PL173459B1 - Podstawione pochodne pirolidyny - Google Patents

Podstawione pochodne pirolidyny

Info

Publication number
PL173459B1
PL173459B1 PL93298038A PL29803893A PL173459B1 PL 173459 B1 PL173459 B1 PL 173459B1 PL 93298038 A PL93298038 A PL 93298038A PL 29803893 A PL29803893 A PL 29803893A PL 173459 B1 PL173459 B1 PL 173459B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
tert
hydroxy
butyl
carboxamide
phenylbutyl
Prior art date
Application number
PL93298038A
Other languages
English (en)
Other versions
PL298038A1 (en
Inventor
Vida Gorys
Francois Soucy
Christiane Yoakim
Pierre Louis Beaulieu
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Ltd filed Critical Boehringer Ingelheim Ltd
Publication of PL298038A1 publication Critical patent/PL298038A1/xx
Publication of PL173459B1 publication Critical patent/PL173459B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Przedmintem wyn/l/zku są pndst/winfe pochodfe pirolidyny j/kn inhibitory prote/zy HIV, wykazujące /ktywnnść, zwł/szcz/ wnbec retrowirusów.
W 1983 r. ust/tonn, że retrowirus, zn/ny j/kn ludzki wirus upnśledzeni/ ndpnrnnści typ 1 /HIV-1/ jest czynnikiem wywnłującym zespół n/bytegn upośledzeni/ ndpnrnnści (AIDS), p/trz R.C. G/11o i L.Mnnt/gnier, ScientiOic Americ/n, 259 /4/, 40 /1988/. Wirus ten wywnł/ł epidemię n /l/rmujących rnzmi/r/ch. Ost/tnin j/kn drugi czynnik wywnłujący AIDS zidentyOiknw/nn b/rdzn zbliżnny wirus - ludzki wirus upnśledzeni/ ndpnrnnści typ 2 /HIV-2/.
IdentyOik/cj/ ludzkiegn wirus/ upnśledzeni/ ndpnrnnści /HIV/ j/kn czynnik/ przyczynnwegn i rnzwój metod ilnścinwegn hndnw/ni/ wirus/ dnprnw/dziły dn ndkryci/ związków, które h/mują replik/cję HIV in vitro. N/jw/żniejszą kl/sę związków inhibitorów zidentyOiknw/nych w ten spnsób, jest grup/ didenksynuklenzydów, z których 3'-/zydo/3'/deoksytymidyn/ /zn/n/ t/kże j/kn zydnwudyn/ lub AZT/ / nst/tnin, 2', 3'-didenksyinnzyn/ /zn/n/ t/kże j/kn did/nnzyn/ lub DDI/ są stnsnw/ne w leczeniu niektórych p/cjentów z nbj/w/mi z/k/żeni/ HlV. Stwierdznnn, że związki tej kl/sy ,zakłóc/ją cykl życtowy HW pnprzez h/mnw/nie ndwrntnej tr/nskrypt/zy. Enzym ten przekszt/łc/ wirusnwy RNA w dwunicinwy kw/s deznksyrybnnukleinnwy /DNA/ i j/kn t/ki jest istotny dl/ replik/cji HIV. Oprócz h/mnw/ni/ ndwrotnej tr/nskrypt/zy w b/d/ni/ch n/d lek/mi przeciwkn AIDS celem były inne et/py cyklu życinwegn HlV. Zwiększnną uw/gę pnświęcnnn enzymnwi kndnw/nemu w HIV, zn/nemu j/kn prote/z/ HIV. Enzym ten, pndnbnie j/k ndwrntn/ tr/nskrypt/z/, jest kndnw/ny przez gen pni i jest istotny dl/ wzrostu HIV. Jest nn ndpnwiedzi/lny z/ przebieg pewnych rozszczepień w nbrębie bi/łek kndnw/nych przez g/g /p55/ lub g/g-pnl /p180/ prow/dzących dn uwnlnieni/ bi/łek struktur/lnych, np. pl7 i p24 i enzymów, w tym i tegn wł/śnie enzymu, zn/lezinnych w dnjrz/łych z/k/źnych wirinn/ch. T/k więc inhibitory prnte/zy HIV mngą blnknw/ć cykl życinwy HIV.
Zwiększnn/ uw/g/, j/ką pnświęcnnn prnte/zie HIV w ciągu nst/tnich kilku l/t, ndbij/ się w zwiększnnej liczbie dnniesień n ndkryciu środków, które blnkują enzym, p/trz np. (/st/tni przegląd n/ tem/t inhibitorów prnte/zy D.W. Nnrbeck/ i D.J. KempO/, Annu/l Repnrts In Medicin/l Chemistry, 26, 141 /1991/. J/k stwierdznnn we wcześniejszym przeglądzie i j/k dnniósł D.H. Rich i in., J. Med. Chem., 33, 1285 /1990/ i N.A. Rnberts i in., Science, 248, 358 /1990/, ntrzym/nn dwie skuteczne serie inhibitorów prote/zy HIV przez umieszczenie hydroksyetyloaminowegn /n/lngu st/nu przejścinwegn /TSA/ w peptydzie z/wier/jącym sekwencję miejsc/ ndszczepieni/ substr/tu p17/p24. B/d/ni/ binlngiczne związków z serii np. Rnberts/ i wsp. znst/ły npis/ne przez H.A. Overton/ i wsp., Virolngy, 179, 508 /1990/, J.A. M/rtin/ i in., Binchem. Binphys. Res. Cnmmun., 176, 180 1991 i J.C. Cr/ig i wsp., Antivir/l Chemistry /nd Chemnther/phy,2, 181/1991/.
Inne publik/cje uj/wni/jące inhibitnry prote/zy HIV, które z/wier/ją hydroksyetyln/minowy TSA, nbejmują: eurnpejskie zgłnszeni/ p/tentowe nr 346847, nr 352000, nr 402646, nr 432695 i k/n/dyjskie zgłnszenie p/tentowe nr 2030415.
Wyn/l/zek mniejszy dntyczy nnwych pndst/winnych pnchndnych pirolidyny, w których strukturę wprnw/dznnn etyln/mnnnwy TSA. Pnchndne te są silnymi inhibitnr/mi prote/zy HIV. Pnn/dtn, wyk/z/nn, że związki te m/ją zdnlnnść h/mnw/ni/ eOektów cytop/togennych w knmórk/ch ludzkich, wywnł/nych przez HIV. T/kie wł/snnści, r/zem z cechą względnie selektywnego działania i oczywistym brakiem toksyczności, stanowią o użyteczności tych związków jako środków do zwalczania zakażeń HIV. Nowe związki według wynalazku przedstawione są wzorem 1.
Związki według wynalazku stosowane są głównie jako środek farmaceutyczny do leczenia zakażeń HIV u ludzi, który obejmuje związek o wzorze 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Związki według wynalazku stosowane są w leczeniu zakażeń HIV u ludzi, polegającym na podawaniu skutecznej ilości związku o wzorze 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli.
Związki według wynalazku stosowane są do zabezpieczania ludzkich komórek przed patogenezą HIV, przez traktowanie tych komórek związkiem o wzorze 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalną solą w ilości skutecznej wobec HIV.
Stosowane w opisie skróty oznaczające aminokwasy i grupy ochronne, oparte są na zaleceniach IUPAC-IUB Commission of biochemical Nomenclature, patrz European Journal of Biochemistry 138, 9 /1984/. Na przykład, Val, Ile, Asn i Leu oznaczają odpowiednio reszty L-waliny, L-izoleucyny, L-asparaginy i L-leucyny.
Stosowany tu termin niższy alkil, sam lub w kombinacji z rodnikiem, oznacza rodniki alkilowe o prostym łańcuchu zawierające 1 do 6 atomów węgla oraz rodniki alkilowe o rozgałęzionym łańcuchu zawierające 3 do 4 atomów węgla i obejmuje metyl, etyl, propyl, butyl, heksyl, 1-metyloetyl, 1-metylopropyl, 2-metylopropyl i 1,1-dimetyloetyl.
Stosowany tu termin niższy cykloalkil, sam lub w kombinacji z rodnikiem, oznacza nasycony cykliczny rodnik węglowodorowy zawierający od 3 do 6 atomów węgla i obejmuje cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl i cykloheksyl.
Stosowany tu termin niższy alkoksyl oznacza rodnik alkoksylowy o prostym łańcuchu zawierający 1 do 6 atomów węgla i rozgałęziony rodnik alkoksylowy zawierający 3 do 4 atomów węgla i obejmuje rodnik metoksylowy, etoksylowy, propoksylowy, heksoksylowy, 1-metyloetoksylowy, butoksylowy i 1,1-dimetyloetoksylowy. Ten ostatni rodnik jest powszechnie znany jako tert-butoksylowy.
Stosowany tu termin chlorowco oznacza rodnik chlorowcowy wybrany spośród rodników bromowego, chlorowego, fluorowego i jodowego.
Stosowany tu terminfarmaceutycznie dopuszczalny nośnik oznacza nietoksyczny, zwykle obojętny nośnik dla substancji czynnej, który nie wpływa na nią szkodliwie.
Na ogół związki o wzorze 1 wytwarza się znanymi sposobami stosując warunki reakcji, które są znane jako odpowiednie dla reagentów. Opis tych metod znajduje się w standardowych podręcznikach, takich jak Annual Reports In Organie Synthesis1990, K. Turnbull i in., wyd. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA, 1990 /i powyższe roczne biuletyny/, Vogeł’s Textbook of Practical Organie Chemistry, B.S. Fumiss i in., wyd. Longman Group Limited, Essex, W. Brytania, 1986 i The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology’, E.Grass i in., - wyd. Academic Press, Nowy Jork, NY, USA, 1979-1987, vol. 1 do 9.
Związki o worze 1 można wytworzyć sposobem obejmującym:
/a/ reakcję związku epoksydowego o wzorze 2, w którym X ma znaczenie określone uprzednio, z pirolidynokarboksamidem o wzorze 3, w którym R1 i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, w wyniku której otrzymuje się związek o wzorze 1, w którym, X, R1 i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, a B nie występuje lub /b/ reakcję związku o wzorze 4, w którym R1 i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, z reaktywną pochodną kwasu karboksylowego Χ-OH, w którym X oznacza R?C/O/ lub R2AOCH2C/O/ jak określone uprzednio, w wyniku której otrzymuje się odpowiedni związek o wzorze 1, w którym X oznacza R2C/O/ lub R2AOCH2C/O/, jak określone uprzednio, R1 i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, a B nie występuje lub /c/ sprzęganie związku o wzorze 4, w którym R1 i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, z α-aminokwasem o wzorze X-NHCHR4COOH, w którym X i R4 mają
173 459 znaczenia jak określone uprzednio, w obecności środka sprzęgającego, w wyniku którego otrzymuje się odpowiedni związek o wzorze 1, w którym X, R1i Y mają znaczenia jak określone uprzednio, a B oznacza dwuwartościowy rodnik -NHCHR4C/O/-, w którym R4 ma znaczenie określone powyżej lub /d/ reakcję związku o wzorze 5, w którym R1, R4 i Y mają znaczenia jak określone powyżej, z reaktywną pochodną kwasu karboksylowego X-OH, w którym X oznacza grupę R2C/O/ lub R2AOCH2C/O/, jak określone powyżej, w wyniku której otrzymuje się odpowiedni związek o wzorze 1, w którym X oznacza grupę R2C/O/ lub r2aOCH2C/O/, Ri i Y mają znaczenia jak określone powyżej, B oznacza dwuwartościowy rodnik -NHCHr4c/O/-, w którym r4 ma znaczenie jak określone powyżej i /e/ w razie potrzeby, przekształcenie związku o wzorze 1 otrzymanego według powyższych punktów /a/, /b/, /c/ lub /d/ w odpowiednią terapeutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.
Należy zauważyć, że te związki o wzorze 1, w których X oznacza zwykle stosowaną grupę N-ochronną, np. Boc, Z, Fmoc lub p-metoksybenzyloksykarbonyl, otrzymuje się najłatwiej i dogodnie sposobami /a/ i /c/. Łatwa dostępność tych związków sprawia, że są użyteczne jako półprodukty w korzystnej drodze, poprzez odpowiednie procesy /b/ i /d/, wytwarzania odpowiednich związków o wzorze 1, w którym X ma znaczenie inne niż zwykle stosowana grupa N-ochronna. Jako półprodukty zatem tego rodzaju związki o wzorze 1 poddaje się procesowi odblokowania /tj. usuwa się grupę ochronną/ i wytworzone aminy z wolnym N-końcem stosuje się jako odpowiednie związki o wzorze 4 lub 5, w opisach /b/ i /d/, w zależności od tego, czy występuje czy nie występuje B, w celu ostatecznego wytworzenia związków o wzorze 1, w którym X ma znaczenie inne niż zwykłe stosowana grupa N-ochronna, np. 2-pirydynylometoksykarbonyl lub 2chinolinylokarbonyl.
Bardziej dokładnie, zgodnie ze sposobem /a/ związki o wzorze 1, w którym nie występuje B, można wytwarzać przez reakcje N-alkilowania obejmującą dodawanie związku epoksydowego o wzorze 2 do pirolidynokarboksamidu o wzorze 3. Reakcję można prowadzić dogodnie przez skontaktowanie dwóch reagentów w obojętnym rozpuszczalniku, np. w etanolu, tetrahydrofuranie lub dimetyloformamidzie, w temperaturze w zakresie od 20°C do 110°C. czas reakcji zależy od temperatury i charakteru reagentów, ale zwykle jest w zakresie od 2 do 24 godzin.
Zgodnie ze sposobem /b/. związki o wzorze 1, w którym B nie występuje, a X oznacza grupę R2C/O/ lub R2'OCH2C/O/, określoną uprzednio, otrzymuje się przez reakcję odpowiedniego związku o wzorze 4 z reaktywną pochodną kwasu karboksylowego X-OH, w którym X oznacza grupę R2C/O/ lub R2AOCH2C/O/, określoną uprzednio. Odpowiednimi pochodnymi reaktywnymi są środki acylujące, które mogą dostarczyć odpowiedniego rodnika' acylowego X-CO i obejmują odpowiednie halogenki kwasowe, korzystnie chlorki lub bromki, aktywne estry, bezwodniki lub mieszane bezwodniki. Reakcję przeprowadza się zgodnie ze znanymi metodami i w warunkach właściwych dla przebiegu reakcji, stosując środki, które nadają żądaną selektywność przez wybór odpowiednich stosunków reagentów lub przez czasowe wprowadzanie znanych grup ochronnych, w razie potrzeby, do innych grup reaktywnych, konkurujących z grupami reaktywnymi, które mają reagować. Zwykle reakcję przeprowadza się w obojętnym rozpuszczalniku, np. w tetrahydrofuranie, dimetyloformamidzie lub w chlorku metylenu, w temperaturze od 0°C do 50°C, a czas reakcji jest w zakresie od 15 minut do 24 godzin.
Zgodnie ze sposobem /c/ związki o wzorze 1, w którym B oznacza dwuwartościowy rodnik -NHCHR4C/O/-, w którym R4 ma znaczenie określone uprzednio, można wytwarzać przez sprzęganie związku o wzorze 4 z a-aminokwasem o wzorze X-NHCHR4COOH w obecności środka sprzęgającego. Stosowanie środków sprzęgających do promowania reakcji sprzęgania wolnej grupy karboksylowej jednego reagenta z wolną grupą aminową innego reagenta z wydzieleniem wody, jest dobrze znane, np.
173 459 patrzThe Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, vol.l do 8. Przykładem odpowiedniego środka sprzęgającego jest 1,1'-karbonylodiimidazol lub N,N'-dicykloheksylo-karbodiimid. Innym przykładem jest 1-hydroksybenzotriazol w obecności N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu lub N-etylo-N'[/3-dimetylo-amino/propylo]karbodiimid. Bardzo praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu heksafluorofosforan /benzotriazol-1-iloksy/tris-/dimetyloamino/fosfoniowy, sam lub w obecności 1-hydroksybenzotriazolu. Jeszcze innym bardzo praktycznym i użytecznym środkiem sprzęgającym jest dostępny w handlu tetrafluoroboran 2-/1H-benzotriazol1-ilo/-N,N,N', N'-tetrametylouroniowy.
Reakcję sprzęgania prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, np. w dichlorku metylenu, acetonitrylu lub w dimetyloformamidzie. Dodaje się nadmiar organicznej aminy, np. diizopropyloetyloaminy lub N-metylomorfoliny, aby utrzymać pH mieszaniny reakcyjnej na poziomie około 8. Temperatura reakcji zwykle jest w zakresie od -20°C do około 30°C, a czas reakcji od 15 minut od 8 godzin.
Sposób /d/ przeprowadza się tak samo jak opisano powyżej w odniesieniu do procesu /b/, z tą tylko różnicą, że jako materiał wyjściowy stosuje się związek o wzorze 5 zamiast związku o wzorze 4.
Związki epoksydowe o wzorze 2 stosowane jako związki wyjściowe w procesie /a/ albo są znane albo można je wytwarzać znanymi metodami. Bardziej szczegółowo związki epoksydowe o wzorze 2 są opisane przez B.K. Handa i in. w europejskim zgłoszeniu 346,847, lub można je wytworzyć metodami opisanymi w tym zgłoszeniu patentowym.
Inne związki wyjściowe dla sposobów, tj. pirolidynokarboksamidy o wzorze 3 i związki o wzorach 4 i 5, są nowe. Odpowiednie sposoby wytwarzania związków o wzorze 4 i 5 zostały opisane powyżej. Pirolidynokarboksamidy o wzorze 3 można wytworzyć przez standardowe amidowanie znanych odpowiednich kwasów pirolidynokarboksylowych. Alternatywnie, można je także wytworzyć metodą według F.Soucy, D.Wemic i P.Beaulieu, J. Chem. Soc. Perkins Trans, 1, 2885 (1991). Sposoby wytwarzania pirolidynokarboksamidów o wzorze 3 są zilustrowane- w przykładach.
Związki o wzorze 1 według wynalazku można otrzymać w postaci terapeutycznie dopuszczalnej soli addycyjnej z kwasem. Przykładami takich soli są sole z kwasami organicznymi, np. z kwasem octowym, mlekowym, bursztynowym, benzoesowym, salicylowym, metanosulfonowym lub p-toluenosulfonowym, jak również z kwasami polimerycznymi takimi jak kwas garbnikowy lub karboksymetyloceluloza, a także sole z kwasami nieorganicznymi takimi jak kwasy chlorowcowodorowe, np. kwas solny lub siarkowy lub fosforowy. W razie potrzeby daną sól addycyjną z kwasem przeprowadza się w inną sól addycyjną z kwasem, taką jak nietoksyczna sól farmaceutycznie dopuszczalna, przez działanie odpowiednią żywicą jonowymienną, sposobem opisanym przez R.A. Boissonnas i in., Helv. Chim. Acta, 43, 1849 /1960/.
Zwykłe terapeutycznie dopuszczalne sole peptydów o wzorze 1 są całkowicie równoważne pod względem, biologicznym samym peptydom.
Własności hamowania proteazy HIV i działanie zabezpieczające komórki przed patogenezą HIV, jakie wykazują związki o wzorze 1 lub ich terapeutycznie dopuszczalne sole, można wykazać przeprowadzając pewne biochemiczne, mikrobiologiczne i biologiczne procedury.
Szczególnie użyteczną procedurą do wykazania właściwości hamowania proteazy HIV przez związki o wzorze 1 lub ich terapeutycznie dopuszczalne sole jest Próba HPLC z proteazą HIV wytworzoną na drodze rekombinacji DNA. Procedura opiera się na zdolności badanego związku do hamowania enzymatycznego rozszczepienia przez proteazę HIV dekapeptydu /substratu/, który zawiera sekwencję aminokwasową obejmującą znane miejsce rozszczepienia przez proteazę HIV poliproteiny HIV, patrz. H. G. Krausslich i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 807 /1989/. Szczegóły dotyczące
173 459 tej próby razem z wynikami otrzymanymi dla przykładowych związków o wzorze 1, są opisane dalej w przykładach.
Zdolność związków o wzorze 1 lub ich terapeutycznie dopuszczalnych soli do zabezpieczania komórek przed zakażeniem HIV, można wykazać za pomocą mikrobiologicznej procedury pozwalającej na ocenę hamującego wpływu badanego związku na cytopatogeniczność HIV w ludzkich limach komórkowych T4. Takie typowe procedury są opisane przez S. Harada i N. Yamamoto Jpn. J. Cancer Res. /Gann/, 76, 432 /1985/ i S. Harada i in., Science, 229, 563 /1985/. Próba oparta na tej drugiej procedurze jest opisana dalej w przykładach.
Gdy związek o wzorze 1 według wynalazku lub jego terapeutycznie dopuszczalną sól stosuje się do zwalczania zakażeń HlV u ludzi, peptyd można podawać doustnie, miejscowo lub parenteralnie, w nośniku obejmującym jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, których stosunek ilościowy jest określony przez rozpuszczalność i charakter chemiczny związku, wybrany sposób podawania i standardową biologiczną praktykę. Do podawania doustnego związek lub jego terapeutycznie dopuszczalną sól można przeprowadzać w postacie użytkowe takie jak kapsułki lub tabletki, z których każda zawiera określoną ilość substancji czynnej, w zakresie od około 5 do 150 mg, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Do podawania miejscowego związek można przygotować w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku zawierającym 0,01 do 2%, korzystnie 0,05 do 1%, substancji czynnej. Takie preparaty mogą mieć postać kremu, lotionu, tabletki podjęzykowej lub korzystnie plastra przezskómego lub policzkowego. W przypadku podawania parenteralnego związek o wzorze 1 podaje się przez dożylną, podskórną lub domięśniową iniekcję, w kompozycji z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Przy podawaniu przez iniekcję korzystnie stosuje się związek w roztworze w jałowym wodnym nośniku, który może także zawierać inne substancje rozpuszczone takie jak bufory lub środki konserwujące jak również wystarczającą ilość farmaceutycznie dopuszczalnych soli lub glukozy, aby nadać roztworowi izotoniczność.
Odpowiednie nośniki do powyższych preparatów można znaleźć w standardowych farmaceutycznych publikacjach, np. w Remington’s Pharmaceutical Sciences wyd. 18, Mack Publishing Company. Easton, Penn., 1990.
Dawka związku będzie zmieniać się w zależności od sposobu podawania konkretnej wybranej substancji czynnej. Ponadto będzie się też zmieniać w zależności od konkretnego pacjenta. Zwykle leczenie zaczyna się od małych dawek, zasadniczo mniejszych niż optymalna dawka peptydu. Potem dawkę zwiększa się małymi skokami, aż do uzyskania optymalnego efektu w danych warunkach. Na ogół, najbardziej wskazane jest podawanie związku w stężeniu, które doprowadza* do skutecznych efektów przeciwwirusowych bez wywoływania szkodliwego działania ubocznego.
W przypadku podawania doustnego związek lub jego terapeutycznie dopuszczalną sól podaje się w ilości w zakresie 5 do 150 mg na kg wagi ciała dziennie, korzystnie w zakresie 5 do 50 mg na kilogram. Przy podawaniu układowym związek o wzorze 1 podaje się w dawce 10 μg do 1000 μg na kg wagi ciała dziennie, aczkolwiek możliwe są wyżej określone zmiany.
Chociaż przedstawione powyżej środki są skutecznymi i stosunkowo bezpiecznymi lekami do leczenia zakażeń HIV, nie wyklucza się możliwości równoczesnego podawania tych preparatów z innymi przeciwwirusowymi lekami lub czynnikami, aby uzyskać korzystne wyniki. Takie inne leki lub czynniki przeciwwirusowe obejmują rozpuszczalny CD4, zydowudynę, didanozynę, zalcytabinę, fosfonomrówczan trisodowy, rybawarynę, acyklowir lub przeciwwirusowe interferony /np. α-interferon lub interleukina-2/.
Następujące przykłady ilustrują dalej ten wynalazek. Procenty lub stosunki odnoszące się do roztworów wyrażają zależności objętościowe, jeśli nie stwierdzono inaczej. Temperatury podane są w stopniach Celsjusza. Widma magnetycznego rezonansu jądrowego /NMR/ uzyskano na spektrofotometrze Bruker 200 MHz; przesunięcia chemiczne /δ/ podane są w częściach na milion. Stosowane w przykładach skróty obejmują:
173 459
Boc: tert-butyloksykarbonyl; BOP: heksafluorofosforan /benzotriazol-l-iloksy/tris/dimetyloamino/fosfoniowy; Bu1: tert-butyl; Bzl: benzyl; DIEA: diizopropyloetyloamina; DMF: dimetyloformamid: HEPES: kwas N-2-hydroksyetylo-piperazyno-N'-2-etanosulfonowy; Et2O: eter dietylowy; EtOAc: octan etylu; EtOH: etanol; HPLC: chromatografia cieczowa wysokosprawna; MeOH: metanol; Ph: fenyl; THF: tetrahydrofuran; Z: benzyloksykarbonyl.
Przykład I. Wytwarzanie 4/S/-benzyloksy-N-tert-butylo-1-/tert-butyloksykarbonylo/pirolidyno-2/S/-karboksamidu /a/ N-chroniony kwas - kwas 1-/tert-butyloksykarbonylo/-4/S/-hydroksypirolidyno2/S/-karboksylowy - wytworzono przez reakcję kwasu 4/S/-hydroksypiro!idyno-2/S/-karboksylowego [cis-4-hydroksy-L-proliny, opisanej przez S.G. Ramaswamy i E. Adamsa, J. Org. Chem., 42, 3440 /1977/] z karbonianem di-tert-butylu w obecności nadmiaru NaOH w THF/H2O/1:1/ w temperaturze pokojowej w ciągu 18 godzin.
/b/ 400 mg /1,73 mmola/ tak otrzymanego N-chronionego kwasu rozpuszczono w 7 ml DMF. Do roztworu dodano 87 mg /99%, 3,63 mmoli/ wodorku sodu. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej /20-22°/ przez 2 godziny. Dodano 1,03 ml /8,65 mmoli/ bromku benzylu i mieszano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie mieszaninę rozcieńczono EtOAc, oziębiono do 0°C i zakwaszono /pH 3/ dodatkiem 10% wodnego roztworu kwasu cytrynowego. Oddzielono warstwę organiczną, przemyto wodą i solanką, wysuszono nad MgSO4 i zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały żółty olej oczyszczono chromatograficznie /SiO2, eluent: heksan-EtOAc, 9:1/ i otrzymano 301 mg /70%/ estru benzylowego kwasu 4/S/-benzyloksy-1-/tert-butyloksykarbonylo/pirolidyno-2/S/-karboksylowego.
/c/ 301 mg /0,73 mmola/ ostatniego związku z /b/ rozpuszczono w MeOH/H2O /2:1, 4 ml/. Roztwór mieszano i oziębiono do 0°C. Dodano 1,16 ml 2M roztworu NaOH. Po 10 minutach mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej, po czym mieszano przez 18 godzin w tej temperaturze. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono Et2Oheksan / 1:1/, 10 ml/ i 5 ml wody. Oddzielono warstwę wodną, ekstrahowano dwukrotnie Et2O/heksan /1:1/, oziębiono do 0°C, zakwaszono /pH 3/ 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego i ekstrahowano EtOAc trzy razy. Połączone ekstrakty w octanie etylu przemyto dwukrotnie wodą oraz solanką, wysuszono nad MgSO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość suszono pod wysoką próżnią i otrzymano z ilościową wydajnością kwas 4/S/-benzyloksy-l-/tert-butyloksykarbonylo/-pirolidyno-2/S/-karboksylowy.
/d/ Do 0,2 M roztworu 234,7 mg /0,73 mmola/ związku z etapu /c/ w CH2Cl2 dodano 127 μΐ /0,73 mmola/ DIEA, następnie dodano 84,4 μΐ /0,803 mmola/ tert-butyloaminy i 387 mg /0,876 mmola/ BOP. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny utrzymując pH 8 przez okresowe jego sprawdzanie i dodawanie w razie potrzeby DIEA. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc i przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaHCO 3 dwukrotnie, potem wodą i solanką. Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4 i zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytworzony żółty olej oczyszczono metodą szybkiej chromatografii (SiO2, eluent: heksan-EtOAc, 7:3, następnie 6:4) i otrzymano związek tytułowy w ilości 252 mg (92%). ^MR/CDCh/ó 7,40-7,25 /m, 5H/, 6,05 /szeroki s, 1H/,
4,6-4,35 /szeroki d, 2H/, 4,2-4,05 /m, 2H/, 3,8-3,55 /m, 2H/, 2,55-2,1 /m, 2H/, 1,46 /s, 9H/, 1,20 /szeroki s, 9H/.
Przykład II. Wytwarzania 1-{3/S/-amino-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo}4/S/-benzyloksy-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamidu /wzór 4: R1 = C/CHo/· a Y = OCH2Ph; C/O/NHR1/Y = cis/ /a/ Roztwór 250 mg /0,664 mmola/ związku tytułowego z przykładu I w 6N mieszaninie HCl/dioksan mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 minut, po czym zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono 10 ml EtOAc i 3 ml 2N wodnego roztworu NaOH. Mieszanine mieszano w temperaturze
173 459 pokojowej przez 15 minut. Oddzielono warstwę organiczną, przemyto minimalną ilością wody i solanki, wysuszono nad MgSOą i zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią i otrzymano 4/S/-benzyloksy-Ntert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid, który jest związkiem o wzorze 3, w którym R1 oznacza C/CH3/3, a Y oznacza OChLPh {C/O/NHR1/Y = cis}.
/b/ Ostatni związek z /a/ zmieszano w 5 ml absolutnego EtOH z 180 mg /0,604 mmola/ 3/S/-/benzyloksykarbonylo/-'1,2/S/-epoksy-4-fenylobutanu, który jest związkiem epoksydowym o wzorze 2, w którym X oznacza Z, patrz B.K. Handa i in., j.w. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 18 godzin, po czym zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii /SiO2, eluent: CHCb-MeOH, 39:1, następnie 19:1/ i otrzymano 220 mg/63%/ 4/S/-benzyloksy-1 { 3/S/- {/benzyloksykarbonylo/amino } -2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo } -N tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamidu w postaci białej piany.
/c/ 220 mg /0,384 mmola/ ostatniego związku z /b/ poddano hydrogenolizie /5% Pd/C, 1 atmosfera H2, MeOH, 3,5 godziny/ i otrzymano związek tytułowy, który stosowano bezpośrednio, zgodnie z procedurą sprzęgania, w następującym przykładzie.
Przykład III. Wytwarzanie 4/S/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-b>enzyloksykarbonyloi/walilo}ammo}-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno2/S/-karboksamidu /wzór 1:X = Z, B = Val, R1 = C/CH3/3 a Y = OCH2Ph; C/O/NH^/Y = cis]
Związek tytułowy wytworzono według następującej procedury sprzęgania:
33,4 μΐ /0,192 mmola/ DIEA, 53,1 mg /0,211 mmola/ chronionego aminokwasu Z-Val-OH i 102 mg /023 mmola/ BOP dodano do 0,2 M roztworu 0,192 mmola związku tytułowego z przykładu II w CH2CI2, pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano na poziomie 8 przez okresowe sprawdzanie i dodawanie DIEA w razie potrzeby i mieszano mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc, przemyto kolejno nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 dwukrotnie, potem wodą i solanką. Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO 4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii /S1O2, eluent: CHCl3-MeOH, 39:1/ i otrzymano 108 mg /83% /związku tytułowego w postaci białego ciała stałego. Widmo masowe FAB, m/z: 673,3 /M + H/+.
Przykład IV. Wytwarzanie 4/R/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-b>enzyloksykarbonylo-walilo}amino}-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno2/S/-karboksamidu /Wzór 1:X = Z, B = Val, R1 = C/CH3/3 a Y = OCH^Ph; C/O/NHR1/Y = trans].
Postępując kolejno według procedur z przykładów I, II i III, ale w sposobie według /a/ z przykładu I zastępując kwas 4/S/-hydroksypirolidyno-2/S/-karboksylowy równoważną ilością kwasu 4/R/-hydroksypirolidyno-2/S/-karboksylowego /kwas trans-4-hydroksyprolino-2-karboksylowy/, patrz S.G. Ramaswamy i E.Adams, j.w./, otrzymano związek tytułowy. Widmo masowe FAB, m/z: 673,3 /M + H/+.
Przykład V. Wytwarzanie 4/R/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-b>en:ylloksyk;lrbonylo/asparaginylo}amino}-2/R./-hydroksy-4-feny]obutylo}-N-tert-butylopirolidyno2/S/-karboksamidu [Wzór 1:X = Z, B = Asn, R1 = C/CH3/3 a Y = OCH2Ph; C/O/NHR1/Y = trans].
Przeprowadzając kolejno procedury według przykładów I i II, ale w procedurze /a/ według przykładu I zastępując kwas 4/S/-hydroksypirolidyno-2/S/-karboksylowy równoważną ilością kwasu 4/R/-hydroksypirolidyno-2/S/-karboksylowego i poddając tak otrzymany 1-{3/'S/-amino-2/R./-hydroksy-4-f’enylóbutylo}-4/R/-benzyloksy-N-tert-butylopirolidyio-2/S/-karboksamid następującej procedurze sprzęgania, otrzymano związek tytułowy.
20,1 mg /0,148 mmola/ 1-hydroksybenzotriazolu dodano do oziobionęgo do 0°C roztworu 34 mg /0,165 mmola/ N,N'-CickkloOeksklokarboCiimiCu w 2 ml THF. Mieszaninę mieszano przez 15 minut. Do mieszaniny dodano roztwór 395 mg /0,148 mmola/
173 459 chronionegn /minnkw/su Z-Asn-OH w 1 ml DMF i roztwór 35,4 mg /0,083 mmnl// uprzednin wymiieni^nnegn 1- 3/S/-/minn-2^/-hydrnksy-4-Oenylnbutyln-4/R/-benz^ylciksy-Niert/butylnpirolidynn-2/S/-k/rbnks/midu w 1 ml DMF. Miesz/ninę pnznst/winnn dn pownlnegn ogrz/ni/ się dn temper/tury pokojowej, po czym miesz/nn przez 18 godzin. N/stępnie miesz/ninę rozcieńczono EtOAc. Oddzielono O/zę org/niczną, przemyto n/sycnnym wodnym roztworem N/HCO/, wodą i sol/nką, wysuszono n/d MgSO4 i z/tężnnn do suchości pnd zmniejszonym ciśnieniem. Bi/łą st/łą poznst/łnść oczyszczono metodą szybkiej chrom/tngr/Oi /S1O2, eluent: EtOAc/MeOH, 97:3 n/stępnie 19:1/ i ntrzym/no związek tytułowy. Widmo m/snwe EI, m/e: 689,2 /M + 2H/+.
N/leży z/uw/żyć, że npis/n/ przykł/dnwo procedur/ sprzęg/ni/, w której stnsuje się 1 /hydroksybenzntri/znl w obecności N,N'-dicykloheksylnk/rbndiimidu, przedstawi/ korzystną procedurę sprzęg/ni/ dl/ wytw/rz/ni/ związków o wzorze 1, w którym B nzn/cz/ resztę /minokw/su Asn/.
Przykład VI. Wytw/rz/nie 4/S/-benzylnksy-1-{3/S/-{{N-b^enzylok/ syk}rbonyln//sp}r/ginyln } /minn } -2/R/-hydroksy-4-Oenylnbutyln } -N-tert-butylnpirolidynn/ 2/S//k/rboks/midu [wzór 1: X = Z, B = Asn, R1 = C/CH3/3 / Y = OCEEPh; C/O/NHR1/Y = cis/.
Przeprow/dz/jąc kolejno procedury według przykł/dów I i II oraz procedurę sprzęg/ni/ według przykł/du V, otrzym/no związek tytułowy. Widmo m/sowe FAB, m/z: 688,4 /M + H/+; 710,4 /M + N//+.
Przykład VII. Wytw/rz/nie 1-{3//S/-{{N-/benzyloksykarbonyln/walilo}/mi/ fn}/2/2../-hydroksy/4-Oenylnbutylo}/N-tert-butylo-4/S/-/2-metylopropyloksy/pirolidyno-2/S/ -k/rboks/midu [wzór 1: X = Z, B = V/l, Ri = C/CH3/3 / Y = OCH2CH/CH3/2; C/'O/NHR'7y = cis].
Przeprnw/dz/jąc knlejnn procedury według przykł/dów I, II i III /le z/stępując bromek benzylu równnw/żną ilością brnmku 2-metylcpropylu w procedurze /b/ według przykł/du I, otrzym/nn związek tytułowy. Widmn m/sowe EI, m/e: 583,4 /MH2-C4H9A.
Przykład VIII. Wytw/rz/nie 1-{3/S/-{{N-0>en:;tllnksyk/r0nnylo/w/liln}}mi/ nn}/2/R/-hydroksy/4-fenylobutyln}-N/tert-bιltyln-4/R/'-/'2-metyk5propc)ksy/'pπ'clidyfn/2/S/k/rbnks/midu [wzór 1: X = Z, B = V/l, R1 = C/CH3/3 / Y = OCH2CH/CH3/2; C/O/NHR1/Y = tr/ns]
Przeprow/dz/jąc kolejno procedury według przykł/dów I, II i III /le w procedurze /// w przykł/dzie I z/stępując kw/s 4/'S/-hyyroksypirolidyno-2/S/-k}rbnksylowy równow/żną ilością kw/su 4/R/-hydroksypirolidynn/2/S/k}rbnksylowfgo, / w procedurze /b/ w przykł/dzie I z/stępując bromek benzylu równnw/żną ilością brnmku 2-metylnprnpylu, ntrzym/nn związek tytułowy. Widmo m/snwe EI, m/e: 583,3 /MH2-C4H9/+.
Przykład IX. Wytw/rz/nie 4/R/-benzylnksy-1-{3/S//{{N-O>enzylnk/ syk/rbonylo/walilo}/mmnO-2/R/-hydroksy-4-Oenylobutylo}/N-cyklopropylopirolidynn /2/S//k}rbnks/midu [wzór 1: B = V/l, R1 = cyklnprnpyl / Y = OCH2Ph; C/O/NHR1/Y = tr/ns].
Przeprow/dz/jąc kolejno procedury według przykł/dów I, II i III, /le w procedurze /// w przykł/dzie I z/stępując kw/s 4/s//hydrnksypirolidyno-2/S/-k}r0nksylowy równnw/żną ilością kw/su 4/R/-hydroksypirolidyno-2/S/-k}rboksytowegn / w procedurze /d/ w przykł/dzie I z/stępując tert/butyln/minę równnw/żną ilością cykłnpropyln/miny, otrzym/no związek tytułowy, Widmo m/snwe EI, m/e: 657,5 /M + H/+.
Przykład X. Wytw/rz/nie 4/R,S/, 4/R/ i 4/S/ izomerów 4-benzylo/1/ { 3/S/-{ { N/be enylo kyy kar b onylo/asp ar agn nyla/ ϋηήηο } -2/R/hydroksy-4-fenylou utyło } /N-tert/butylnpirolidyno-2/S/-k/rboks}midu [wzór 1: X = Z, B = Asn, R1 = C/CH3/3 / Y = Bzl].
Stosując metndę npis/ną przez F. Soucy, D, Wemic i P. Be/ulieu, j.w. z l/ktnnu seryny i bromku 3-Oenyln-2-propenylu otrzym/no miesz/ninę yi}stfrecizomerów 4/R/ i 4/S/ kw/su 4/ł7enzyln-1-/tert-Out;y:l(^lkss^t^^}^rocc^2^tlc/]^i]rr_Clli^-^tfCc-^/ί3/--^^}rr^(^nkss^l(^cwegn /3:2, w/g./w/g./. W wyniku sprzęg/ni/ miesz/niny yi/stereniznmerycznej z tert-butyln/miną w obecności BOP zgodnie z procedurą /d/ przykładu I uzyskano odpowiednią diastereoizomeryczną mieszaninę 4/R/ i 4/S/ izomerów 4-benzylo-N-tert-butylo-1-/tert-butyloksykarbonylo/pirolidyno-2/S/-karboksamidu. Następnie, sposobem według /b/ w przykładzie II stosując tę ostatnią mieszaninę diastereoizomerów jako karboksamid o wzorze 3, otrzymano odpowiednią mieszaninę diastereoizomeryczną izomerów 4/R/ i 4/S/ 4-b enzylo-1-{ 3/S/- {/benzyloksykarbonylo/-amino }-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo } -Ntert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamidu. Widmo masowe fAb, m/z: 558 /M + H/+.
Z kolei, w reakcji tej ostatniej mieszaniny diastereoizomerycznej z N-chronionym aminokwasem Z-Asn-OH, zgodnie z procedurą sprzęgania według przykładu V, otrzymano odpowiednią mieszaninę diastereoizomeryczną izomerów 4R i 4S 4-benzylo-1{3-/S/-{{N-jb>enzyloksykarbonylo/asparaginylo}amino}-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo } -N -tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamidu. Widmo masowe FAB, m/z: 672 /M + M/+.
Dwa izomery rozdzielono metodą HPLC i otrzymano odpowiednie czyste izomery R 4R i 4S. Bardziej szczegółowo: 20 mg próbkę ostatnio wymienionej mieszaniny, rozpuszczonej w 2,5 ml 50% wodnego roztworu kwasu octowego /warunki początkowe/ załadowano do kolumny C18 oktadecylosililowej Whatman Magnum 9 /0,94 x 50 cm/. Początkowe warunki zrównoważenia kolumny były następujące: 10% A i 90% B /pompa A: 0,06% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu; pompa B: 0,06% kwas trifluorooctowy w wodzie/. Gdy przeszedł pik odpowiadający kwasowi octowemu /przy czole rozpuszczalnika/, nastąpił liniowy gradient. Program rozdziału izomerów był następujący: 10-30% A przez 5 minut, 30% A przez 10 minut, następnie 30-100% A przez 110 minut, przy 3 ml/min i 230 nm. Izomer 4/R/ i 4/S/ zebrano przy 60% A /9,2 mg/ i 63% A /8,3 mg/, odpowiednio.
Przykład XI. Wytwarzanie N-tert-butylo-1-{2/R/-hydroksy-4-fenylo-3/S/{ { N-2-chmolinylokarbonylo/walilo } amino}butylo} -4R/-//2-pirymidynyloiio/pikolidyn o-2/S/-karboksamidu [wzór 1: X = 2-chinolinylokarbonyl, B = Val, R1 = CJcH-il a Y = 2-pirymidynylotio].
/a/ 17,5 g /75,6 mimoli/N-chronionego kwasu, opisanego w sposobie /a/ w przykładzie I, rozpuszczono w 300 ml CH2CI2 i 13 ml /76,6 mmoli/ DIEA. Do roztworu dodano 8,73 ml /83,1 mmoli/ tert-butyloaminy, następnie dodano 40 g /90,7 mmoli/ BOP i 13 ml /151 mmoli/ DIEA. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 7 godzin, a następnie rozcieńczono EtOAc. Oddzielono fazę organiczną, przemyto ją nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 dwukrotnie, wodą i dwukrotnie solanką, wysuszono nad MgSC>4 i odparowano do suchości. Stałą pozostałość roztarto z Et2<0/EtOAc /9:1/, zebrano na sączku, przemyto Et2O i wysuszono i otrzymano 15,6 g /72%/ N-tert-butylo-1-/tert-butyloksykarbonylo/-4/R/-hydroksypirolidyno-2/S/karboksamidu.
/b/ 5,0 g /17,5 mmoli/ związku z /a/ rozpuszczono w mieszaninie toluen/THF /3:1, 175 ml/. Do roztworu dodano w temperaturze pokojowej 5,72 g /21,8 mmoli/ trifenylofosfiny i 1,08 g /30,5 mmoli/ imidazolu. Mieszaninę ogrzano do 45-50°C. Dodano 5,54 g /21, 8 mmoli/ jodu i mieszano mieszaninę intensywnie przez 80 minut w 45-50°C. Następnie mieszaninę reakcyjną oziębiono i rozcieńczono Et2O i wodą. Fazę organiczną oddzielono, przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 jeden raz i raz solanką, wysuszono nad MgSO4 i odparowano do suchości uzyskując brązowy olej zawierający trochę substancji stałej /tlenku trifenylofosfiny/. Oleistą stałą pozostałość roztarto z Et2O i ciało stałe zebrano na sączku. Przesącz odparowano do suchości i uzyskano brązowy olej. Olej oczyszczono metodą szybkiej chromatografii /S1O2, eluent: EtOAc/heksan, 1:4/ i otrzymano 4,83 g /70%/ N-tert-butylo-1/-tert-butyloksykarbonylo/-4/S/-jodkpirolidyno-2/S/-karboksamidu w postaci żółtego ciała stałego.
‘NMR /CDCl3/ δ 6,2-6,0 /szeroki s, 1H/, 4,27-4,0 /m, 3H/, 3,75-3,55 /m, 1H/, 2,9-2,5 /m, 2H/, 1,47 /s, 9H/, 1,38 /s, 9H/.
/c/ Do oziębionej /0°/ zawiesiny wodorku sodu !99%, 182 mg, 7,57 mmoli/ w 10 ml DMF dodano porcjami 1,06 g, 9,46 mmoli/ 2-pirymidynotiolu. Mieszaninę mieszano
173 459 w tej samej temperaturze przez 30 minut. Następnie, roztwór 1,5 g /3,19 mmoli/ produktu z etapu /b/ w 5 ml DMF wkroplono do mieszaniny. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, po czym rozcieńczono EtOAc i wodą. Fazę organiczną oddzielono, przemyto jeden raz zimną wodą, dwa razy 1N wodnym roztworem NaOH i jeden raz solanką, wysuszono nad MgSO 4 i odparowano do suchości i otrzymano ciało stałe. Po roztarciu go z Et2O otrzymano N-tert-butylo-1/tert-butyloksykarbonylo/-4/R/-/2-pirymidynylotio/pirolidyno-2/S/-karboksamidu w postaci białawego ciała stałego.
1H NMR /CDCl3/ó 8,53-8,51 /d, J=4,85 Hz, 2H/, 7,01-6,96 / t, J=4,85, 10,0 Hz, 1H/, 5,97-5,75 /szeroki s, 1H/, 4,4-4,2 /m, 2H/, 4,1-3,91 /m, 1W/, 3,70-3,35 /m, 2H/, 2,92-2,75 /m, 1H/, 1,47 /s, 9H/, 1,36 /s, 9H/. Widmo masowe FAB /m/z/: 381 /M + H/+, 403 /M + Na/+.
/d/ Związek z etapu /c/ odblokowano i poddano reakcji ze związkiem epoksydowym o wzorze 2 i otfzymano N--t^e^t-łKnt^lc^-l^{3/S/-{/'tert-butyl(^ok:^s^y^ćn^łTornyo/ai^mi^o}-^:^/'R/-h;^droksy-4-fenylobutylo}-4/R/-/2-pirymklynylotio/pirolidyno-2/S/-karboksamid. Widmo masowe FAB, m/z: 544 /M + H/+, 566 /M + Na/+. Dalej ostatni związek odblokowano zgodnie ze sposobem /a/ w przykładzie II i sprzężono z Boc-Val-OH zgodnie z procedurą według przykładu III i otrzymano N-tert-butylo-l-{3/S/-{{N//tztt-butyroksykarbonylo/walilo}amm-}-2RU-hydroksy-4-fenylobutylo}-4/R/-22-pirymidynylotio/pirolidyno2/S/-karboksamid. Widmo masowe FAB /m/z/: 643 /M + H/ , 665 /M + Na/+.
/e/ Roztwór 887 mg /1,38 mmola/ ostatniego związku w 7 ml 6N HCl/dioksan mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość białe ciało stałe, wysuszono pod wysoką próżnią w ciągu 20 minut i otrzymano odpowiednią chronioną aminę w postaci chlorowodorku. Sól tę rozpuszczono w 7 ml CH2Cl2 i 481 μΐ /2,76 mmoli/ DIEA. Do roztworu soli dodano 263 mg /1,52 mmola/ kwasu 2-chino]in/karboksylowego i 732 mg /1,66 mmola/ BOP. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, utrzymując jej pH na poziomie 8 przez okresowe sprawdzanie i dodawanie w razie potrzeby DIEA. Następnie, mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc i przemyto kolejno dwukrotnie nasyconym wodnym roztworem NaHCOa, dwukrotnie wodą i raz solanką. Warstwę organiczną wysuszono nad MgSO4 i zatężono do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytworzony bezbarwny olej oczyszczono metodą szybkiej chromatografii /SiO2, eluent: heksan-EtOAc, 3:7, następnie 1:9/ i otrzymano związek tytułowy w postaci białej piany w ilości 750 mg /78%/. Po roztarciu piany z Et2O otrzymano związek tytułowy w postaci ciała stałego /378 mg, 40%/. Widmo masowe FAB, m/z: 698 /M + H/+, 720 /M + Na/+. NMR związku potwierdziło wyznaczoną strukturę.
Sposobem według tego przykładu, ale zastępując w etapie /c/ 2-pirymidynotiol 3/pitydynometanotiolem, otrzymano N-tert-butylo-1-{2/R//hydroksy-4-fenylo-3/S// {{N//2/chinol.inylokί-lrborlylotwalilθ/amino/bŁltylo/-44R///{3-p iiyclynylc3metylo/tio} pirolidjrno-2/S/-karboksamid. Widmo masowe FAB, m/z: 711 /M + H/+, 733 /M + Na/+.
Tym samym sposobem, ale zastępując w etapie /c/ 2/pirymidynotioC 2,6-dimetylo/ 4/hydroksypirymidyną, otrzymano N-tert-butylo-1-{2/R/-hydroksy-4-fenylo-3/S/-{{N-/2chinolinylokarbonykr/wallio}amino}butylo}-4/R//{/2,6-dimetylo-4-pirymidynyl// oksy^irolidyno^/SZ-karboksamid. Widmo masowe FAB, m/z: 710 /M + H/+, 586 /M + H - C6H8N2O/+.
Przykład XII. Wytwarzanie N-tett/butylo-1/{3/S/-{{/2,6-dimetyCofenoksy/ace/ tylo}amino}-2R//-hydroksy-4-fenylobutyCo}-4R////2-prrymidynylotio/pirolidyno-2/S/-karb/ ksamidu /wzór 1: X = /2,6-dimetylofenoksy/acetyl, B nie występuje, R1 = C/CH3/3 a Y = 2-priymidynylotio/
N-tert/butylo-1-{3/S/-{N/teΓ--butylofc>ykarbonylo/amino-2/R/-hydroksy-4-fenylobu-/ tylo}/4/R./-2-pirymidynyk-tio/pirolidynO/2/S//karboksamid, opisany w etapie /d/ przykładu XI, przeprowadzono w odpowiadającą mu aminę pierwszorzędową, tj. N-tert-butylo173 459
1-/3/S/-amino-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo/-4/R/-/2-pirymidynylotio/pirolidyno-2-karboksamid, przez usunięcia grupy ochronnej Boc zwykłym sposobem. Związek ten następnie sprzężono z kwasem /2,6-dimetylofenoksy/octowym, zgodnie ze sposobem według przykładu III i otrzymano związek tytułowy. Widmo masowe FAB, m/z: 606 /M + H/+, 628 /M + Na/+.
Sposobem według tego przykładu, ale zastępując pierwszorzędową aminę stosowaną w nim, odpowiednią pierwszorzędową aminą, N-tert-butylo-1-/3/S/-amino-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo/-4/R/-{/3-pirydynylometylo/tio}pnOlidyno-2-karboksamidem /stosowanym jako półprodukt dla N-tert-butylo-1-{2/R/-hydroksy-4--fenylo-3/S/-{{N/2-chinolinylokarbonylo/walilo}amino}butylo}-4R//-{/3-pirddynylometylo/tio}pnOlidyno-2/S/-karboksamidu według przykładu XI/, otrzymano N-tert-butylo-1-{3{S/-{{/2,6dimetylofenoksy/acetylo } amino } -ZR/Ahydr oksy-4-fenylobutylo W/RZ- /β iry dy nyo o me t ylo/tiojpirolidyno^/SAkarboksamidu. Widmo masowe FAB, m/z: 619 /M + H/+, 641 /M + Na/+.
Przykład XIII. Próba HPLC z proteazą HIV wytworzoną na drodze rekombinacji DNA
Enzym: Proteazę HIV otrzymano przez ekspresję w E. coli /konstrukt pBRT prt+, patrz W.G. Farmerie i in., Science, 236, 305 /1987/, następującym sposobem: Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie roztwory są roztworami wodnymi.
/i/ Fermentacja
Komórki E. coli zawierające plazmid pBRT prt+ wykorzystano do zaszczepienia podłoża do hodowli zaszczepiającej, złożonego z bulionu Luria-Bertaniego zawierającego 100 μ g/ml ampicyliny. Kolby inkubowano w 37° 'mieszając przez 17 godzin. Kolby produkcyjne zawierające jałowy bulion M9, uzupełniony 100 «g/ml ampicyliny, zaszczepiono na poziomie 1% /obj./obj./ stosując opisaną powyżej hodowlę zaszczepiającą. Całkowita objętość zawartości w każdej 2 l produkcyjnej kolbie Erlenmeyera wynosiła 500 ml. Kolby inkubowano w 37° mieszając aż do uzyskania stężenia komórek odpowiadającego optymalnej gęstości /λ = 540 μm/ 0,6 /bez rozcieńczenia/. Uzyskiwano to zwykłe w ciągu 3-4 godzin. Następnie kolby uzupełniono 5 mM izopropylotiogalaktozydu /IPTG, Research Organics, Cleveland, Ohio, USA/ i prowadzono dalej inkubację, aż stężenie komórek osiągnęło optymalną gęstość 0,2 przy 16-krotnym rozcieńczeniu. Następnie kolby uzupełniono 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu i szybko oziębiono do 4°. Komórki bakteryjne odzyskano przez odwirowanie w 4°. Wilgotny osad przechowywano w -70°.
/ii/ Ekstrakcja i przygotowanie enzymu do próby.
Wszystkie przedstawione poniżej etapy przeprowadzano w 4°, jeśli nie zaznaczono inaczej. Rozmrożone komórki zmieszano z buforem A [50 mM tris/hydroksymetylo/aminoetanu HCl /Tris-HCl, pH 7,4/; 0,6 mM kwasu etylenodiammotetraoctowego /EDTA/; 0,375 M NaCl, 0,2% Nonidet P-40 /BDH Chemicals Ltd., Poole, W. Bryt./; ImM PMSF] w stosunku 1 część komórek na 9 części buforu A. Dodano ziemię okrzemkową /Celite 545, John ManVille, Lompoc, USA/ w stosunku 2 części na jedną część wilgotnych komórek /wagowo/. Wytworzoną zawiesinę shomogenizowano przy wysokiej szybkości /około 20 000 obr./min./ w przemysłowym mieszalniku Waringa przy 8 x 15 sek. impulsach. Debris komórkowe/Celit zebrano przez odwirowanie i otrzymany osad ekstrahowano 4,5 częściami buforu A na 1 część wilgotnego stałego osadu, stosując procedurę homogenizacji opisaną powyżej. Supernatanty z obu etapów homogenizacji połączono i wytrącono rozpuszczalne białko dodatkiem stałego /NH4/2SO4, aż do uzyskania 75% nasycenia. Mieszaninę tę mieszano przez 60 minut i wytrącony osad zebrano przez odwirowanie. Otrzymany z wirowania osad zawieszono w buforze B [50 mM Tris-HCl, pH 8; 30 mM NaCl; 1 mM DL}ditiotritol /DTT/; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF; 10% gliceryny] i dializowano przez 18 godzin do takiego samego buforu.
Próbkę dializowanego ekstraktu zawierającego 150 mg białka załadowano na kolumnę amonitową Sephadex A25 /Pharmacia, Uppsala, Szwecja/ ze złożem o rozmiarach:
173 459 cm długości i 2,5 cm średnicy. Próbę eluowano izokratycznie buforem B z liniową szybkością przepływu 10 cm/godz.. Frakcje zawierające aktywność proteazy HTV połączono i wytrącono rozpuszczalne białko dodatkiem nasyconego wodnego roztworu /NH4/2SO 4 aż do uzyskania całkowitego stężenia /NH4/2SO 4 wynoszącego 85% nasycenia. Wytrącone białko usunięto przez odwirowanie, a otrzymany osad rozpuszczono w buforze C [50 mM kwasu 2-/4-morfolino/etanosulfonowego /MES/, pH 5,5; 150 mM NaCl; 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 10% gliceryny]. Uzyskany roztwór poddano dializie przez 18 godzin wobec buforu C, po czym zamrożono w -70°. Wszystkie surowe ekstrakty oczyszczono chromatograficznie w próbkach zawierających 150 mg białka, takim samym sposobem jak opisano powyżej. Końcowe preparaty z każdej serii połączono, podzielono na próbki po 34 μΐ i przechowywano w -70°. Z 20 l fermentacji typowo odzyskano 300 mg białka o specyficznej aktywności wobec proteazy HIV, wynoszącej 18,2 mmoli/substratu rozszczepianego/min/mg.
Próbki rozcieńczono do 1/38 początkowego stężenia buforem, patrz poniżej, przed użyciem /roztwór roboczy enzymu/.
Substrat: Jako substrat stosowano VSFNFPQITL-NH2, MW 1164, patrz Krausslich i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 807 /1989,/. Substrat przeprowadzono w 10 mM roztwór podstawowy w DMSO i przechowywano w 4°. Przed użyciem roztwór podstawowy rozcieńczono buforem i otrzymano roztwór o stężeniu 400«M /tj. roboczy roztwór substratu/.
Bufor. 100 mM MES, 300 mM KCl i 5 mM EDTA rozpuszczono w 90 ml wody destylowanej i pH roztworu doprowadzono do 5,5 stężonym wodnym roztworem NaOH. Roztwór rozcieńczono do 100 ml wodą i otrzymano bufor.
Procedura: /1/ Mieszaninę do próby przygotowano przez zmieszanie 20 μ 1 roztworu roboczego substratu, 10 μ 1 roztworu badanego związku w 10% DMSO i 10 μΐ roboczego roztworu enzymu.
/2/ Mieszaninę do próby inkubowano w 37° przez 30 minut.
/3/ Reakcję zakończono gwałtownie przez dodanie 200 μΐ 2%o wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego.
/4/ Substrat i produkty /t.j. VSFNF i PQ1TL-NH2 rozdzielono poddając 100 μΐ mieszaniny do próby po zakończeniu reakcji HPLC w kolumnie Perkin-Elmera 3x3 CRC8 /Perkin Eimer Inc., Norwalk, CT, USA/ ze stopniowym gradientem przy szybkości przepływu 4 ml/min. Stosowano następujący gradient:
0,0 - 0,5 minuty, 70% A / 30% B;
0,5 - 3,0 minut, 67% A / 133% B;
3.0 - 5,, minutt 20% A / 80% B;
5.0 - 6,5 minuty, 70% A / 30% B;
przy czym A oznacza 3 mM dodecylosiarczanu sodu/ 0,05% H3PO4 w wodzie a
B 0,05% H3PO4 w acetonitrylu. Elucję monitorowano przy 210 nM.
151 Równocześnie przeprowadzono etapy 2 do 4 próby kontrolnej, w której mieszanina do próby nie zawierała badanego związku.
Badanie hamowania: Produkty rozszczepienia i pozostały substrat macierzysty oceniono ilościowo albo przez wysokość piku albo przez całkowanie odpowiednich pików HPLC. Konwersję substratu obliczono według następującej zależności:
% konwersji = Suma wysokości piku lub powierzchnia piku produktów_ χ 100 J Suma wysokości piku lub powierzchnia piku substratu i produktów
Hamowanie enzymu przez badany związek obliczono w sposób następujący:
% hamowania = 100 - konwersji dla_mieszanmy do próby x 100 % konwersji w próbie kontrolnej
173 459
Stężenie badanego związku, które powoduje 50% hamowanie proteazy HIV, tj. IC50, określono następująco: Procent hamowania enzymu określono dla co najmniej trzech różnych stężeń badanego związku. Następnie wyznaczono IC50 graficznie przez wykreślenie wykresu procentu hamowania enzymu w funkcji stężenia badanego związku.
Wartości IC50 dla przykładowych związków o wzorze 1, określone w próbie HPLC z proteazą HIV wytworzono na drodze rekombinacji DNA, są przedstawione w następującej tabeli.
Tab el a 1
Nr kolejny Związek IC50 /nM/
1 4ZSZ-benzyloksy-1- {3/S/- { {N-Zbenzyloksykarbonylα/walllo} amino} -2ZR/-hydroksy4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid 150
2 4ZR/-benzyloksy-1-{3ZS/-{{N-benzyloksykarbonylo/wallio}amino}-2/RZ- hydroksy-4-fenylϋbutylo}-N-tert-butylopiIΌlidyno-2/S/-karboksamid 16
3 4/RZ-benzyloksy-1-{3/S/-{{Nzb)eIzηlloksykarbonylo/aspara{giίlylo}amino}-2ZR/- hydroksy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid 39
4 4/S/-benzyloksy-1-{3/S/- { {N-bemylobykarbonylo/asparagmyto} amino } -2/R/hydroksy-4-fenylobutylo}-N-teΓt-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid 300
5 l-{3/S/-{{N-/bmzyloksykarbonyloMalilo}amino}-2/R/-hydrolay-4-feny- lobutylc}-^l·teΓt-buίylo-4/S/-,'2-metylopropyloksy/pirolidyno-2/S/-karboksamid 745
6 l-{3/S/-{{N-/bbnzyloksskarbonylo/walllo}aminc}-2RZ/-hsdroksy-4-fbny- lcbutylo}-N-tert-buΐslo-4RL/-2’-melsllopΓopyloksy/pirolidsno-2/S/-karbcksamid 180
7 4ZRZ-benzsloksy-1-{3/SZ-{{N-b)enzy]0)ksykarbonylo/walilo}aminc}-2ZRZ- hsdroksy-4-fenylobutylo}-N-cskloprcpslopiIΌlidync-2/S/-karboksamid 100
8 4/RZ-bbnzylc-1-{3/S/-{{Nzb)en;ηllol«ykarbonylc/asparaginylo}amino}-2/RZhsdroksy-4-fbnylobutslc } -N-tbrt-butylopirclidync-2^,/S,/-karbcksamίd 48
9 4/S/-bbnzslc-1-{3/SZ- { {N-/bbnzsloksskarbcnslo/asparaginylo} amino } -2/R/hydroksy-4-fbnylcbutylo}-N-tbrt-buts'k>piIΌlidyno-karboksamid 780
10 N-tbrt-butylo-1-{2ZR/-hydroksy-4-fenylo-3/S/-{{N-/2-chirolmslokar- b(lrslcZwalilo}-ammo}butylc}-4/R/z,22-piy'midynylotio/-piIΌlidsro-2/S/- karboksamid 4,7
11 N-tert-butylc-l-{2RZ/-hsdrcksy-4-fbnslc-3ZS/-{{N-2-chinolinylokar- bonslcZwalilo}-amino}butslo}-4RZ/-{33-pily(tynylometsloZtio}pirolidsno-2ZSZ- karboksamid 12
12 N-tert-butylo-1 - {2ZRZ-hydroksy-4-fenylo-3ZSZ- { {N^-chinolinylokar- bcnylc/walilo}-ammo}butyło}-4RZ/-/22)6-dimeS]lo-4-pirymidsnylcZoksy}pi- rolidsnc-2/SZ-karbcksamid 9,4
13 N-tbrt-butylo-1-{3ZSZ-{{/2,6-dimetylofenoksy/acbtslo}amiro}-2RZ/-hsdrcksy-4- fbnylobutylc}-4/R/-/2’-piΓsmidynylotio/-pirclidyno-2/S/-karboksamid 4,6
14 N-tbrt-butylo-1-{3/SZ-{{,22,6-dimetslofbnoksy/acetslo}amino}-2RZ/-hydrckss-4- fbnylobutylo}-4/R/-{3^piydlsmslometslo/tio}-pirolidsrlo-2/S/-karboksamid 43
173 459
Przykład XIV. Następujący protokół stosowany do selekcji efektów przeciwwi^^sowych związków o wzorze 1, jest zaadaptowaną próbą łysinkową, w której stosuje się transformowane komórki HTLV-I, opisaną przez Harada i in., j.w. Stosuje się stransformowane komórki HTLV-I z powodu szybkości z jaką HIV replikuje w tych komórkach.
1. Badany związek rozpuszcza się w sulfotlenku dimetylu do stężenia 5 mg/ml. Wytworzony roztwór można przechowywać w 4° aż do czasu stosowania.
2. Wytworzony roztwór rozcieńcza się RPMI 1640 /Gibco Laboratories, St. Lawrence, MA. USA/ cztery razy do końcowego stężenia, które ma być badane. Po rozcieńczeniu w RPMI 1640 roztwór stosuje się w próbie z hodowlą komórkową w ciągu 4 godz.
3. Roztwór 4x dodaje się do trzech z 96 płaskodennych dołków na płytce Co mikromiareczkowania /50 μΐ/ Do kontrolnych dołków dodaje się także 50 μ 1 RPMI.
4. Do wszystkich dołków dodaje się komórki C8166 /5 x 104/ w 50 μ 1 RPMI 1640 buforowanego HEPES /pH = 7,2/, 10% Ceaktywowaną płodową surowicę cielęcą /FCS/, 12,5 /zl/ml gentamycyny /pożywka wzbogacona/.
5. Do wszystkich dołków dodaje się 50-krotność TCID50 podstawowego H9/HTLVIIIV /przechowywanego w ciekłym azocie jako supematant hodowli komórek w 50% FCS/ w 100 μΐ wzbogaconej pożywki. Zakaźne miano podstawowych roztworów wirusa jest, jak uprzednio, określone przez końcowe rozcieńczenie na komórkach C8166. Miano podstawowych roztworów jest trwałe przez 6-12 miesięcy przy przechowywaniu w -193°.
6. Płytki Co mikromianowania umieszcza się następnie na pólkach w inkubatorze w 37°, w atmosferze z zawartością 5% CO2 i odpowiedniej wilgotności na 72 godziny.
7. Następnie płytki wyjmuje się i liczy się środki syncytium w każdym dołku za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem fazowym o niskiej mocy, Każde skupisko komórek, które wykazuje oczywiste wytwarzanie syncytium liczy się jako jeden środek syncytium. W dołkach kontrolnych powinno być 25-75 środków syncytium na dołek.
8. Procentowe hamowanie tworzenia się syncytium oblicza się według wzoru:
(liczba środków syncytialnych (liczba środków syncytialnych w dołkach kontrolnych) - w dołkach testowanych) % hamowania = 100 x (liczba środków syncytialnych w dołkach kontrolnych)
Stężenie badanego związku, które wywołuje 50% hamowanie tworzenia się syncytiów, tj. EC50, jest określone za pomocą techniki kolejnych rozcieńczeń roztworu roboczego w etapie 3 i graficznego wykreślenia zaobserwowanego procentu hamowania tworzenia się syncytiów w funkcji różnych stężeń badanego związku.
W następującej tabeli II przedstawione są wyniki próby Cla przykładowych związków o wzorze 1 z próby łysinkowej w tym przykładzie.

Claims (4)

1. Podstawione pochodne pirolidyny o wzorze 1, w którym podstawniki mają następujące znaczenia
X oznacza grupę benzyloksykarbonylową,
2-chinolinylokarbonylową lub (2,6-dimetylofenoksy)acetylową
B nie występuje albo oznacza resztę walilową lub asparaginylową
R1 oznacza C1-C6-alkil albo C3-C6-cykloalkil i
Y oznacza benzyl, 2,6-dimetylo-4-pirymidynyloksyl, benzyloksyl 2-metylopropyloksyl, grupę 2-pirymidynylotio lub 3-pirydynylometylo/tio lub stanowią ich terapeutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.
2. Związki według zastrz. 1, w których
X oznacza grupę benzyloksykarbonylową, 2-chinolinylokarbonylową,
B oznacza resztę walilową lub asparaginylową
Ri oznacza 1,1-dimetyloetyl lub cyklopropyl i
Y oznacza benzyl, 2,6-dimetylo-4-pirymidynyloksyl, benzyloksyl, grupę 2-pirymidynylotio lub (3-pirydynyklmetylo)tio lub stanowią ich terapeutycznie dopuszczalną sól z kwasem.
3. Związki według zastrz. 1, w których
X oznacza grupę (2,6-dimetylofenoksy)acetylową
B nie występuje
Ri oznacza 1,1-trimetyloetyl i
Y oznacza 2,6-dimetylo-4-pirymidynyloksyl, grupę 2-pirymidynylotio lub (3-pirydyrn^4lumet;^d(^))tio lub stanowią ich terapeutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.
4. Związek według zastrz. 1, którym jest
4/S/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-b)en2yloksykarbonylo/walilo}-ammo}-2Rt/-hydroksy4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid,
4/R/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-/^enzyloksykarbonylo/walilo}-amino}-2RL/-hydroksy4-fenylobutylo}/N-tert-butylopirolidyno-2/S/7karboksamid,
4/R/-benzyloksy-1-{3/S/-{{N-b>en:yιloksykarbonylo/asparaginylo}-ammo }-2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo}/N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid,
4/S/-benzyloksy-1- { 3/S/- {{N-/b en n ^οΐ»^arbo nylo/a s p a raginylo } -amino } -2/R/- hydroksy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid,
1 - { 3/S/- { {N -/benzyloksykarbonylo/walilo} -amino } -2/R/-hydroksy-4-fenylobutylo } N-tert-butylo-4/S/-/2-metylopropyloksy/pirolidyno-2/S/-karboksamid,
1-{3/S/-{{N-/benzyloksykarbonykl/walilo}-amiτκl}2-/R/-hydroksy-4-fenylobutylo}N-tert-butylo-4/R/-/2-metylopropyloksy/pirolidyno-2/S/-karboksamid,
4/R/-benzyloksy/1-{3/S/-{{N-/>enzyloksykarbonylo/walilo}-amino}-2R//-hydroksy4-fenylobutylo}-N-cyklopropylopirolidyno-2/S/-karbok.samid,
4/R/-benzylo-l-{3/S/-{{Nb'benzyloksykaΓbonylo/asparaginykl}-amino}-2/R./-hydroksy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopirolidyno-2/S/-karboksamid,
4/S/-benzylo-1-{3/S/-{{N-/^enyloksykarbonylo/asparaginylo}-amino}-2/R/-hydrok/ sy-4-fenylobutylo}-N-tert-butylopiroiidyno-2/S/-karboksamid,
N-tert-butylo-1-{2/R//-hydroksy-4-fenylo-3/S/-{{N-/2-chinolinylokarbonylo/walilo} ammo}butylo-4/R//-/2-piiymlidynylotio/-pirolidyno-2/S/-karboksymid,
N-tert-butylo-1-{ 2/R/-hydroksy-4-fenylo-3/S/-{{N-/2-chinolinylokarbonylo/walilo } amino}butylo-4/R/--{/3-piIΛ'midynyloπletylo/tio}-pirolidyno-2/S/-karboksyamid,
N-tert-butylo-1-{2/R/-hydroksy-4-fenylo-3/S/-{{N//2-chinolinylokarbonylo/walilo} aπnno}butylo-4/R./-{-2,6-dimelyk--4-piηm'iidynykl/oksy}-pirolidyno-2/S/-karboksymid,
173 459
N-tert-butylo- 1-{3/S/- { {/2,6-dmetylofenoksy/acetylo} amino } -2/R/-hydroksy-4-feny lobutylo} -4/R/-//-pirymidynylntin/-pirnlidyfn-//S/-k/rbnksymid i
N-tert-butylo-l-{3/S/-{{/2,6-dimetylofenoksy//cetyln}amifio}-22/-hydroksy-4-4efy lobutylo}-4/R/-{/3-prrymidynnmetyln/tio}/prrolidyno-2/S/-k/rboksymid.
PL93298038A 1992-03-13 1993-03-12 Podstawione pochodne pirolidyny PL173459B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85059692A 1992-03-13 1992-03-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL298038A1 PL298038A1 (en) 1993-11-15
PL173459B1 true PL173459B1 (pl) 1998-03-31

Family

ID=25308596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93298038A PL173459B1 (pl) 1992-03-13 1993-03-12 Podstawione pochodne pirolidyny

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5552405A (pl)
EP (1) EP0560269B1 (pl)
JP (1) JP3198191B2 (pl)
AT (1) ATE123275T1 (pl)
AU (1) AU663164B2 (pl)
CA (1) CA2092653C (pl)
DE (1) DE69300169T2 (pl)
HU (1) HU215520B (pl)
NZ (1) NZ247124A (pl)
PL (1) PL173459B1 (pl)
TW (1) TW301651B (pl)
ZA (1) ZA931777B (pl)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA93002392A (es) 1992-03-11 2005-02-04 Narhex Ltd Derivados amino de hidrocarburos-oxo e hidroxi-substituidos.
US5888992A (en) 1992-03-11 1999-03-30 Narhex Limited Polar substituted hydrocarbons
US6071895A (en) 1992-03-11 2000-06-06 Narhex Limited Polar-substituted hydrocarbons
JPH07504654A (ja) 1992-03-11 1995-05-25 ナルヘックス　リミテッド オキソ及びヒドロキシ置換炭化水素のアミン誘導体
DE69300043T2 (de) * 1992-03-13 1995-05-24 Bio Mega Boehringer Ingelheim Substituierte Pipecoline-Säurederivate als HIV-Protease-Hemmer.
US5559256A (en) * 1992-07-20 1996-09-24 E. R. Squibb & Sons, Inc. Aminediol protease inhibitors
EP0610745A3 (en) * 1993-02-09 1994-09-28 Miles Inc Novel aminomethylene derivatives as immunosuppressants.
IL110898A0 (en) * 1993-09-10 1994-11-28 Narhex Australia Pty Ltd Polar-substituted hydrocarbons
US5883252A (en) * 1996-01-26 1999-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aspartyl protease inhibitors
US6803466B1 (en) * 1997-12-08 2004-10-12 The Scripps Research Institute HIV/FIV protease inhibitors having a small P3 residue
EP1039886A4 (en) * 1997-12-08 2001-05-16 Scripps Research Inst HIV / LIV PROTEASES INHIBITORS WITH SMALL P3 REST
US6251906B1 (en) 1998-05-15 2001-06-26 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
EP1463807A4 (en) 2001-12-19 2006-04-12 Bristol Myers Squibb Co FORMATHYDROGENASE FROM PICHIA PASTORIS AND USES THEREOF
US7662852B2 (en) 2003-05-22 2010-02-16 Lead Chemical Co., Ltd. Compounds and preparations having antiviral effect

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340588C (en) * 1988-06-13 1999-06-08 Balraj Krishan Handa Amino acid derivatives
EP0361341A3 (en) * 1988-09-28 1991-07-03 Miles Inc. Therapeutics for aids based on inhibitors of hiv protease
WO1991008221A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide inhibitors of hiv protease

Also Published As

Publication number Publication date
ATE123275T1 (de) 1995-06-15
CA2092653A1 (en) 1993-09-14
EP0560269A1 (en) 1993-09-15
DE69300169D1 (de) 1995-07-06
HU9300729D0 (en) 1993-05-28
CA2092653C (en) 1998-12-15
ZA931777B (en) 1993-09-23
AU3516593A (en) 1993-09-16
DE69300169T2 (de) 1995-10-26
TW301651B (pl) 1997-04-01
HUT70147A (en) 1995-09-28
AU663164B2 (en) 1995-09-28
JPH0625158A (ja) 1994-02-01
EP0560269B1 (en) 1995-05-31
NZ247124A (en) 1995-09-26
US5552405A (en) 1996-09-03
JP3198191B2 (ja) 2001-08-13
HU215520B (hu) 1999-01-28
PL298038A1 (en) 1993-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL176362B1 (pl) Nowe związki, podstawione pochodne kwasu pipekolinowego i ich terapeutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasem
PL173459B1 (pl) Podstawione pochodne pirolidyny
EP0695758B1 (en) Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
BG65738B1 (bg) Трипептиди, инхибитори на хепатит с
US5545640A (en) Protease inhibiting succinic acid derivatives
EP1226115A1 (en) Novel carbamates and ureas
BG64956B1 (bg) Пептиди, инхибитори на хепатит с
US5614533A (en) Substituted pipecolinic acid derivatives as HIV protease inhibitors
EP0443559A2 (en) HIV protease inhibiting agents
CA2036397C (en) Hiv protease inhibitors containing derived amino acid units
Kitchin et al. Synthesis and structure-activity relationships of a series of penicillin-derived HIV proteinase inhibitors: heterocyclic ring systems containing P1'and P2'substituents
US5925762A (en) Practical synthesis of urea derivatives
Ermolat’ev et al. Solid-phase synthesis of N-(pyrimidin-2-yl) amino acid amides
Waibel et al. On the inhibition of HIV-1 protease by hydrazino-ureas displaying the N→ CO interaction
US6803466B1 (en) HIV/FIV protease inhibitors having a small P3 residue
Lin et al. Assembly of the TAN-1057 A/B heterocycle from a dehydroalanine precursor
MXPA00003450A (en) Azetidinone derivatives for the treatment of hcmv infections
HK1021530A1 (en) Intermediates for preparing non-peptide retroviral protease inhibitors
HK1021530B (en) Intermediates for preparing non-peptide retroviral protease inhibitors