PL172710B1 - Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL - Google Patents

Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL

Info

Publication number
PL172710B1
PL172710B1 PL93307025A PL30702593A PL172710B1 PL 172710 B1 PL172710 B1 PL 172710B1 PL 93307025 A PL93307025 A PL 93307025A PL 30702593 A PL30702593 A PL 30702593A PL 172710 B1 PL172710 B1 PL 172710B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
self
oligonucleotide
virus
nucleotides
complementary
Prior art date
Application number
PL93307025A
Other languages
English (en)
Other versions
PL307025A1 (en
Inventor
Sudhir Agrawal
Jin-Yan Tang
Original Assignee
Hybridon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon Inc filed Critical Hybridon Inc
Publication of PL307025A1 publication Critical patent/PL307025A1/xx
Publication of PL172710B1 publication Critical patent/PL172710B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Samostabilizujacy sie oligonukleotyd o dlugosci mniej- szej niz okolo 100 nukleotydów zawierajacy region hybrydyzujacy z sekwencja docelowa i region komplementujacy sam ze soba, znamienny tym, ze region hybrydyzujacy z sekwencja docelowa obejmuje pierwsza sekwencje kwasu nukleinowego o co najmniej osmiu nukleotydach, komplementarna do sekwencji kwasu nuk- leinowego pochodzacego z wirusa organizmu patogennego lub genu komórkowego, a region komplementujacy sam ze soba zawiera druga sekwencje kwasu nukleinowego o co najmniej czterech nu- kleotydach komplementarna do trzeciej sekwencji kwasu nukleino- wego w obrebie samostabilizujacego sie oligonukleotydu przy czym albo druga albo trzecia sekwencja kwasu nukleinowego zawiera w wiekszosci sekwencje 3’ nukleotydowe w samostabilizujacym sie ohgonukleotydzie, i przy czym druga sekwencja kwasu nukleinowego i trzecia sekwencja kwasu nukleinowego tworza w warunkach fizjologi- cznych trwaly dupleks zapewniajac w obrebie regionu hybrydyzujace- go z sekwencja docelowa nieobecnosc nukleotydu pomiedzy druga sekwencja kwasu nukleinowego a trzecia sekwencja kwasu nuklei- nowego, oraz to ze region hybrydyzujacy z sekwencja docelowa nie zawiera calkowitej czasteczki i to ze region hybrydyzujacy z se- kwencja docelowa, a takze trzecia sekwencja kwasu nukleinowego maja co najmniej jeden wspólny nukleotyd Fig. 1 Fig. 2 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy środek terapeutyczny używany w czasie terapii oligonukleotydarni antysensownymi. Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku są poprawione antysensowne oligonukleotydy, które mają zwiększoną oporność na nukleazy.
Założenia terapii opartej na antysensownych oligonukleotydach pozwalają na opracowanie atrakcyjnej strategii uzyskania leków antywirusowych i chemioterapeutyków przeciw innym patogenom i przeciw zespołom chorobowym wynikającym z zaburzeń ekspresji genów. Założenia terapii opierają się na specyficznym wiązaniu pomiędzy docelową sekwencją kwasu nukleinowego a komplementarnym nukleotydem. W kilku publikacjach wykazano skuteczność hamowania ekspresji genów przez komplementarne oligonukleotydy w wyniku takiego specyficznego wiązania.
Zamecnik i Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 285 - 288 (1978) opisują specyficzne hamowanie replikacji wirusa mięsaka Rousa w zakażonych fibroblastach kurzych przez 13-metrowy syntetyczny oligonukleotyd, komplementarny do części genomu wirusa.
Zamecnik i wsp., Proc.Nal. Acad. Sci, USA 83: 4143-4146 (1986) opisują hamowanie replikacji ludzkiego wirusa nabytego upośledzenia odporności (HIV-1 zwanego dalej HTLV-III) w hodowlach komórkowych przez syntetyczne fosfodiestry oligonukleotydów, komplementarny do wirusowego RNA.
Niedawno wykazano, że oligonukleotydy mające większą oporność na degradację nukleolityczną niż fosfodiestry oligonukleotydów mają większą efektywność jako oligonukleotydy antysensowne. Agrawal, Tibtech 10: 152-158 (1992) podsumowali użycie zmodyfikowanych oligonukleotydów, jako środków przeciwwirusowych.
Sarin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451 (1988) wykazali, że metylofosforany oligodeoksynukleozydów są bardziej aktywne jako inhibitory ludzkiego wirusa HIV-I niż tradycyjne oligodeoksynukleotydy.
172 710
Agrawal i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA&5: 7079-7083 (1988) wykazali, że tiofosforany oligonukleotydów i różne amidofosforany oligonukleotydów są bardziej aktywne jako inhibitory ludzkiego wirusa HIV-I niż tradycyjne oligodeoksynukleotydy.
Agrawal i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 7790-7794 (1989) opisują zalety tiofosforanów oligonukleotydów w hamowaniu HIV-1 w komórkach we wczesnych i zaawansowanych stadiach infekcji.
Dodatkową cechą, która czyni oligonukleotydy bardziej efektywnymi jako związki antysensowne, jest ich zdolność do aktywacji RNazy H. Tiofosforany oligonukleotydów, które są jednocześnie oporne na degradację nukleolityczną i aktywują RNazę H są wydajnymi inhibitorami HIV-1 i kilku innych wirusów.
Gao i wsp., Antimicrob. Agents and Chem, 34: 808 (1990) opisują hamowanie HSV przez tiofosforany oligonukleotydów.
Storey i wsp., Nucleic Acids Res., 19: 4109 (1991) opisują hamowanie HPV przez tiofosforany oligonukleotydów.
Leiter i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA §9:3430 (1990) opisują hamowanie wirusa grypy przez tiofosforany oligonukleotydów.
Niestety tiofosforany oligonukleotydów mają zwiększoną, ale nie całkowitą oporność na degradację nukleolityczną in vivo.
Agrawal i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88 7595-7599 (1991) wykazali, że tiofosforany oligonukleotydów są w komórkach mysich intensywnie degradowane od końca 3'.
Ponadto, tiofosforany oligonukleotydów tworzą mniej stabilne dupleksy pomiędzy oligonukleotydem i sekwencją docelową niż fosfodiestry oligodeoksynukleotydów. W celu przezwyciężenia tych wad, opracowano oligonukleotydy mające na 3'- końcu strukturę zablokowaną. Agrawal i Goodchild, Tetrahedron Lett. 98: 3539-3549 (1987) opisują użycie metylofosforanów oligodeoksynukleozydów jako związków blokujących 5' lub 3'-koniec. Shaw i wsp., Nucleic Acids Res., 19: 4109 (1991) opisują fosfodiestry oligodeoksynukleotydów mające struktury blokujące na końcu-3'.
Temsamani i wsp., w Antisense Strategies, Annals of New York Academy of Science (w druku) (1999) opisują zablokowane na końcu-3' tiofosforany oligonukleotydów.
Nawet takie oporne na nukleazy, zablokowane na końcu-3' oligonukleotydy mogą być czasami degradowane, ponieważ takie 3'-zablokowane końce tych oligonukleotydów są powoli trawione przez kombinację enzymatycznych aktywności endolitycznej i egzolitycznej.
Istnieje więc potrzeba uzyskania oligonukleotydów, które tworzą stabilne dupleksy, są oporne na degradację nukleolityczną, aktywują RNazę H i sąpozbawione wad oligonukleotydów dotychczas znanych w sztuce. Idealnie, takie oligonukleotydy powinny być oporne nawet na połączone działanie endonukleaz i egzonukleaz, powinny się stabilnie parować z sekwencją docelową w temperaturach fizjologicznych, aktywować RNazę H, a w wyniku ich degradacji powinny powstawać tylko nukleotydy.
Znane są w sztuce oligonukleotydy mające struktury komplementarne do siebie i mogące tworzyć strukturę szpilki do włosów.
Germann i wsp., Biochemistry 94:5698-5709 (1985) opisuje częściowo komplementujący sam ze sobą 94-merowy oligonukleotyd, d(GC)5 T4(CG)5, który ulega tranzycji β-DNA do Z-DNA.
Hilbers i wsp., Biochimie 69: 685-695 (1985) opisuje dynamikę tworzenia się struktury szpilki do włosów w częściowo komplementującym sam ze sobą oligonukleotydzie, dATCCTATnTAGGAT.
Żadne z tych badań nie odnosiły się do określania stabilności oligonukleotydów lub ich zastosowań terapeutycznych.
Tak więc, poprzednie doniesienia nie dają opisów ani sugestii co do użycia komplementujących same ze sobą oligonukleotydów jako terapeutycznych oligonukleotydów antysensowych, ani nie dyskutują zastosowania struktury szpilki do włosów jako sposobu uczynienia oligonukleotydów opornymi na degradację nukleolityczną.
Przedmiotem wynalazku jest nowy środek terapeutyczny używany w czasie terapii oligonukleotydami antysensownymi. Wynalazek dostarcza poprawionych antysensownych oligonu172 710 kleotydów, które są oporne na degradację nukleolityczną. Oligonukleotydy otrzymane sposobem według wynalazku są oporne na degradację nukleolityczną, włączając połączone działanie endonukleaz i egzonukleaz. Oligonukleotydy otrzymane sposobem według wynalazku tworzą stabilne stabilnie hybrydy z sekwencją docelową w temperaturach fizjologicznych, aktywują RNazę H, a w wyniku ich degradacji powstają tylko nukleotydy.
Przewaga oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku znanych jako oligonukleotydów komplementujących same ze sobą, wynika z obecności dwóch cech struktury, regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową i regionu komplementującego sam ze sobą. Region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera sekwencję oligonukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji kwasów nukleinowych wirusa roślinnego lub zwierzęcego, patogennego organizmu, lub genu komórkowego lub transkryptu genu, lub nienormalnej ekspresji genów lub produktu, który wynika ze stanu chorobowego. Region komplementujący sam ze sobą zawiera sekwencję oligonukleotydową, którajest komplementarna do sekwencji kwasów nukleinowych w obrębie nukleotydu. Tak więc, gdy oligonukleotyd nie zhybrydyzuje z docelową sekwencją kwasów nukleinowych to tworzy strukturę całkowicie lub częściowo dwuniciową, która jest oporna na degradację nukleolityczną, ponieważ wewnętrzna struktura tych cząsteczek zapewnia oporność na nukleazy nie jest konieczne użycie zmodyfikowanych wiązań międzynukleotydowych w celu zapewnienia takiej oporności, jednakże, oczywiście można użyć zmodyfikowanych wiązań. Tak więc użycie fosfodiestrów oligonukleotydów lub tiofosforanów oligonukleotydów, które są degradowane in vivo, jest możliwe do wykonania przez użycie oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku. Pozwala to na otrzymanie oligonukleotydów, które aktywują RNazę H, co jest ważną cechą związków używanych w terapii antysensownymi oligonukleotydarni. Ponadto, użycie fosfodiestrów oligonukleotydów daje bardziej stabilną hybrydyzację pomiędzy terapeutycznym oligonukleotydem a sekwencją docelową. Wreszcie, degradacja takich oligonukleotydów daje jako produkty rozpadu wyłącznie nukleotydy, w ten sposób minimalizując ewentualną toksyczność.
Wynalazek dostarcza także samostabilizujących się rybozymów, ponieważ samostabilizujący się motyw otrzymany sposobem według wynalazku można łatwo otrzymać przy użyciu rybonukleotydów. Takie rybozymy otrzymane sposobem według wynalazku mają ogólnie typową strukturę rybozymu, z wyjątkiem tego, że zawierają one komplementujący sam ze sobą region blisko 5-' lub 3’-końca. Region ten zapewniarybozymom oporność namukleazy, czyniąc je bardziej stabilnymi niż rybozymy znane w sztuce.
Rycina 1 przedstawia samostabilizujący się nukleotyd otrzymany sposobem według wynalazku w konfiguracji szpilki do włosów. Rycina 2 - samostabilizujący się nukleotyd otrzymany sposobem według wynalazku w konfiguracji podobnej do młotka. Rycina 3 - wyniki badania stabilności dupleksu dla hybrydyzacji pomiędzy terapeutycznym oligonukleotydami lub samostabilizującym się oligonukleotydem i komplementarną sekwencją oligonukleotydu. Rycina 4 - wyniki działania 3’-egzonukleazy na oligonukleotydy. Rycina 5 - strukturę samostabilizującego się nukleotydu używanego w przykładach 1 -4. Rycina 6 - mechanizm działania terapeutycznego samostabilizujących się nukleotydów. Rycina 7 - amostabilizujący się rybozym otrzymany sposobem według wynalazku. Ten przykład samostabilizującego się rybozymu otrzymanego sposobem według wynalazku jest komplementarny do regionu gag HlV i powoduje cięcie mRNA gag HIV.
Przedmiotem wynalazku jest nowy nukleotyd, który stanowi środek terapeutyczny używany do leczenia infekcji wirusowych, infekcji organizmami patogennymi i chorób wynikających z nienormalnej ekspresji genów lub ich produktów.
Pierwszym aspektem wynalazku jest dostarczenie terapeutycznych samostabilizujących się oligonukleotydów, które są bardziej oporne na degradację nukleolityczną niż oligonukleotydy znane w sztuce. Do celów wynalazku, termin oligonukleotyd oznacza polimery rybonukleotydów, deoksyrybonukleotydów lub obu, a monomery rybonukleotydu i/lub deoksyrybonukleotydu są połączone ze sobą przez wiązanie 5’ do 3’, wiązanie to obejmuje każde wiązanie znane w sztuce tworzenia oligonukleotydów antysensownych. Ponadto, termin oligonukleotyd obejmuje także cząsteczki mające zmodyfikowane zasady i/lub cukry, a także cząsteczki mające podstaw6
172 710 niki, takie jak diaminy, cholesteryl lub inne grupy lipofilowe. Pewne korzystne kombinacje monomerów i wiązań pomiędzy monomerami opisano poniżej bardziej szczegółowo.
Oligonukleotydy otrzymane sposobem według wynalazku ogólnie cechuje posiadanie dwóch regionów: regionu hybrydyżującego z sekwencją docelową i regionu kompelementującego sam ze sobą. Rycina 1 przedstawia pierwszy przykład wykonania samostabilizującego się nukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku. W tym przykładzie wykonania region hybrydyzującego z sekwencją docelową pokazano jako połączone prostokąty, a region komplementującego sam ze sobą jako połączone kółka. Komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego w docelowej cząsteczce RNA pokazano jako połączone romby. Wiązania wodorowe pomiędzy nukleotydami pokazano jako kropki. Oligonukleotyd jest stabilizowany, to znaczy przejawia oporność na degradację nukleolityczną od końca 5’ do 3’, dzięki parowaniu się zasad pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową a regionem komplementującym sam ze sobą i/lub dzięki parowaniu się zasad pomiędzy sekwencjami komplementarnymi w obrębie regionu komplementującego sam ze sobą. Kiedy oligonukleotyd znajdzie cząsteczkę kwasu nukleinowego mającą komplementarną sekwencję parowanie zasad pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową a regionem komplementującym sam ze sobą oligonukleotydu zostaje przerwane i zastąpione przez parowanie zasad pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową oligonukleotydu a komplementarną sekwencją docelowej cząsteczki kwasu nukleinowego. Takie rozerwanie i zastąpienie parowania zasad zachodzi ponieważ struktura międzycząsteczkowa utworzona przez sparowanie zasad się w hybrydzie pomiędzy docelową sekwencją kwasu nukleinowego i regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową jest bardziej stabilna termodynamicznie niż struktura wewnątrzcząsteczkową utworzona przez sparowanie się zasad w komplementującym sam ze sobą oligonukleotydzie. Ten fenomen przedstawiono na rycinie 3 i omówiono bardziej szczegółowo w przykładzie 4.
Drugi przykład wykonania nukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku jest podobny do pierwszego, ale tworzy inną strukturę po samokomplementującym parowaniu zasad. Ten alternatywny przykład wykonania tworzy strukturę podobną do młotka, tak jak pokazano na rycinie 2. W tym przykładzie wykonania region komplementujący sam ze sobą zawiera sekwencje oligonukleotydowe, które mogą parować z innymi sekwencjami oligonukleotydowymi regionu komplementującego sam ze sobą. Region komplementujący sam ze sobą może zawierać także sekwencje oligonukleotydowe, które są komplementarne z regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową.
Region hybrydyzujący z sekwencją docelową oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku zawiera sekwencje oligonukleotydowe, które są komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego wirusa, organizmu patogennego lub genu komórkowego, transkryptu genu, nienormalnej ekspresji genów lub produktu, który wynika ze stanu chorobowego. Korzystnie region hybrydyzujący z sekwencją docelową ma długość około od 8 do około 50 nukleotydów. Dla celów wynalazku termin sekwencja oligonukleotydowa, którajest komplementarna do sekwencji kwasu nukleinowego jest użyta dla określenia sekwencji oligonukleotydowej (2 do około 50 nukleotydów), która hybrydyzuje do sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach fizjologicznych, na przykład, przez parowanie zasad według Watsona-Cricka (oddziaływania pomiędzy oligonukleotydem i jednoniciowym kwasem nukleinowym) lub przez parowanie zasad według Hoogsteena (oddziaływania pomiędzy oligonukleotydem i dwuniciowym kwasem nukleinowym) lub w jakikolwiek inny sposób. Taką hybrydyzację w warunkach fizjologicznych można zmierzyć w sposób fizyczny obserwując oddziaływanie z sekwencją kwasu nukleinowego.
Sekwencja kwasu nukleinowego, do której jest komplementarny region oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku hybrydyzujący z sekwencją docelową może się zmieniać w zależności od choroby, która ma być leczona. W wielu przypadkach sekwencja kwasu nukleinowego będzie sekwencją kwasu nukleinowego wirusa. Użycie antysensownych oligonukleotydów do hamowania różnych wirusów jest dobrze znane i ostatnio zostało opisane przez Agrawala, Tibtech 10: 152-158 (1992). Wirusowe sekwencje kwasu nukleinowego, które są komplementarne do czynnych antysensownych oligonukleotydów zostały opisane dla wielu wirusów, włączając ludzkiego wirusa nabytego upośledzenia odporności typu 1. Opis patentowych Stanów Zjednoczonych nr. 4 806 463, wirusa opryszczki, opis patentowy Stanów Zjedno172 710 czonych nr. 4 689 320, wirusa grypy, opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr. 5 194 428 i ludzkiego papillomawirusa (Storey i wsp., Nucleic Acids Res., 19: 4109-4114 (1991)). Sekwencje komplementarne do jakiejkolwiek z tych sekwencji mogą być użyte jako docelowe regiony hybrydyzacyjne oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku, takjak mogą być użyte sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego każdego innego wirusa. Inne wirusy o znanej sekwencji kwasu nukleinowego do której można otrzymać antysensowne oligonukleotydy obejmują wirusa pryszczycy (patrz Robertson i wsp., J. Virology 54: 651 (1985); Harris i wsp., J.Virology 36: 659 (1980)), wirusa żółtej gorączki (patrz Rice i wsp., Science 229: 726 (1985)), wirusa ospy wietrznej i półpaśca (patrz Davison i Scott, J. Gen. Virology 67: 2279 (1986)), wirusa mozaiki ogórka (patrz Richards i wsp., Virology 89: 395 (1978)).
Alternatywnie, region oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku hybrydyzujący z sekwencją docelową może mieć sekwencję oligonukleotydową komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego organizmu patogennego. Opisano sekwencje kwasu nukleinowego wielu organizmów patogennych, włączając patogen malarii Plasmodium fulciparum i wiele patogennych bakterii. Sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego każdego z tych organizmów mogą tworzyć docelowe regiony hybrydyzacyjne oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku. Przykłady patogennych organizmów eukariotycznych mają znaną sekwencję kwasu nukleinowego do której można otrzymać antysensowne oligonukleotydy obejmują Trypanosoma brucei i Leishmania (patrz Campbell i wsp., Nature 311: 350 (1984)), Fasciola hepatica (patrz Zurita i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2340 (1987). Oligonukleotydy o działaniu przeciwgrzybicznym można otrzymać przy użyciu regionu hybrydyżującego z sekwencją docelową komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego, na przykład, genu syntetazy chityny, a oligonukleotydy o działaniu przeciwbakteryjnym można otrzymać przy użyciu na przykład, genu racemazy alaninowej.
W jeszcze innym przykładzie wykonania region oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku hybrydyzujący z sekwencją docelową może mieć sekwencję oligonukleotydową komplementarną do genu komórkowego lub transkryptu genu, nienormalnej ekspresji lub produktu, który wynika ze stanu chorobowego. Opisano sekwencje kwasu nukleinowego kilku takich genów komórkowych, włączając białka prionów (Stahl i Prusiner, FASEB J. 5: 2799-2807 (1991)), białek typu amyloidowego związanych z chorobą Alzheimera (Dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr. 5 015 570, ujawnienia którego są tu włączone przez odnośnik literaturowy) i różnych dobrze znanych onkogenów i protoonkogenów, takich jak c-myb, c-myc, c-abl i n-ras. Ponadto oligonukleotydy, które hamują syntezę białek strukturalnych lub enzymów biorących duży lub wyłączny udział w spermatogenezie, ruchu plemników, wiązaniu się plemników do jaja lub jakimkolwiek innym etapie wpływającym na żywotność spermy mogą być używane jako środki antykoncepcyjne dla mężczyzn. Podobnie jako środki antykoncepcyjne dla kobiet mogą być użyte oligonukleotydy, które hamują białka lub enzymy biorące udział w owulacji, zapłodnieniu lub zagnieżdżeniu się zygoty lub hamują biosyntezę hormonów biorących udział w tych procesach.
Za pomocą oligonukleotydów, które hamują syntezę enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE) lub pokrewnych enzymów systemu renina/angiotensyna można także kontrolować nadciśnienie. W zaburzeniach krążenia wieńcowego i mózgowego, zawałach, arteriosklerozie, zatorach i zakrzepicy za pomocą hamowania syntezy enzymów niezbędnych do syntezy tromboksanu A2 można kontrolować agregację płytek; a w arteriosklerozie można także zahamować odkładanie się cholesterolu w ścianach naczyń przez zahamowanie syntezy transferazy acyloakrylokoenzym A:acylocholesterol, zahamowanie syntezy cholinofosfotransferazy może być użyteczne w leczeniu hypolipidemii.
Istnieje także wiele zaburzeń nerwowych, w których areszt hybrydyzacyjny może być używany do zmniejszenia lub eliminacji niekorzystnych objawów chorobowych. Na przykład, zahamowanie syntezy oksydazy monoaminy może być użyteczne w leczeniu choroby Parkinsona, zahamowanie syntezy transferazy o-metylokatecholowej może być użyteczne w leczeniu depresji, zahamowanie syntezy transferazy N-metyloindolowej może być użyteczne w leczeniu schizofrenii.
172 710
Zahamowanie wybranych enzymów kaskady kwasu arachidonowego prowadzącej do prostadlanyn i leukotrienów może być użyteczne do kontroli agregacji płytek, alergii, stanów zapalnych, bólu i astmy.
Zahamowanie syntezy białek wytwarzanych przez gen oporności na leki (mdr), który jest odpowiedzialny za powstawanie oporności na różne leki przeciwnowotworowe i jest główną przeszkodą w chemioterapii, może być bardzo korzystne w leczeniu nowotworów.
Sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego jakiejkolwiek z tych genów mogą być używane jako docelowe regiony hybrydyzacyjne oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku, tak jak mogą być użyte sekwencje oligonukleotydowe komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego każdego innego genu komórkowego lub transkryptu genu, nienormalnej ekspresji lub produktu, który wynika ze stanu chorobowego.
Antysensowna regulacja ekspreasji genowej w roślinach została opisana w dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr. 5 107 065, ujawnienia którego są tu włączone przez odnośnik literaturowy.
Drugim aspektem wynalazku jest dostarczenie opornych na nukleazę oligonukleotydów aktywujących Rnazę H. Region oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku hybrydyzujący z sekwencją docelową może zawierać rybonukleotydy, deoksyrybonukleotydy lub jakiekolwiek analogi rybonukleotydów lub deoksyrybonukleotydów. W jednym korzystnym przykładzie wykonania region ten jest złożony z rybonukleotydów. W innym korzystnym przykładzie wykonania region ten jest złożony z deoksyrybonukleotydów. W jeszcze innym korzystnym przykładzie wykonania region ten jest złożony z rybonunukleotydów i deoksyrybonukleotydów. W dodatkowym korzystnym przykładzie wykonania region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera fosfodiestry oligonukleotydów, tiofosforany, ditiofosforany lub ich mieszaninę lub je razem z rybonukleotydami i deoksyrybonukleotydami. Wszystkie te korzystne przykłady wykonania powodują aktywację RNazy H, ponieważ mają cztery lub więcej kolejnych fosfodiestrów oligonukleotydów, tiofosforanów lub ditiofosforanów. Oczywiście, możliwe są także inne przykłady wykonania wykorzystujące region hybrydyzujący z sekwencją docelową, które nie aktywują RNazy H.
Procedury syntezy każdego z tych przykładów wykonania są dobrze znane w sztuce. Zarówno fosfodiestry oligodeoksyrybonukleotydów i tiofosforany oligodeoksyrybonukleotydów oraz ich analogi można zsyntetyzować stosując H-fosforany, podejście opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych numer 5 149 679. Podejście z użyciem H-fosforanów może być także użyte do syntezy oligorybonukleotydów i analogów oligorybonukleotydów, jak to opisał Agrawal i Tang, Tetrahedron Lett. 31:7541-7544 (1990). W nauce znane są także sposoby syntezy ditiofosforanów oligonukleotydów.
Oczywiście możliwych jest wiele przykładów wykonania i biegli w nauce wiedzą, że inne analogi lub kombinacje analogów mogą być użyte jako region oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku hybrydyzujący z sekwencją docelową. Takie analogi charakteryzuje się posiadaniem wiązań międzynukleotydowych innych niż naturalne wiązania fosfodiestrowe. Synteza wielu takich analogów jest dobrze znana w sztuce, włączając analogi mające wiązania alkilofosforanowe (Agrawal i Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)) lub amidofosforanowe (Agrawal i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)).
Drugi ważny region samostabilizujących się oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku to region komplementujący sam ze sobą. Region komplementujący sam ze sobą zawiera sekwencję komplementującą do innej sekwencji oligonukleotydowej w obrębie tego oligonukleotydu. Ta inna sekwencja oligonukleotydowa może znajdować się w obrębie regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową lub regionu komplementującego sam ze sobą lub pomiędzy oboma regionami. Zasady sekwencji komplementarnych tworzą pary co powoduje utworzenie się struktury szpilki do włosów, pokazanej na rycinie 1, lub struktury podobnej do młotka, pokazanej na rycinie 2. Zarówno struktura szpilki do włosów jak i struktura podobna do młotka mogą mieć w środku pętle powstające w wyniku obecności niesparowanych nukleotydów, jak to pokazano na rycinie 1 dla struktury szpilki do włosów i na rycinie 2 dla struktury podobnej do młotka. Liczba par zasad utworzonych w wyniku hybrydyzacji wewnątrzcząste172 710 czkowej przy udziale regionu komplementującego sam ze sobą może być różna, ale powinna być wystarczająca do utworzenia struktury dwuniciowej, w taki sposób, że koniec 3’ nie jest dostępny dla endonukleaz. Ogólnie, około 4 lub więcej par zasad jest niezbędnych do utrzymania takiej dwuniciowej struktury. W korzystnym przykładzie wykonania samostabilizujący się oligonukleotyd zawiera około 10 par zasad, tworzących 10 kolejnych par zasad z najbardziej zewnętrznych 3’ nukleotydów. Oczywiście, wewnątrzcząsteczkowe parowanie zasad można rozszerzyć aż do sparowania wszystkich nukleotydów oligonukleotydu. Korzystnie obejmuje to region komplementujący sam ze sobą o wielkości 50 nukleotydów lub mniej.
W jednym korzystnym przykładzie wykonania region komplementujący sam ze sobą można połączyć z regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową za pomocą odpowiedniego łącznika nie złożonego z kwasu nukleinowego. Przykłady takich łączników obejmują podstawione lub niepodstawione grupy alkilowe. W jednym najbardziej korzystnym przykładzie wykonania łącznik jest (glikolem etylenowym) 16. Przy większej wielkości tego linkera syntezę można dogodnie prowadzić używając dostępnego w handlu glikolu trójetylenowego mającego na jednym końcu dwumetylotritylową grupę ochronną, a na drugim grupę cyjanoetyloamidofosforanową.
Region komplementujący sam ze sobą może zawierać rybonukleotydy, deoksyrybonukleotydy analogi rybonukleotydów lub deoksyrybonukleotydów mające sztuczne łączniki lub kombinacje powyższych. Zdolność aktywacji RNazy H nie jest ważna dla regionu komplementującego sam ze sobą, tak więc nukleotydy mające sztuczne łączniki, które nie aktywują RNazy H mogą być w tym regionie używane bez zmniejszenia efektywności działania oligonukleotydu. Tak więc oprócz łączników fosfodiestrowych, tiofosforanowych lub ditiofosforanowych region ten może zawierać także lub alternatywnie zawierać łączniki amidofosforanowe (włączając N-podstawione amidofosforany), alkilofosforanowe, alkilotiofosforanowe, a także łączniki niefosforanowe, takie jak łączniki sulfonowe, siarczanowe i keto. Oczywiście w przykładach wykonania samostabilizujących się oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku, w których nie następuje aktywacja RNazy H każdy z tych łączników może być równie dobrze użyty w regionie hybrydyzującym z sekwencją docelową.
W jednym korzystnym przykładzie wykonania samostabilizujący się oligonukleotyd według wynalazku jest dodatkowo stabilizowany. Można to osiągnąć przez włączenie w region komplementującego sam ze sobą jednego lub więcej rybonukleotydów lub 2’-0-Me-iybonukleotydów, jeżeli komplementarna część regionu hybrydyzującego z sekwencją docelowąjest DNA. Alternatywnie, komplementarna część regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową może zawierać rybonukleotydy lub 2’-O-Me-rybonukleotydy, a region komplementujący sam ze sobą może zawierać DNA. Takie oligonukleotydy będą dodatkowo stabilizowane, ponieważ oddziaływania pomiędzy DNA i RNA są bardziej stabilne niż oddziaływania pomiędzy DNA i DNA. Jeszcze innym sposobem modyfikacji regionu komplementującego sam ze sobą (i/lub regionu łącznika) w celu otrzymania dodatkowo stabilizowanego samostabilizującego się oligonukleotydu jest włączenie jednej lub więcej cząsteczek związku interkalującego. Takie oligonukleotydy będą dodatkowo stabilizowane, ponieważ związek interkalujący stabilizuje hybrydę utworzoną pomiędzy regionem komplementującym sam ze sobą i regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową. Każdy związek interkalujący nadaje się do tego celu. Korzystne związki interkalujące obejmują akrydynę i etydynę. Oligonukleotydy zawierające akrydynę można łatwo otrzymać za pomocą dostępnych w handlu akrydyno-ON amidofosforanu lub 3’-akrydyno-ON CPG (Clontech Laboratories Inc.).
Trzecim aspektem wynalazku jest dostarczenie rybozymów, które są bardziej stabilne niż rybozymy znane w sztuce. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA, które nacinają wiązania wewnątrznukleotydowe. Stabilność rybozymów otrzymanych sposobem według wynalazku jest zapewniona przez włączenie regionu komplementującego sam ze sobą na lub blisko 5’- lub 3’- końca cząsteczki rybozymu. Taki region komplementujący sam ze sobą powstaje w wyniku tworzenia się struktury szpilki do włosów lub struktury podobnej do młotka, czyniąc w ten sposób 5’ - lub 3’-koniec cząsteczką dwuniciową, powodującą, że cząsteczka rybozymu jest oporna na degradację nukleolityczną. Struktura i działanie rybozymów jest ogólnie opisana w
172 710 dokumencie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 987 071, ujawnienia którego są tu włączone przez odnośnik literaturowy.
Czwartym aspektem wynalazku jest dostarczenie sposobu hamowania ekspresji genu wirusowego, organizmu patogennego lub genu komórkowego, sposobu zawierającego etap dostarczenia, w dwóch pierwszych przypadkach do komórki zainfekowanej wirusem lub organizmem patogennym, a w ostatnim przypadku do komórki ogólnie, samostabil i zującego się oligonukleotydu lub rybozymu według wynalazku.
Piątym aspektem wynalazku jest dostarczenie sposobu leczenia ludzkich lub zwierzęcych chorób, które powstają w wyniku infekcji wirusem lub organizmem patogennym, lub w wyniku nienormalnej ekspresji genu komórkowego. Sposób obejmuje podanie choremu człowiekowi lub zwierzęciu samostabilizującego się oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku w akceptowanym farmaceutycznie nośniku. Korzystne drogi podawania obejmują podanie doustne, donosowe, doodbytnicze, i miejscowe. W takich sposobach podawania, otrzymany sposobem według wynalazku samostabilizujący się oligonukleotyd można podawać w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, na przykład, AZT w przypadku AIDS.
Sposobem tym można leczyć różne choroby wirusowe, włączając AIDS, ARC, opryszczkę ust lub narządów płciowych, brodawczaki, grypę, pryszczycę, żółtą gorączkę, ospę wietrzną, półpasiec, białaczkę HTLV i wirusowe zapalenie wątroby. Pośród chorób grzybowych nadających się do leczenia sposobem według wynalazku znajdują się drożdżyce, histoplazmowy, kryptokokozy, blastomykozy, grzybice kropidlakowe, sporotrichozy, chromomykozy, dermatofytozy i kokcydioidomykozy. Sposób ten może być używany także do leczenia chorób wywołanych przez riketsje (na przykład, dur, plamista gorączka Gór Skalistych), a także chorób przenoszonych drogą płciową wywołanych przez Chlamydia trachomatis lub Lymphogranuloma venerum.
Sposobem według wynalazku można leczyć różne choroby pasożytnicze, włączając amebiozy, chorobę Chegasa, toksoplazmozę, pneumocytozę, lambliozę, kryptosporydiozę, rzęsistkowicę, zapalenie płuc wywołane przez Pneumocystis carini, a także robaczyce, takie jak glistnica, filarioza, trichinoza, schistosomatoza i infekcje nicieniowe lub tasiemcowe. Sposobem tym można leczyć też malarię bez względu na to, czy jest spowodowana przez P.falciparum, P. vivax, P. orale lub P. malariae.
Wszystkie opisane powyżej choroby infekcyjne można leczyć sposobem opisanym, ponieważ czynniki infekcyjne tych chorób są znane i można otrzymać samostabilizujące się oligonukleotydy, mające region hybrydyzujący z sekwencją docelową, który ma sekwencję oligonukleotydową komplementarną do sekwencji aminokwasowej, która jest sekwencją aminokwasową ważną do namnażania się czynnika infekcyjnego, takiej jak ważne geny.
Inne stany chorobowe, które można leczyć tym sposobem wynikają z nienormalnej ekspresji lub produktu genu komórkowego. Takie stany chorobowe można leczyć przez podanie samostabilizującego się oligonukleotydu otrzymanego sposobem według wynalazku i zostało omówione wcześniej w tym opisie.
Wynalazek ma wiele zalet w porównaniu do oligonukleotydów znanych w sztuce. Po pierwsze samostabilizujące się oligonukleotydy według wynalazku mają dłuższy czas półtrwania, niż większość znanych oligonukleotydów, dzięki temu obniża się dawka konieczna dla osiągnięcia odpowiedniej skuteczności terapeutycznej. Można osiągnąć nawet większą oporność na degradację nukleolityczną przez użycie opornych na nukleazę wiązań międzynukleotydowych w pobliżu lub struktury pokrywki na jednym lub obu końcach oligonukleotydu. Po drugie stabilność enzymatyczna uzyskana dzięki strukturom ze sparowanych zasad obejmującym sekwencje komplementujące same ze sobą pozwala na użycie fosfodiestrów oligonukleotydów, które w przeciwnym przypadku byłyby natychmiast degradowane. Zapewnia to zwiększenie stabilności dupleksu i aktywację RNazy H, czego nie zapewniały żadne oporne na nukleazę oligonukleotydy znane w sztuce. Aktywacja RNazy H jest utrzymana, jeżeli używa się tiofosforanów lub ditiofosforanów oligonukleotydów. Trzecią zaletą jest to, że jedyne produkty degradacji kilku przykładów wykonania oligonukleotydów otrzymanych sposobem według wynalazku są nukleotydami, na przykład, monofosforany nukleotydów i/lub monotiofosforany nukleotydów. Wreszcie, wynalazek ten pozwala na użycie deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów.
172 710
Możliwość użycia tych ostatnich czyni wynalazek łatwym do zaadaptowania do użycia z rybozymami, dla których stabilność enzymatyczna jest krytyczna.
Następujące przykłady zamieszczono w celu dalszego zilustrowania pewnych aspektów korzystnych przykładów wykonania wynalazku, i nie mają one limitować zakresu wynalazku.
Przykład I. Oporność na nukleazy fosfodiestrów oligonukleotydów.
Oligonukleotydy użyte w tych badaniach pokazano na rycinie 5. Oligonukleotyd CMPD A jest komplementarny do części regionu gag HIV-1. Oligonukleotyd CMPD B ma ten sam region hybrydyzujący z sekwencją docelową, ale ma dodatkowy 3’ region komplementujący sam ze sobą złożony z 10 nukleotydów. Region komplementujący sam ze sobą w oligonukleotydzie CMPD E i CMPD F jest złożony z 6 i 4 nukleotydów, odpowiednio. Oligonukleotyd CMPD G jest identyczny jak oligonukleotyd CMPD A, ale ma dodany na 3’ końcu region 10 niesparowanych oligonukleotydów (Tio).
Oligonukleotydy badano pod kątem względnej oporności na 3’ egzonukleolityczną degradację. Dla każdego oligonukleotydu zliofilizowano 0,4 A260 jednostek oligonukleotydowych, rozpuszczono w 0,5 ml buforu (10 mM Tris, 10 mM MgCh, pH 8,5) i zmieszano z 5 pl (1,5 milijednostki) fosfodiesterazy jadu węża (SVPD). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C w komorze z kontrolą temperatury, na rycinie przedstawiono zależność A260 od czasu. Degradację oligonukleotydu mierzono jako funkcję wzrostu efektu hiperchromowego. Wyniki tych doświadczeń pokazano w tabeli I, poniżej. Wyniki wykazały, że samostabilizujące się fosfodiestry oligonukleotydów otrzymane sposobem według wynalazku są dużo bardziej oporne na degradację nukleolityczną niż fosfodiestry oligonukleotydów lub fosfodiestry oligonukleotydów mających niekomplementamy koniec.
Oprócz opisanych powyżej badań, oligonukleotydy poddano 3’-egzolitycznemu trawieniu polimerazą I DNA. Jak pokazano narycinie 4 nie stabilizujące się samoczynnie oligonukleotydy, CMPD A i G zostały całkowicie strawione w ciągu 30 minut, podczas gdy samostabilizujący się oligonukleotyd CMPD B w ciągu 30 minut został strawiony tylko częściowo.
Tabela I
Czas półtrawienia oligonukleotydów
Oligonukleotyd t1/2 dla trawienia
SVPD CMPD A CMPD G CMPD B 75 sekund 75 sekund 350 sekund
Przykład II. Oporność na nukleoazę tiofosforanów oligonukleotydów.
W celu określenia względnej oporności na nukleazy tiofosforanów samostabilizujących się oligonukleotydów i nie stabilizujących się samoczynnie oligonukleotydów, z powodu wolnego trawienia tiofosforanów oligonukleotydów przez SVPD, użyto testu aktywności 3’-egzolitycznej polimerazy I DNA. Wszystkie oligonukleotydy znakowano na 5’-końcu przy użyciu gamma'P-ATP i kinazy. Do roztworu 40 pmoli 5’-znakowanego oligonukleotydu w 20 pl buforu (40 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCh, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 50 pg/ml BSA), dodano 5 jednostek polimerazy I DNA i inkubowano w temperaturze 37°C. Następnie po upływie 0, 30, 60,120 minut pobrano objętość 4 pl i zmieszano z 6 pl roztworu przerywającego (98% formamid, 10 mM EDTA, 0,1% cyjanolu ksylenowego, 0,1% błękit bromofenolowy). Próbki analizowano metodą elektroforezy na 15% żelu poliakrylamidowym (z mocznikiem) i autoradiografii.
Wyniki pokazano na rycinie 4. Analog tiofosforanowy CMPD A został strawiony prawie w 50% w czasie 4 godzin. Analog tiofosforanowy CMPD B nie został strawiony w czasie 4 godzin. Analogi tiofosforanowe CMPD E i F, które mają 6 i 4 zasadowe sekwencje komplementujące same ze sobą także były stabilne. Analog tiofosforanowy CMPD G, mający rozszerzoną strukturę, ale nie mający regionu komplementującego sam ze sobą, był trawiony tak samo szybko jak CMPD A. Wyniki te wskazuje, że tiofosforany oligonukleotydów są dużo bardziej
172 710 oporne na degradację nukleolityczną niż tiofosforany nie stabilizujących się samoczynnie oligonukleotydów.
Przykład III. Aktywność przeciw-HIV oligonukleotydów.
Fosfodiestry samostabilizujących się i nie stabilizujących się samoczynnie oligonukleotydów testowano pod kątem zdolności do hamowania wirusa HlV-1 w hodowlach komórkowych. Oligonukleotydy użyte w tych badaniach pokazano na rycinie 5.
Limfocyty H9 zainfekowano wirionami HlV-1 (=0,01 - 0,1 TCIDso/komórkę) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po jednej godzinie odmyto niezaabsorbowane wiriony i zainfekowane komórki rozlano na mikropłytki 24-studzienkowe. Do każdej studzienki dodano oligonukleotydów w odpowiednim stężeniu (z roztworu stężonego), tak żeby otrzymać wymagane stężenie w 2 ml podłoża. W doświadczeniach z kontrolą dodatnią używano ddC lub AZT. Komórki hodowano następnie przez trzy dni. Pod koniec trzech dni, zbierano supernatant znad zainfekowanych komórek i testem ELlSA mierzono ekspresję p24. Poziom ekspresji p24 porównano pomiędzy zainfekowanymi komórkami traktowanymi oligonukleotydarni i nietraktowanymi (bez leku).
Cytotoksyczność oligonukleotydów zbadano hodując komórki w obecności wzrastającego stężenia oligonukleotydów za pomocą metody barwienia błękitem trypanu. Wyniki dwóch doświadczeń pokazano w tabeli HI.
Tabela III. Akywność oligonukleotydów przeciw - HIV Doświadczenie 1.
Stężenie (g/ml) Hamowanie p24 (%) % przeżywalności komórek IC50 (g/ml)
CMPDA 25 90 93 2
5 89 103
1 15 94
0,2 26 97
CMPDB 25 90 95 0,25
5 85 92
1 84 94
0,2 46 103
CMPDG 25 86 106 0,5
5 86 105
1 81 106
0,2 0 109
AZT 0,2 90 95 0,037 μΜ
0,04 73 98
0,08 44 104
0,0016 6 108
Doświadczenie 2
Stężenie (g/ml) Hamowanie p24 (%) % przeżywalności komórek IC50 (g/ml)
1 2 3 4 5
CMPD A 5 66 93 2,8
172 710 cd tabeli III
—--J . T~ - -— 3 4 5
1 20 101
0,2 21 107
0,04 0 102
CMPD B 5 93 89 0,35
1 81 99
0,2 33 103
0,04 0 104
CMPD E 5 89 93 0,45
1 41 100
0,2 19 99
0,04 0 102
CMPD F 5 89 93 1,5
1 41 110
0,2 19 99
0,04 0 102
AZT 0,2 89 93 0,1 gm
0,04 65 98
0,008 5 101
0,0016 6 103
Wszystkie samostabilizujące się oligonukleotydy wykazują większą aktywność przeciw HIV-1 niż CMPD A, oligonukleotyd nie stabilizujący się samoczynnie. Największą aktywność obserwowano dla samostabilizującego się oligonukleotydu mającego 10 nukleotydów komplementujących same ze sobą. Ma on blisko 10 razy większą aktywność niż fosfodiestry oligonukleotydów. Oligonukleotyd CMPD G, który ma koniec poliT, wykazuje także pewien wzrost aktywności, prawdopodobnie wynikającej ze stabilizacji struktury wywołanej przez hybrydyzację z poliA regionem mRNA komórek H9.
Prawdopodobny mechanizm działania oligonuleotydu CMPD B pokazano na rycinie 6. Oligonukleotyd wnika do komórki w postaci częściowo dwuniciowej powstającej w wyniku wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad regionu komplementującego sam ze sobą. Gdy oligonukleotyd napotka cząsteczkę RNA HIV mającą sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do sekwencji nukleotydowej regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową oligonukleotydu, zachodzi hybrydyzacja pomiędzy HIV RNA i regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową. Aktywność RNazy H następnie degraduje HIV RNA, co umożliwia oligonukleotydowi ponowną samostabilizację w wyniku parowania zasad.
W celu zbadania względnej aktywności przeciw-HIV dodatkowych struktur oligonukleotydu powyższy eksperyment powtórzono dla dodatkowych oligonukleotydów, a także oligonukleotydów opisanych w doświadczeniach 1 i 2. Dodatkowe oligonukleotydy pokazano na rycinie 5. Tymi dodatkowymi oligonukleotydami były CMPD C, w którym region komplementujący sam ze sobą jest komplementarny z 5’ końcem oligonukleotydu, CMPD D, który ma region komplementujący sam ze sobą wielkości 8 nukleotydów i CMPD H, 35-mer nukletyd doskonale komplementujący do HIV gag RNA, ale nie posiadający regionu komplementującego sam ze sobą. Wyniki tego trzeciego eksperymentu przedstawiono w tabeli IV.
Wyniki te wskazują, że całkowicie komplementujące same ze sobą samostabilizujące się oligonukleotydy są zgrubnym odpowiednikiem pod kątem aktywności przeciw-HIV dla częściowo komplementujących same ze sobą samostabilizujące się oligonukleotydów. Wyniki wykazały także, że cztery komplementujące same ze sobą nukleotydy są wystarczające do zapewnienia zwiększonej wydajności.
Tabela IV Aktywność oligonukleotydów przeciw - HIV Doświadczenie 3
Stężenie (g/ml) Hamowanie p24 (%) % przeżywalnoś;ci komórek IC50 (g/ml)
CMPDA 5,0 92 97 1,7
1,0 36 103
0,2 23 102
0,04 0 109
CMPDB 5,0 95(97)* 98(97)* 0,5(0,2)*
1,0 61(97)* 101(102)*
0,2 33(97)* 104(103)*
0,04 0(19)* 11(106)*
CMPDG 5,0 94 97 0,6
10 68 104
0,2 11 109
0,04 12 110
CMPDE 5,0 92 98 0,8
1,0 55 101
0,2 13 103
0,04 0 107
CMPDF 5,0 95 99 0,25
1,0 64 102
0,2 48 104
0,04 22 109
CMPD C 5,0 94 96 0,3
1,0 76 101
0,2 39 103
0,04 17 106
CMPD H 5,0 92 93 0,26
1,0 88 101
0,2 43 93
0,04 0 102
CMPD D 5,0 80 93 0,4
172 710 cd tabeli IV
-1 3 “ A 5
1,0 76 100
0,2 30 108
0,04 3 109
* Wyniki drugiego niezależnego badania.
Przykład IV. Stabilność dupleksu pomiędzy samostabilizującymi się oligonukleotydami i oligonukleotydami komplementarnymi.
W celu zbadania stabilności dupleksu utworzonego pomiędzy samostabilizującymi się oligonukleotydami i komplementarną sekwencją aminokwasową przeprowadzono badania hybrydyzacji. W pierwszym eksperymencie oligonukleotyd CMPD A, który jest pozbawiony sekwencji komplementujących same ze sobą, zmieszano w temperaturze pokojowej z komplementarnym 25-mer oligonukleotydem. Mieszaninę następnie stopniowo podgrzewano i zbadano wzrost efektu hiperchromowego w zależności od wzrostu temperatury. W tych badaniach, wyniki których pokazano jako punktowana linia na rycinie 3, temperatura topnienia dupleksu wynosiła około 65°C.
W drugim eksperymencie oligonukleotyd CMPD B, który ma ten sam region hybrydyzujący z sekwencją docelową co CMPD A i region komplementujący sam ze sobą wielkości 10 nukleotydów, zmieszano w temperaturze pokojowej z tym samym 25-mer oligonukleotydem. Mieszaninę następnie stopniowo podgrzewano i zbadano wzrost efektu hiperchromowego w zależności od wzrostu temperatury. Wyniki pokazano jako ciągłą linię na rycinie 3. Tym razem oprócz topnienia obserwowanego w temperatura około 65°C, obserwowano wcześniejszy wzrost efektu hiperchromowego w temperaturze około, odpowiadający topnieniu wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych struktury szpilki do włosów. Wynik ten wskazuje, że wewnątrzcząsteczkowe parowanie zasad występujące w wyniku obecności regionu komplementującego same ze sobą jest mniej stabilne termodynamicznie niż międzycząsteczkowe parowanie zasad występujących pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową i komplementarnymi oligonukleotydami.
W celu dalszego zbadania wzrostu stabilności międzycząsteczkowego parowania zasad w stosunku do wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad, CMPD B, zmieszano z tym samym 25-mer oligonukleotydem i ogrzano do temperatury 80°C, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Taką mieszaninę następnie stopniowo podgrzewano i zbadano wzrost efektu hiperchromowego w zależności od wzrostu temperatury. Wyniki pokazanojako przerywaną linię na rycinie 3. Obserwowano tylko jedno topnienie w temperaturze około 65°C, co świadczy, że międzycząsteczkowe parowanie zasad pomiędzy CMPD B i komplementarnym 25-mer oligonukleotydem jest faworyzowane w stosunku do wewnątrzcząsteczkowego parowania zasad w regionie komplementującym sam ze sobą.
Wyniki te wskazują, że samostabilizujące się oligonukleotydy hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami kwasów nukleinowych bez względu na obecność w tych oligonukleotydach sekwencji, która jest komplementarna do regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową. Ponieważ dobrze wiadomo, że pewne typy struktur oligonukleotydowych hybrydyzują bardziej stabilnie niż pewne inne typy struktur oligonukleotydowych (na przykład, hybrydy RNA:DNA > hybrydy DNA:DNA i oligonukleotydy zawierające fosfodiestry > oligonukleotydy zawierające tiofosforany, metylofosforany lub amidofosforany) wyniki te wskazują także, że preferencyjna hybrydyzacja z sekwencją docelową może być zwiększona dzięki zaprojektowaniu samostabilizującego się oligonukleotydu, tak żeby hybrydyzacja pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową i sekwencją docelową obejmowała bardziej stabilnie parujące struktury oligonukleotydowe niż hybrydyzacja w obrębie regionu komplementującego same ze sobą.
Przykład V. Nadstabilne samostabilizujące się oligonukleotydy.
W celu dostarczenia oligonukleotydów dających bardziej stabilne oddziaływania pomiędzy regionem komplementującym sam ze sobą i regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową otrzymano fosfodiestry oligonukleoksynukleozydów lub tiofosforany oligodeoksynukleotydów,
172 '710 mające 2-O-Me-rybobonukleotydy w regionie komplementującym sam ze sobą. Jak pokazano w tabeli V poniżej, takiej oligonukleotydy dają nadstabilne oddziaływania pomiędzy regionem komplementującym sam ze sobą i regionem hybrydującym z sekwencją docelową. Pomimo tego, takie oligonukleotydy nadal faworyzują tworzenie międzycząsteczkowych hybryd z komplementarnym DNA, w porównaniu do cząsteczek zawierających wewnątrzcząsteczkowe hybrydy.
Tabela V
Stabilność dupleksu samostabilizujących się oligonukleotydów mających 2-O-Me-rybonukleotydy w regionie komplementującym sam ze sobą
TM Komplementarny z DNA (25-mer)
5 · -CTCTCGCACCCA^CTCTCTCCTTZ^ZGGtAGGA-h ' 59°C 64,8°C
5 · -CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAG-3' 66°C 64,5°C
5' -CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGAG-3' 71°C 65°C
Inny rodzaj nadstabilnych samostabilizujących się oligonukleotydów otrzymano przez kowalencyjne wiązanie cząsteczki akrydyny do końca regionu komplementującego sam ze sobą. Takie cząsteczki wykazują także nadstabilność oddziaływań pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową i regionem komplementującym sam ze sobą. Pomimo tego, takie cząsteczki nadal preferencyjnie tworzą hybrydy międzycząsteczkowe z komplementarnym DNA, w porównaniu do hybryd wewnątrzcząsteczkowych.
Wyniki te wykazują, że możliwe jest otrzymanie nadstabilnych samostabilizujących się oligonukleotydów dających bardzo stabilne oddziaływania pomiędzy regionem hybrydyzującym z sekwencją docelową i regionem komplementującym sam ze sobą, bez wpływania na zdolność oligonukleotydów do tworzenia międzycząsteczkowych hybryd z docelową sekwencją kwasu nukleinowego.
T a b e i a VI
Stabilność dupleksu samostabilizujących się oligonukleotydów mających związki interkalujące w regionie komplementującym sam ze sobą.
TM Komplementarny z DNA (25-mer)
5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTX-3' N/A 67,5°C
5'-ctctcgcacccatctctctccttctggx-3' N/A 66,7°C
5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGX-3' 65°C 66,3°C
5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGX-3' 66,8°C 66,7°C
172 710
Fig. 2
Fig. 3
172 710
Fig. 4
172 710
Cmpb ą
CMT6 Ϊ y-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT
CK Pb c
CHPb b r-CTCTCGCACCCAT ctctctcc T □AOAiGAGG T c*?b r
MPS g cnn h r-CTCTCGCACCCATCTCTCTCC TT τπττπτπττ0 r-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTrCTAGCCTCCGCT 3
Fig. 5
172 710
J- AGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCX3AGAGCGTCAGTA
F-CTCTCGCACCC 1TCTCTCTCC - * CAGAGAGAGG
S· AGOC1 AaAAGG/SAgAaATl^CTngaki AGCGTCACTA -Gt
3' TA GA
AGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGA
GCGTCAGTA
Γ-CTCTCGCAC ccKTcrcTcrcc
TAGAGAGAGG
Fig. 6
172 710 ς-'-ΑΑΑΑ ą-4^A4-c4-bZA4 UA 'Jt}AA$c /-Wc^ćóć^ć ΰ^Αι,ΑΑυυ^a
Atfr c >4
-) r
^c^-cucucerc uzA(JAAuuC4~r' CĄ^cą^-i' * cu.
?
€ c 4 c
X ¢.
Fig. 7
172 710
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (18)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Samostabilizujący się oligonukleotyd o długości mniejszej niż około 100 nukleotydów zawierający region hybrydyzujący z sekwencją docelową i region komplementujący sam ze sobą, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową obejmuje pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego o co najmniej ośmiu nukleotydach, komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego pochodzącego z wirusa organizmu patogennego lub genu komórkowego, a region komplementujący sam ze sobą zawiera drugą sekwencję kwasu nukleinowego o co najmniej czterech nukleotydach komplementarną do trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego w obrębie samostabilizującego się oligonukleotydu, przy czym albo druga albo trzecia sekwencja kwasu nukleinowego zawiera w większości sekwencje 3’ nukleotydowe w samostabilizującym się oligonukleotydzie, i przy czym druga sekwencja kwasu nukleinowego i trzecia sekwencja kwasu nukleinowego tworzą w warunkach fizjologicznych trwały dupleks zapewniając w obrębie regionu hybrydyzującego z sekwencją docelową nieobecność nukleotydu pomiędzy drugą sekwencją kwasu nukleinowego a trzecią sekwencją kwasu nukleinowego, oraz to że region hybrydyzujący z sekwencją docelową nie zawiera całkowitej cząsteczki i to że region hybrydyzujący z sekwencją docelową, a także trzecia sekwencja kwasu nukleinowego mają co najmniej jeden wspólny nukleotyd.
  2. 2. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera cztery lub więcej kolejnych fosfodiestrów, tiofosforanów, ditiofosforanów oligonukleotydów.
  3. 3. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera nukleotydy wybrane z grupy zawierającej fosfodiestry, fosfotriestry, tiofosforany, ditiofosforany, amidofosforany alkilofosforany, alkilotiofosforany i alkilotiofosforany deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów.
  4. 4. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy zawierającej ludzkiego wirusa nabytego upośledzenia odporności typu 1, wirusa opryszczki, ludzkiego papillomawirusa, wirusa grypy, wirusa pryszczycy, wirusa żółtej gorączki, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa mozaiki ogórka.
  5. 5. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że patogenny organizm jest wybrany z grupy zawierającej Plasmodium fulciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania i Fasciola Hepatica.
  6. 6. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że gen komórkowy jest wybrany z grupy zawierającej białka prionów, białka typu amyloidowego związanych z chorobą Alzheimera, onkogenów i protoonkogenów.
  7. 7. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencję docelową zawiera nukleotydy wybrane z grupy zawierającej fosfodiestry, fosfotriestry, tiofosforany, ditiofosforany, amidofosforany alkilofosforany, alkilotiofosforany deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów.
  8. 8. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy zawierającej ludzkiego wirusa nabytego upośledzenia odporności typu 1, wirusa opryszczki, ludzkiego papillomawirusa, wirusa grypy, wirusa pryszczycy, wirusa żółtej gorączki, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa mozaiki ogórka.
  9. 9. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że patogenny organizm jest wybrany z grupy zawierającej Plasmodium fulciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania i Fasciola hepatica.
  10. 10. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że gen komórkowy jest wybrany z grupy zawierającej białka prionów, białka typu amyloidowego związanych z chorobą Alzheimera, onkogenów i protoonkogenów.
    172 710
  11. 11. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy zawierającej ludzkiego wirusa nabytego upośledzenia odporności typu 1, wirusa opryszczki, ludzkiego papillomawirusa, wirusa grypy, wirusa pryszczycy, wirusa żółtej gorączki, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusa mozaiki ogórka.
  12. 12. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że patogenny organizm jest wybrany z grupy zawierającej Plasmodium fulciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania i Fasciola hepatica.
  13. 13. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że gen komórkowy jest wybrany z grupy zawierającej białka prionów, białka typu amyloidowego związanych z chorobą Alzheimera, onkogenów i protoonkogenów.
  14. 14. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera od około 8 do około 50 nukleotydów, a region komplementujący sam z sobą zawiera 6, 8 lub około 10 nukleotydów.
  15. 15. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że region hybrydujący z sekwencją docelową zawiera od około 8 do około 50 nukleotydów, a region komplementujący sam ze sobą zawiera 6, 8 lub około 10 nukleotydów.
  16. 16. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera od około 8 do około 50 nukleotydów, a region komplementujący sam ze sobą zawiera 6, 8 lub około 10 nukleotydów.
  17. 17. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera od około 8 do około 50 nukleotydów, a region komplementujący sam ze sobą zawiera około 10 nukleotydów.
  18. 18. Samostabilizujący się oligonukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że region hybrydyzujący z sekwencją docelową zawiera od około 8 do około 50 nukleotydów, a region komplementujący sam ze sobą zawiera około 10 nukleotydów.
PL93307025A 1992-07-02 1993-07-02 Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL PL172710B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90906992A 1992-07-02 1992-07-02
PCT/US1993/006326 WO1994001550A1 (en) 1992-07-02 1993-07-02 Self-stabilized oligonucleotides as therapeutic agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL307025A1 PL307025A1 (en) 1995-05-02
PL172710B1 true PL172710B1 (pl) 1997-11-28

Family

ID=25426596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL93307025A PL172710B1 (pl) 1992-07-02 1993-07-02 Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0649467B1 (pl)
JP (1) JPH08501928A (pl)
KR (1) KR950702626A (pl)
AT (1) ATE171210T1 (pl)
AU (1) AU4770093A (pl)
CA (1) CA2139319A1 (pl)
CZ (1) CZ333294A3 (pl)
DE (1) DE69321122D1 (pl)
FI (1) FI946201A (pl)
HU (1) HUT69981A (pl)
NZ (1) NZ255028A (pl)
PL (1) PL172710B1 (pl)
RU (1) RU94046425A (pl)
WO (1) WO1994001550A1 (pl)

Families Citing this family (210)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2703053B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-16 Genset Sa Oligonucleotides agrafes et semi-agrafes, procede de preparation et applications .
WO1995024477A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 City Of Hope Human papillomavirus targeted ribozymes
US5631148A (en) * 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
US6776986B1 (en) 1996-06-06 2004-08-17 Novartis Ag Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050032067A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Non-phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20030044941A1 (en) 1996-06-06 2003-03-06 Crooke Stanley T. Human RNase III and compositions and uses thereof
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
WO1998003646A1 (en) * 1996-07-22 1998-01-29 Hybridon, Inc. Compositions and methods for treating specific gene expression-related diseases and disorders in humans
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US5886165A (en) * 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
EP1857549B1 (en) 1998-03-20 2018-10-17 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Control of gene expression
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
US8598332B1 (en) * 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
SI1068311T1 (sl) † 1998-04-08 2011-07-29 Commw Scient Ind Res Org Postopki in sredstva za pridobivanje modificiranih fenotipov
WO1999067379A2 (en) * 1998-06-23 1999-12-29 Medical Research Council Structured antisense nucleic acid molecules
ATE440963T1 (de) 1998-07-02 2009-09-15 Gen Probe Inc Molekulare fackeln
WO2000022113A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
AU6298899A (en) * 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
US20060172925A1 (en) * 1998-10-26 2006-08-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
AU770963B2 (en) * 1998-12-02 2004-03-11 I.D.M. Immuno-Designed Molecules New oligomeric conjugates liable to transfer biological molecules into cells
EP1147204A1 (en) 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
FR2790757B1 (fr) * 1999-03-09 2003-08-01 Bioalliance Pharma Oligonucleotides contenant une sequence antisens stabilises par une structure secondaire et compositions pharmaceutiques les contenant.
ATE241697T1 (de) * 1999-03-31 2003-06-15 Hybridon Inc Pseudo-cyclische oligonukleobasen
DE19925073C2 (de) * 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7419964B2 (en) 1999-09-16 2008-09-02 Cytogenix, Inc. Treatment of HSV-related pathologies using ssDNA
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
US8017742B2 (en) * 1999-11-10 2011-09-13 Japan Science And Technology Agency Gene carrier
DE10160151A1 (de) * 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
IL151781A0 (en) 2000-03-16 2003-04-10 Genetica Inc Methods and compositions for rna interference
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
JP5500750B2 (ja) 2000-03-30 2014-05-21 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ Ｒｎａ干渉のｒｎａ配列特異的メディエータ
MXPA02012733A (es) * 2000-06-23 2003-05-14 Du Pont Extrusturas recombinantes y su uso en la reduccion de la expresion de genes.
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
US20080032942A1 (en) 2000-08-30 2008-02-07 Mcswiggen James RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
MXPA03004836A (es) * 2000-12-01 2005-09-08 Max Planck Gesellschaft Moleculas pequenas de arn que median la interferencia de arn.
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US20050256068A1 (en) 2001-05-18 2005-11-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070897A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR SUPERFAMILY GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003072590A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070888A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050014172A1 (en) 2002-02-20 2005-01-20 Ivan Richards RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003102131A2 (en) * 2002-04-22 2003-12-11 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US8008472B2 (en) 2001-05-29 2011-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2606290T3 (es) 2001-07-12 2017-03-23 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
DE10133858A1 (de) * 2001-07-12 2003-02-06 Aventis Pharma Gmbh Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide zur gezielten Hemmung der Genexpression
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
EP1446162B1 (en) 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharmaceutical GmbH Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
DE10163098B4 (de) * 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
ATE508188T1 (de) 2002-02-01 2011-05-15 Life Technologies Corp Oligonukleotid-zusammensetzungen mit verbesserter wirksamkeit
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US7928219B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US7910724B2 (en) 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1448590A4 (en) * 2002-02-20 2004-12-15 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION INDUCED BY THE INTERFERENCE OF RNA OF THE MYC AND MYB GENES OR OF GENES INTERVENING IN THEIR RESPECTIVE PATHWAYS
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253774A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR (PDGF) AND PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR (PDGFR) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7691999B2 (en) 2002-02-20 2010-04-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7678897B2 (en) 2002-02-20 2010-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8013143B2 (en) 2002-02-20 2011-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7700760B2 (en) 2002-02-20 2010-04-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090192105A1 (en) 2002-02-20 2009-07-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCELIC ACID (siNA)
US7897752B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005517427A (ja) 2002-02-20 2005-06-16 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
AU2003215161A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TELOMERASE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2003207708A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683165B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683166B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003219833A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20090099117A1 (en) 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1472265A4 (en) * 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENERATED BY RNA INTERFERENCE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7897757B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8067575B2 (en) 2002-02-20 2011-11-29 Merck, Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003216255A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7928218B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253773A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7795422B2 (en) 2002-02-20 2010-09-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928220B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7662952B2 (en) 2002-02-20 2010-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
US20050042646A1 (en) 2002-08-05 2005-02-24 Davidson Beverly L. RNA interference suppresion of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
EP3222726A1 (en) 2002-08-05 2017-09-27 Silence Therapeutics GmbH Further novel forms of interfering rna molecules
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
AU2012216354B2 (en) * 2002-08-05 2016-01-14 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
US8729036B2 (en) 2002-08-07 2014-05-20 University Of Massachusetts Compositions for RNA interference and methods of use thereof
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004029212A2 (en) 2002-09-25 2004-04-08 University Of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
EP1572978A4 (en) 2002-10-16 2006-05-24 Univ Texas COMBINATORIAL BANKS OF APTAMERS WITH OLIGONUCLEOTIDE OLIGONUCLEOTIDE PHOSPHOROTHIOATE AND PHOSPHORODITHIOATE GROUPS RELATED TO BALLS
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
AU2003290597A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
US9150606B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
FR2850971B1 (fr) * 2003-02-10 2006-08-11 Aventis Pharma Sa Oligonucleotide antisens inhibant l'expression de la proteine ob-rgrp et procede de detection de composes modifiant l'interaction entre la famille de la proteine ob-rgrp et le recepteur de la leptine
CA2519912A1 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Monsanto Technology Llc Regulatory regions that promote early plant seed enhanced transcription
US7910523B2 (en) 2003-05-23 2011-03-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting AP-1 transcription factors
US7476729B2 (en) * 2003-10-24 2009-01-13 Institut Curie Dbait and uses thereof
EP1526177A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut Curie Nucleic acids useful for triggering tumor cell lethality
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
GB2422607A (en) * 2003-11-10 2006-08-02 Univ Utah Res Found Improved methods and compositions for RNA interference
WO2005054494A2 (en) 2003-11-26 2005-06-16 University Of Massachusetts Sequence-specific inhibition of small rna function
US7468431B2 (en) * 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US20060075515A1 (en) 2004-08-11 2006-04-06 Luethy Michael H Enhanced zein reduction in transgenic corn seed
EP1713915B1 (en) 2004-02-10 2009-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (MULTIFUNCTIONAL siNA)
EP1730161B1 (en) 2004-03-25 2010-09-08 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
EP1732379B1 (en) 2004-04-09 2013-11-06 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for control of insect infestations in plants
EP1753292A4 (en) * 2004-05-12 2007-09-26 Kamel Khalili COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING ARNIC GENES OF PRIMATE POLYOMA VIRUS
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2005115481A2 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant double-stranded ribonucleic acid
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
TWI386225B (zh) * 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
WO2006074108A2 (en) * 2004-12-30 2006-07-13 Hauser Todd M Compositions and methods for modulating gene expression using self-protected oligonucleotides
WO2006076423A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US8034994B2 (en) 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
CA2614295A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Anges Mg, Inc. Transcription factor decoy
US9297036B2 (en) 2005-07-01 2016-03-29 Agilent Technologies, Inc Nucleic acid probes for analysis of small RNAs and other polynucleotides
CA2622671C (en) 2005-09-16 2020-12-22 Devgen Nv Methods for controlling pests using rnai
US8853489B2 (en) 2005-09-16 2014-10-07 Devgen Nv Transgenic plant-based methods for plant pests using RNAi
AU2006292362B2 (en) 2005-09-16 2013-02-14 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
ATE526975T1 (de) 2005-10-07 2011-10-15 California Inst Of Techn Pkr-aktivierung mittels hybridisierungskettenreaktion
US20100167390A1 (en) 2005-12-22 2010-07-01 Toshohiro Nakajima Novel Oligonucleotide and NF-kB Decoy Comprising the Same
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
US7754475B2 (en) * 2006-01-25 2010-07-13 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid probes and microarrays for analysis of polynucleotides
JP5213723B2 (ja) 2006-01-27 2013-06-19 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド マイクロｒｎａの調節に使用するためのオリゴマー化合物及び組成物
ES2479090T3 (es) 2006-02-10 2014-07-23 Monsanto Technology, Llc Identificación y uso de genes diana para el control de nematodos parásitos de plantas
CN105385679B (zh) 2006-02-13 2020-05-26 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
EP1986697B1 (en) * 2006-02-17 2016-06-29 GE Healthcare Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
EP2023936A4 (en) * 2006-05-05 2010-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND THEIR USES ASSOCIATED WITH THE ALPHA PTPR RECEPTOR
CN101195821A (zh) 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
EP2641971A1 (en) 2007-01-29 2013-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
EP2074219B1 (en) 2007-02-16 2013-11-20 BASF Plant Science GmbH Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
US8318921B2 (en) 2007-03-01 2012-11-27 California Institute Of Technology Triggered RNAi
US9217151B2 (en) 2007-05-16 2015-12-22 California Institute Of Technology Versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
US8853375B2 (en) * 2007-08-15 2014-10-07 Idera Pharmaceuticals, Inc. Toll like receptor modulators
US8497364B2 (en) 2008-02-27 2013-07-30 California Institute Of Technology Triggered RNAi
US8241854B2 (en) 2008-05-22 2012-08-14 California Institute Of Technology Triggered RNAi
WO2009149921A2 (en) * 2008-06-11 2009-12-17 Bionucleon S.R.L. Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
WO2010123904A1 (en) 2009-04-20 2010-10-28 Monsanto Technology Llc Multiple virus resistance in plants
US9145556B2 (en) 2010-04-13 2015-09-29 Life Technologies Corporation Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function
US8658780B2 (en) 2010-05-18 2014-02-25 California Institute Of Technology Triggered covalent probes for imaging and silencing genetic expression
US8962241B2 (en) 2010-07-20 2015-02-24 California Institute Of Technology Triggered molecular geometry based bioimaging probes
US8877438B2 (en) 2010-07-20 2014-11-04 California Institute Of Technology Self-assembled polynucleotide structure
US9834439B2 (en) 2010-07-20 2017-12-05 California Institute Of Technology Biomolecular self-assembly
WO2012027206A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
EP3327125B1 (en) 2010-10-29 2020-08-05 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (sina)
UY33853A (es) 2010-12-30 2012-07-31 Dow Agrosciences Llc ?moléculas de ácido nucleico que se dirigen a la subunidad h de la atpasa vacuolar y confieren resistencia a plagas de coleópteros?.
AU2011351969A1 (en) 2010-12-30 2013-07-25 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that target the RHO1 small GTP-binding protein and confer resistance to coleopteran pests
CN103403162A (zh) 2010-12-30 2013-11-20 陶氏益农公司 赋予对鞘翅目有害生物的抗性的核酸分子
RU2644669C2 (ru) 2010-12-30 2018-02-13 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Молекулы нуклеиновой кислоты, которые воздействуют на субъединицу с вакуолярной атфазы и придают устойчивость к жесткокрылым насекомым-вредителям
US10557136B2 (en) 2011-12-12 2020-02-11 Oncolmmunin Inc. In vivo delivery of oligonucleotides
US9688983B2 (en) 2012-12-20 2017-06-27 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
US9856472B2 (en) 2013-07-01 2018-01-02 California Institute Of Technology Small conditional RNAs
US20150050738A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating rna
MX2016008263A (es) 2013-12-20 2017-05-09 Dow Agrosciences Llc Moleculas de acido nucleico rnapii 140 que confieren resistencia a plagas de coleopteros.
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
US20170029835A1 (en) 2014-03-12 2017-02-02 The University Of Sydney Rna production in higher plants
UY36113A (es) 2014-05-07 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico dre4 que confieren resistencia a plagas de coleópteros
CN105087554B (zh) * 2014-05-14 2017-09-22 武汉大学 Dna磷硫酰化修饰基因簇
PL3164113T3 (pl) 2014-06-04 2019-09-30 Exicure, Inc. Wielowartościowe dostarczanie modulatorów immunologicznych w liposomowych kolistych kwasach nukleinowych do zastosowań profilaktycznych lub terapeutycznych
ES2811279T3 (es) 2014-12-22 2021-03-11 Fraunhofer Ges Forschung Moléculas de ácido nucleico de Nucampholin para controlar plagas de insectos coleópteros
US10758558B2 (en) 2015-02-13 2020-09-01 Translate Bio Ma, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
EP3067424A1 (en) 2015-03-13 2016-09-14 Dow AgroSciences LLC Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
WO2016165729A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel aflatoxin and fungal infection control methods
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
WO2017066041A2 (en) 2015-10-12 2017-04-20 Dow Agrosciences Llc Wupa nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
WO2017106126A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Dow Agrosciences Llc Ribosomal protein L40 (RPL40) NUCLEIC ACID MOLECULES THAT CONFER RESISTANCE TO COLEOPTERAN AND HEMIPTERAN PESTS
EP3481843B1 (en) 2016-07-05 2022-01-26 California Institute of Technology Fractional initiator hybridization chain reaction
AU2017321492A1 (en) 2016-08-30 2019-03-14 California Institute Of Technology Immunohistochemistry via hybridization chain reaction
WO2018089237A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Dow Agrosciences Llc Cytochrome b (cytb) nucleic acid molecules that control pathogens
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
US11696954B2 (en) * 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
WO2022164796A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide rnas for cell-selective regulation of crispr/cas

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0547142A1 (en) * 1990-08-28 1993-06-23 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Solid support synthesis of 3'-tailed oligonucleotides via a linking molecule

Also Published As

Publication number Publication date
ATE171210T1 (de) 1998-10-15
PL307025A1 (en) 1995-05-02
HU9403788D0 (en) 1995-02-28
FI946201A0 (fi) 1994-12-30
RU94046425A (ru) 1997-03-20
HUT69981A (en) 1995-09-28
JPH08501928A (ja) 1996-03-05
NZ255028A (en) 1997-03-24
FI946201A (fi) 1994-12-30
EP0649467A1 (en) 1995-04-26
AU4770093A (en) 1994-01-31
DE69321122D1 (de) 1998-10-22
EP0649467B1 (en) 1998-09-16
CA2139319A1 (en) 1994-01-20
WO1994001550A1 (en) 1994-01-20
CZ333294A3 (en) 1995-07-12
KR950702626A (ko) 1995-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL172710B1 (pl) Samostabilizujacy sie oligonukleotyd PL PL
US6346614B1 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5652355A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6143881A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0677056B1 (en) Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
US5929226A (en) Antisense oligonucleotide alkylphosphonothioates and arylphospohonothioates
US5739308A (en) Integrated oligonucleotides
WO1994002498A9 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
Tang et al. Self-stabilized antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioates: properties and anti-HIV activity
US5693773A (en) Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
US5532130A (en) Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
AU7550594A (en) Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation, and/or multiplication of infectious disease pathogens
CA2490644A1 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates