie
Całkowita bilirubina	W normie	Żelazo	W normie
Sprzężona bilirubina	W normie	Cholesterol	W normie
ALK Fosf.	W normie	Trójglicerydy	W normie
Gamma GT	W normie		W normie

Interpretacja

W tabeli 17 przedstawiono badania biochemiczne i hematologiczne krwi (po 8 godzinach poszczenia) siedmiu ochotników, którzy przyjmowali ekstrakt etanolu przez 3 miesiące po zakończeniu badań.

176 595

5. Podsumowanie

Uzyskane wyniki statystycznie wykazują, że koncentrat ekstraktu w etanolu redukuje ból i obszary ciała doświadczające ból u ludzi z dolegliwościami reumatycznymi i zapaleniem reumatycznym stawów.

Chociaż zmniejszenie bólu może wystąpić u niektórych stosujących ekstrakt w etanolu podczas pierwszych 3-6 tygodni używania, to wyniki wskazują, że zmniejszenie bólu zależy od poziomu bólu i czasu stosowania koncentratu ekstraktu w etanolu. Tak więc, 12 tygodniowe stosowanie ekstraktu w etanolu daje najbardziej efektywne rezultaty. Zatem z parametrycznych analiz, można wyprowadzić co następuje.

12 tygodni stosowania
Zwykły ból	średni poziom bólu zredukowany do 52% zakres redukcji bólu 11% -100%
Zwykły ból	szczątkowy ból (brak bólu nie został wzięty pod uwagę) średni poziom zredukowany do 45% zakres redukcji bólu szczątkowego 11% - 90%
Aktualny ból	średni poziom zredukowany do 68% zakres redukcji bólu 10% - 100%
Aktualny ból	szczątkowy ból (brak bólu nie został wzięty pod uwagę) średni poziom zredukowany do 45% zakres bólu szczątkowego 10% - 90%

Ponieważ nie ma znacznej różnicy pomiędzy znacząco zredukowanymi średnimi wartościami bólu zwykłego i bólu aktualnego w 12 tygodniu, należy stwierdzić, że koncentrat ekstraktu w etanolu redukuje ból średnio o 45% - 68% w zakresie od 10% -100%. Rezultaty te także pokazują, że ekstrakt w etanolu daje trwałe zmniejszenie bólu, ponieważ w żadnym przypadku nie stwierdzono przeszywającego bólu podczas przyjmowania koncentratu ekstraktu w etanolu. Dalej jest to wykazywane jako powrót bólu po przerwaniu zażywania ekstraktu w etanolu i zmniejszenie bólu po powrocie do zażywania ekstraktu.

Ten wzór odpowiedzi i analiza korelacji pokazuje, że może być uzyskane następne zmniej szenie bólu u ochotników z bólem szczątkowym, jeżeli kontynuują oni przyjmowanie ekstraktu w etanolu po 12 tygodniach. Ekstrapolacja wskazuje, że potrzebny byłby całkowity czas od 22 do 24 tygodni.

Koncentrat ekstraktu w etanolu nie wydaje się mieć wpływu na funkcje nerek i wątroby lub ogólną biochemią krwi. Podobnie koncentrat ekstraktu w etanolu nie wywiera wpływu na parametry hematologiczne.

176 595

PRZYPISY

1. Beeson PBN, McDermott W and Wyngaarden JB. (1975). In: Cecil Textbook of Medicine. 5th Edition. Publ. W B Saunders Co., Philadelphia, London, Toronto.

2. Webb J and Nash PT. (1990). Polyarthritis - A diagnostic approach. Australian Family Physician 19 (10): 1533 - 1542.

3. Kremer JM. (1990). Severe rheumatoid arthritis: Current options in drug therapy. Geriatrics 45 (12): 43-48.

4. Van der Heijde MFM, Van’t Hof MA, Van Riel PLCM, Theunisse LAM,

Lubberts EW, Van Leeuwen MA, Van Rijswijk MH and Van de Patte LBA. (1990). Judging disease activity in clinical practice in rheumatoid arthritis: first step in the development of a disease activity score. Annals. Rheumatic Diseases 49:916-920.

5. Farge D, Liote F, Guillman R and Carpentier A. (1990). Hyperuricemia and gouty arthritis in heart transplant recipients. Amer J Med 88:553.

6. Bomaiaske JS, Williamson PK and Zurier RB. (1983). Prostaglandins and the inflammatory response. Clin Lab Med 3:695.

7. Robinson DF, McGuire MB and Levine L. (1974). Prostaglandins in the rheumatic diseases. AmnN.Y. Acad Sci 256:318.

8. Samealsson B, Dahlem SE, Lindgren JA, Rouzer CA and Serhan CN. (19877). Leukotriene and lipoxins:structure and biosynthesis and biological effects.

Science 237:1171.

9. Yoneda T and Mundy GR. Monocytes regulate osteoclast activating factor production by releasing prostaglandins. J Exp Med 150:338.

10. Hasselbacher P and Schumacker HR. (1978). Immunoglobulins in trophi and on the surface of monosodium urate crystals. Arthritis Rheum 21:353.

11. Hasselbacher P. (1979). Binding of IgG and complement protein by monosodium urate crystals and other crystals. J Lab Clin Med 94:532.

12. Wigley FM, Fine IT and Newcombe DS. (1983). The role of the human synovial fibroblast in monosodium urate crystal induced synovitis. J Rheumatol 10:602.

13. Dayer JM, Krane SM, Russell RGG and Robinson DF. (1979). Production of collagenase and prostaglandins by isolated adherent rheumatoid synovial cells.

Proc Natl Acad Sci USA 73:94.

14. McMillian RM, Vater CA, Hasselbacher P, Hahn J and Harris EH. (1981).

Induction of collagenase and protaglandin synthesis in synovial fibroblasts treated with monosodium urate crystals. J Pharm Phaimacol 33:382.

15. Rae SE, Davidson EM and Smith JH. (1982). Leukotriene B4 - An inflammatory mediator in gout. Lancet 2:1122.

16. Bomalaski JS, Baker DG, Brophy LM and Clark MA. (1990). Monosodium urate crystals stimulate phospholipase A2 enzyme activities and the synthesis of a phospholipase A2-activating protein. The J Immunol 145:3391-3397.

17. Roubenoff R. (1990). Gout and hyperuricemia. Rheumatic Disease Clinics or North America 16(3):539-551.

18. Leventhal LJ, Levin RW and Bomalski JS. (1990). Peripheral arthrocentesis in the workup of acute low back pain. Ach Phy Med Rehabil 71:253-254.

19. Hess B and Binswanger U. (1990). Acute uric acid nephropathy in two gouty patients with moderate hyperuricemia and high urine acidity. Klin,

Wochenschr 68:874-879.

20. Kirwan JR, de Saintonge CDM, Joyce CRB and Currey HLF. (1983). Clinical judgment in rheumatoid arthritis I. Rheumatologists opinion and the development of paper patients. Ann Rheum Dis 42:644-647.

21. Kirwan (1983). Clinical judgment in rheumatoid arthritis II. Judging current disease activity in clinical practice. Ann Rheum Dis 42:648-651.

176 595

22. Kirwan JR, de Saintonge CDM, Joyce CRB and Currey HLF. (1986). Inability of rheumatologists to describe their true policies for assessing rheumatoid arthritis Ann Rheum Dis 45:156-161.

23. Sany, Clinical and Experimental Rheumatology 8 (Suppl. 5) 81-88 (1990).

24. Kumar et al., JAP1 (1990) Vol 38 No. 6 400-402.

25. Foreman et al., (1990). Child Nephrol Urol 10:115-118.

26. Curtin Microbiological Sciences 1 No. (1984).

27. Webb et al. Australian Family Physician 19 Np. 10 October 1990, 1533-1542.

28. British Pharmacopoeia (1934).

29. Kohli et al., Oct 1967. Indian Jour me Res 55:1099-1102.

30. Kulshrestha et al., 1 Jan 1970. Indian Jour Med Res 58:99-102.

31. European Pharmacopoeia Standards.

32. McLeod et al, (1988). Phytochemistry 27No. 2,373-375.

33. Salzer CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition Nov 1977.

34. Lewis et al, (1985). Int J Crude Drug Res 3 No. 1, 27-32.

35. Al-Hindawi et al, (1989). J Ethnopharmacology 26:163-168.

36. Price et al, (1987). Critical Reviews in Food Science and Nutrition 26 No. 1.

37. In. Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology. Applications of HPLC in Biochemistry by A. Fallon, R F G Booth and L D Bell. Publ. Elsevier Amsterdam: N.Y. Oxford. Vol. 17. 1990.

176 595 absorpcja

FIG. 1

CZAS RETENCJI (min)

FIG 2

176 595

nm

FIG 4

176 595

ABSORPCJA 34Qnm

D
1 c -~-Λ———	L

CZAS RETENCJI (min)

CZAS RETENCJI (tn.n)

FIG 6

176 595

ABSORPCJA 20 3 nm

0-4 m

O

CM

CZAS RETENCJI (mm)

FIG. 8

176 595

ABSORPCJA

FIG. 10

176 595

FIG. 12B

176 595 zip? pulii 3βηκ6Π£Λ itrtlh

U*

O

C O o o

c	4J	o o	O		0
c		o	r,
c		Oe		40
				4»	o			3
					X			w
					—*			O
					<0			c
					40
					U/
					V
					o
					a	«
					Cu
			<.	a		—*	V		c
	e		X	e			O
c	€	«	o	«			Λ»	c
o	o	0	0	**		X	a		e

<

O m Λ/ Ο» — •'r <V O O o— co ·* X -r *1 * O

M > >» *“1 0» **» «7» O <V ‘“I C *** « « · Ο» O <V — v <a <_ χ ry cw O e « « o σ> τ *** <. o n ** — *m

-J c. c \ c —

C» «—

X >» «Λ v* < o c « «

c >

X.

w <a » c -*

ο<*μ»μ ry «ν»·**'*, Σ* <c « «>

Οπή **4 <m «V — fS.

α <0 <. Μ <9 «* *» <® /3 c η * x x o α. « X o O O <M <v c «Π · ·<·>«->

r* o <\>

c

V

Λ ·» <X W ·* 4> «* O 0 c

•c

O

-

e « — a ·>

<J *· «4 _£ f

X C - c e - c c >c c *> — o c <o σ>

FIG. 13

V <

176 595

FIG. 14B

176 595

S*HPI£ P£C « Vt diii H«y (9 93 dn HI loWiftt COCO doi 0 (lit /hoft«/*A«* da non rl/vnArsye/dftta/Oa* dfc» c

-< cr fu c <1 a & <e ę 9 ** ** C

<3 O α

c

FIG. 15 «9

176 595

FIG. 16B

176 595

U0.39X: A f<aa<2. 4.tefc-l

i.]¹!

2- 4—

4W1

3<Xfl «

2850

1301 f£AK X 4000.0 400.0 thfeshold 10.002: emissioo base

Cm—1 2929.9	2 68.87	cm-1 1764.1	Z 26.15	Cm-1 1466.1	2 77.32	cm- 1 1285.3	7. 72.38
1212-3	83.34	1061.3	62.43	984.2	84.71	743.5	78.68
694.0	80.04	434.6	91.48	444.3	90.23	436.0	118.71
432.0	114.32	427.8	112.94	421.9	43.19	414.2	47.05
409.6	64.57

peaks *ound

FIG. 17

176 595

ABSORPCJA 2O3nm

CZAS RETENCJI (min)

FIG. 19

176 595

ABSORPCJA 203nm

FIG 21

176 595

ABSORPCJA 203nm

CZAS RETENCJI (nun)

CZAS RETENCJI (πΰη)

FIG 23

176 595

ABSORPCJA 2O3nm

CZAS RETENCJI (min)

FIG. 25

176 595

ABSORPCJA 2O3nm

CZAS RETENCJI (min)

F IG. 27

176 595

ABSORPCJA 2O3nm

D	0
R BaC 7 ---_A	H 1--i ©0-4

CZAS RETENCJI (min)

FIG. 29

176 595

ABSORPCJA 203nm

FIG 31

176 595

ABSORPCJA 2O3nm

FIG. 33

FIG 34

176 595

Zwykłe obszary ciała

Obecne obszary ciała

Zwykłe obszary ciała

FIG. 36

Obecne obszary ciała

176 595

Tygodnie

F ig . :39

FIG. 40

FIG. 41

FIG. 42

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek leczniczy w postaci koncentratu ekstraktu z nasion selera, do leczenia dolegliwości zapalnych, znamienny tym, że środek leczniczy zawiera mieszaninę związków butyloftalidu reprezentowanego pikiem A na fig. 2, sedanolidu reprezentowanego pikiem B na fig. 2 i sedanenolidu reprezentowanego pikiem C na fig. 2, w którym resztę stanowi czwarty składnik reprezentowany obszarem D na fig. 2 i w którym stosunek sedanolid:butyloftalid:sedanenolid:czwarty składnik wynosi 1:15:41:11 odpowiednio.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera farmaceutycznie dopuszczalny wypełniacz.
3. 3. Środek według zastrz. 2, znamienny tym, żejako wypełniacz zawiera fosforan wapnia.
4. 4. Środek według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera wypełniacz w ilości 5-95% wagowo.
5. 5. Sposób otrzymywania środka leczniczego w postaci koncentratu z nasion selera do leczenia dolegliwości zapalnych, w którym ekstrahuje się nasiona selera rozpuszczalnikiem organicznym zdolnym do wyekstrahowania rozpuszczalnych składników z nasion selera, usuwa się stałą pozostałość i odpędza rozpuszczalnik, znamienny tym, że prowadzi się etapy, w których: a) kontaktuje się rozdrobnione nasiona selera z rozpuszczalnikiem organicznym, zdolnym do ekstrahowania rozpuszczalnych składników z nasion selera, korzystnie etanolem, wyekstrahowując ekstrahowalne składniki; (b) usuwa się stały materiał z mieszaniny otrzymanej po etapie (a); (c) usuwa się rozpuszczalnik oraz materiał lotny przez zatężanie ekstraktu, po czym pozostałość po etapie c) dalej zatęża się w warunkach destylacji próżniowej, prowadząc monitoring chromatograficzny co najmniej jednego składnika spośród butylofalidu, sedanolidu i sedanenolidu, do otrzymania koncentratu o składzie przedstawionym pikami A, B i C oraz obszarem D na fig. 2, na której pik A reprezentuje butyloftalid, pik B reprezentuje sedanolid, pik C reprezentuje sedanenolid a obszar D resztę składników pozostałych po zatężaniu, o stosunku sedanolid:butyloftalid:sedanenolid:czwarty składnik wynoszącym 1:15:41:11 odpowiednio.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że przed etapem (a) rozgniata się nasiona selera.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozgniata się nasiona selera do wielkości odpowiadającej przeciętnej średnicy około 1,5 x 1,55 mm i o grubości 0,5 mm, i ewentualnie dalej do otrzymania drobnych cząsteczek o przeciętnej średnicy 0,1 - 0,2 mm.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozgniecione nasiona selera zawiesza się w rozpuszczalniku organicznym w stosunku 1 kg nasion na objętość rozpuszczalnika organicznego 5 litrów do 16 litrów.
9. 9. Sposób według zastrz. 5 albo 8, znamienny tym, że rozpuszczalnik dobiera się z grupy obejmującej alkohol, aceton, chlorek metylenu, benzen, chloroform, glikole, eter i oleje organiczne.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, żejako rozpuszczalnik organiczny stosuje się etanol.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się etanol o stężeniu w zakresie pomiędzy 95% do 98%.
12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się etanol o stężeniu 99,99%.
13. 13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie kontaktowania rozgniecionych nasion selera z rozpuszczalnikiem organicznym miesza się rozgniecione nasiona selera z rozpuszczalnikiem organicznym w warunkach powolnego mieszanina, aż do całkowitego wyekstrahowania ekstrahowalnych składników.

    176 595
14. 14. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że etap oddzielania nierozpuszczalnego materiału roślinnego z mieszaniny zawierającej nierozpuszczalny materiał roślinny prowadzi się przez filtrację.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się filtr o wielkości porów w zakresie pomiędzy 0,2 do 10 mikrometrów.
16. 16. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że na etapie usuwania rozpuszczalnika organicznego stosuje się próżnię.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że etap usuwania rozpuszczalnika organicznego prowadzi się do utraty 50% wagi ekstraktu.