PL171497B1

PL171497B1 - Sposób wytwarzania peptydów PL PL PL

Info

Publication number: PL171497B1
Application number: PL92301284A
Authority: PL
Inventors: Tamas Bartfai; Tomas Hoekfelt; Ulo Langel; Bo Ahren; Stefan Lindskog; Silvana Consolo; Tiit Land; Zsuzsanna Wiesenfeld-Hallin
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1991-05-15
Filing date: 1992-05-14
Publication date: 1997-05-30
Also published as: IE921555A1; SG43921A1; DK0585300T3; EE9400346A; HUT65810A; EP0585300A1; NO934098L; ATE149525T1; EP0514361A1; YU50592A; AU1785892A; FI935010A0; ES2098510T3; SK127793A3; CZ242293A3; DE69217937D1; AU664180B2; SI9200081B; GR3023150T3; DE69217937T2

Abstract

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Scr-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Gln- -Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro- -Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro- -Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro- -Lys-X Prc-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-H, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-AIa-GLy-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro- -(D-Arg)-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-(D-Trp)-Phe-(D-Trp)-Leu- -Leu-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro- -Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Ala- -Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-X, H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro- -Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-X, w których X ozn acza -NH2 lub -OH (am id lub w o ln y kw as), zn a m ie n n y ty m , ze a) kolejno w la cza sie w fazie stalej po jed n ej zadane reszty am inokw asow e do rosn acego lan cu ch a p ep tyd ow ego, albo b) sp rzega sie am in okw asy etapow o w ro ztw o rze, stosujac odpow iednio d eryw atyzo w an e am in o k w asy PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydów, antagonistów galaniny, będących ligandami receptora galaniny. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania peptydów Galanina (1-12)-Pro-Substancja P(5-11), Galanina(1-12)-Pro-Bradykinina(2-9), Galanma(112)-Pro-Pro-Pro-(Leu⁵-Enkefallna(5-1), Galanina(1-12)-Pro-Lys(e-NH-Pro-(Leu⁵-Enkefalina(5-1). Związki będące antagonistami galaniny znajdują zastosowanie do wytwarzania preparatów farmaceutycznych, zwłaszcza do leczenia zaburzeń u ssaków, zależnych od fizjologicznej funkcji galaniny przy receptorze galaniny.

Stan techniki

Neurotransmitery i hormony mogą indukować swoje efekty końcowe przez wiązanie się z receptorami związanymi z błonami komórkowymi i aktywowanie ich. Neuropeptyd galaninę wyizolowano w roku 1983 ze świńskiego jelita górnego i stwierdzono, ze zawiera on 29 reszt aminokwasowych (Tatemoto, K., et al., FEBS Lett., 164 (1983) 124-128). Opisano sekwencje

171 497 galaniny dwóch innych ssaków, szczura i krowy (Vrontakis M.E., et al. J. Biol. Chem. 262 (1987) 16755-16758; Kaplan L.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 (1988) 1065-1069 oraz Rokaeus A. i CarlquistM. FEBS Lett. 234 (1988) 400-406). Porównanie sekwencji peptydów w galaninie ssaków szczura, świni i wolowej ujawniło, ze N-końcowe aminokwasy 1-15 są identyczne. Zatem jest bardzo prawdopodobne, że wspomniany zachowany region znajduje się w galaninie innych ssaków, w tym człowieka..

Dystrybucja galaniny ma charakter bardzo rozległy, co często koreluje z wielością działań neurologicznych, wywieranych w wielu różnych układach.

Dotychczas nie opisano żadnych antagonistów galaniny. będących ligandami receptorów galaniny. Antagonista galaniny może być użytecznym narzędziem do ustalenia fizjologicznego znaczenia galaniny i do opracowania środków farmaceutycznych do regulacji funkcji fizjologicznych galaniny przy receptorze galaniny. Sposób według wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania peptydów spełniających funkcję antagonistów galaniny, które są równocześnie ligandami receptora galaniny. Zatem antagonistyczny efekt antagonisty galaniny wytwarzanego sposobem według wynalazku jest wywierany przy receptorach galaniny.

Uważa się. że za działanie farmakologiczne peptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku jako antagonisty galaniny i za jego powinowactwo do receptora galaniny (przez co jest ligandem receptora galaniny) odpowiedzialna jest jego konformacja strukturalna przy receptorze galaniny.

Jak wspomniano powyżej, peptydy mogą być również nazwane odpowiednio Galanina(112)-Pro-Substancja P(5-11), Galanina(1-12)-Pro-Bradykimna(2-9), Galanina(1-12)-Pro-ProPro-(Leu⁵-Enkefalina(5-1) i Galanina( 1-12)-Pro-Lys-(t'-NH-Pro(Leu⁵-E'nkefalina(5-1).

W części eksperymentalnej tego opisu wymieniono powyżej peptydy w formie amidowej (to jest X = -NH 2) nazwano odpowiednio M15, M35, M36, A i M34, A.

Sposób wytwarzania peptydów wybranych z grupy składającej się z:

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-X

Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-H,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-(D-Arg)-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-(D-Trp)-Phe-(D-Trp)-Leu-Leu-X,

171 497

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu^Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-PTO-Pra-Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe -Arg-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Χ, i

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-Χ, w których X oznacza -NH 2 lub -OH (amid lub wolny kwas), według wynalazku polega na tym, że

a) kolejno włącza się w fazie stałej po jednej żądane reszty aminokwasowe do rosnącego łańcucha peptydowego, albo

b) sprzęga się aminokwasy etapowo w roztworze, stosując odpowiednio derywatyzowane aminokwasy.

Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku będące antagonistami galaniny, a jednocześnie ligandami receptora galaniny są stosowane jako preparat farmaceutyczny oraz znajdują zastosowanie do wytwarzania preparatu farmaceutycznego. Należy wspomnieć, że wymienione powyżej peptydy są rozpuszczalne w wodzie, co ułatwia przygotowanie preparatu farmaceutycznego do iniekcji. Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku będące anta6 gonistami galaniny, a jednocześnie ligandami receptora galaniny mozna stosować jako składniki aktywne, łącznie z dopuszczalnym(i) farmaceutycznie dodatkiem(ami). Dodatek(i) potrzebne do wytworzenia Żądanego preparatu farmaceutycznego naleŻy dobrać zaleŻnie od rodzaju tego preparatu. Dodatek(i) odpowiednie do wytworzenia specyficznych rodzajów preparatów, takich jak roztwory do iniekcji, tabletki lub plastry, można znaleźć w Farmakopei Stanów Zjednoczonych Ameryki.

Stosuje się zatem środki, zawierające efektywną ilość związków wytwarzanych sposobem według wynalazku, w tym ich nietoksyczne sole addycyjne, amidy i estry, które mogą same zapewnić wyliczane powyżej korzystne skutki terapeutyczne. Takie środki mogą być również dostarczane łącznie z tolerowanymi fizjologicznie rozcieńczalnikami ciekłymi, Żelowymi lub stałymi lub adiuwantami i nośnikami.

Te związki i środki mogą być podawane ssakom w zastosowaniach weterynaryjnych, na przykład zwierzętom domowym, oraz w zastosowaniach klinicznych ludziom w sposób podobny jak inne środki terapeutyczne. Na ogół dawka wymagana dla skuteczności klinicznej będzie zawierać się w zakresie od około 0,01 do 1000 mcg/kg, częściej 0,1 do 1000 mcg/kg wagi ciała gospodarza. Alternatywnie, dawki zawarte w tych zakresach mogą być podawane poprzez ciągłą infuzję w dłuższym okresie czasu aż do uzyskania Żądanych skutków terapeutycznych.

Typowo środki takie wytwarza się jako środki do iniekcji, w postaci ciekłych roztworów albo zawiesin; mogą być równieŻ wytwarzane formy stałe, nadające się do rozpuszczania lub zawieszania w cieczy przed wstrzyknięciem. Preparat moŻe być równieŻ emulgowany lub inkorporowany do systemów dostarczania leku, takich jak liposomy lub mikrokulki. Składnik czynny jest często mieszany z rozcieńczalnikami lub nośnikami, które są tolerowane fizjologicznie i mieszalne ze składnikiem czynnym. Do odpowiednich rozcieńczalników i nośników naleŻą na przykład woda, solanka, dekstroza, gliceryna lub podobne, oraz ich połączenia. Ponadto w razie potrzeby środki mogą zawierać niewielkie ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilŻające lub emulgujące, środki buforujące pH lub stabilizujące i podobne.

Środki dogodnie podaje się pozajehtowo przez iniekcję, na przykład podskórnie, domięśniowo, dootrzewnowo lub doŻylnie. Do dodatkowych preparatów, które nadają się do innych sposobów podawania naleŻą czopki, preparaty dopochwowe, aerozole donosowe, preparaty podpoliczkowe, takie jak tabletki adhezyjne, Żele lub plastry i w niektórych przypadkach preparaty doustne. Do tradycyjnych środków wiąŻących i nośników do czopków i preparatów dopochwowych naleŻą na przykład glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki mogą być utworzone z mieszanin zawierających składnik czynny w zakresie od 0,5% do 10%, korzystnie 1 %-2%. Preparaty doustne zawierają takie zwykle stosowane nośniki jak na przykład mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharozy, celuloza, węglan magnezu i podobne, o czystości farmaceutycznej. Środki takie przybierają formę roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłuŻonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10%-95% składnika czynnego, korzystnie 25%-70%. Związki peptydowe wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być formułowane w środki w postaci obojętnej lub w postaci soli. Do dopuszczalnych farmaceutycznie, nietoksycznych soli naleŻą sole addycyjne z kwasami (utworzone poprzez wolne grupy aminowe), które są utworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak na przykład kwasy chlorowodorowy lub fosforowy, lub kwasami organicznymi, takimi jak na przykład kwasy octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy i podobne. Sole tworzone poprzez wolną grupę karboksylową mogą być otrzymane z zasad nieorganicznych, takich jak na przykład wodorotlenki sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy lub Żelazowy, oraz takie zasady organiczne jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i podobne.

Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie w metodach leczenia zaburzeń zaleŻnych od fizjologicznej funkcji galaniny przy receptorze galaniny u ssaków, która obejmuje podawanie wspomnianemu ssakowi efektywnej farmakologicznie ilości antagonisty galaniny, który jest ligandem receptora galaniny. PoniewaŻ funkcja fizjologiczna galaniny przy receptorze galaniny jest specyficzna dlakaŻdego osobnika, decyzję co do efekty w171 497 nej farmakologicznie ilości antagonisty galaniny, która ma być podawana w celu leczenia zaburzeń u ssaków musi podjąć lekarz lub weterynarz w każdym poszczególnym przypadku.

Antagoniści galaniny mogą znaleźć zastosowanie w regulacji co najmniej:

.....

- wyuzicldiud liiduniijy,

- wydzielania hormonu wzrostu,

- wydzielania acetylocholiny,

- wydzielania dopaminy,

- wydzielania substancji P,

- wydzielania somatostatyny,

- wydzielania noradrenaliny.

Obecnie przypuszczalnymi dziedzinami wskazań medycznych są endokrynologia, zaburzenia wchłaniania pożywienia, neurologia i psychiatria, demencja starcza typu choroby Alzheimera, schizofrenia, analgezja, choroby jelit. Poniżej podano szczegółowe przykłady wykonania ilustrujące sposób wytwarzania antagonisty galaniny według wynalazku.

Do otrzymywania peptydów sposobem według wynalazku mogą być zastosowane konwencjonalne sposoby wytwarzania peptydów, zmodyfikowane odpowiednio jeśli antagonista galaniny jest peptydomimetykiem. Oprócz syntezy w fazie ciekłej do konwencjonalnych procedur syntezy nowych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku należą dowolne metody syntezy peptydów w fazie stałej. W metodzie takiej syntezę nowych związków można prowadzić przez kolejne włączanie po jednej żądanych reszt aminokwasów do rosnącego łańcucha peptydu zgodnie z ogólnymi zasadami metod syntezy w fazie stałej.

Poniżej zastosowano następujące skróty:

NMP - N-metylopirolidon

HOBt - N-hodroksybenzotriazol

MBHA - p-metytobenzhydrylyamina

PAM - p-acetoksy metyl

Boc - t-butylo- tykarbonyl

DMSO - dimetylo-uleotlonek

DIEA - dilzυpI(lp\ΊυepvlloeIoml

Tos - tosyl

OcHex = ette- cyklohekyylowy

4-MeBzl - 4-metylobenoyl

OBzl - istes- benzyoowy

Bom = --benzylokoymetyl

Clz - 2-ohlorobeyzy loknyknrbony i

Bzl - 0-benzyl

For - formyl

Brz - Ź-Oromobennyloksykarbonyl

TFA - kwas tri fluorooctowy

DMS - siarczek ylmctylowe

DCM - dichlorometan

DMF - N,N-dmNtyleoIOΐlarnle

Przykłady

Peptydy M15, M35 i M36,A wytwarzane sposobem według wynalazku łączono w sposób etapowy na stałym nośniku, stosując syntetyzyr peptydów Applied Biosystems Model 431 A, przy użyciu standardowej strategii typu solvynt-activation NMP/HOBt w skali 0,1 mmola (mała skala). Peptyd M34,A zsyntetyzowano w ten sam sposób poza tym, że jako grupę zabezpieczającą zastosowano ε-Fmoc i Boc dla Lys. Zgodnie z tym jedną część peptydu zsyntetyzowano stosując chemię Boc, a drugą część zsyntetyzowano stosując chemię Fmoc.

T-Boc-aminokwasy sprzęgano z t-Boc-aminokwasem połączonym z żywicą wiązaniem estrowym PAM (Nova Chemical Company Ltd., Wielka Brytania) dlakwasu wolnego (X = -OH) lub wiązaniem estrowym MBHA (Bachem Felnchyminalien AG, Szwajcaria) dla amidu (X = -NH 2) jako estry hydronsybynzotπazolowe (HObt).

171 497

Pojedynczy cykl dla każdego z aminokwasów obejmował odbezpieczenie grupy t-Boc 50% kwasem trifluorooctowym w CH 2G2 (DCM) przez 19 minut i acylowanie 10-krotnym nadmiarem (w porównaniu z ilością grup aminowych w żywicy) zabezpieczonych aminokwasów w mieszaninie 15% DMSO w N-metylopirolidomc (NMP) przez 35 minut. Pomiędzy każdą z operacji przeprowadzano kilka dokładnych przemywań CH2Cl2, DIEA i NMP. Po każdym sprzęganiu przeprowadzano acetylowanie (blokowanie) stosując 10% bezwodnik octowy i 5% DlEA w NMP przez 5 minut.

PozaBoc-Lys(Fmoc) w przypadku peptydu 34,A, wszystkie stosowane aminokwasy były zabezpieczone t-Boc przy N- końcu (otrzymane z Nova Chemical Company Ltd., Wielka Brytania), a ich reaktywne łańcuchy boczne zabezpieczono Tos w Arg, OcHex w Asp, 4-MeBzl w Cys, Obzl w Glu, Bom w His, Clz w Lys, Bzl w Ser i Thr, For w Trp i Brz w Tyr.

Wszystkie rozpuszczalniki i inne reagenty do automatycznej syntezy peptydów pochodziły z Applied Biosystems.

Reagenty stosowane w etapach odbezpieczania i rozszczepiania były czystości analitycznej i stosowano je bez dalszego oczyszczania.

1,2-Elanodiiiol, bezwodnik octowy, kwas trifluorometylosulfonowy (TFMSA), siarczek dimetylowy (DMS) i p-krezol pochodziły z firmy Fluka, eter dietylowy i acetonitryl z firmy Merck, a HF z firmy AGA Gas.

Całkowicie zestawione połączenia peptyd-żywica suszono przez noc pod wysoką próżnią. Odbezpieczanie grup formylowych na Trp i grup benzylowych przeprowadzano stosując metodę małej ilości TEMSA. W tym celu na 100 mg połączenia peptyd-żywica działano, wstrząsając, 2 ml mieszaniny TFMSA (10%), TFA (50%), DMS (30%), p-krezolu (8%) i dimerkaptoetanu (2%) w ciągu 2 godzin w 0°C, przemywano EtOH, DCM, dMf, DIEA/DCM, DMF i Dcm.

Po wysuszeniu pod próżnią peptyd odszczepiono od żywicy i odbezpieczono przez mieszanie 10 ml ciekłego HF (zawierającego 20% mieszaniny 1:1 p-krezolu i p-tiokrezolu z 1 g połączenia peptyd-żywica w 0°C w ciągu 60 min. Żywicę przemyto 2 razy 10 ml Et2O, peptyd ekstrahowano 20% roztworem acetonitrylu w wodzie i przesączono. Po liofilizacji z wodnego przesączu otrzymano surowy peptyd.

Preparatywne oczyszczanie surowego produktu przeprowadzano za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, stosując kolumnę C18. 10 mg surowego peptydu rozpuszczono w 1 ml 20% roztworu acetonitryl/woda i eluowano z gradientem (45 min.) mieszaniną 20-60% 0,1 %(TFA)acetonitryl w 0,1 % TFA/woda przy prędkości przepływu równej 2,0 ml/min. Frakcje zbierano na podstawie absorpcji przy 238 min.

Czystość poszczególnych peptydów sprawdzano za pomocą analitycznej HPLC i ustalono, że wynosiła ona 99%. Ciężary cząsteczkowe peptydów oznaczano stosując spektrometr masowy z desorpcją plazmą (PDMS) Model Bioion 20, Applied Biosystems, otrzymując w każdym przypadku wyliczony ciężar cząsteczkowy dla oczyszczonego peptydu.

Ogólne procedury zilustrowane powyższymi przykładami zastosowano w celu wytworzenia peptydów przedstawionych w poniższej tabeli.

Tabela

Czystość' poszczególnych peptydów sprawdzano za pomocą analitycznej HPLC 1 ustalono, ze wynosiła 99% Ciężary cząsteczkowe peptydów oznaczano stosując spektrometr masowy z desorpcją plazmą (PDMS) Model Bioion 20, Applied Biosystems, otrzymując w każdym przypadku wartości oczekiwane.

Galanina(1-12)-Pro-SP(5-11)amid (M15): (MW=2199) IC₅₀=0,1nM

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Gln-Gln-Phc1 20 5 10 12 5 7

-Phe-Gly-Leu-Met amid

171 497

Galanina(l-12)-Pro-Spantyd amid(C7):(IMJ=2827) IC_Ł==0,2nM i 13

Gly-Trp-Thr-Leu-.Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-(D-Arg) Pro23 24 22 23 24

-Lys-Pro--Gln-Gln-(D-Trp)-Phe-(D-Trp)-Leu-LeuNH₂ spantyd

Galamna(l-12)-Pro-Pro-Pro-SP(5-11)amld IC₅₀ .4CnM

12

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Gln22 5

-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met amld

Galanlna (1-13) -Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala amid (M38) : (MW=197C)

IC =C,2nM c-n ^T_

13

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Ala-Leu2C

-Ala-Leu-Ala amid

Galanina(l-12)—Pro-Pro-Prc-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala amid (M40): (MW=1980)

IC₅o=13nM

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Ala20

-Leu-Ala-Leu-Ala amid

171 497

Galanina (l-13)-Bradykinina (3-9) amid (M20) : (MW=2135) IC_g0=i_nM

13

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Aia-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe20 3

-Ser-Pro-Phe-Arg amid

Galanina (1-13)-Bradykinina (2-9) amid (M35) : (MW=2232) IC5n=0,2riM

13

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro21 2

-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg amid

Galani ni^{* 1}.-13.)-,Χ?¥( 25-36) amid (M32):(MW=2961) IC_5o=0,05nM

13

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Arg-His25 25

-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr amid

Galanina(l-12)-Ala-NPY(25-36) amid (M88):(MW=2935) ICsn=1nM

13

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg-His25 t5S

-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr amid

Galanina((L-12)-Pro-Pro-Pro-Leuenkefalina(1-5) amid (M36): (MW=2078)

IC = 40nM an

12

Gly~Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-L_eu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro20

-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu amid

5

Gaianina(l-22)-Pro-Pro-Pro-Leuenkefalina(5-2) amid (M41): (MW=2078)

IC =20nM

1L2

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-^a-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro20

-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr amid

2

Galami^ l-23)-Lys amid (Pro-Leuenkefalina(5-2)) (M34,A):(MW=2223)

IC =20nM ___

Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Aia-Gly-Tyr-Leu-Leu-Giy23 24

-Pro-Lys amid

I

Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr

2

IC50 oznaczono w eksperymentach wypierania na podwzgóizu szczura.

171 497

Eksperymenty farmakologiczne

1) Hamowanie przez galaninę wydzielania insuliny indukowanego glukozą mierzono według B Ahren et al.. (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 140, Nr 3, 1986, strony 1059-1063). Stosując taką samą procedurę jak cytowana proceduraB. Ahren et al., wykazano, że peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, blokuje w stężeniu równomolowym wydzielanie insuliny hamowane galaniną.

Zwierzęta i przygotowanie komórek

Dorosłe, otłuszczone myszy hiperglikemiczne (ob/ob) obu płci wzięto z własnej hodowli wsobnej i głodzono przez noc. Zwierzęta zabito przez dekapitację i wyizolowano wysepki techniką izolacji kolagenazowej. Zawiesinę komórek przygotowano w sposób opisany przez A. Lehrnmark w Diabetologia 10, 1974, 431-438. W skrócie wysepki rozdzielono na pojedyncze komórki i małe klastery przez wytrząsanie w pożywce ubogiej w Ca²⁺ i Mg²⁺, suplementowanej EGTA (kwas etylenoglikolotetraoctowy, SIGMA). Następnie komórki inkubowano w 37°C i pH 7,4 przez noc w 12 ml pożywki RPMI1640 (pożywka do hodowli tkankowych z firmy SIGMA, zawierająca L-glutaminę i nie zawierająca węglanu sodu), suplementowanej 10% NUserum TM (Collaborative Research Inc., Lexington, Ma, USA), 100 j.m./ml penicyliny, 60 μg/ml gentamycyny i 100 gg/ml streptomycyny. Dla uniknięcia przyłączania komórek do kolb z hodowlą podczas inkubacji zawiesinę łagodnie wstrząsano.

Pożywka

Jako podstawową pożywkę stosowano bufor HEPES (kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy, STGMA), pH 7,4, o zrównoważonych fizjologicznie kationach i Cf jako jedynym anionem. We wszystkich przypadkach pożywkę podstawową suplementowano albuminą w ilości 1 mg/ml.

Pomiary wydzielania insuliny

Kinetykę uwalniania insuliny badano przez perfundowanie trzustkowych komórek beta (w przybliżeniu 1 x 10⁶) 20 mM lub 5 mM glukozy zmieszanej z perełkami poliakryloamidowymi Bio-Gel P-4 (sito o oczkach od 0,037 mm do 0,074 mm, Bio-Rad Lab., Richmond, Ca, USA) w kolumnie 0,5 ml. Prędkość przepływu wynosiła 0,5 ml/min, a frakcje zbierano co 1-3 min i analizowano radioimmunologicznie na zawartość insuliny, stosując krystaliczną insulinę szczurzą jako wzorzec.

Wyniki

Po 60 minutach inkubacji w obecności glukozy (8,3 mM) galanina (10⁷) całkowicie zahamowała wydzielanie insuliny od 34±^j/ml do 3±1 gj/ml (PC< 0,001 ; N=32). Peptdd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, pojedynczo (10‘6m - 10’⁹M) przeciwdziałał w sposób zależny od dawki indukowanemu przez galaninę wydzielaniu insuliny.

Wydzielanie insuliny w obecności glukozy, galaniny i M15 w ilości 10’6 M, 10 7 M lub 10'⁸ M wynosiło odpowiednio 28± pM-j/ml (N=16), 17±4 (tj/ml (N=16) i 10±3 gj/ml (N=16). M15 przy łO^M nie wywierał efektu.

W rezultacie powyższych eksperymentów wyciągnięto wniosek, że peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, przeciwdziała indukowanemu przez galaninę wydzielaniu insuliny przez wysepki.

2) Hamowanie przez galaninę wydzielania acetylocholiny mierzono według G. Fisone et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., wol. 84, 1987, 7339-7343). Stosując taką samą procedurę jak cytowana procedura G. Fisone et al., wykazano, że peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, przeciwdziała efektowi hamującemu galaniny na indukowane skopolaminą wydzielanie acetylocholiny in vivo.

Eksperymenty z mikrodializą

Chirurgia i metodologia podstawowa. Eksperymenty prowadzono ze szczurami płci żeńskiej CD-COBS (Charles River, Como, Włochy), ważącymi 200-260 g. Zwierzęta uśpiono ekwitenzyną (1 % pentobarbitalu, 4% wodzianu chloralu). Do hipokampa brzusznego implantowano stereotaksjalnie kaniulę prowadzącą zgodnie z następującymi współrzędnymi z atlasu Paxinosai Watsona(Paxinos G. and Watson C. (1986) The Rat Brain in Stereotoxic Coordinates, wyd. 2, Academic Press, Sydney): 5 mm w tył od bregmy, 4,0 mm w bok od linii środkowej i 6,8 mm poniżej powierzchni opony twardej. Następnie wprowadzono drut usztywniający w celu utrzymania drożności kaniuli do następnego dnia. Po tym czasie drut usunięto i zastąpiono sondą mikrodializacyjną (CMA 10, Carnegie Medicine AB, Stockholm, Szwecja), zawierającą membranę o odsłoniętej powierzchni równej 3 x 0,5 mm. Sonda mikrodializacyjna rozciągała się 3 mm poza koniec kaniuli prowadzącej; perfundowano ją ze stałą szybkością 2μ 1/mm. roztworem Ringera (NaCl, 147 mM; CaCh, 2,2, mM i KCl, 4,0 mM), zawierającym 10 μΜ siarczanu fizostygminy i pH uregulowanym do 7,0 za pomocą NaOH. Perfuzat z początkowych 40 min. odrzucono. Następnie w ciągu łącznego okresu perfuzji wynoszącego 260 minut perfuzaty zbierano co 20 minut. Na końcu okresu zbierania próbki niezwłocznie zamrożono na stałym CO2 i liofilizowano. Zawartość acetylocholiny (Ach) oznaczono specyficzną metodą radioenzymatyczną, opisaną szczegółowo przez Consolo S., et al., (J. Neurochem. 48, (1987), 14591465) i Wu C. F. et al. (Neurobiol. Aging9. (1988), 357-361),polegającąna (a) konwersji choliny do fosforylocholiny w obecności fosfokinazy cholinowej i ATP, (b) enzymatycznej hydrolizie acetylocholiny do choliny i kwasu octowego, (c) reacetylacji uzyskanej choliny do (©acetylocholiny przez dodanie (©acetylokoenzymu A, 99,9 GBq/mmol i acetylokoenzymA: ChAT, i (d) separacji uzyskanej (©acetylocholiny przez ekstrakcję do zawierającej tetrafenylobor fazy ketonowej za pomocą chromatografii jonowymiennej ciecz-ciecz i zliczanie scyntylacyjne. Reakcje fosforylacji, hydrolizy i acetylacji oceniano w sposób rutynowy.

Stężenie acetylocholiny w każdej próbce wyliczano przez regresję liniową w oparciu o radioaktywność wzorców (liniowa od 10 fmol do 25 pmol acetylocholiny) przy nachyleniu krzywej równym 7800 net dpm/mpmol. Współczynnik zmienności powtarzanych próbek perfuzatu lub wzorców acetylocholiny wyniósł w przybliżeniu 3%.

Odzysk in vitro acetylocholiny w trzech rurkach dializacyjnych oznaczano w sposób opisany poprzednio (Wu et al., ibid). Średni odzysk wyniósł 17,6+-0,5%.

Po zakończeniu eksperymentów z wydzielaniem zweryfikowano histologicznie umiejscowienie sond dializacyjnych stosując wybarwianie substancją Nissl’a. Wpływ galaniny i m15 na indukowane skopolaminą wydzielanie acetylocholiny, mierzony in vivo ze szczurzego hipokampa brzusznego.

Solanka	2,0 pmole
Skopolamina	13,1 pmola
Skopolamina + Galanina	6,9 pmola
Skopolamina + M15	9,4 pmola

Galaninę (1,56 nmola) i M15 (3,12 nmola) wstrzyknięto i.c.v. 2 minuty przed skopolaminą (0,3 mg/kg, s.c.). Wydzielanie ACh mierzono w perfuzacie zbieranym podczas następnych 80 min, w czterech frakcjach co 20 minut. Wartości wyrażono w pmolach ACh mierzonej podczas 20 minutowej frakcji odpowiadającej pikowi efektu skopolaminy i odpowiadającej drugiej frakcji 20 minutowej. Dane są średnimi z eksperymentów przeprowadzonych na dwóch szczurach (n=2).

Na podstawie powyższych eksperymentów można wywnioskować, że peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, przeciwdziała indukowanemu przez galaninę hamowaniu indukowanego przez skopolaminę wydzielania acetylocholiny w hipokampie.

3) Wpływ doyanałowngo pogawania galaniny i ntymulacji wtókna C na oCrnc h zginacza opisali Wiesenfeld-Hallin Z., et al. (Brain Res. 486 (1989) 205-213). Stosując taką samą procedurę jak w cytowanej pozycji wykazano, że peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M15, posiada efekt antanonistynzny na indukowane przez aokanałowo podawaną nalanmę

171 497 torowanie odruchu zginacza. Inny peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku. M35, w eksperymentach wstępnych dał podobne wyniki.

Badania elektrofizjologiczne

W eksperymentach ostrych wielkość polisynantycznego odruchu zginacza ścięgna podkolanowego w odpowiedzi na pobudzanie wysokoprogowych nerwów doprowadzających zbadano na odkorowanych, nie usypianych szczurach przez zapisanie elektromiogramu (EMG) tylnych mięśni dwugłowych udowopółścięgnistych. Zwierzęta uśpiono na krótko Brietalem i do tchawicy wprowadzono kaniulę. Szczury rozpięto na ramie stereotaksyjnej, odkorowano przez aspirowanie przodomózgowia i śródmózgowia i wentylowano. Rdzeń kręgowy odsłonięto przez laminektomię na poziomie klatki piersiowej i wycięto przy Ths-9. Implantowano doklatkowo kateter (PE 10) w kierunku ogona do przecięcia z jego szczytem na lewej stronie lędźwiowego rdzenia kręgowego (L4-5). Jako bodziec testowy, wywołujący odruch zginacza stosowano pobudzanie nerwu łydkowego lub jego obszaru unerwienia pojedynczymi wstrząsami elektrycznymi (0,5 ms, 10 mA) o sile wystarczającej do aktywacji włókien C (Wall and Woolf, 1984). W niektórych eksperymentach do nerwu łydkowego jako bodziec testowy doprowadzano CS (bodziec warunkowy) (1 Hz, 20 s) o tej samej sile, co bodziec testowy.

Odruch zginacza zapisywano jako aktywność EMG poprzez elektrody igłowe ze stali nierdzewnej, wprowadzone do mięśni ścięgien podkolanowych po tej samej stronie. Ilość potencjałów działania wywołanych podczas odruchu sumowano przez 2 s. Zsumowany odruch zapisywano na rejestratorze wykresów Gould'a (model 2400 S). Podczas eksperymentów monitorowano szybkość uderzeń serca i temperaturę w odbycie szczura i utrzymywano je w granicach normy. Prawidłowe umieszczenie kateteru dopiersiowego potwierdzano po każdym eksperymencie przez laminektomię.

Galaninę (Bachem, Bubendorff, Szwajcaria) i somatostatynę (Ferring, Malmo, Szwecja) rozpuszczono w 0,9% solance. Wszystkie peptydy wstrzykiwano dopiersiowo w objętości 10 μΐ, po czym przepłukiwano kateter 10jLtl solanki.

Zbieranie danych

Stabilną podstawową wielkość odruchu ustalano w ciągu co najmniej 20 min. przed każdą iniekcją doklatkową lub CS nerwu. Wpływ peptydów podawanych doklatkowo lub CD nerwu na odruch zginacza jako procentową zmianę wielkości odruchu w porównaniu z linią podstawową, którą zdefiniowano jako 100%. Dla zbadania interakcji galaniny z innymi peptydami lub CS łydki galaninę podawano 15 min. przed iniekcją pozostałych peptydów, gdy ułatwiający wpływ galaniny zmniejszał się, lub jednocześnie z CS łydki.

Mierzono antagonistyczny efekt doklatkowego (i.t.) podania M15 na indukowane przez doklatkowe podanie galaniny torowanie odruchu zginacza. Pik efektu torującego dla 30 pmoli galaniny wynosił 167,0±42% w porównaniu z wielkością podstawową odruchu. Antagonizm M-15, wstrzykniętego 5-10 minut później wyliczono jako procentowe zmniejszenie piku torującego efektu galaniny. Dane podano jako średnie SEM.

Dawka M-15	n	% antagonizmu
30 pmoli	4	35,8±20,7
300 pmoli	4	79,3± 8,4
3 nmole	3	93,0± 3,4

Eksperymenty powtórzono, stosując peptyd wytwarzany sposobem według wynalazku, M35, i osiągnięto podobne rezultaty.

Na podstawie powyższych eksperymentów można wywnioskować, że peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku przeciwdziałają indukowanemu przez doklatkowe podanie galaniny torowaniu odruchu zginacza w sposób zależny od dawki.

4) Przeprowadzono badania wiązania ligandu. Badano wypieranie ^5 I-galan-ny fragmentu galaniny (1-13), fragmentu substancji P (4-11), fragmentu .οΙοπι- (1-13) + fragment substancji P (4-11) w stężeniach równomalawnch i peptydów wytwarzanych sposobem według

171 497 wynalazku M15, M35 i M34A. Wykazano, że peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku wiązą się specyficznie z receptorem galaniny.

Otrzymywanie świńskiej ¹²⁵ I-monojodo-Tyr -galaniny

Syntetyczną świńską galaninę (1-29) jodowano metodą z chloraminą T, otrzymując świńską ¹²⁵I-monojodoTyr“⁶-galaninę (aktywność właściwa 18100-2000 C1/mmol) (jak opisali Land. T. et al., w Mrthods in Neurosciyncey, Ed. M. Conn, S, 1991,225-234), którą zastosowano w badaniach wiązania ligandów, przeprowadzonych w warunkach równowagowych. Przygotowanie frakcji membranowej komórek Rin m 5F.

Ustalanie i hodowlę komórek Rin m SF (linia komórkowa szczurzych komórek trzustkowych) opisano wcześniej (Gazdav A. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(1980) 3519-3523. W skrócie komórki namnażano w pożywce RPMI-1640 (Gibco), zawierającej 10% (v/v) cielęcej surowicy płodowej, 2,06 mM L-glutaminy, 100 j.m./ml penicyliny i 1 θ0 gg/ml streptomycyny w atmosferze składającej się w 110% z CO2 i w 90% z powietrza o temperaturze 37°C. Pasazowano je co 5 dni. Komórki zdjęto z powierzchni butli, stosując 0,25% trypsynę, zawierającą 1 mM EDTA i wirowano przy 2000 g w ciągu 5 minut w temperaturze 4°C. Peletkę poddano działaniu przez 15 minut hipoosmotycznego bufora HEPES o stężeniu 5 mM (pH 7,4). Zawiesinę wirowano przy 2000 g przez 15 minut, uzyskaną peletkę zawieszono ponownie w roztworze Krebsa-Ringem (137 mM NaCl, 2, 68 nM KCl, 1 8 mM CaCb, 1 g/l glukozy) buforowanym 5 mM HEPES, zawierającym bacytracynę (1 mg/ml), pH 7,4, i zastosowano niezwłocznie w równowagowych eksperymentach wiązania.

Wypieranie ^l25I-galaniny przez, galaninę i ligandy receptora galaniny

Eksperymenty wypierania przeprowadzano w objętości końcowej 400 ul roztworu Krebsa-Ringera buforowanego HEPES (5 mM), zawierającego bacytracynę (1 mg/ml), 0,05% (w/v) BSA’ (pH 7,4) w obecności 0,1-0,2 nM ¹²⁵I-galaniny, preparatu membranowego i wzrastających stężeń (10'’2 -10’6m) nieznakowanej galaniny świńskiej lub innych ligandów receptora galaniny. Próbki inkubowano w ciągu 30 minut w 37°C. Inkubowanie zakończono przez dodanie 10 ml lodowato zimnego roztworu Krebsa-Ringera buforowanego HEPES, po czym szybko sączono przez sączki Whatmana GF/C, powlekane przez 5-6 godzin w 0,3% (v/v) roztworze polietylynoiminy. Sączki przemyto 10 ml roztworu badanego. Radioaktywność pozostałą na sączkach oznaczano za pomocą licznika gamma Packarda. Wiązanie właściwe definiowano jako wiązanie wypieralne przez 1 μΜ galaniny (lub odpowiednie stężenie substancji wypierającej). Wartości IC50 ligandów wypierających obliczano z generowanych komputerowo wartości IC 50 jak opisali Land T. et al., ibid. Dopasowywanie danych eksperymentalnych prowadzono na komputerze Macintosh SE metodą najmniejszych kwadratów, stosując program Macintosh KalyidGraph.

Wypieranie ^I25I-galaniny z membran Rin m 5F przez ligandy receptora galaniny

	IC50
Galanina (1-29)	1 nM
M15	0,1 nM
Fragment galaniny (1-13)	100 nM
Fragment substancji P (4-11)	brak wypierania > 10 μm
Fragment galaniny (1-13) + fragment substancji P (4-11) w stężeniach równomolowych	100 nM
M35	0,1 nM
M34,A	10 nm

Wyniki powyższych eksperymentów wskazują niezbicie, że peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku są receptorami galaniny.

Eksperymenty farmakologiczne 1), 2) i 3) wykazują zatem, że peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku są antagonistami galaniny, a eksperyment 4) wykazują, że są ligandami receptora galaniny. Zatem antagoniści galaniny wytwarzam sposobem według wynalazku są ligandami receptora galaniny, w przeciwieństwie do innych związków, które jak wykazano wcześniej, antagonizują specyficzny efekt galaniny w specyficznych tkankach poprzez interakcję z etapem reakcji poza receptorem galaniny, biorących udział w biologicznym działaniu galaniny w danym rodzaju komórek. Taki antagonizm niejest specyficzny dla działania galaniny i niejest wywierany przy receptorze galaniny. Nie ma on równieŻ zastosowania w kilku tkankach, w których działa galanina, podczas gdy antagoniści wytwarzani sposobem według wynalazku są rzeczywistymi antagonistami w znaczeniu farmakologicznym i wywierają swoje działanie w miejscu receptorowym poza komórką przez współzawodnictwo z ligandem endogennym.

Przygotowanie membran z podwzgórza szczura

Dorosłe szczury płci męskiej (Sprague-Dawley, 180-200 g) dekapitowano, podwzgórze szybko wycięto i zhomogenizowano (10% mas/obj.) w 0,05 M buforze TRIS-Cl o pH 7,4. Homogenizat rozcieńczono dziesięciokrotnie i wirowano przy 1000 g w ciągu 10 minut. Supernatant wirowano przy 10000 g w ciągu 45 minut, a peletkę zawieszono ponownie w roztworze Krebsa-Ringera (137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 1,8 CaCE, glukoza 1 g/l), pH 7,4, buforowanym 5 mM HEPES, uzyskując końcowe stęŻenie białka 1,0-1,5 mg/ml.

Badania wiązania ligandu na podwzgórzu szczura

Eksperymenty wypierania prowadzono w końcowej objętości 400 μΐ roztworu KrebsaRingera buforowanego Hepes (5 mM), 0,05% (w/v) BSA (pH 7,4), suplementowanego bacytracyną (1 mg/ml) w obecnością 0,1 -0.2 nM ’⁵l-galaniny, preparatu membran z podwzgórza szczura i wzrastających stęŻeń (10^-10^-6 M) nieznakowanej galaniny lub innych ligandów receptora galaniny. Próbki inkubowano w ciągu 30 minut w 37°C. Inkubację kończono przez dodanie 10 ml lodowato zimnego roztworu Krebsa-Ringera buforowanego Hepes, po czym szybko sączono przez sączki Whatman GF/C, powlekane przedtem przez 5-6 godzin w 0,3% (v/v) roztworze polietylenoiminy. Sączki przemywano 10 ml roztworu badanego. Radioaktywność zatrzymaną na sączkach oznaczano za pomocą licznika gamma Packard. Specyficzne wiązanie określano jako wiązanie wypierane przez 1 μ M galaniny. Dla galaniny szczurzej i świńskiej otrzymano krzywe wypierania nie róŻniące się od krzywych dla membran z podwzgórza szczura.

Wartości IC50 dla ligandów wypierających obliczono przez dopasowanie danych eksperymentalnych na komputerze Macintosh SE za pomocą metody najmniejszych kwadratów, stosując program Kaleidagraph.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania peptydów wybranych z grupy składającej się z:

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Gln

-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro

-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro

-Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-X

Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-H,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-(D-Arg)-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-(D-Trp)-Phe-(D-Trp)-Leu-Leu-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro

-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Ala

-Leu-Ala-Leu-Ala-.Leu-Ala-X,

171 497

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Lcu-Gly-Pro-Pro-Pro-Ala-Leu-Ala-Lcu-Ala-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Ala-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Lcu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-X,

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Lcu-Leu-Gly-Pro-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gly-Tyr-X, w których X oznacza -NH2 lub -OH (amid lub wolny kwas), znamienny tym, że:

a) kolejno włącza się w fazie stałej po jednej żądane reszty aminokwasowe do rosnącego łańcucha peptydowego, albo

b) sprzęga się aminokwasy etapowo w roztworze, stosując odpowiednio derywatyzowane aminokwasy.