HU215520B - Eljárás HIV-proteáz inhibitor hatású szubsztituált pirrolidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Eljárás HIV-proteáz inhibitor hatású szubsztituált pirrolidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215520B
HU215520B HU9300729A HU9300729A HU215520B HU 215520 B HU215520 B HU 215520B HU 9300729 A HU9300729 A HU 9300729A HU 9300729 A HU9300729 A HU 9300729A HU 215520 B HU215520 B HU 215520B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
butyl
formula
phenyl
amino
carboxamide
Prior art date
Application number
HU9300729A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT70147A (en
HU9300729D0 (en
Inventor
Pierre Louis Beaulieu
Vida Gorys
Francois Soucy
Christiane Yoakim
Original Assignee
Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. filed Critical Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd.
Publication of HU9300729D0 publication Critical patent/HU9300729D0/hu
Publication of HUT70147A publication Critical patent/HUT70147A/hu
Publication of HU215520B publication Critical patent/HU215520B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás bizőnyős retrővírűsők, így a HIV ellenhatásős, új (1) általánős képletű pirrőlidinszármazékők – a képletben X jelentése R2–O–CO–, R2–CO– vagyR2A–O–CH2–CO– általánős képletűcsőpőrt, ahől R2 jelentése l–6 szénatőmős alkil-, fenil-(1–6 szénatőmős alkil)- vagy2-kinőlil-csőpőrt, R2A jelentése 1–6 szénatőmős alkilcsőpőrttal mőnő-, di- vagytriszűbsztitűált fenilcsőpőrt; B jelentése kémiai kötést kifejező vegyértékvőnal vagy –NH–CHR4–CO–általánős képletű kétértékű csőpőrt, ahől R4 jelentése adőtt esetben karbőxicsőpőrttal mőnőszűbsztitűált 1–6szénatőmős alkilcsőpőrt; R1 jelentése 1–6 szénatőmős alkil- vagy 3–6 tagszámú ciklőalkilcsőpőrt;és Y jelentése benzilcsőpőrt vagy egy V–(CH2)n–W– általánős képletűcsőpőrt, ahől V jelentése 1–6 szénatőmős alkilcsőpőrt, fenilcsőpőrt vagy adőttesetben 1–6 szénatőmős alkilcsőpőrttal mőnő- vagy diszűbsztitűáltpiridil- vagy pirimidilcsőpőrt, W jelentése őxigén- vagy kénatőm és n értéke 0 vagy 1 – és gyógyászatilag elfőgadható savaddíciós sóik, valamint ezekettartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás bizonyos retrovírusok ellen hatásos pirrolidínszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.
1983-ban egy retrovírusról, nevezetesen az ember immunhiányos állapotát okozó 1-es típusú, az angol elnevezésből (humán immunodeficiency vírus) származó rövidítés elterjedése révén HIV-1 néven ismert vírusról megállapították, hogy az AIDS (ez ugyancsak egy betűszó, a szerzett immunhiányos tünetcsoport angol nevének: Acquired Immuné Deficiency Syndrome kezdőbetűiből eredeztethető) okozója [lásd R. C. Gallo and L. Montagnier: Scientific American 259, 40 (1988)]. A vírus ijesztő mértékben terjedt el már eddig is, így korunk pestisévé vált. Legújabban sikerült azonosítani a humán immunhiányos állapotot okozó vírusnak az előzővel szoros rokonságot mutató 2-es típusát, amelyet HIV-2 néven ismerünk, és amelyet az AIDS egy másik okozójaként tartanak számon.
Az a tény, miszerint a HIV-vírusról bebizonyosodott, hogy az AIDS okozója, továbbá hogy sikerült módszert kidolgozni a vírus szaporítására, arra sarkallta a kutatókat - éspedig sikerrel -, hogy találjanak olyan hatóanyagokat, amelyek gátolják a HÍV replikációját in vitro körülmények között. A felfedezett inhibitorok közül legjelentősebbnek a didezoxi-nukleotidok, ezek köréből is a 3’-azido-3’-dezoxitimidin - ez a vegyület zidovudin vagy AZT néven vált ismertté -, illetve legújabban a 2’3’-didezoxiinozin - a vegyülettel didanozin vagy DDI néven is találkozhatunk - bizonyult, és ezeket a hatóanyagokat a terápiában is alkalmazták a HIV-fertőzés tüneteit mutató bizonyos páciensek esetében. Erről a vegyületcsaládról sikerült kimutatni, hogy a HÍV életciklusába a reverz transzkriptáz gátlása révén avatkozik be. Ez az enzim alakítja át a vírus ribonukleinsavat (RNS) a kétszálú dezoxiribonukleinsavvá (DNS), következésképpen az enzim a HÍV replikációjához alapvetően szükséges. A reverz transzkriptáz gátlásán kívül a HÍV életciklusának más fázisait is célba vették, hogy az AIDS ellen hatóanyagokat találjanak, így például egyre nagyobb figyelmet érdemel egy, a HÍV által kódolt enzim, a HIV-proteáz. Ez az enzim, amelynek kódja a reverz transzkriptázéhoz hasonlóan a pol génben található, és amely szintén létfontosságú a HÍV szaporodásához, felelős a gag (p55) vagy gag-pol (pl80) fehérjék (gag és pol a vírusgenom részei, zárójelben található p betű a fehéijére, idegen szóval protein, utal, a szám pedig a molekulatömeg kilodaltonban) megfelelő helyen történő elhasításáért és ezáltal bizonyos strukturfehéijék, például egy pl7 és egy p24 fehérje, valamint bizonyos, az érett fertőzőképes virionban található enzimek - saját magát is beleértve szabaddá tételéért. A HIV-proteáz inhibitorai tehát a vírus életciklusának gátlásával megállíthatják annak szaporodását.
A HIV-proteázoknak szentelt megnövekedett figyelem abból is lemérhető, hogy megszaporodott azoknak a publikációknak a száma, amelyekben az enzimet blokkolni képes hatóanyagok felfedezéséről számolnak be. Nemrégiben például D. W. Norbeck és D.
J. Kempf [Annual Reports In Medicina! Chemistry 26,
141 (1991)] közöltek átfogó ismertetést a proteáz inhibitorokról. Amint az szerepel az imént említett ismertetésben is, D. H. Rich és munkatársai [Science 248, 358 (1990)] a HIV-proteáz inhibitorok köréből két hatékony sorozatot írnak le, amelyek úgy jöttek létre, hogy egy pepiidbe, amelyben megtalálható a szubsztrát pl7/p24 hasítási helyének megfelelő szekvencia, egy hidroxi-etil-amin átmeneti állapot analógot (az angol név rövidítéséből származó betűszóval TSA = transition State analóg) építettek be. A Roberts és munkatársai által leírt sorozat kiemelt vegyületeinek biológiai vizsgálatáról többek között H. A. Overton és munkatársai [Virology 179, 508 (1990)], J. A. Martin és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 176, 180 (1991)], valamint J. C. Craig és munkatársai [Antiviral Chemistry and Chemotherapy 2, 181 (1991)] adnak számot.
A hidroxi-etil-amin átmeneti állapot analógot magukban foglaló HIV-proteáz inhibitorokkal kapcsolatban még a következő publikációk jelentek meg:
Β. K. Handa et al.: 346 847 számú európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1989. december 20-án; G. B. Dreyer et al.: 352000 számú európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1990. január 24-én; D. J. Kempf et al.: 402 646 számú európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1990. december 19-én;
K. E. B. Parkes et al.: 2,030,415 számú kanadai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1991. június 12-én; és
J. A. Martin és S. Redshaw: 432 695 számú európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1991. június 19-én.
Itt a találmányi leírásban olyan szubsztituált pirrolidinszármazékokat ismertetünk, amelyek szerkezeti felépítésük révén egy etil-amin átmeneti állapot analógot foglalnak magukban, és amelyek ezáltal hatékonyan gátolják a HIV-proteázt. Ezekről a vegyületekről továbbá sikerült azt is kimutatni, hogy képesek a HÍV emberi sejtekre gyakorolt citopatogén hatását is gátolni, és ezen tulajdonságaik, valamint az a tény, hogy viszonylag szelektív hatásúak, azonfelül kétségtelenül nem toxikusak, különösen alkalmassá teszik a találmány szerinti hatóanyagokat a HIV-fertőzések leküzdésére.
A fentiek alapján tehát a találmány tárgya eljárás az (1) általános képletű vegyületek, mely képletben X jelentése R2-O-CO-, R2-CO- vagy
R2a-O-CH2-CO- általános képletű csoport, ahol
R2 jelentése 1-6 szénatomos alkil-, fenil-(l-6 szénatomos alkil)- vagy 2-kinolil-csoport,
R2A jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono-, di- vagy triszubsztituált fenilcsoport;
B jelentése kémiai kötést kifejező vegyértékvonal vagy -NH-CHR4-CO- általános képletű, kétértékű csoport, ahol
R4 jelentése adott esetben karboxicsoporttal monoszubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport;
R1 jelentése 1-6 szénatomos alkil- vagy 3-6 tagszámú cikloalkilcsoport; és
Y jelentése benzilcsoport vagy egy V-(CH2)n-Wáltalános képletű csoport, ahol
HU 215 520 Β
V jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono- vagy diszubsztituált piridil- vagy pirimidilcsoport,
W jelentése oxigén- vagy kénatom és n értéke 0 vagy 1;
és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóik előállítására.
Az elmondottakkal kapcsolatban még szükségesnek tartjuk megjegyezni, hogy amennyiben az (1) általános képletben B kémiai kötést kifejező vegyértékvonalat jelent, akkor ez a kémiai kötés kovalens kötés, amely az X szimbólumnak megfelelő csoport és a szekunder aminocsoport között jön létre oly módon, hogy egyszerűen elhagyjuk a képletből B-t, amelyhez egyébként ezek az említett csoportok kapcsolódnak.
Kiemelkedő jelentőségűek azok az (1) általános képletű vegyületek - a gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókat is beleértve -, amelyek képletében X jelentése R2-O-CO- vagy R2-CO- általános képletű csoport, ahol R2 1 -6 szénatomos alkilcsoportot, fenil-(l - 6 szénatomos alkil)-csoportot vagy 2-kinolil-csoportot jelent; vagy
X jelentése R2A-O-CH2-CO- általános képletű csoport, ahol R2A fenilcsoportot jelent, amely 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono-, di- vagy triszubsztituált, és a szubsztituensek 2-, 4- és 6-helyzetűek lehetnek;
B jelentése vegyértékvonal vagy -NH-CHR4-COáltalános képletű, kétértékű csoport, ahol R4 1-6 szénatomos alkilcsoportot vagy karboxicsoporttal monoszubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoportot jelent;
R1 jelentése izopropil-, terc-butil-, izobutil-, ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil- vagy ciklohexilcsoport; és
Y jelentése benzilcsoport vagy V-(CH2)n-W- általános képletű csoport, ahol
W jelentése, valamint n értéke az előzőekben megadott, V pedig 1-6 szénatomos alkil-, fenil-, 2-piridil-, 3-piridil-, 4-piridil-, 2-pirimidinil-, 4,6-dimetilpirimidin-2-il- vagy 2,6-dimetil-pirimidin-4-il-csoportot jelent.
Különösen kiemelkedő jelentőségűek azok az (1) általános képletű vegyületek - beleértve a gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókat is -, amelyek képletében
X jelentése terc-butoxi-karbonil-, benzil-oxi-karbonil-,
2-kinolil-karbonil-, (2-metil-fenoxi)-acetil-, (2,4dimetil-fenoxi)-acetil- vagy (2,4,6-trimetil-fenoxi)acetil-csoport;
B jelentése vegyértékvonal vagy -NH-CHR4-COáltalános képletű, kétértékű csoport, ahol R4 izopropil-, terc-butil-, szek-butil-, izobutil-csoportot jelent;
R1 jelentése terc-butil- vagy ciklopropilcsoport; és
Y jelentése benzil-, 4-metoxi-benzil-, izobutoxi-, fenoxi-, 2-piridil-oxi-, 3-piridil-oxi-, 4-piridil-oxi-, 2-pirimidinil-oxi-, (4,6-dimetil-pirimidin-2-il)-oxi-, (2,6-dimetil-pirimidin-4-il)-oxi-, benzil-oxi-, (2piridilj-metoxi-, (2-pirimidinil)-metoxi-, fenil-tio-,
2-piridil-tio-, 3-piridil-tio-, 4-piridil-tio-, 2-pirimidinil-tio-, (4,6-dimetil-pirimidin-2-il)-tio-, benziltio-, [(2-piridil)-metil]-tio-, [(3-piridil)-metil]-tiovagy [(4-piridil)-metil]-tio-csoport.
A legjelentősebb (1) általános képletű vegyületek a gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókat is beleértve - mindazonáltal azok, amelyek képletében X jelentése terc-butoxi-karbonil-, benzil-oxi-karbonil-, vagy 2-kinolil-karbonil-csoport;
B jelentése a valil-, izoleucil- vagy aszparaginilcsoportból az α-amino-csoport egy hidrogénatomjának az elvételével kapott kétértékű csoport;
R1 jelentése terc-butil- vagy ciklopropilcsoport; és
Y jelentése benzil-, fenoxi-, 2-pirimidinil-oxi-, (2,6dimetil-pirimidin-4-il)-oxi-, benzil-oxi-, fenil-tio-, 2piridil-tio-, 3-piridil-tio-, 4-piridil-tio-, 2-pirimidiniltio-, (4,6-dimetil-pirimidin-2-il)-tio vagy [(3 -piridil)metil]-tio-csoport.
Az (I) általános képletű vegyületek köréből - a gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sókat is beleértve - rendkívül jelentősek továbbá azok, amelyek képletében
X jelentése (2-metil-fenoxi)-acetil-, (2,4-dimetilfenoxi)-acetil-, (2,6-dimetil-fenoxi)-acetil- vagy (2,4,6-trimetil-fenoxi)-acetil-csoport;
B jelentése kémiai kötést kifejező vegyértékvonal;
R1 jelentése terc-butil-csoport; és
Y jelentése azonos a legjelentősebb (1) általános képletű vegyületekkel kapcsolatban megadottakkal. Azoknál az (1) általános képletű vegyületeknél, amelyek képletében B egy -NH-CHR4-CO- általános képletű, kétértékű csoportot jelent, előnyös, ha az R4 szimbólumnak megfelelő szubsztituenst hordozó szénatom S-konfigurációjú.
A találmány tárgyát képezik azonfelül a HÍV által fertőzött személyek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként az (1) általános képletű vegyületek valamelyikét vagy annak valamely gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal együtt.
Végül a találmány még mindezeken felül eljárás az emberi sejtek megvédésére a HÍV patogenitásától, ami abból áll, hogy az adott sejteket valamely (1) általános képletű vegyület - a gyógyászatilag elfogadható sókat is beleértve - olyan mennyiségével kezeljük, amely vírusellenes hatását a HÍV ellenében kifejteni képes.
Itt a leírásban különböző rövidítéseket és szimbólumokat használunk, elsősorban az aminosavakkal és a védőcsoportokkal kapcsolatban, amelyek általában megfelelnek az IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature [lásd European Journal of Biochemistry 138, 9 (1984)] ajánlásainak. így például a Val, He, Asn és Leu szimbólumok ugyanebben a sorrendben az L-valin, az L-izoleucin, az L-aszparaginsav és az L-leucin aminosav-maradékát jelentik.
Aminosav-maradék alatt egyébként itt egy olyan csoportot értünk, amelyet valamely α-aminosavból úgy kapunk, hogy — a képletet magunk elé képzelve — el3
HU 215 520 Β vesszük a karboxicsoport hidroxicsoportját, valamint az α-amino-csoport egy hidrogénatomját.
A leírásban rövid szénláncú alkilcsoport összefoglaló néven szerepelnek - akár önálló csoportként, akár más csoportok részeként - azok az egyenes láncú alkilcsoportok, amelyek 1-6, és azok az elágazó láncú alkilcsoportok, amelyek 3 vagy 4 szénatomosak. Ilyen például a metil-, az etil-, a propil-, a butil-, a hexil-, az izopropil-, az izobutil-, a szek-butil- és a terc-butilcsoport.
A kis gyűrűtagszámú cikloalkilcsoport akár önmagában, akár más csoportok részeként értelmezésünk szerint telített, ciklusos szénhidrogénekből származtatható 3-6 szénatomos csoport, így ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil- vagy ciklohexilcsoport.
Gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyag alatt általában közömbös, nem toxikus, a hatóanyaggal összedolgozható kötő-, hígító- vagy más gyógyszerészeti segédanyagot értünk, amely semmilyen módon nem károsítja a többi összetevő bármelyikét.
A hatékony mennyiség kifejezéssel itt a leírásban a vírusellenes hatóanyagnak azt a meghatározott mennyiségét jelöljük, amely szükséges ahhoz in vivő körülmények között, hogy a HÍV szaporodását gátló hatás megmutatkozzék.
Az (1) általános képletű vegyületeket általában ismert, a szintetikus szerves kémia eszköztárához tartozó eljárásokkal állítjuk elő, a reaktánsok tulajdonságainak megfelelő körülmények között végezve a reagáltatást. Ezeknek az általánosan alkalmazható szintetikus módszereknek a leírását kézikönyvekben és monográfiákban találjuk, ilyenek többek között: „Annual Reports in Organic Synthesis - 1990”, K. Tumbull et al., Eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA 1990 (és hasonlóképpen a megelőző években kiadottak); „Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry”, B.
S. Fumiss et al., Eds, Longman Group Limited, Essex, UK, 1986; és „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, E. Grass et al., Eds, Academic Press, New York, NY, USA, 1979-1987, Volumes 1-9.
Konkrétabban, az (1) általános képletű vegyületeket például a következőképpen állíthatjuk elő:
a) egy (2) általános képletű epoxidot egy (3) általános képletű pirrolidinkarboxamiddal - a képletekben X, R1 és Y a bevezetőben megadott jelentésűek - reagáltatunk, aminek eredményeképpen egy olyan (1) általános képletű vegyületet kapunk, ahol a képletben X, R1 és Y jelentése azonos a korábban megadottakkal, B pedig kémiai kötést kifejező vegyértékvonalat jelent; vagy
b) egy (4) általános képletű vegyületet, amelynek képletében az R1 és Y szimbólumok az előzőekben meghatározott jelentésűek, egy X-OH általános képletű karbonsav valamilyen reaktív származékával - a képletben X az R2-CO- vagy R2A-O-CH2-CO- általános képletű, az előzőekben már meghatározott csoportok valamelyikét jelenti - reagáltatunk, amikor is az így kapott (1) általános képletű vegyület képletében X jelentése R2-CO- vagy R2A-O-CH2-CO- általános képletű csoport, ahol R2 és R2A jelentése azonos az előzőekben megadottakkal, R1 és Y jelentése pedig ugyanaz, mint a (4) általános képletben, és B jelentése vegyértékvonal; vagy
c) egy (4) általános képletű vegyületet, amelynek képletében R1 és Y jelentése a fenti, valamilyen kondenzálószer jelenlétében összekapcsolunk egy X-NH-CHR4-COOH általános képletű a-aminosavval - a képletben az X és R4 szimbólumok a bevezetőben, az (1) általános képlettel kapcsolatban megadott jelentésűek -, aminek eredményeképpen egy olyan (1) általános képletű vegyületet kapunk, ahol X, R1 és Y jelentése a fenti, B jelentése pedig a megfelelő -NH-CHR4-CO- általános képletű, kétértékű csoport, amely általános képletben tehát R4 jelentése szintén a fenti; vagy
d) egy (5) általános képletű vegyületet, amelynek képletében R1, R4 és Y a bevezetőben meghatározott jelentésűek, egy X-OH általános képletű karbonsav - a képletben X megfelelője az R2-CO- vagy R2A-O-CH2-CO- általános képletű csoportok valamelyike - valamilyen reaktív származékával reagáltatunk, ekkor a termék egy olyan (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése a fentebb már meghatározott R2-CO- vagy R2A-O-CH2-COáltalános képletű csoport, R1 és X jelentése a fenti, B pedig egy -NH-CHR4-CO- általános képletű, kétértékű csoportot jelent, ahol R4 jelentése szintén a fenti; és kívánt esetben a fenti a), b), c) vagy d) pont alatt ismertetett eljárások valamelyikével kapott (1) általános képletű vegyületet valamilyen gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk.
A tárgyalt eljárásokkal kapcsolatban megjegyezzük, hogy azokat az (1) általános képletű vegyületeket, amelyek képletében X jelentése valamilyen általánosan használt aminovédő csoport, például terc-butoxikarbonil-csoport (Boc), benzil-oxi-karbonil-csoport (Z), [(9-fluorenil)-metoxi]-karbonil-csoport (Fmoc) vagy 4-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoport, legegyszerűbben az a) és c) pont alatt tárgyalt módon állíthatjuk elő. Ezeknek a származékoknak a könnyű hozzáférhetősége lehetővé teszi olyan vegyületeknek az előállítását, amelyek köztitermékei lehetnek azoknak az (1) általános képletű vegyületeknek, ahol a képletben X jelentése különbözik a fentebb tárgyalt, általánosan használatos aminovédő csoportoktól, és amelyek könnyen előállíthatók például a b) és d) pont szerinti eljárásokkal. Ez esetben úgy járunk el, hogy ezen köztiterméknek tekinthető (1) általános képletű vegyületek aminovédő csoportját eltávolítjuk a molekulából, majd az N-terminális aminocsoportján szabaddá tett vegyületet, amely tehát egy (4) vagy (5) általános képletű vegyület, a b) vagy d) pont szerint - attól függően, hogy B vegyértékvonalat jelent-e vagy sem - a kívánt (1) általános képletű vegyületté - amelynek képletében X jelentése a szokásos aminvédő csoportoktól különböző, valamely más csoport, például [(2-piridil)-metoxi]-karbonil- vagy 2kinolil-karbonil-csoport - alakítjuk át.
Részletesebben elemezve a fentebb vázolt előállítási módokat, az a) pont alatti eljárás tehát arra szolgál, hogy egy olyan (1) általános képletű vegyületet kapjunk, amelynek képletében B vegyértékvonalat szimbolizál.
HU 215 520 Β
Maga a reakció tulajdonképpen N-alkilezés, ami ebben a speciális esetben egy (2) általános képletű epoxid addíciója egy (3) általános képletű pirrolidin-karboxamidra. A reagáltatást célszerűen valamilyen inért oldószerben, például etanolban, tetrahidro-furánban vagy N,Ndimetil-formamidban, 20 és 110 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A reakcióidő a hőmérséklettől, valamint a reaktánsok egyedi tulajdonságaitól függ, de általában a 2 és 24 óra közötti tartományba esik.
A b) pontban leírtak szerint állítjuk elő azokat az (1) általános képletű vegyületeket, amelyek képletében B vegyértékvonalat jelent, X jelentése pedig az R2-COvagy R2a-O-CH2-CO- általános képletű, az előzőekben már pontosan körülírt csoportok valamelyike, és ez esetben úgy járunk el, hogy egy (4) általános képletű vegyületet reagáltatunk egy X-OH általános képletű karbonsav - a képletben X jelentése R2-CO- vagy R2a_O-CH2-CO- általános képletű csoport - valamilyen reaktív származékával. Ez a reaktív származék általában valamilyen acilezőszer, amely alkalmas arra, hogy a megfelelő acilcsoportot bevigyük általa egy molekulába, például savhalogenid, elsősorban savklorid vagy savbromid, aktív észter, savanhidrid vagy vegyes anhidrid. Az acilezés kivitelezésének a módja, a körülményeket is beleértve, önmagában ismert, és általában olyan mértékig kidolgozott, hogy például a reaktánsok arányának a megváltoztatásával vagy átmeneti védelmet nyújtó, ismert védőcsoportokkal kívánt esetben megfelelő szelektivitást érhetünk el, még akkor is, ha esetleg a reagáltatni szándékozott csoporttal összemérhető reaktivitású más csoport található a molekulában.
Rendszerint a reagáltatást valamilyen inért oldószerben, például tetrahidrofuránban, N,N-dimetilformamidban vagy metilén-dikloridban, 0 és 50 °C közötti hőmérsékleten végezzük, a reakcióidő 15 perctől 24 óráig terjedhet.
A c) pont alatt ismertetett eljárást követve állítjuk elő azokat az (1) általános képletű vegyületeket, amelyek képletében B helyén egy -NH-CHR4-CO- általános képletű, kétértékű csoport - a képletben R4 jelentése az előzőekben megadottakkal azonos - áll, éspedig úgy, hogy valamilyen kondenzálószer jelenlétében összekapcsolunk egy (4) általános képletű vegyületet és egy X-NH-CHR4-COOH általános képletű α-aminosavat. A kondenzálószerek, amelyek elősegítik, illetve meggyorsítják a két reaktáns - ezek közül az egyiknek szabad karboxicsoportja, a másiknak pedig szabad aminocsoportja van - vízkilépéssel járó, úgynevezett kondenzációs reakcióját, jól ismertek [lásd például az előzőekben már hivatkozásként szerepelt „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, Volumes 1-8]. Ilyen kondenzálószerekre példaként említhetjük az 1,1 ’-karboníl-diimidazolt vagy az N,N’diciklohexil-karbodiimidet. Ugyancsak jól használható kondenzálószer az 1-hidroxi-benzo-triazol N,N’diciklohexil-karbodiimid vagy N-[3-(dimetil-amino)propil])-N’-etil-karbodiimid jelenlétében. Nagyon praktikus és jól használható kondenzálószer akár önmagában, akár 1-hidroxi-benzo-triazol jelenlétében a kereskedelemben is kapható [(benzo-triazol-l-il)-oxi]trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát], és hasonlóképpen kereskedelmi forgalomban van egy másik rendkívül jól használható, praktikus kondenzálószer, a 2-(lH-benzo-triazol-l-il)-N,N,N’,N’-tetrametil-urónium- [tetrafluoro-borát].
A kapcsolási reakció kivitelezését célszerűen valamilyen inért oldószerben, például metilén-dikloridban, acetonitrilben vagy Ν,Ν-dimetil-formamidban végezzük, a reakcióelegy pH-ját valamilyen szerves amin, például Ν,Ν-diízopropiI-etil-amin vagy N-metilmorfolin feleslegével tartjuk 8 körüli értéken. A reagáltatás hőmérséklete rendszerint a -20 és +30 °C közötti tartományba esik, a reakcióidő lehet 15 perc, de akár 8 óra is.
A d) pont szerinti eljárásra vonatkozóan a reakciókörülményeket tekintve a b) pontnál leírtak érvényesek, az egyetlen különbség, hogy a kiindulási anyagként megadott (4) általános képletű vegyület helyett egy (5) általános képletű vegyületet reagáltatunk.
Az a) pont szerinti eljárás kiindulási vegyületeként szolgáló (2) általános képletű epoxidok általában ismertek vagy ismert módon, minden különösebb nehézség nélkül előállíthatok. A (2) általános képletű epoxidok közül többet leírtak például Β. K. Handa és munkatársai [346,847 számú európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságra hozták 1989. december 20-án], de a többit is előállíthatjuk a szabadalmi bejelentésben leírt eljárásokat követve.
Ami a találmány szerinti eljárás többi kiindulási anyagát, így a (3) általános képletű pirrolidinkarboxamidokat, valamint a (4) és (5) általános képletű vegyületeket illeti, ezek új, még le nem írt vegyületek, ezért a találmány lényeges elemének tekintendők. A (3) általános képletű pirrolidinkarboxamidokat a megfelelő, ismert pirrolidinkarbonsavakból a szokásos, általánosan alkalmazott savamidszintézissel állíthatjuk elő, illetve követhetjük F. Soucy, D. Wemic és P. Beaulieu eljárást [J. Chem. Soc. Perkins Trans. 1, 2885 (1991)]. Az (5) általános képletű pirrolidinkarboxamidok előállítását itt a leírásban, a példáknál is bemutatjuk.
A találmány szerinti (1) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sók formájában is. A sóképzéshez használhatunk szerves savakat, például ecetsavat, tej savat, borostyánkősavat, benzoesavat, szalicilsavat, metánszulfonsavat vagy p-toluolszulfonsavat; polimer savakat, például csersavat vagy (karboxi-metil)-cellulózt, valamint szervetlen savakat, például hidrogén-halogenideket, elsősorban sósavat, azonkívül kénsavat vagy foszforsavat. Kívánt esetben az egy bizonyos savval képzett savaddíciós sót megfelelő ioncserélő gyanta alkalmazásával, követve az R.A. Biossonnas és munkatársai által közölt eljárást [Helv. Chim. Acta 43, 1849 (1960)], átalakíthatjuk egy másik, például egy nem toxikus, gyógyszerészetileg elfogadható sóvá.
Általánosságban kijelenthetjük, hogy a találmány szerinti (1) általános képletű peptidek és gyógyászatilag elfogadható sóik biológiai hatásukat tekintve teljesen egyenértékűek.
HU 215 520 Β
Az (1) általános képletű vegyületeknek vagy vegyületek gyógyászatilag elfogadható sóinak a HIV-proteáz aktivitására kifejtett gátló, valamint a sejtekre gyakorolt, a HÍV patogenitásával szemben megmutatkozó védő hatását biokémiai, mikrobiológiai és biológiai módszerekkel bizonyíthatjuk.
Az egyik ilyen módszer, amely különösen alkalmasnak bizonyult az (1) általános képletű vegyületek vagy gyógyászatilag elfogadható sóik HIV-proteáz inhibitor hatásának kimutatására, a nagynyomású folyadékkromatográfiás rekombináns HIV-proteáz aktivitásmérés. A módszer azon alapszik, hogy a hatóanyag képes gátolni egy szubsztrátként kiválasztott dekapeptidnek a dekapeptidben megtalálható az az aminosavsorrend, amely a HIV-poliproteinben a HIV-proteáz hasítási helyének felel meg - a HIV-proteáz közreműködése révén végbemenő hasítását [lásd H. G. Krausslich et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 807 (1989)]. A vizsgálati módszert részletesen lenjük a példáknál, és ugyanott megadjuk azokat a mérési eredményeket is, amelyeket az (1) általános képletű vegyületek köréből kiválasztott hatóanyagokkal kaptunk.
Az (1) általános képletű vegyületeknek - a gyógyászatilag elfogadható sókat is beleértve - a HlV-fertőzéssel szemben megmutatkozó sejtvédő hatását mikrobiológiai módszerekkel igazolhatjuk, amikor is azt vizsgáljuk, hogy a hatóanyagok milyen mértékben gátolják a HÍV humán T4-sejtekkel szemben megnyilvánuló citopatogenitását. Ilyen vizsgálati módszert ismertetnek S. Harada és N. Yamamoto [Jpn. J. Cancer Rés. (Gann), 76, 432 (1985)], valamint S. Harada és munkatársai [Science 229, 563 (1985)]. Az általunk alkalmazott és itt a leírásban később, a példáknál részletesen leírt mérési módszer az utóbbin alapszik.
Az (1) általános képletű vegyületeket és azok gyógyászatilag elfogadható sóit az ember HlV-fertőzésének leküzdésére hasznosítva, a hatóanyagot adhatjuk a páciensnek orálisan vagy parenterálisan, illetve alkalmazhatjuk helyileg, és ilyen esetben a hatóanyagot mindig egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivő-, hígító- vagy egyéb segédanyaggal kombináljuk.
A vivőanyag arányát a készítményben a hatóanyag oldhatósága, kémiai tulajdonságai, valamint az orvosi gyakorlatban kialakult szokások és előírások szabják meg. Az orális beadásra szánt készítmények esetében a hatóanyagot vagy annak valamely gyógyászatilag elfogadható sóját rendszerint egységnyi dózist tartalmazó gyógyszerformában, például kapszula vagy tabletta formájában adjuk a betegnek. Ezek hatóanyag-tartalma 5 és 150 mg között lehet, amely hatóanyagot megfelelő, gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagokkal dolgozzuk össze.
A helyi alkalmazásra szánt gyógyszerkészítményeknél a hatóanyagot szintén a megfelelő gyógyszerforma tartalmazza, mintegy 0,01-2%, előnyösen 0,05-1% mennyiségben, a fennmaradó részt egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyag teszi ki. Helyileg alkalmazható gyógyszerforma például a krém, a borogatószer, a nyelv alá helyezhető tabletta, illetve előnyösen a transzdermális tapasz vagy a bukkális tapasz.
Az úgynevezett parentális készítmények esetében az (1) általános képletű vegyületeket megfelelő, gyógyszerészetileg elfogadható vivő-, hígító- vagy egyéb segédanyagokkal készült intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris injekció formájában juttatjuk a beteg szervezetébe. Az injekciós készítmények célszerűen oldatok, előnyösen steril, vizes oldatok, amelyek tartalmazhatnak még az oldódást elősegítő adalékokat, pufferanyagokat és tartósítószereket, továbbá valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható sót vagy glükózt, amelyekkel az oldatot izotóniássá tehetjük.
A fenti gyógyszerkészítmények előállításához megfelelő gyógyszerészeti vivő-, hígító- és egyéb segédanyagokról többet is megtudhatunk különböző kézikönyvekből és szabványleírásokból [lásd például: „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1990],
Az alkalmazandó dózisok különbözőek lehetnek, a kezelés módjától valamint a kiválasztott hatóanyagtól függően, de a kezelendő egyednek is szerepe lehet az adagolás megállapításában. Általában úgy járunk el, hogy a kezelést alacsony dózisszinten kezdjük, rendszerint lényegesen kisebb dózisokkal, mint ami az optimális lenne, azután lépésenként, kis mennyiségekkel növeljük az adagokat mindaddig, amíg az adott körülmények között elvárható optimális hatást sikerül elérni. Mindig azt kell szem előtt tartanunk, hogy a hatóanyag olyan koncentrációt érjen el, amely kielégítően hatékony a vírussal szemben, de nem okoz semmiféle káros vagy veszélyes mellékhatást.
Orálisan a találmány szerinti vegyületeket, illetve azok gyógyászatilag elfogadható sóit a testtömegre számítva napi 5-150 mg/kg, előnyösen 5-50 mg/kg dózisban adhatjuk. Szisztémás kezelés esetén az (1) általános képletű vegyületek dózisa naponta és testtömegkilogrammonként 10 pg és 1000 pg között lehet, de mindenképpen tekinettel kell lennünk az imént tárgyalt, esetleg jelentős különbségeket okozó tényezőkre is.
Bár a találmány szerinti gyógyszerkészítmények a HIV-fertőzések hatékony és viszonylag biztonságos kezelését teszik lehetővé, nem kizárt, hogy más vírusellenes szerekkel együtt adva a találmány szerinti hatóanyagokat, még jobb eredményeket érhetünk el. Ezek az egyéb vírusellenes gyógyszerek vagy hatóanyagok például a következők lehetnek: oldható CD4, zidovudin, didanozin, zalcitabin, trinátrium-(foszfono-formiát), ribavarin, aciklovir, továbbá vírusellenes interferonok, például α-interferon vagy interleukin-2.
Az itt következő részben a találmány bemutatása végett példákat adunk meg. Az előiratokban az oldatok összetételét jelölő százalékarányok mindig térfogatszázalékra vonatkoznak, hacsak az adott helyen ettől eltérő adat nem szerepel. Az NMR-spektrumokat Bruker 200 MHz spektrométerrel vettük fel, a kémiai eltolódásokat (δ) ppm-ben adjuk meg.
A példákban és a táblázatokban a következő, eddig még nem tárgyalt rövidítések fordulhatnak elő: Boc = terc-butoxi-karbonil-csoport; BOP = [(benzo-triazol-1il)-oxi]-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluorofoszfát]; Bu1 = terc-butil-csoport; Bzl = benzilcsoport;
HU 215 520 Β
DIEA = Ν,Ν-diizopropil-etil-amin; DMF = N,N-dimetil-formamid; HEPES = 2-[4-(2-hidroxi-etil)-piperazinl-il]-etánszulfonsav; Et2O = dietil-éter; EtOAc = etilacetát; EtOH = etanol; HPLC = nagynyomású folyadékkromatográfia; MeOH = metanol; Ph = fenilcsoport; THF = tetrahidrofurán; Z = (benzil-oxi)karbonil-csoport.
I. példa
4(S)-(Benzil-oxi)-N-(terc-butil)-l-(terc-butoxi-karbonil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása
a) Az N-védett savat, azaz az 1-(terc-butoxikarbonil)-4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsavat úgy állítjuk elő, hogy tetrahidrofurán és víz 1:1 arányú elegyében, feleslegben vett nátrium-hidroxid jelenlétében 4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsavat [ez a vegyület tulajdonképpen az S. G. Ramaswamy és E. Adams által leírt [J. Org. Chem. 42, 3440 (1977)] cisz-4-hidroxi-Lprolin] di(terc-butil)-dikarbonáttal reagáltatunk szobahőmérsékleten, 18 órán át.
b) 400 mg (1,73 mmol), a fent leírtak szerint kapott N-védett savat feloldunk 7 ml N,N-dimetil-formamidban és az oldathoz 86 mg (3,63 mmol) 99%-os nátrium-hidridet adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten, 20-22 °C-on keverjük 2 óra hosszáig, majd beadagolunk 1,03 ml (8,65 mmol) benzil-bromidot, és folytatjuk a kevertetést szobahőmérsékleten további 18 órán át. Ezt követően meghígítjuk a reakcióelegyet etil-acetáttal, lehűtjük 0 °C-ra és 10%-os vizes citromsavoldattal pH 3-ra savanyítjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó sárga olajat kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, hexán és etilacetát 9:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 301 mg 4(S)-(benzil-oxi)-l-(tercbutoxi-karbonil)-pirrolidin-2(S)-karbonsav-benzil-észtert kapunk, a kitermelés 70%.
c) 301 mg (0,73 mmol) fenti, b) pont szerinti terméket feloldunk 4 ml 2:1 arányú metanol-víz elegyben. Az oldatot 0 °C-on keveqük, miközben 1,16 ml 2 M nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá, majd hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni, és további 18 óra hosszáig keveredni. A reakcióidő leteltével 10 ml 1:1 arányú dietil-éter-hexán elegyet, valamint 5 ml vizet adunk a reakcióelegyhez, azután a vizes részt elválasztjuk, kétszer egymást követően dietil-éter és hexán 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd lehűtjük 0 °C-ra és 10%-os vizes citromsavoldattal 3-as pH-júra savanyítjuk.
A megsavanyított vizes részt etil-acetáttal extraháljuk háromszor egymás után, majd az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, kétszer vízzel, azután egyszer telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül vákuumban bepároljuk. A párlási maradékot nagyvákuumban megszárítva kvantitatív kitermeléssel kapjuk a 4(S)-(benzil-oxi)-l-(terc-butoxikarbonil)-pirrolidin-2(S)-karbonsavat.
d) 234,7 mg (0,73 mmol) fenti, c) pont szerinti terméket annyi metilén-dikloridban oldunk, hogy 0,2 M koncentrációjú oldatot kapjunk, majd sorban hozzáadunk 127 μΐ (0,73 mmol) N,Ν-diizopropil-etil-amint,
84,4 μΐ (0,803 mmol) terc-butil-amint és 387 mg (0,876 mmol) [(benzo-triazol-l-il)-oxi]-trisz(dimetilamino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát)-ot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 3 órán át, miközben a pH-ját időnként ellenőrizzük, és szükség esetén Ν,Ν-diizopropil-etil-amin hozzáadásával 8-as értéken tartjuk. A reakcióidő leteltével az elegyet etil-acetáttal meghígítjuk, majd egymás után kétszer telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, egyszer vízzel és egyszer telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, majd a visszamaradó sárga olajat flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, hexán és etil-acetát előbb 7:3, azután 6:4 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Ilyen módon 252 mg, a címben megnevezett vegyületet kapunk, a kitermelés 92%.
Ή-NMR-spektrum (CDC13, δ): 7,40-7,25 (m, 5H); 6,05 (széles s, 1H); 4,6-4,35 (széles d, 2H); 4,2-4,05 (m, 2H); 3,8-3,55 (m, 2H); 2,55-2,1 (m, 2H); 1,46 (s, 9H); 1,20 (széles s, 9H).
2. példa l-[3(S)-Amino-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(S)(benzil-oxi)-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (4) általános képletű vegyület, amelynek képletében R1 jelentése terc-butil-csoport; Y jelentése benzil-oxicsoport; és az R’-NH-CO- általános képletű csoport, valamint az Y helyén álló csoport egymáshoz képest cisz-helyzetűek.
a) Bemérünk 250 mg (0,664 mmol), az 1. példa címében megnevezett vegyületet, feloldjuk 6 M dioxános hidrogén-klorid-oldatban, azután szobahőmérsékleten 20 percig keveqük, majd vákuumban szárazra pároljuk az elegyet. A párlási maradékot felvesszük 10 ml etilacetátban és 3 ml 2 M vizes nátrium-hidroxid-oldatban, majd 15 percnyi szobahőmérsékleten folytatott kevertetés után a szerves fázist elválasztjuk, nagyon kevés vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A párlási maradékot nagyvákuumban megszárítva kapjuk a 4(S)-(benzil-oxi)-N-(terc-butil)pirrolidin-2(S)-karboxamidot, amely egy (3) általános képletű vegyület, ahol a képletben R1 terc-butil-csoportot, Y benzil-oxi-csoportot jelent, és a karboxamidcsoport, valamint az Y helyén álló csoport egymáshoz képest cisz-helyzetűek.
b) A fenti termékhez 5 ml vízmentes etanolt, valamint 180 mg (0,604 mmol) 3(S)-[(benzil-oxi-karbonil)amino]-l,2(R)-epoxi-4-fenil-butánt - ez egy (2) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport [lásd a Β. K. Handa és munkatársai nevével korábban már idézett publikációt] - adunk, majd az elegyet 18 óra hosszáig visszafolyató hűtő alatt forraljuk, azután vákuumban szárazra pároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, kloroform és metanol előbb 39:1, majd 19:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot,
HU 215 520 Β aminek eredményeképpen 220 mg fehér hab formájában kapjuk a 4(S)-(benzil-oxi)-l-{3(S)-[(benzil-oxikarbonil)-amino]-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil}-N-(tercbutil)-pirrolidin-2(S)-karboxamidot. A kitermelés 63%.
c) 220 mg (0,384 mmol) fenti, b) pont szerinti terméket 5%-os csontszenes palládiumkatalizátor jelenlétében metanolban 1 atmoszféra nyomású hidrogéngázzal 3,5 óra hosszat hidrogénezünk, majd az így kapott cím szerinti vegyületet azonnal felhasználjuk a következő példában megadott kapcsolási reakcióhoz.
3. példa
4(S)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)pirrolidin-2(S)-karboxatnid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Val; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése benzil-oxi-csoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest císz-helyzetűek.
0,192 mmol, a 2. példa címében megnevezett vegyületet annyi metilén-kloridban oldunk, hogy 0,2 M koncentrációjú oldatot kapjunk, majd sorban hozzáadunk
33,4 μΐ (0,192 mmol) N,N-diizopropil-etil-amint, 53,1 mg (0,211 mmol) Z-Val-OH védett aminosavat és 102 mg (0,23 mmol) [(benzo-triazol-l-il)-oxi]trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát]-ot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 2.: óra hosszáig, miközben szükség szerint további N,N-diizopropil-etil-amin hozzáadásával a pH-ját 8-as értéken tartjuk. A reakcióidő leteltével az elegyet etil-acetáttal meghígítjuk, egymást követően kétszer telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, egyszer vízzel és egyszer telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, kloroform és metanol 39:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 108 mg fehér, szilárd termék formájában kapjuk a címben megnevezett vegyületet. A kitermelés 83%.
Tömegspektrum (FAB) m/z: 673,3 (M + H)+.
4. példa
4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[benzil-oxi-karbonil)valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Val; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése benzil-oxi-csoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest transz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy sorban követjük az 1., 2. és 3. példában leírtakat, de az 1. példa a) pontjában megadott 4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsav helyett azonos mennyiségű 4(R)-hidroxipirrolidin-2(S)-karbonsavat [ez a vegyület tulajdonképpen az S. G. Ramaswamy és E. Adams már idézett cikkében leírt transz-4-hidroxi-prolin] reagáltatunk.
A termék tömegspektruma (FAB) m/z: 673,3 (M + H)~.
5. példa
4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Asn; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése benzil-oxi-csoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest transz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy követjük az 1. és 2. példában leírt eljárást, de az 1. példa a) pontjában az ott megadott 4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsav helyett 4(R)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsav ekvivalens mennyiségét reagáltatjuk, majd az így kapott 1 -[3(S)-amino-4-fenil-2 R-hidroxi-butil]-4(R)-benziloxi)-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamiddal elvégezzük a következő kapcsolási reakciót:
mg (0,165 mmol) N,N’-diciklohexil-karbodiimid 2 ml tetrahidrofuránnal készült és 0 °C-ra hűtött oldatához 20,1 mg (0,148 mmol) 1-hidroxi-benzotriazolt adunk. A reakcióelegyet 15 percig keveijük, majd hozzáadjuk 395 mg (0,148 mmol) Z-Asn-OH védett aminosav 1 ml Ν,Ν-dimetil-formamidos, valamint 35,4 mg (0,083 mmol) már említett 1-[3(S)amino-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-(benzil-oxi)-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid ugyancsak 1 ml Ν,Ν-dimetil-formamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet lassan hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, 18 órán át keverjük, azután meghígítjuk etilacetáttal és mossuk telített, vizes nátrium-hidrogénkarbonáttal, vízzel, valamint telített nátrium-klorid-oldattal, majd magnézium-szulfáton szárítjuk, végül vákuumban bepároljuk. A visszamaradó fehér, szilárd anyagot flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, először etil-acetát és metanol 97:3 arányú, majd később 19:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott termék a címben megnevezett vegyület, amelynek a tömegspektruma (El) m/z: 689,2 (M + 2H))+.
Szükségesnek tartjuk megjegyezni, hogy a fenti kapcsolási reakció kivitelezése során alkalmazott kondenzálószer, nevezetesen: N,N’-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében az 1-hidroxi-benzo-triazol különösen előnyös reagensnek bizonyult olyan (1) általános képletű vegyületek előállításához, amelyek képletében B jelentése az aszparaginsavból származtatható aminosav-maradék.
6. példa
4(S)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Asn; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése benzil-oxi-csoport; az R'-NH-CO— általános képletű
HU 215 520 Β csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest cisz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy követjük az 1. és 2., valamint az 5. példában megadott eljárást.
A termék tömegspektruma (FAB) m/z: 688,4 (M + H)+; 710,4 (M + Na)+.
7. példa l-[3 (S)-{[N-(Benzil-oxi-karbonil)-valil]-am ino}-4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(S)-izobutoxipirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Val; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése izobutoxicsoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest cisz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy követjük az 1., 2. és 3. példában megadott eljárást, de az 1. példa b) pontjában benzil-bromid helyett ekvivalens mennyiségű izobutil-bromidot reagáltatunk.
Az így kapott termék tömegspektruma (El) m/z:
583,4 (MH2-C4H9)+.
8. példa l-[3 (S)-{[N- (Benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(R)-izobutoxipirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Val; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése izobutoxicsoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest transz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy követjük az 1., 2. és 3. példában leírtakat, de az 1. példa a) pontjában megadott 4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karbonsav helyett ekvivalens mennyiségű 4(R)-hidroxi-pirrolidin2(S)-karbonsavat, a b) pontjában megadott benzil-bromid helyett pedig ekvivalens mennyiségű izobutil-bromidot reagáltatunk.
A kapott termék tömegspektruma (El) m/z: 583,3 (MH2-C4H9)+.
9. példa
4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-ciklopropil-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Val; R' jelentése ciklopropilcsoport; és Y jelentése benzil-oxi-csoport; az R'-NH-CO- általános képletű csoport és az Y helyén álló csoport egymáshoz képest transz-helyzetűek.
A vegyületet úgy állítjuk elő, hogy pontosan követjük az 1., 2. és 3. példában leírtakat, de az 1. példa a) pontjában megadott 4(S)-hidroxi-pirrolidin-2(S)karbonsav helyett ekvivalens mennyiségű 4(R)-hidroxipirrolidin-2(S)-karbonsavat, továbbá az 1. példa d) pontjában megadott terc-butil-amin helyett ciklopropilamint reagáltatunk.
A kapott termék tömegspektruma (El) m/z:
657,5 (M + H)+.
10. példa
A 4-Benzil-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(tercbutil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 4(R,S)-, 4(R)- és 4(S)-izomerjeinek előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése benzil-oxi-karbonil-csoport; B jelentése Asn; R* jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése benzilcsoport.
F. Soucy, D. Wmic és P. Beaulieu fentebb már idézett eljárását követve, szerin-laktonból és 3-fenil-2propenil-bromidból a 4-benzil-l-(terc-butoxi-karbonil)-pirrolidin-2(S)-karbonsav 4(R)- és 4(S)-diasztereomerjeinek 3:2 tömegarányú keverékét kapjuk. Ezt a diasztereomer keveréket az 1. példa d) pontjában leírtak szerint, [(benzo-triazol-l-il)-oxi]-trisz(dimetilamino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát] jelenlétében terc-butil-aminnal összekapcsoljuk, amikor is a termék a 4-benzil-N-(terc-butil)-1 -(terc-butoxi-karbonil)pirrolidin-2(S)-karboxamid 4(R)- és 4(S)-izomerjeinek a keveréke. A következő lépésben a diasztereomer keverékből a 2. példa b) pontjában megadott eljárással előállítjuk a 4-benzil-l-{3(S)-[(benzil-oxi-karbonil)amino]-4-fenil-2(S)-hidroxi-butil}-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamidot, amelyet szintén a 4(R)- és 4(S)-izomerek keverékeként kapunk, a termék tömegspektruma (FAB) m/z: 558 (M + H)+. A szintézist most úgy folytatjuk, hogy az 5. példában leírtak szerint a fenti vegyülethez - a diasztereomerek keverékéből álló termékről van szó hozzákapcsoljuk a Z-Asn-OH N-védett aminosavat, aminek eredményeképpen most már a 4-benzil-l-[3(S)- {N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 4(R)- és 4(S)-izomerjeinek keverékéhez jutunk, ennek a terméknek a tömegspektruma (FAB) m/z: 672 (M + H)+.
A két izomert nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással választjuk szét a tiszta 4(R)- és 4(S)-izomerekre. Eszerint a fenti termékből egy 20 mg-os mintát feloldunk 2,5 ml 50%-os ecetsavban, és az oldatot rávisszük egy 0,94x50 cm méretű, Whatman Magnum 9*, C18 oktadecil-szilil kolonnára. Az eluálás kezdetekor az A szivattyú 10%, a B szivattyú 90% oldószert szállít [az A oldószer: 0,06% trifluor-ecetsav acetonitrilben; a B oldószer: 0,06% trifluor-ecetsav vízben]. Amikor megjelenik az ecetsavnak megfelelő csúcs - ez tulajdonképpen az oldószerfront - lineáris grádiens mellett folytatjuk az eluálást a következőképpen: 10-30% A oldószer 5 percig, 30% A oldószer 10 percig, 30-100% A oldószer 110 percig. Az átfolyási sebesség 3 ml/perc, a detektor 230 nm-nél dolgozik. Az elválasztandó izomerek közül a 4(R)-izomer 60%-os A oldószeraránynál jön le a kolonnáról, a tömege 9,2 mg, míg a 4(S)-izomer 63% A oldószeraránynál jelentkezik, a tömege 8,3 mg.
HU 215 520 Β
11. példa
N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletű vegyület, amelynek képletében X jelentése 2-kinolil-karbonil-csoport: B jelentése Val; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése 2pirimidinil-tio-csoport.
a) 17,5 g (75,6 mmol), az 1. példa a) pontjában leírtak szerint előállított N-védett savat feloldunk 300 ml metilén-dikloridban, majd előbb 13 ml (76,6 mmol) Ν,Ν-diizopropil-etil-amint és 8,73 ml (83,1 mmol) tercbutil-amint, azután 40 g (90,7 mmol) [(benzo-triazol-1il)-oxi]-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluorofoszfát]-ot, valamint újabb 13 ml (76,6 mmol) Ν,Νdiizopropil-etil-amint adunk az oldathoz. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 7 óra hosszáig, majd etil-acetáttal meghígítjuk és egymást követően kétszer telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, kétszer vízzel, valamint kétszer telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül szárazra pároljuk. A visszamaradó szilárd anyagot dietiléter és etil-acetát 9:1 arányú elegyével eldörzsöljük, azután szűrőre visszük, dietil-éterrel mossuk és szárítjuk. Az így kapott N-(terc-butil)-1-(terc-butoxi-karbonil)4(R)-hidroxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid tömege 15,6 g, a kitermelés 72%.
b) 5,0 g (17,5 mmol) fenti, a) pont szerinti terméket feloldunk 175 ml 3:1 arányú toluol-tetrahidrofuránelegyben. Az oldathoz szobahőmérsékleten 5,72 g (21,8 mmol) trifenil-foszfint és 1,08 g (30,5 mmol) imidazolt adunk, azután felmelegítjük az elegyet 40-50 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten hozzáadunk 5,54 g (21,8 mmol) jódot. 80 percig 45-50 °C-on erélyesen keveijük a reakcióelegyet, majd lehűtjük és dietilétert, valamint vizet adunk hozzá, azután a szerves fázist elválasztjuk, mossuk egyszer telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és egyszer telített nátrium-klorid-oldattal, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül szárazra pároljuk. A visszamaradó barna olaj kevés szilárd trifeníl-foszfin-oxidot tartalmaz. Ezt a maradékot előbb dietil-éterrel eldörzsöljük és a szilárd anyagot kiszűrjük, majd a szűrletet ismét bepároljuk, és az így visszamaradt olajat flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, etil-acetát és hexán 1:4 arányú elegyével eluálva az oszlopot. A kapott 4,83 g sárga, szilárd termék az N-(terc-butil)-1 -(terc-butil-oxi-karbonil)-4(S)-jód-pirrolidin-2(S)-karboxamid, a kitermelés 70%.
*H-NMR-spektrum (CDC13, δ): 6,2-6,0 (széles s, 1H); 4,27-4,0 (m, 3H); 3,75-3,55 (m, 1H); 2,9-2,5 (m, 2H); 1,47 (s, 9H); 1,38 (s, 9H).
c) Bemérünk 182 mg (7,57 mmol) 99%-os nátriumhidridet és 10 ml Ν,Ν-dimetil-formamidot, a szuszpenziót lehűtjük 0 °C-ra, és ezen a hőmérsékleten kis részletekben beadagolunk 1,06 g (9,46 mmol) 2pirimidintiolt. Az elegyet 0 °C-on keveijük 30 percig, majd hozzácsepegtetjük 1,5 g (3,79 mmol) fenti, b) pont szerinti termék 5 ml Ν,Ν-dimetil-formamiddal készült oldatát. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten keverjük 18 órán át, majd etil-acetáttal és vízzel, kétszer 1 M vizes nátrium-hidroxid-oldattal, valamint egyszer telített nátrium-klorid-oldattal, magnéziumszulfát felett szárítjuk, végül az oldószert elpárologtatjuk. A visszamaradó szilárd anyagot dietil-éterrel eldörzsölve, piszkosfehér színű, szilárd termékként kapjuk az N-(terc-butil)-l-(terc-butoxi-karbonil)-4(R)-[(2pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamidot.
Ή-NMR-spektrum (CDC13, δ): 8,53-8,51 (d, J = 4,85 Hz, 2H); 7,01-6,96 (t, J = 4,85 és 10,0 Hz, 1H); 5,97-5,75 (széles s, 1H); 4,4-4,2 (m, 2H); 4,1-3,91 (m, 1H); 3,70-3,35 (m, 2H); 2,92-2,75 (m, 1H); 1,47 (s, 9H); 1,36 (s,9H).
Tömegspektrum (FAB) m/z: 381 (M + H)+,
403 (M + Na)+.
d) A 2. példa a) és b) pontjában leírtak szerint a fenti termék védőcsoportját lehasítjuk, és a keletkezett pirrolidinszármazékot reagáltatjuk a megfelelő (2) általános képletű epoxiddal, amelynek képletében X jelentése terc-butoxi-karbonil-csoport. Az így kapott N-(tercbutil)-l-{3(S)-[(terc-butoxi-karbonil)-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin2(S)-karboxamid tömegspektruma (FAB) m/z: 544 (M + H)+, 566 (M + Na)+. A vegyületet megint csak a 2. példa a) pontjában leírtak szerint reagáltatva megszabadítjuk a védőcsoporttól, azután követve a 3. példában megadott eljárást, hozzákapcsoljuk a Boc-Val-OH védett aminosavat, aminek eredményeképpen az N-(tercbutil)-1 - [3 (S)- {[N-(terc-butoxi-karbonil)-valil]-amino}4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamidot kapjuk.
Tömegspektrum (FAB) m/z: 643 (M + H)+,
655 (M + Na)+.
e) 887 mg (1,38 mmol) fenti, d) pont szerinti terméket 7 ml 6 M dioxános hidrogén-klorid-oldattal szobahőmérsékleten keverünk 20 percig, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A visszamaradó fehér, szilárd anyagot nagyvákuumban szárítjuk 20 percig, azután az így kapott, a védőcsoportjától megszabadított amin-hidroklorit-sót feloldjuk 7 ml metiléndiklorid és 481 pl (2,76 mmol) N,N-diizopropil-etilamin elegyében, majd 263 mg (1,52 mmol) 2kinolinkarbonsavat, valamint 732 mg (1,66 mmol) [(benzo-triazol-1 -il)-oxi]-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát]-ot adunk az oldathoz. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 5 óra hosszáig, miközben a pH-ját rendszeresen ellenőrizzük és - ha szükséges - további N,N-diizopropil-etil-amin hozzáadásával 8-as értéken tartjuk. A reakcióidő leteltével az elegyet etil-acetáttal meghígítjuk, azután egymást követően telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer, vízzel kétszer és telített nátriumklorid-oldattal egyszer mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül vákuumban szárazra pároljuk. A viszszamaradó színtelen olajat flash-kromatográfiás eljárással szilikagélen tisztítjuk, hexán és etil-acetát előbb 3:7 arányú, majd 1:9 arányú elegyével eluálva az oszlopot. A megfelelő frakciók bepárlásakor a cím szerinti vegyület 750 mg (78%) fehér hab formájában marad vissza, amelyet dietil-éterrel eldörzsölve 378 mg fehér, szilárd terméket kapunk. Ez a termék, amint azt az
HU 215 520 Β
NMR-spektrum is bizonyítja, a címben megnevezett vegyület, a kitermelés 40%.
A tömegspektruma (FAB) m/z: 698 (M + H)+, 720 (M + Na)+.
Mindenben a fent leírt eljárást követve, azonban a c) pontban megadott 2-pirimidintiol helyett 4-hidroxi-2,6dimetil-pirimidint reagáltatva, az N-(terc-butil)-4R[(2,6-dimetil-pirimidin-4-il)-oxi]-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]pirrolidin-2(S)-karboxamidot kapjuk.
Tömegspektrum (FAB) m/z: 710 (M + H)+,
586 (Μ + H - C6HgN2O)+.
12. példa
N-(terc-Butil)-l-[3(S)-{[(2,6-dietil-fenoxi)-acetil]amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid előállítása (1) általános képletü vegyület, amelynek képletében X jelentése (2,6-dimetil-fenoxi)-acetil-csoport; B jelentése vegyértékvonal; R1 jelentése terc-butil-csoport; és Y jelentése 2-pirimidinil-tio-csoport.
All. példa d) pontjában leírtak szerint előállított N-(terc-butil)-1 - {3 (S)-[N-(terc-butoxi-karbonil)-amino]4-fenil-2(R)-hidroxi-butil}-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]pirrolidin-2(S)-karboxamidot, a szokásos módon eltávolítva a terc-butoxi-karbonil-csoportot a molekulából, átalakítjuk a megfelelő primer aminná, majd ezt a 3. példában megadott eljárást követve, (2,6-dimetil-fenoxi)-ecetsawal összekapcsoljuk. Az így kapott termék a címben megnevezett vegyület, amelynek a tömegsprektuma (FAB) m/z: 606 (M + H)+, 628 (M + Na)+.
Mindenben az itt leírtak szerint eljárva, de szabad aminocsoportot hordozó reaktánsként az N-(terc-butil)l-[3(S)-amino-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-{[(3-piridil)-metil]-tio} -pirrolidin-2(S)-karboxamidot reagáltatva, amely all. példában az N-(terc-butil)-l-[4-fenil2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-4(R)-{[(3-piridil)-metil]-tio}-pirrolidin2(S)-karboxamid előállításánál szolgált köztitermékként, az N-(terc-butil)-l-[3(S)-{[(2,6-dimetil-fenoxi)acetilj-amino} -4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)- {[(3-piridil)-metil]-tio} -pirrolidin-2(S)-karboxamidot kapjuk. A termék tömegspektruma (FAB) m/z: 619 (M + H)+, 641 (M + Na)+.
13. példa
Rekombináns HIV-proteáz aktivitásának meghatározása nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel, és a hatóanyagok gátló hatásának vizsgálata
Enzim:
A HIV-proteázt E. coli baktériumban expresszáljuk, amelyhez W. G. Farmeri e és munkatársai szerint [Science 236,305 (1987)] pBRTl prt+-vektort konstruálunk.
A továbbiakban az összes oldat, ha külön nem jelezzük, vizes oldatot jelent.
i) Fermentáció pBRTl prt+-plazmiddal bíró E. coli sejtekből 100 pg/ml ampicillint tartalmazó Luria-Bertani-féle tápoldatban oltótenyészetet készítünk. A palackokat rázatás mellett 37 °C-on inkubáljuk 17 órán át. A termelő palackokat, amelyek 100 μg/ml ampicillinnel adalékolt M9 tápoldatot tartalmaznak, 1 térfogatszázalék fenti oltótenyészettel beoltjuk. A termelő palackok kétliteres Erlenmeyer-lombikok, amelyek mindegyike 500 ml fermentlevet tartalmaz. A palackokat rázatás mellett 37 °C-on inkubáljuk mindaddig, amíg a sejtkoncentráció a λ = 540 pm-nél hígítás nélkül mért 0,6-os optikai sűrűségnek megfelelő értéket eléri, ez az időtartam általában 3-4 óra. Ekkor a palackokhoz 5 mM koncentrációnak megfelelő mennyiségű izopropil-tiogalaktozidot (IPTG, Research Organics, Cleveland, Ohio, USA) adunk, és folytatjuk az inkubálást, amíg a sejtkoncentráció eléri a 16-szoros hígításnál mért 0,2-es optikai sűrűségnek megfelelő értéket. A fermentlevekhez most 1 mM koncentrációnak megfelelő benzil-szulfonilfluoridot (PMSF) adunk, azután gyorsan lehűtjük 4 °Cra. A baktériumsejteket 4 °C-on végzett centrifugálással nyeljük ki, és a nedves pelletet -70 °C-on tároljuk.
ii) A méréshez megfelelő tisztaságú enzim kinyerése és előkészítése
Más adat hiányában az itt tárgyalt összes műveletet 4 °C-on végezzük. A felengedett sejteket 1 rész sejtre számítva 9 rész A pufferoldattal - az A pufferoldat összetétele: 50 mM 2-amino-2-(hidroxi-metil)-l,3-propán-diol-hidroklorid (írisz HC1, pH = 7,4); 0,6 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA); 0,375 M nátrium-klorid; 0,2% Nonidet P-40® (BDH Chemicals Ltd., Poole, UK); és 1 mM benzil-szulfonil-fluorid (PMSF) - szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 1 rész nedves sejttömegre számítva 2 rész diatómaföldet (Celite 545®, John Manville, Lompoc, CA. USA) adunk, majd egy Waring® ipari keverővei mintegy 20 000 fordulat/perc sebességnél, 8x15 másodperces periódusokkal homogenizáljuk. A sejttörmelék Celite® elválasztását centrifugálással végezzük, azután a kapott pelletet a nedves tömegre számított 4,5 rész A pufferoldattal a fent leírt homogenizálási műveletet megismételve extraháljuk. A két homogenizálás során kapott felülúszót egyesítjük, és az oldódó fehérjéket szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával - a mennyiséget úgy választjuk meg, hogy 75%ban telített oldatot kapjunk - kicsapjuk. Az elegyet 60 percig keveijük, majd a kicsapott sejteket centrifugálással elkülönítjük. Az így nyert pelletet B pufferoldatban - a B pufferoldat összetétele: 50 mM Tris-HCl, pH = 8; 30 mM nátrium-klorid; 1 mM DL-ditiotreit (DTT); 1 mM EDTA; 1 mM PMSF; és 10% glicerin- szuszpendáljuk és 18 órán át ugyanezen pufferoldattal szemben dializáljuk.
A dializált extraktumból kiveszünk egy 150 mg fehérjét tartalmazó részt, és felvisszük egy 70 cm hosszú,
2,5 cm átmérőjű Sephadex A25® ioncserélő oszlopra (Pharmacia, Uppsala, Sweden). A mintát izokratikus körülmények között B pufferoldattal egyenletes, 10 cm/óra sebességet biztosítva eluáljuk, a HIV-proteáz aktivitást mutató frakciókat (a vizsgálat menetét lásd később) egyesítjük, és az oldott fehérjét telített, vizes ammónium-szulfát-oldat hozzáadásával - a mennyiséget úgy választjuk meg, hogy a végső koncentráció a
HU 215 520 Β telítési koncentráció 85%-a legyen - kicsapjuk. A kicsapott fehérjét centrifugálással elkülönítjük, és a pelletet C pufferoldatban - a C pufferoldat összetétele: 50 mM 2-(4-morfolino)-etán-szulfonsav (MES), pH = 5,5; 150 mM nátrium-klorid; 1 mM DTT; 1 mM EDTA; és 10% glicerin - oldjuk, 18 órán át C pufferoldattal szemben dializáljuk, végül -70 °C-ra hűtve lefagyasztjuk. Az összes nyers extraktumot 150 mg fehérjét tartalmazó adagokban az itt leírt módon megtisztítjuk, majd az összes fehéijepreparátumot egyesítjük, azután 34 μΐ-es részekre osztva, -70 °C-on tároljuk. Tipikus esetben 20 liter fermentléből összesen 300 mg fehérjét kapunk, amelynek a fajlagos HIV-proteáz aktivitása olyan, hogy minden mg-ja 18,2 mmol szubsztrátot képes elhasítani percenként.
A fenti módon kiadagolt fehéijepreparátumokat felhasználás előtt pufferoldattal (lásd később) az eredeti koncentráció 38-szorosára hígítjuk, így kapjuk az enzim-munkaoldatot.
Szubsztrát:
Szubsztrátként a 1164 dalton molekulatömegű VSFNFPQITL-NH2 [lásd Krausslich et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 807 (1989)] dekapeptidet - ez az úgynevezett egybetűs kóddal jelölt pepiid megfelel a Val-Ser-Phe-Asn-Phe-Pro-Gln-Ile-Thr-Leu szekvenciának - használjuk.
A szubsztrátból 10 mM dimetil-szulfoxidos törzsoldatot készítünk, és azt 4 °C-on tároljuk. Közvetlenül a felhasználás előtt a törzsoldatot pufferoldattal meghígítjuk, hogy 400 μΜ koncentrációjú oldatot kapjunk, ez az úgynevezett szubsztrát-munkaoldat.
Pufferoldat:
2-Morfolino-etánszulfonsavat (100 mM), káliumkloridot (300 mM) és etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA; 5 mM) feloldunk 90 ml desztillált vízben, majd az oldat pH-ját tömény, vizes nátrium-hidroxid-oldattal 5,5-ös értékre állítjuk be. Ezt az oldatot ezután 100 ml-re hígítjuk vízzel, és ebben a formában használjuk pufferoldatként.
A mérés kivitelezése:
1) A méréshez szükséges reakcióelegyet úgy állítjuk össze, hogy bemérünk 20 μΐ szubsztrát-munkaoldatot, 10 μΐ, a vizsgálati anyagból 10%-os dimetil-szulfoxiddal készült oldatot és 10 μΐ enzim munkaoldatot.
2) A reakcióelegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.
3) A reakcióelegyhez 200 μΐ 2%-os trifluor-ecetsavat adva, leállítjuk a reakciót.
4) A szubsztrátot és a hasítási termékeket - ezek: VSFNF és PQITL-NH2 - elválasztjuk oly módon, hogy 100 μΐ, trifluor-ecetsavval kezelt reakcióelegyet rávi40 szünk egy Perkin-Elmer 3x3 CRC8 nagynyomású folyadékkromatográfiás kolonnára (Perkin Elmer Inc., Norwalk, CT, USA), majd a kolonnát lépcsőzetes grádienst alkalmazva 4 ml/perc átfolyási sebességei eluáljuk.
A lépcsőzetes grádienst a következőképpen hozzuk létre:
0,0-0,5 perc, 70% A oldat 130% B oldat;
0,5-3,0 perc, 67% A oldat / 33% B oldat;
3,0-5,0 perc, 20% A oldat / 80% B oldat;
5,0-6,5 perc, 70% A oldat / 30% B oldat;
ahol az A oldat 3 mM nátrium-dodecil-szulfát
0,05%-os vizes foszforsavoldatban; a B oldat 0,05% foszforsav acetonitrilben. Az eluálást 210 nm-nél monitorozzuk.
5) A kontrollként szolgáló mérés során a vizsgálati 15 anyagot nem tartalmazó reakcióeleggyel elvégezzük a
2)—4) pont alatti műveleteket.
Az inhibitor hatás kiértékelése:
A hasítási termékek, illetve a változatlan szubsztrát mennyiségét nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel vagy a csúcsmagasságok alapján, vagy a csúcsterület integrálásával állapítjuk meg. Az átalakult szubsztrát %-ban kifejezett mennyiségét az alábbi képlettel számítjuk ki:
a termékek csúcsmagasságának, illetve csúcsterületének összege
Konverzió (%) =- χ 100 a szubsztrát és a termékek csúcsmagasságának, illetve
3q csúcsterületének összege
A vizsgálati hatóanyag inhibitor hatásának kiszámítása a következőképpen történik:
konverzió (%) a reakcióelegyben
Gátlás (%) =100---- x 100 konverzió (%) a kontrollkísérletben
Az IC50-értéket, vagyis azt a koncentrációt, amely mellett a vizsgálati anyag a HIV-proteáz aktivitásának 50%-os gátlását okozza, úgy határozzuk meg, hogy legalább három különböző koncentrációnál megmérjük és kiszámítjuk a hatóanyagnak az enzimre gyakorolt gátló hatását, majd az így kapott adatokból grafikusan ábrázoljuk a százalékos gátlást a koncentráció függvényében, és a görbe alapján megkeressük az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció értékét.
Az 1. táblázatban az (1) általános képletű vegyületek köréből kiválasztott hatóanyagok IC50-értékét adjuk meg a fenti, a rekombináns HIV-proteáz gátlását alapu50 ló mérések alapján.
1. táblázat
Sorszám A vegyület neve IC50(nM)
1. 4(S)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)- hidroxi-butil)-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 150
2. 4(R)-(Benzil-oxi)-1 - [3(S) - {[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino} -4-fenil-2(R)hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 16
HU 215 520 Β
I. táblázat (folytatás)
Sorszám A vegyület neve IC50 (nM)
3. 4(R)-(Benzil-oxi)-1 -[3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil] -amino} -4-fenil2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 39
4. 4(S)-(Benzil-oxi)-1 -[3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparagmil]-amino} -4-fenil2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 300
5. l-[3(S)-([N-(Benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc- butil)-4(S)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid 745
6. l-[3(S)-{[N-(Benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc- butil)-4(R)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid 180
7. 4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino)-4-fenil-2(R)- hidroxi-butil]-N-ciklopropil-pirrolidin-2(S)-karboxamid 100
8. 4(R)-Benzil-1 -[3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino)-4-fenil-2(R)hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 48
9. 4(S)-Benzil-l-[3(S)-{(N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)- hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 780
10. N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{(N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}- butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 4,7
11. N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-([N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}- butil]-4(R)-{[(3-piridil)-metil]-tio}-pirrolidin-2(S)-karboxamid 12
12. N-(terc-Butil)-4(R)-[(2,6-dimetil-pirimidin-4-il)-oxi]-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 9,4
13. N-(terc-Butil)-l-[3(S)-{[(2,6-dimetil-fenoxi)-acetil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi- butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 4,6
14. N-(terc-Butil)-l-[3(S)-{[(2,6-dimetil-fenoxi)-acetil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxibutiI]-4(R) {(3-piridil)-metil-tio} -pirrolidin-2(S)-karboxamid 43
14. példa
Az (1) általános képletű vegyületek közül a vírusellenes hatásúak kiszűrésére a korábban már idézett publikációban Harada és munkatársai által leírt módszert, az 1-es típusú humán T-sejt leukémiavírus (HTLV-I) által transzformált sejtek alkalmazásával történő, plakkszámlálásos technikát adaptáltuk, és ezt az eljárást közöljük az alábbiakban. A HTVL-I által transzformált sejtek alkalmazását az indokolja, hogy ezekben a sejtekben a HÍV replikációja viszonylag gyors.
1) A vizsgálati anyagot annyi dimetil-szulfoxidban oldjuk, hogy 5 g/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. Az oldatot felhasználásig 4 °C-on tároljuk.
2) A fenti oldatot RPMI 1640 (Gibco Laboratories, St. Lawrence, MA, USA) tápoldattal hígítjuk olyan módon, hogy a végső koncentrációnál, amely mellett a vizsgálatot végezzük, négyszer töményebb oldatot kapjunk. Amikor az RPMI 1640 tápoldattal a hígítást elvégeztük, az oldatot 4 órán belül fel kell használni a vizsgálathoz.
3) Egy 96 kísérleti helyes, lapos fenekű mikrotitráló tálcára, mindig 3 párhuzamos kísérletet indítva, a fenti négyszeres töménységű oldatból 50-50 μΐ-t mérünk ki. A kontrolikísérlethez 50 μΐ RPMI 1640 tápoldatot veszünk.
4) A mikrotitráló tálcára szétosztott elegyekhez 50 μΐ, HEPES-pufferrel 7,2-es pH-júra beállított és 10% hőkezeléssel inaktivált magzati boíjúszérummal (FCS = fetal calf serum), valamint 2,5 μΐ/ml gentamicinnel adalékolt, komplett RPMI 1640 tápoldatban 5 χ 104 C8166 sejtet adunk.
5) 100 μΐ komplett tápoldatban a TCID50 (TCID50 = médián tissue culture infectious doses; a szövettenyészet sejtjeinek 50%-át megfertőző dózis) ötvenszeresének megfelelő mennyiségű H9/HTLV-IHB törzsoldatot (ezt a sejttenyészet felülúszójaként, 50% magzati boíjúszérummal kiegészített formában, cseppfolyós nitrogénben tároljuk) adunk minden egyes kísérleti mintához. A vírustörzsoldat titerét előzőleg C8166 sejteken végponthígítá40 sós módszerrel határozzuk meg, a törzsoldat titere -193 °Con történő tárolás mellett 6-12 hónapig nem változik.
6) A mikrotitráló tálcát vízszintes polcrendszerű, 37 °C-os, 5% szén-dioxidot tartalmazó, nedvesített légkörű inkubátorba helyezzük 72 órára.
7) A tálcákat kivesszük, és minden egyes kísérleti helyen fáziskontraszt mikroszkóp alatt megszámoljuk a szinciciális centrumokat. Minden sejtcsomót, amelyikről kétségtelenül megállapítható a szinciciumképződés, egyetlen szinciciális centrumnak számolunk. A kontroll50 kísérleteknél egy-egy helyen 25-75 szinciciális centrumot kell találnunk.
8) A szinciciumképződés százalékos gátlását az alábbi képlettel számítjuk ki:
szinciciális centru- szinciciális cent55 mok száma a kont--rumok száma rollkísérletben hatóanyag jelenlétében
Gátlás (%) = lOOxszinciciális centrumok θθ száma a kontrolikísérletben
HU 215 520 Β
Az EC50-értékeket, vagyis a vizsgálati hatóanyagoknak azt a koncentrációját, amely a szinciciumképződést 50%-ban gátolja, 3 lépéses sorozathígításos technikával határozzuk meg. A %-ban kifejezett gátlás mértékét a koncentráció függvényében ábrázoljuk, megszerkesztjük a görbét, és a görbe segítségével megkeressük az 50%-os gátláshoz tartozó koncentrációt.
A 2. táblázatban megadjuk a fenti vizsgálattal kapott eredményeket az (1) általános képletű vegyületek közül kiválasztott néhány hatóanyagra.
2. táblázat
Sorszám A vegyület neve EC50 (nM)
1. 4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)- hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 600
2. 4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4- fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 600
3. l-[3(S)-{[N-(Benzil-oxi-karbonil-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N- (terc-butil)-4(R)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid 3000
4. 4(R)-(Benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)- hidroxi-butil]-N-ciklopropil-pirrolidin-2(S)-karboxamid 900
5. 4(R)-Benzil-1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino} -4-fenil2(R)-hidroxi-butilJ-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 700
6. 4(S)-Benzil-1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino} -4-fenil-2(R)hidroxibutil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid 4000
7. N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]amino} -butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 250
8. N-(terc-Butil)-I-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]amino} -buti 1] -4(R)- {[(3-piridil)-metil-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 480
9. N-(terc-Butil)-4(R)-[(2,6-dimetil-pirimidin-4-il)-oxi]-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi- 3(S)-{[N-(2-kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-pinOlidin-2(S)-karboxamid 390
10. N-(terc-Butil)-1 -[3 (S)- {[(2,6-dimetil-fenoxi)-acetil]-amino} -4-fenil-2(R)-hidroxibutil]-4(R)-[(2-pirimidiniI)-tío]-pirrolidin-2(S)-karboxamid 250
További (1) általános képletű vegyületek:
N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-4(R)-(fenil-szulfonil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-4(R)-[(2-piridil)tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil)-4(R)-[(4-piridil)tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-4(R)-[(4,6-dimetil-pirimidin-2-il)tio)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-kinolilkarbonil)-valil]-amino}-butil]-pirrolidin-2(S)karboxamid,
N-(terc-Butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2piridil-karbonil)-valil]-amino} -butil)-4(R)-fenoxipirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2piridil-karbonil)-aszparaginil]-amino}-butil]-4(R)fenoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-Ciklopentil-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2kinolil-karbonil)-leucil]-amino}-butil)-4(R)-(fenilszulfonil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
-[4-Fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2-kinolilkarbonil)-valil]-amino}-butil]-N-izopropil-4(R)-[(2piridil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-Ciklopropil-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(3kinolil-karbonil)-aszparaginil]-amino}-butil]-4(R)-[(4piridil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-2(S)- {[N-(2kinolil-karbonil)-izoleucil]-amino} -butil] -4(R)- [(240 pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-4(R)-[(4,6-dimetil-pirimidin-2-il)tio]-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-naftoil)-valil]amino}-butil]-pÍHolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(245 piridil-karbonil)-izoleucil]-amino}-butil]-4(R)-fenoxipirrolidin-2(S)-karboxamid,
N-(terc-Butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2piridil-karbonil)-aszparaginil]-amino}-butil]-4(R)(fenil-tio)-pirrolidin-2(S)-karboxamid.

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    55 1. Eljárás (1) általános képletű vegyületek - a képletben
    X jelentése R2-O-CO-, R2-CO- vagy
    R2A_O-CH2-CO- általános képletű csoport, ahol R2 jelentése 1-6 szénatomos alkil-, fenil-(l-6 szénθθ atomos alkil)- vagy 2-kinolil-csoport,
    HU 215 520 Β
    R2A jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono-, di- vagy triszubsztituált fenilcsoport;
    B jelentése kémiai kötést kifejező vegyértékvonal vagy -NH-CHR4 -CO- általános képletű kétértékű csoport, ahol;
    R4 jelentése adott esetben karboxicsoporttal monoszubsztituált 1 -6 szénatomos alkilcsoport;
    R1 jelentése 1-6 szénatomos alkil- vagy 3-6 tagszámú cikloalkilcsoport; és
    Y jelentése benzilcsoport vagy egy V-(CH2)„-Wáltalános képletű csoport, ahol V jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono- vagy diszubsztituált piridil- vagy pirimidilcsoport,
    W jelentésa oxigén- vagy kénatom és n értéke 0 vagy 1 és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására - ahol a képletben X, R1 és Y jelentése a tárgyi körben megadott, B pedig kémiai kötést kifejező vegyértékvonalat jelent - egy (2) általános képletű epoxidot egy (3) általános képletű pirrolidin-karboxamiddal reagáltatunk, ahol a képletekben X, R1 és Y jelentése a fenti; vagy
    b) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására - ahol X jelentése R2-CO- vagy R2A-O-CH2-COáltalános képletű csoport, ahol R2 és R2A jelentése a tárgyi körben megadott, B vegyértékvonalat jelent, továbbá R1 és Y jelentése a tárgyi körben megadott - egy (4) általános képletű vegyületet - ahol R1 és Y jelentése a fenti - egy X-OH általános képletű karbonsav, ahol X jelentése a fentiekben megadott, valamely reaktív származékával reagáltatunk; vagy
    c) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására ahol X, R> és Y jelentése a tárgyi körben megadott, B jelentése pedig egy -NH-CHR4-CO- általános képletű kétértékű csoport, ahol R4 jelentése a tárgyi körben megadott - egy (4) általános képletű vegyületet - ahol R1 és Y jelentése a fenti - valamely kondenzálószer jelenlétében összekapcsolunk egy X-NH-CHR4-COOH általános képletű α-aminosavval, ahol a képletben X és R4 jelentése a fenti; vagy
    d) olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására - ahol X jelentése R2-CO- vagy R2A-O-CH2-COáltalános képletű csoport, B jelentése egy -NH-CHR4-CO- általános képletű kétértékű csoport, ahol a képletekben R2, R2A és R4 jelentése a tárgyi körben megadott, továbbá R1 és Y jelentése a tárgyi körben megadott - egy (5) általános képletű vegyületet - ahol R1, R4 és Y jelentése a fenti - egy X-OH általános képletű karbonsav, ahol X jelentése a fenti, valamely reaktív származékával reagáltatunk;
    és kívánt esetben a fenti a), b), c) vagy d) eljárással kapott (1) általános képletű vegyületet gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk.
    Elsőbbsége: 1993. 03. 12.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi vegyületek valamelyikének előállítására
    4(S)-(benzil-oxi)-1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(tercbutil)-pirrolidin-2-(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(S)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino} -4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(S)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid, l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(R)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-1 -[3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-ciklopropil-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-benzil-1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)~aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(S)-benzil-1 - [3 (S) - {[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    N-(terc-butil)-1 -[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)- {[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino}-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    N-(terc-butil)-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2kinolil-karbonil)-valil]-amino} -butil]-4(R)- {[(3-piridil)-metil]-tio}-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    N-(terc-butil)-4(R)-[(2,6-dimetil-pirimidin-4-il)oxi]-l-[4-fenil-2(R)-hidroxi-3(S)-{[N-(2-kinolilkarbonil)-valil]-amino}-butil]-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    N-(terc-butil)-l - [3 (S)- {[(2,6-dimetil-fenoxi)-acetil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)-[(2-pirimidinil)-tio]-pirrolidin-2(S)-karboxamid vagy N-(terc-butil)-1 -[3 (S)- {[(2,6-dimetil-fenoxi)-acetil]-amino} -4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-4(R)- {(3 -piridil)-metil-tio}-pirrolidin-2(S)-karboxamid, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
    Elsőbbsége: 1993. 03. 12.
  3. 3. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (1) általános képletű vegyületet - ahol X, B, R1 és Y jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vívó-, hígítóés/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
    Elsőbbsége: 1993.03. 12.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HIV-proteáz inhibitor hatású gyógyszerkészítményt állítunk elő.
    Elsőbbsége: 1993. 03. 12.
    HU 215 520 Β
  5. 5. Eljárás (1) általános képletű vegyületek - a képletben
    X jelentése R2-O-CO- vagy R2-CO- általános képletű csoport, ahol
    R2 jelentése 1-6 szénatomos alkil-, fenil(1-6 szénatomos alkil)- vagy 2-kinolil-csoport,
    B jelentése -NH-CHR4-CO- általános képletű kétértékű csoport, ahol R4 jelentése adott esetben karboxicsoporttal monoszubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport;
    R1 jelentése 1-6 szénatomos alkil- vagy 3-6 tagszámú cikloalkilcsoport; és
    Y jelentése benzilcsoport vagy egy V-(CH2)n-Wáltalános képletű csoport, ahol V jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal mono- vagy diszubsztituált piridil- vagy pirimidilcsoport,
    W jelentése oxigén- vagy kénatom és n értéke 0 vagy 1 és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy
    a) egy (4) általános képletű vegyületet - ahol R1 és Y jelentése a tárgyi körben megadott - valamely kondenzálószer jelenlétében összekapcsolunk egy X-NH-CHR4-COOH általános képletű a-aminosavval, ahol a képletben X és R4 jelentése a fenti; vagy
    b) egy (5) általános képletű vegyületet - ahol R1, R4 és Y jelentése a tárgyi körben megadott - egy X-OH általános képletű karbonsav, ahol X jelentése a fenti, valamely reaktív származékával reagáltatunk; és kívánt esetben a fenti a) vagy b) eljárással kapott (1) általános képletű vegyületet gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk.
    Elsőbbsége: 1992. 03. 13.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás az alábbi vegyületek valamelyikének előállítására
    4(S)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(S)-(benzil-oxi)-l-[3(S)-{[N-(benzil-oxi-karbonil)-aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino} -4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(S)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino} -4fenil-2(R)-hidroxi-butil]-N-(terc-butil)-4(R)-izobutoxi-pirrolidin-2(S)-karboxamid,
    4(R)-(benzil-oxi)-1 -[3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)-valil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]-Nciklopropil-pirrolidin-2(S)-karboxamid, 4(R)-benzil-1 - [3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid, 4(S)-benzil-1 - [ 3 (S)- {[N-(benzil-oxi-karbonil)aszparaginil]-amino}-4-fenil-2(R)-hidroxi-butil]N-(terc-butil)-pirrolidin-2(S)-karboxamid, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat reagáltatjuk.
    Elsőbbsége: 1992. 03. 13.
  7. 7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 5. igénypont szerint előállított (1) általános képletű vegyületet - ahol X, B, R1 és Y jelentése az 5. igénypontban megadott - vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóját egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható vivő-, hígítóés/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
    Elsőbbsége: 1992.03. 13.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HIV-proteáz inhibitor hatású gyógyszerkészítményt állítunk elő.
HU9300729A 1992-03-13 1993-03-12 Eljárás HIV-proteáz inhibitor hatású szubsztituált pirrolidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására HU215520B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85059692A 1992-03-13 1992-03-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9300729D0 HU9300729D0 (en) 1993-05-28
HUT70147A HUT70147A (en) 1995-09-28
HU215520B true HU215520B (hu) 1999-01-28

Family

ID=25308596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300729A HU215520B (hu) 1992-03-13 1993-03-12 Eljárás HIV-proteáz inhibitor hatású szubsztituált pirrolidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5552405A (hu)
EP (1) EP0560269B1 (hu)
JP (1) JP3198191B2 (hu)
AT (1) ATE123275T1 (hu)
AU (1) AU663164B2 (hu)
CA (1) CA2092653C (hu)
DE (1) DE69300169T2 (hu)
HU (1) HU215520B (hu)
NZ (1) NZ247124A (hu)
PL (1) PL173459B1 (hu)
TW (1) TW301651B (hu)
ZA (1) ZA931777B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6071895A (en) 1992-03-11 2000-06-06 Narhex Limited Polar-substituted hydrocarbons
EP0633881B1 (en) 1992-03-11 2003-10-29 Narhex Limited Amine derivatives of oxo- and hydroxy-substitued hydrocarbons
DE69333270T2 (de) 1992-03-11 2004-08-05 Narhex Ltd. Aminderivate von oxo- und hydroxy- substituierten kohlenwasserstoffen
US5888992A (en) 1992-03-11 1999-03-30 Narhex Limited Polar substituted hydrocarbons
ES2066623T3 (es) * 1992-03-13 1995-03-01 Bio Mega Boehringer Ingelheim Derivados sustituidos del acido pipecolinico como inhibidores de la vih-proteasa.
US5559256A (en) * 1992-07-20 1996-09-24 E. R. Squibb & Sons, Inc. Aminediol protease inhibitors
EP0610745A3 (en) * 1993-02-09 1994-09-28 Miles Inc Novel aminomethylene derivatives as immunosuppressants.
IL110898A0 (en) * 1993-09-10 1994-11-28 Narhex Australia Pty Ltd Polar-substituted hydrocarbons
US5883252A (en) * 1996-01-26 1999-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Aspartyl protease inhibitors
US6803466B1 (en) * 1997-12-08 2004-10-12 The Scripps Research Institute HIV/FIV protease inhibitors having a small P3 residue
WO1999029311A1 (en) * 1997-12-08 1999-06-17 The Scripps Research Institute Hiv/fiv protease inhibitors having a small p3 residue
US6251906B1 (en) 1998-05-15 2001-06-26 Abbott Laboratories Retroviral protease inhibiting compounds
US7087418B2 (en) 2001-12-19 2006-08-08 Bristol-Myers Squibb Company Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor
US7662852B2 (en) 2003-05-22 2010-02-16 Lead Chemical Co., Ltd. Compounds and preparations having antiviral effect

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340588C (en) * 1988-06-13 1999-06-08 Balraj Krishan Handa Amino acid derivatives
EP0361341A3 (en) * 1988-09-28 1991-07-03 Miles Inc. Therapeutics for aids based on inhibitors of hiv protease
WO1991008221A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide inhibitors of hiv protease

Also Published As

Publication number Publication date
PL173459B1 (pl) 1998-03-31
ATE123275T1 (de) 1995-06-15
CA2092653C (en) 1998-12-15
AU663164B2 (en) 1995-09-28
HUT70147A (en) 1995-09-28
EP0560269B1 (en) 1995-05-31
JPH0625158A (ja) 1994-02-01
PL298038A1 (en) 1993-11-15
EP0560269A1 (en) 1993-09-15
US5552405A (en) 1996-09-03
ZA931777B (en) 1993-09-23
DE69300169D1 (de) 1995-07-06
JP3198191B2 (ja) 2001-08-13
AU3516593A (en) 1993-09-16
TW301651B (hu) 1997-04-01
CA2092653A1 (en) 1993-09-14
NZ247124A (en) 1995-09-26
DE69300169T2 (de) 1995-10-26
HU9300729D0 (en) 1993-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3258422B2 (ja) 置換ピペコリン酸誘導体及びｈｉｖプロテアーゼ阻害剤
EP0432695B1 (en) Amino acid derivatives
EP1105422B1 (en) Hepatitis c inhibitor peptides
US7365092B2 (en) Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US7026485B2 (en) Retroviral protease inhibitors
RU2232760C2 (ru) Ингибитор сериновых протеаз и фармацевтическая композиция на его основе
HU215520B (hu) Eljárás HIV-proteáz inhibitor hatású szubsztituált pirrolidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
KR20000030004A (ko) 키니노게나제저해제로서의디펩티드벤즈아미딘
US5212157A (en) Enzyme inhibitors
EP0401675B1 (en) Enzyme inhibiting peptide derivatives
CA2036398C (en) Hiv protease inhibiting agents
CA2036397C (en) Hiv protease inhibitors containing derived amino acid units
JP2987313B2 (ja) 不可逆的なヒト免疫不全ウイルス（ｈｉｖ）プロテアーゼ阻害剤、中間体、組成物およびその製造方法
KR100367379B1 (ko) 항바이러스제로유용한마크로시클릭디플루오로스타톤유도체
CN1096292A (zh) 取代的吡咯烷衍生物用作hiv蛋白抑制剂
MXPA01001422A (en) Hepatitis c inhibitor peptides

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: BOEHRINGER INGELHEIM (CANADA) LTD., CA

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee