PL170943B1 - Sposób wzmacniania ekspresji enzymu wykazujacego aktywnosc degradowania arabinanu, zwlaszcza enzymu z grupy arabinofuranozydaz PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1, Sposób wzmacniania ekspresji enzymu wykazujacego aktywnosc degradowania arabinanu, zwlaszcza enzymu z grupy arabinofuranozydaz, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm gospodarza stransformowany czasteczka DNA kodujaca enzym wykazujacy zdolnosc do rozszczepiania wiazan (1 - 2)- a-L-arabinozydowych, wiazan (1- 3)- a-L-arabinozydowych lub wiazan (1 - 5)- a- L-arabinozydowych albo wiazania (1- 6) pomiedzy terminalna jednostka arabinofuranozylowa, a posrednia jednostka glukozylowa monoterpenylo-a-L-arabinofuranozyloglukozydów przy czym jako czasteczke DNA stosuje sie czasteczke wybrana z grupy obejmujacej: 1) czasteczke DNA posiadajaca sekwencje nukleotydowa od pozycji 161 do 1660 na fig. 5; 2) czasteczke DNA, która obejmuje, w nastepujacej kolejnosci egzony biegnace od nukleolydów 1247 do 1390, od 1443 do 1957, od 2006 do 2089, od 2138 do 2214, od 2263 do 2295, od 2347 do 2498, od 2519 do 3037, od 3093 do 3485 na fig. 14; 3) czasteczke DNA, która obejmuje, w nastepujacej kolejnosci egzony biegnace od nukleotydów 1178 do 1444, od 1495 do 1971, od 1972 do 1930, od 2031 do 2116 i od 2168 do 2378 na fig. 19; 4) czasteczke DNA, która jest genetycznym wariantem czasteczek DNA wyszczególnionych w powyzszych podpunktach 1 - 3 ; 5) czasteczke DNA, która jest zdolna do hybrydyzacji z czasteczkami zdefiniowanymi w powyzszych podpunktach 1-3, a nastepnie odzyskuje sie enzym wykazujacy aktywnosc degradowania arabinanu. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wzmacniania ekspresji enzymu wykazującego aktywność degradowania arabinanu, zwłaszcza enzymu z grupy arabinofuranozydaz. Wynalazek znajduje zastosowanie do usuwania zmętnienia arabinanowego, zmniejszania lepkości soku owocowego lub warzywnego i uwalniania terpenylowych składników aromatycznych z soku owocowego lub warzywnego. Prowadzi to do polepszania in vivo przyswajania i wykorzystania roślinnych składników odżywczych przez zwierzęta. Wynalazek dotyczy dziedziny biologii molekularnej, a w szczególności klonowania i ekspresji genów kodujących enzymy pochodzenia grzybowego.

Skład ścian komórek roślinnych jest złożony i zmienny. Polisacharydy stwierdza się głównie w postaci długich łańcuchów celulozy (główny składnik strukturalny ściany komórek roślinnych), hemicelulozy (zawierającej różne łańcuchy (β-ksylanu)) i substancji pektynowych (składających się z galakturonianów i ramnogalakturo-nianów; arabinanów oraz galaktanów i arabinogalaktanów). Z punktu widzenia przemysłu spożywczego, substancje pektynowe, szczególnie arabiniany, stały się jednymi z najważniejszych składników ścian komórek roślinnych (Whitaker, J.R. (1984) Enzyme Microb. Technol., 6, 341).

Arabinany składają się z głównego łańcucha podjednostek α-L-arabinozy połączonych ze sobą wiązaniami α-(1—5). Łańcuchy boczne połączone są z głównym szkieletem α-(1—5)-Ε--κώίη3ηη wiązaniami α-('.1->3) lub czasami α-(1—2). W jabłkach, na przykład, jedna trzecia całkowitej zawartości arabinozy występuje w łańcuchach bocznych. Masa cząsteczkowa arabinanu zazwyczaj wynosi około 15 kDa.

Enzymy zdolne do degradacji arabinanów stają się coraz ważniejsze dla przemysłu spożywczego. W produkcji soków, na przykład, konieczność podwyższenia wydajności w celu obniżenia kosztów produkcji narzuca potrzebę zmodyfikowania tradycyjnych procesów. Wykorzystanie wstępnych obróbek enzymatycznych miazgi owocowej,

170 943 przed wytłaczaniem, specyficznymi produktami enzymatycznymi znacząco poprawia wydajność przy produkcji soków dzięki rozpuszczaniu polisacharydów ścian komórkowych.

Jednakże, trwałe zmętnienie. powszechnie określane jako zmetnienie ara• ‘ JL *»

ΊΤ!npe-ł- wp^lonę nrsKla^Am w rz^łs ρλΌΑιρ 7τη^·τχ^^^'α ο^ό_

W J PiUUlViŁl piULUVJLliUVY ΥΎ jJx uuunyjl X4U£t^k74CVZA_/Xljr vil uł\JXVV7VT. > Ji LI tixci binanowe częściej występuje w zagęszczonym niż w niezagęszczonym soku. Może to wskazywać na wpływ aktywności wodnej na rozpuszczalność arabinanu. Stwierdzono ponadto, że zmętnienie ulega rozpuszczeniu w temperaturach pomiędzy 60 a 80°C.

Stwierdzono także, że o ile rozgałęziony arabinan jest rozpuszczalny w zagęszczonych schłodzonych sokach jabłkowym i gruszkowym, liniowy, nierozgałęziony α-(1-5)L-arabinan jest znacznie mniej rozpuszczalny. Ten nierozgałęziony α-(1-5)-L-arabman tworzy się z L-arabinanu dzięki działaniu enzymu degradującego arabinan obecnego w dostępnych w handlu preparatach enzymów pektynowych z Aspergllus niger, powszechnie stosowanych do zwiększania wydajności wytwarzania soku po obróbce miazgi, ale przed wytłaczaniem.

Z drugiej strony, nierozgałęzione arabinany uważa się za pożądane do pewnych innych zastosowań. Światowy opis patentowy numer 90/06343 ujawnia nierozgałęzione arabany buraków cukrowych powstałe dzięki działaniu α-iLarabmofuranozydazy, wolnej od aktywności endolitycznej arabinanazy, którą izoluje się z przesączu hodowli Aspergillus niger lub z dostępnej w handlu mieszaniny pektynazy, stosując procedury chromatografii jonowymiennej i sączenia molekularnego. Nierozgałęziony araban można stosować jako substytut tłuszczu w żywności.

Wiadomo, że enzymy degradujące arabinan są wytwarzane przez szereg roślin i mikroorganizmów, a wśród nich grzyby, takie jak te z rodzajów AspergzY/us, Corńczum, Rhodotorula (Kaji, A. (1984) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 42, 383), Dzchotomzius (Brillouet i in. (1985) Carbohydrate Research, 144. 113), Ascomyce/es i Basidomyceies (Sydow, G. (1977) zgłoszenie patentowe Niemieckiej Republiki Demokratycznej numer 124 812).

W szczególności, wiadomo, że nitkowaty grzyb Aspergllus niger wytwarza trzy różne enzymy degradujące arabinan: α-L-arab-nana/ę, posiadającą masę cząsteczkową około 35 kDa, i dwie α--2-10^1110/23^^, posiadające masy cząsteczkowe odpowiednio 118 i 60 kDa (Rombouts i in. (1988) Carbohydrate Polymers, 9, 25). [N.B. van der Veen i in. ((1991) Arch. Microbial., 157. 23) podają masy tych trzech enzymów odpowiednio na 43, 83 i 67 kDa].

Arabinanaza o masie cząsteczkowej 35 kDa (znana także jako ABN A) posiada aktywność endolityczną i rozszczepia wyłącznie wiązania 1—5. Aktywność tego enzymu obniża się w miarę jak sekwencja 1,5-α-L·-arab-nanu staje się krótsza, a wzrasta stężenie dimerów i trimerów arabmozy (Rombouts i in., supra). [N. B. van der Veen i in. (1991) podali masę cząsteczkową 43 kDa].

α-L·iAabmofurano/yda/a o masie cząsteczkowej 118 kDa (znana także jako arabinofuranozydaza A, ABF A lub EXO A) rozszczepia wyłącznie wiązania 1—5 posiadając aktywność typu egzolitycznego, jak wykazano przez akumulację monomerów arabinozy. Enzym wykazuje najwyższą aktywność wobec substratów o niskiej masie cząsteczkowej (Rambouts i in., supra). [N. B. van der Veen i in. (1991) podali masę cząsteczkową 83 kDa].

α-L-Arabmofuranozyda/a o masie cząsteczkowej 60 kDa (znana także jako arabinofuranozydaza B, ABF B lub EXO B), także posiadająca aktywność typu egzolityc/nego, rozszczepia głównie 1—3 i 1—2 α-L--irabinany, a ponadto wykazuje także zdolność do rozszczepiania 1—5 α-L-arabmanów. Ponownie, po degradacji substratu zawierającego cr-L-arabinan wykrywa się tylko monomery arabinozy (Rambouts i in., supra). [N. B. van der Veen i in. (1991) podali masę cząsteczkową 67 kDa].

Wykazano także, że enzym ABF B A. niger posiada także zdolność rozszczepiania wiązania 1—6 pomiędzy końcową jednostką arabinofuranozylową a pośrednią glukozą monoterpenylo-α-L-Irab-nαfuranozyloglukozydów (Gunata i in. (1989) europejskie zgłoszenie patentowe numer 332.281; Gunata i in. (1990) J. Agric. Food Chem., 38, 772).

170 943

Enzymy posiadające aktywność podobną do aktywności enzymu ABF B A. niger zidentyfikowano w innych grzybach, takich jak D/chotomituj spualms' (Brillouet i in., supra, Corticium rolfwi i Rhodotorula f7ava (Kaji, A., supra).

Możliwym rozwiązaniem problemu tworzenia zmętnienia w sokach może być zastosowanie preparatu enzymatycznego o poprawionej równowadze pomiędzy endolityczną arabinanazą (ABN A) a enzymami ABF A i ABF B lub, alternatywnie, enzymami o podobnych aktywnościach, tj. jedną lub więcej arabinofuranozydazami otrzymanymi z innego mikroorganizmu, które zdolne są do rozs^t^^t^j^i^^^nia 1->3 i 1-*2 α-L-arabinanów, jak również 1->5 α-L-anibmanów. Jednakże, normalna fermentacja A. niger nie zapewnia wystarczających poziomów pożądanych arabinofuranozydaz. Co więcej, korzystna by była możliwość zmniejszenia ilości ABF A, ABF B i ABN A dla uzyskania optymalnych wyników w specyficznych zastosowaniach.

Zdolność enzymu ABF B do rozszczepiania końcowego wiązania 1->6 monoterpenylo-α-L··arabinofuranozyloglukozydów można wykorzystać do wspomagania uwalniania składników aromatycznych z różnych soków owocowych i zatem, wzmocnienia ich smaku (Gunata, Z. i in. (1989 i 1990), supra). Jednakże, byłoby korzystne stosowanie do tego celu oczyszczonego enzymu ABF B lub podobnego do ABF B, ponieważ obecność innej aktywności enzymatycznej może powodować degradację innych ważnych składników soku i, w ten sposób, mieć niekorzystny wpływ na ostateczną jakość soku.

W warunkach naturalnych enzymy mikroorganizmów degradujące arabinany mikroorganizmów wytwarzane są zawsze wraz z innymi enzymami o aktywnościach degradujących polisacharydy, takimi jak pektynazy, ksylanazy, esterazy acetyloksylanowe, esterazy octanowe, galaktanazy i celulazy. Jak wspomniano powyżej, do pewnych zastosowań te aktywności enzymatyczne nie są potrzebne lub są niepożądane. Co więcej, na skutek stosunkowo niskich poziomów ekspresji w szczepach typu dzikiego, enzymy degradujące arabinan okazały się być nieco trudne do rozdzielenia od siebie nawzajem i od innych enzymów wytwarzanych przez A. niger.

Wiadomo, że warunki fermentacji można zmieniać tak aby sprzyjały wytwarzaniu enzymu będącemu przedmiotem zainteresowania. Wiadomo także, że sklonowanie genu kodującego pożądany enzym i umożliwienie jego zwiększonej ekspresji w jego naturalnym gospodarzu, lub w innym kompatybilnym gospodarzu ekspresyjnym, wzmocni specyficznie wytwarzanie enzymu będącego przedmiotem zainteresowania. Ta druga metoda jest szczególnie użyteczna, jeśli enzym będący przedmiotem zainteresowania można otrzymać w większych ilościach, lub w postaci, w której jest wolny od innej, niepożądanej aktywności enzymatycznej.

Wyraźnie, zwiększenie aktywności degradującej arabinan poprzez techniki rekombinacji byłoby użyteczne. Jednakże, jak dotąd, geny A. niger kodujące enzymy degradujące arabinan nie były dostępne. A zatem, wielkie znaczenie miałoby otrzymanie genów pochodzenia grzybowego kodujących enzymy degradujące arabinan, które mogłyby wywołać ekspresję w natywnym gospodarzu lub, alternatywnie, w innych gospodarzach będących mikroorganizmami, w których można uzyskać wysokie poziomy ekspresji jednego lub więcej enzymów degradujących arabinan.

Ekspresję zrekombinowanej bakteryjnej α---arabinofuranozydazy opisali uprzednio Schwarz i in. ((1990) Biochem. Biophys. res. Commun., 170. 368). Gen kodujący bakteryjną arabinofuranozydazę wyizolowano z ClosZ/ridium stercoratrum i wywołano ekspresję w gospodarzu E. coli.

Gen kodujący arabinozydazę sklonowano z beztlenowej bakterii BacZeroidej ovaZus i wywołano ekspresję w E. coli, jak ujawnili Whitehead i Hespell ((1990) J. Bacteriol., 172. 2408).

E. coli, jednakże, w pewnych przypadkach uważana jest za niebezpiecznego gospodarza ekspresyjnego do wytwarzania białek metodami rekombinacji DNA na skutek wytwarzania przez nią niemożliwych do przyjęcia produktów ubocznych, takich jak toksyny. Ponadto, podczas ekspresji w E. coli duże ilości białek heterologicznych mają tendencję do skumulowania, się wewnątrz komórki. Oczyszczenie pożądanego białka z puli wewnątrzkomórkowych białek E. coli może czasami być trudne.

Co więcej ponieważ geny bakteryjne nie zawierają intronów. napotyka się niewiele *> a» x w a aa a i / x a *-»^•»•/-*1^.1 1x1 r\-r\ /StłTO νΜΛ « 4τ»1πλ1> w»» ζΑΧ/νη «a Λ TAX^1m ·»« Xv4-w TArr picsuiCuLiuw puuuLdo fuunimaiLia 1 vjkDpivoji ιαινινιι gvnUw w Uiga.inzjiIIa.vii piUAaiiutyvL“ nych. Z drugiej strony. ekspresja genów eukariotycznych nie zawsze jest tak prosta. Dobrze wiadomo. że geny wyizolowane ze szczepów eukariotycznych mogą zawierać introny. Wprowadza to komplikacje podczas klonowania i ekspresji tych genów. dlatego też powinien być preferowany gospodarz prokariotyczny.

Ponadto, pomiędzy właściwościami fizycznymi enzymów degradujących arabinan pochodzenia grzybowego i tych z bakterii występują pewne różnice. Ogólnie rzecz biorąc. enzymy grzybowe posiadają optimum pH w zakresie od < 3.0 - 6.0. Nieliczne gatunki grzybów wytwarzają enzymy degradujące arabinan posiadające optimum pH tak niskie. jak pH 2.0. Te optima pH są generalnie znacząco niższe w porównaniu do podobnych enzymów ze szczepów bakteryjnych które posiadają optimum pH w zakresie 5.0 - 7.0 (Karimi i Ward (1989) J. Indust. Microbiol.. 4. 173; Lee i Forsberg (1987) Can. J. M.icrobiol.. 33. 1011). A zatem. jest jasne. że bakteryjne enzymy degradujące arabinan są mniej odpowiednie do stosowania w. na przykład. procesach wymagających warunków niższego pH.

Sposób wzmacniania ekspresji enzymu wykazującego aktywność degradowania arabinanu. zwłaszcza enzymu z grupy arabinofuranozydaz polega według wynalazku na tym. że hoduje się mikroorganizm gospodarza stransformowany cząsteczką DNA kodującą enzym wykazujący zdolność do rozszczepiania wiązań (1—2)-α-iLarabinozydowych . wiązań (1-*3)-a-L-arabmozydowy lub wiązań (1—5)azaίLarabmozydowych albo wiązania (1—6) pomiędzy terminalną jednostką raabmofuarLnozylową. a pośrednią jednostką glukozylową monoterpenyk-α -L-arabinofuranozylogίukozydów. przy czym jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej:

1) cząsteczkę DNA posiadającą sekwencję nukleotydową od pozycji 161 do 1660 na fig. 5;

2) cząsteczkę DNA. która obejmuje. w następującej kolejności egzony biegnące od nukleotydów 1247 do 1390. od 1443 do 1957. od 2006 do 2089. od 2138 do 2214. od 2263 do 2295. od 2347 do 2498. od 2519 do 3037. od 3093 do 3485 na fig. 14;

3) cząsteczkę DNA która obejmuje. w następującej kolejności egzony biegnące od nukleotydów 1178 do 1444. od 1495 do 1971. od 1972 do 1930. od 2031 do 2116 i od 2168 do 2378 na fig. 19;

4) cząsteczkę DNA. która jest genetycznym wariantem cząsteczek DNA wyszczególnionych w powyższych podpunktach 1-2;

5) cząsteczkę DNA. która jest zdolna do hybrydyzacji z cząsteczkami zdefiniowanymi w powyższych podpunktach 1--3. a następnie odzyskuje się enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu.

W sposobie według wynalazku korzystnie. jako cząsteczki DNA stosuje się cząsteczki pochodzące z mikroorganizmu grzybowego. a zwłaszcza cząsteczki DNA pochodzące ze szczepu grzybowego Aspergillus.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA możliwą do otrzymania z gatunków grzybowych wybranych z Aspergillus niger. Aspergillus niger var. tuhzg^enszs. Aspergi/lus niger var awamori. Aspergillus acu/eatiS', Dzchotomztus sęua/enes. Cortzcium ro/fM/. Penicellium chrysogenum i Rhodtorula flaya.

Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA możliwą do otrzymania z gatunków grzybowych wybranych z Aspergillus niger. Aspergillus niger yar. tubzgensis lub Aspergillus niger yar. awamori.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA kodującą enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu dodatkowo włączoną do konstrukcji DNA zdolnej do kierowania wzmocnioną ekspresją z cząsteczką DNA kodującą enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu. przy czym wspomniana cząsteczka DNA

170 943 jest połączona w sposób umożliwiający działanie z regionami regulacyjnymi zdolnymi do kierowania wzmocnioną ekspresją enzymu degradującego arabinan w odpowiednim gospodarzu.

Sposob według wynalazku korzystnie polega na tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, w której dodatkowo regiony regulacyjne obejmują promotor połączony w sposób umożliwiający działanie ze wspomnianą cząsteczką DNA, w której promotor jest możliwy do otrzymania z następujących genów: genu grzybowej endolitycznej α-L-arabinanazy (abnA); genu grzybowej α-L-arabmofuranozydazy A (abfA); genu grzybowej α-L-arabinofuranozydazy B (abfB); genu grzybowej ksylanazy (x1nA); genu grzybowej fitazy; genu grzybowej syntetazy ATP; genu grzybowej podjednostki 9 (oliC); genu grzybowej izomerazy triozofosforanowej (tpi); genu grzybowej dehydrogenazy alkoholowej (adhA); genu grzybowej α-amylazy (amy); genu grzybowej amyloglukozydazy (glaA); genu grzybowej acetoamidaz (amdS); genu grzybowej dehydrogenazy 3-fosfoglicerynowego (gpd); genu drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej; genu drożdżowej laktazy; genu drożdżowej kinazy 3df:)sfogllceiy.nianowej; genu drożdżowej izomerazy triozofosforanowej; genu bakteryjnej α-amylazy; genu bakteryjnej Spo2 i genów bakteryjnych proteaz zewnętrznokomórkowych.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się cząsteczki DNA, w których dodatkowo regiony regulacyjne obejmują sekwencję lidera sekrecji, przy czym lider sekrecji jest możliwy do otrzymania z następujących genów; genu 18-aminokwasowego lidera AG grzybowej amyloglukozydazy (glaA); genu 24-aminokwasowego lidera AG grzybowej amyloglukozydazy (glaA); genu drożdżowego czynnika i genu bakteryjnego α-amylazy.

Sposób według wynalazku korzystnie polega na tym, że stosuje się konstrukcję DNA dodatkowo włączoną do wektora.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się stransformowanego gospodarza będącego mikroorganizmem, zdolnym do wzmocnionej ekspresji enzymu wykazującego , aktywność degradowania arabinanu, dodatkowo wybranego z następujących rodzajów Aspergllus, K/uyneromyces, Pzc/zoderma, Saccha^z^o^^yccs i BacrY/us.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się gospodarza będącego mikroorganizmem, dodatkowo wybranego z następujących gatunków Aspergillus niger, Aspergil/us niger var. awarmori, Aspergllus nar. tubi^gensis, Aspergillus aculeatus, Aspergllus oryzae, Trichoderma reesei, Bacil/ns subulis, Bacillus lichenifbzwżs, Kluyeromyces lactis i Saccharomyces cerewisiiae.

	Krótki opis figur
1	2
Figura 1	Schematyczny diagram procedury oczyszczania do otrzymywania enzymu α-L-ababinofuranozydazy (ABF B) zA. niger
Figura 2	Sekwencja aminokwasowa N-końca białka ABF B A. niger (wzór 1) i sekwencja nukleotydowa mieszaniny oligonukteoiydowej AB1719 (wzór 1a).
Figura 3	Sekwencja aminokwasowa N-końca fragmentu otrzymanego przez strawienie CNBr białka ABF B A. niger (wzór 3) i sekwencja nukleotydowa mieszaniny oligonukeotiydowej AB23G6 (wzór 3a).
Figura 4	Częściowa mapa restrykcyna hybrydyzującego klonu fagowego 7.
Figura 5	Sekwencja nukleotydowa genu abfB A. niger (wzór 4)
Figura 6	Sekwenq'a aminokwasowa (wzór 5) białka ABF BA. niger, na podstawie sekwenqi genu abfB i potwierdzona sekwenq’ą cDNA abfB.
Figura 7	Fizyczna mapa pAB 6-1. Wstawka Hindlll DNA o długości 14,5 kb w pUC19 zawiera całe locus amyloglukozydazy (AG) A. niger.

170 943

ciąg dalszy tabeli
1	2
Figura 8	Schemat tworzenia fuzji genowych AG/abfB przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). Sekwencje wszystkich stosowanych starterów oligonukleotydowych wskazano w tekście.
Figura 9	Schematyczne przedstawienie konstrukcji pAGabfB2 i pAGabfB3. Klucz do stosowanych symboli: NAv\\x;| : sekwencja kodująca peptyd sygnałowy o długości 18 aminokwasów genu amyloglukozydazy (AG) A. niger (glaA). : sekwencja kodująca dojrzałe białko ABF B Amp : gen oporności na ampicylinę ori : miejsce początku replikacji E. coli AG : promotor amyloglukozydazy (AG) A. niger
Figura 10	Konstrukcja kasetki ekspresyjnej pAGabfB4. Klucz do stosowanych symboli: pyrA : gen A. niger kodujący dekarboksylazę orotydyno-5’--ossoranową. Pozostałe symbole są takie same jak te przedstawione w legendzie do figury 9.
Figura 11	Konstruowanie kasetki ekspresyjnej pAGabfB5. Klucz do stosowanych symboli: admS : gen A. nidulans kodujący acetoamidazę. Pozostałe symbole są takie same jak te przedstawione w legendzie do figury 9.
Figura 12	Mapa restrykcyjna cDNA klonu pC1X1. Wskazano tylko miejsca Pstl i XhoI. Miejsca restrykcyne z poliłącznika części pC1X1 pochodzącej z wektora pBluescript SK' przedstawiono w nawiasach i nie naysowano w skah.
Figura 13	Odcinek przedstawia fragment XbaI/NsiI o długości 8,5 kb sklonowany w wektorze pGEM-7Zf(+). Zakreskowana ramka odpowiada przybliżonej pozycji genu abfA. Wskazano tylko miejsca KpnI, PstI iXhoI.
Figura 14	Sekwencja nukleotydowa genu abfAA. niger (wzór 20).
Figura 15	Sekwenqa aminokwasowa (wzór 21) białka ABF AA. niger określona na podstawie sekwencji cDNA abfA.
Figura 16	A: Analiza przesączu hodowlanego transformantów abfA i A. nidulans WG096 typu dzikiego hodowanych w ciągu 24 godzin na miazdze buraka cukrowego poprzez SDSPAGE i następnie wybawienie Coomassie BrillantBlue R250. ścieżka 1 :1 ąg oczyszczonej α-L-aaabinofuranozydazy A ścieżka 2 : WGO96 ścieżki 3 do 6 : losowo wybrane transformanty abfA B: Analiza przesączu hodowlanego transformantów abfA i A. niger N402 typu dzikiego hodowanych w ciągu 24 godzin na miazdze buraka cukrowego poprzez analizę blotingiem Western. ścieżka 1 :1 fig oczyszczonej α-L-aaabbnofuranozydazy A ścieżka 2 : N402 ścieżki 3 do 6 : losowo wybrane transformanty abfA

170 943

	ciąg dalszy tabeli
1	2
Figura 17	Analiza wzoru indukcji ABF B i ABF A wA. niger N572 przez analizę blotingiem Western przesączy hodowlanych z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciw ABF B i ABN A ścieżka 1 : 24 godziny wzrostu na 1% D-glukozie ścieżka 2 :1 godzina indukqi na 1% L-arabbtolu ścieżka 3 : 2 godziny indukcji na 1% L-arabhtolu ścieżka 4 :3 godziny indukcji na 1% ścieżka 5 : 4 godziny indukcji na 1% L-irabbtolu ścieżka 6 :5 godzin indukcji na 1% L-arabhtolu ścieżka 7 :6 godzin indukcji na 1% L-arabkolu ścieżka 8 : 7 godzin indukcji na 1% L-arabkolu ścieżka 9: 1/zg oczyszczonej α-aaabmofuranozydazy B
Figura 18	Mapa restrykcyna pIM950. Odcinek przedstawia fragment HindUI o długości 3,1 kb sklonowany w wektorze pEMBL19. Zakreskowana ramka odpowiada przybliżonej pozyqi genu abnA.
Figura 19	Sekwencja nukleotydowa genu abn A. niger (wzór 22)
Figura 20	Sekwenq'a aminołwasowa (wzór 23) białka ABN A określona na podstawie sekwencji cDNAabnA
Figura 21	Analiza przesączu hodowlanego transformantów abnA i A. nidu/ans WGO96 typu dzikiego hodowanego w ciągu 24 godzin na miazdze buraka cukrowego przez analizę blotingiem Western. ścieżka 1 :1 gg oczyszczonej 1,5-α-L-aaaainanazy o aktywności endolitycznej z A. niger ścieżka 2 :1 pg oczyszczonej endolilycznej 1,5-a--L-aabmanazy z A. nidu/ans Ścieżłk. 3 i 4 :A. nidu/ans WG096 ścieżka 5 : transformant numer 20 ścieżka 6 : transformant numer 18 ścieżka 7 : transformant numer 17 ścieżka 8 : transformant numer 16 ścieżka 9 : transformant numer 12 ścieżka 10 : transformant numer 11 ścieżka 11 : transformant numer 7 ścieżka 12 : transformant numer 6 ścieżka 13 : transformant numer 2 ścieżka 14 : transformant numer 1
Figura 22	Analiza przesączy hodowlanych transformantów abnA i A. niger N402 typu dzikiego hodowanych w ciągu 24 godzin na miazdze buraka cukrowego przez bloting Western.
A:	ścieżka 1 :1 pg oczyszczonej endolitycznej 1,5-a-L arabinanazy z A. niger ścieżka 2 : N402

170 943 ciąg dalszy tabeli

1	2
B:	ścieżki 3 do 9 : transformanty 1 do 7. ś «1 1 « /V Z*X ΛΛ/1r\11 Λ* Ί C Έ Λ λ λ . — A ονινιχα a. .x wz.joŁ.wAniyj <ua.uiiiaii<iĄy z. ZA. uigci ścieżka 2 : N402 ścieżki 3 do 9 : transformanty 8 do 14.

Niniejszy wynalazek dostarcza oczyszczone i wyizolowane cząsteczki DNA możliwe do otrzymania z grzybów oraz ich genetyczne warianty, kodujące enzymy posiadające aktywność degradowania arabinanu. Genetyczne warianty obejmują cząsteczki DNA kodujące zmutowane białka degradujące arabinan i zdegenerowane cząsteczki DNA, w których zachowana jest aktywność enzymu ulegającego z nich ekspresji.

Takie konstrukcje DNA (również określane tu jako konstrukcje ekspresyjne) do ekspresji jednego lub więcej enzymów degradujących arabinan w pożądanym gospodarzu ekspresy nym. Dostarczone konstrukcje DNA mogą obejmować cząsteczkę DNA kodującą pożądany enzym degradujący arabinan i jego natywne 5’- i 3’-końcowy region regulacyjny. Alternatywnie, dostarcza się hybrydowe konstrukcje DNA, które obejmują cząsteczkę DNA kodującą enzym degradujący arabinan połączony w sposób umożliwiający działanie z regionami regulatorowymi, takimi jak promotor, sekwencje sygnałowe sekrecji i terminacji pochodzące z organizmów homologicznych lub heterologicznych, przy czym te regiony regulatorowe są zdolne do kierowania wzmocnioną ekspresją genu strukturalnego w odpowiednim gospodarzu. Korzystnie, konstrukcja ekspresyjna zostanie zintegrowana z genomem wybranego gospodarza ekspresyjnego.

Wektory, są to korzystnie plazmidy, do klonowania i/lub transformowania gospodarzy będących mikroorganizmami poprzez wprowadzanie do takiego gospodarza konstrukcji DNA do ekspresji pożądanego enzymu degradującego arabinan.

Ponadto, niniejszy wynalazek dostarcza będących mikroorganizmami gospodarzy stransformowanych jednym lub więcej wektorami, z których każdy zawiera co najmniej jedną z opisanych powyżej konstrukcji DNA. Takich gospodarzy DNA można wybrać spośród bakterii, drożdży lub grzybów.

W kontekście niniejszego wynalazku, termin wzmocniona ekspresja jest zdefiniowany jako ekspresja konstrukcji DNA, w wyniku której będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan wytwarzany jest na poziomie wyższym niż poziom zazwyczaj spotykany w homologicznym organizmie typu dzikiego. W tym samym kontekście, wzmocniona ekspresja również oznacza ekspresję w organizmie heterologicznym, który normalnie nie wytwarza takiego enzymu degradującego arabinan, z wyjątkiem wprowadzenia cząsteczki DNA kodującej będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan, wraz z odpowiednimi regionami regulacy'nymi, do heterologicznego gospodarza ekspresynego.

W kontekście niniejszego wynalazku przez termin homologiczny należy rozumieć jako element natywny dla cząsteczki DNA kodującej będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan, włącznie z jego regionami regulacyjnymi. Gospodarza homologicznego definiuje się jako gatunek, z którego można wyizolować taką cząsteczkę DNA. Termin heterologiczny definiuje się zatem jako element nienatywny dla cząsteczki DNA kodującej sam będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan, włącznie z regionami regulacyjnymi. Gospodarza heterologicznego definiuje się jako jakikolwiek gatunek mikroorganizmu inny niż ten, z którego wyizolowano gen kodujący enzym degradujący arabinan.

W obrębie niniejszego wynalazku termin będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan należy rozumieć jako obejmujący enzymy pochodzenia grzybowego degradujące arabinan.

170 943

Aktywnością degradowania arabinanu, jak zostało zdefiniowane w kontekście niniejszego wynalazku, jest zdolność enzymu do uwalniania reszt arabinozy, albo monomerów, albo oligomerów, ze szkieletu arabinanowego lub z zawierających arabinan łańcuchów bocznych innych struktur hemicelulozowych, takich jak arabinoksylany lub arabinogalaktany, lub nawet uwalniania monomerów arabinozy poprzez rozszczepianie wiązania 1->6 pomiędzy jednostką arabinofuranozylową a pośrednią jednostką glukozylową monoterpenylo-α-]Laaabmofuranozyloglukozydów.

Przykłady korzystnych aktywności degradowania arabinanu można wybrać spośród:

a) zdolności rozszczepiania wiązań (1—2)-«-arabinozydowych;

b) zdolności rozszczepiania wiązań (1—3)-α-aaabinozydowych

c) zdolności rozszczepiania wiązań (1->5)-α-arabinozydowych;

d) zdolności rozszczepiania wiązania 1->6 pomiędzy terminalną jednostką arabinofuranozylową a pośrednią jednostką glukozylową monoterpenylo-α-L-aaabinofuranozylo glukozydów.

Najkorzystniejszymi enzymami degradującymi arabinan są α--Laaaibπofuranozydazy i α ---•aaabinazy, które wykazują 1) aktywność degradowania arabinanu typu egzolitycznego wobec wiązań lub 2) aktywność degradowania arabinanu typu egzolitycznego wobec wiązań (1-»3)-α-L-aaabmozydowyqh i wiązań (1—2)-α-L-arabinozydowyych; 3) aktywność degradowania arabinanu typu endolitycznego wobec wiązania (1—5)-α -L-aaabinozydowych; lub 4) zdolność do rozszczepiania wiązania 1-> 6 pomiędzy terminalną jednostką arabinofuranozylową a pośrednią jednostką glukozylową monoterpenylo-α-L-aaabinofuranozyloglukozydów.

Korzystnymi cząsteczkami DNA kodującymi enzym degradujący arabinan są te, które można otrzymać z nitkowatych grzybów z rodzaju Aspergt/lus (szczególnie A. niger, A. niger var. tubigensis (patrz także Kusters-van Someren (1991) Curr. Genet., 19, 21), A. niger var. awamori, A. nidulans (z wyjątkiem genu abfA) i A. aculeatis), Dichotomitus (szczególnie D. sgualens), Corlicium (szczególnie C. rolfsii), Penici/lium (szczególnie P chrysogenum) i Rhodotomla (szczególnie R. flava). Szczególnie korzystne są α-L-aaabinanaza (ABN A) i α-L-aaabinofuranozydazy' (ABF A i ABF B), które można otrzymać z AspergiZlus niger, Aspergillus niger var. tubigensis lub Aspergillus niger var. awamori.

Niniejszy wynalazek obejmuje także sekwencje DNA, które w warunkach o niskiej surowości hybrydyzują z sekwencjami DNA możliwymi do otrzymania z grzybów opisanych powyżej, ale które mogą różnić się sekwencją kodonów na skutek degeneracji kodu genetycznego lub zróżnicowania międzygatunkowego.

Arabinofriranozydazy posiadające pożądaną aktywność można identyfikować różnymi metodami, nie mającymi zasadniczego znaczenia dla niniejszego wynalazku. Na przykład, oznaczenia obecności paranitrofenolu lub monomerów arabinozy wskazują na zdolność enzymu do rozszczepiania wiązań 1—3 lub 1—2-α-L-naabinozydowych przy użyciu para-nitrofenylo-α-L-aaabinozydu lub innych substratów zawierających arabinan, odpowiednio, stosując metody takie, jak te opisane przez Romboutsa i in. ((1988) supra) lub van der Veena i in. ((1991) supra). Zdolność enzymu do rozszczepiania wiązań 1 —5-α-L-aaabmozydowych można określić stosując jako substrat arabinanowy pozostałość soku jabłkowego po ultrafiltracji (UFR) i oznaczając obecność małych oligomerów arabinozydu, jak opisali Rombouts i in., supra. Alternatywnie, aktywność endolitycznej 1—5-α-L-aaabinanazy przesączu hodowlanego można mierzyć stosując zestaw testowy, taki jak tabletki Arabma-Zyme®, takie jak produkowane przez Megazyme Pty. Ltd. (North Rocks, Nowa Południowa Walia, Australia).

Kiedy będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan zostanie zidentyfikowany, cząsteczkę DNA kodującą taki enzym można otrzymać z nitkowatego grzyba, który wytwarza go w sposób naturalny, przez hodowanie grzyba w odpowiednim podłożu, izolowanie pożądanego enzymu degradującego arabinan z zastosowaniem znanych metod, takich jak te przedstawione na figurze 1 (enzym ABF B) lub te opisane

170 943 przez Romboutsa i in. ((1988) supra) lub van der Veen i in. ((1991) supra) i określenie części sekwencji aminokwasowej oczyszczonego białka.

Następnie można otrzymać sondy DNA przez skonstruowanie oligonukleotydów opierając się na przewidywanej częściowej sekwencji aminokwasowej. Sekwencje aminokwasowe można określać od N-końca całego białka i/lub od N-końców wewnętrznych fragmentów peptydowych otrzymanych przez strawienie proteolityczne bądź chemiczne całego białka. Po otrzymaniu, sondę(y) DNA stosuje się następnie do przeszukiwania biblioteki genomowej lub cDNA.

Bibliotekę genomową można przygotować przez częściowe strawienie grzybowego DNA chromosomowego enzymem restrykcyjnym, który rozpoznaje sekwencję DNA czterech kolejnych nukleotydów, np. Sau3A, i sklonowanie otrzymanych fragmentów w odpowiednim plazmidzie lub wektorze fagowym lambda, np. lambda GEM-11.

Alternatywnie, można przygotować bibliotekę cDNA przez sklonowanie cDNA zsyntetyzowanego na matrycy mRNA wyizolowanego z komórek grzybowych indukowanych do syntezy enzymu degradującego arabinan w odpowiednim wektorze fagowym, np. lambda gt10, jak opisali Harmsen i in. (1990) Curr. Genet. 18, 161.

Następnie, po wysianiu dostatecznej ilości kolonii lub łysinek, bibliotekę genomową lub cDNA można przeszukiwać odpowiednią sondą DNA.

Jeśli metoda ta nie pozwoli osiągnąć sukcesu, bibliotekę genomową lub cDNA można różnicowo przeszukiwać sondami cDNA, otrzymanymi na matrycy mRNA z komórek nieindukowanych i indukowanych. Indukowany mRNA przygotowuje się z komórek hodowlanych na podłożach zawierających arabinan jak źródło węgla, podczas gdy nieindukowany mRNA musi zostać wyizolowany z komórek hodowanych na innym źródle węgla niż arabinan, np. glukozie. Wśród klonów hybrydyzujących tylko z sondą indukowanego cDNA, można znaleźć klon zawierający gen kodujący pożądany enzym degradujący arabinan. Alternatywnie, gen kodujący będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan można zidentyfikować dzięki hybrydyzacji krzyżowej ze zbliżonym enzymem degradującym arabinan.

W przypadku enzymu ABF B, sondy oligonukleotydowe otrzymuje się opierając się na N-końcowej sekwencji aminokwasowej (patrz figura 2, wzór 1) enzymu degradującego arabinan o pozornej masie cząsteczkowej 60 kDa (w formie zglikozylowanej) otrzymanego z przesączu hodowli Aspergillus niger i/lub sekwencji aminokwasowej wewnętrznego fragmentu peptydowego (patrz figura 3, wzór 3), otrzymanego przez strawienie enzymu CNBr. Mieszaniny oligonukleotydów AB1719 (figura 2, wzór la) i AB2306 (figura 3, wzór 3a) są komplementarne do odpowiadających przewidywanych mRNA arabinofuranozydazy. W wyniku przeszukiwania biblioteki lambda GEM-11, przygotowanej z częściowo strawionego Suu3A DNA wyizolowanego z Aspergillus niger, otrzymano cztery dodatnie klony fagowe stosując mieszaninę oligonukleotydów odpowiadających N-końcowi AB 1719.

DNA wyizolowany z czterech klonów fagowych hybrydyzował z mieszaniną oligonukleotydćw odpowiadających N-końcowi AB1719 (patrz figura 2, wzór 1a). Otrzymano i zsekwencjonowano fragment SacI o długości 2,8 kb (patrz figura 4). Sekwencję nukleotydową i kodowaną sekwencję aminokwasową przedstawiono na figurach 5 i 6 (odpowiednio wzory 4 i 5). Fragment SacI w plazmidzie pGBabfBl zdeponowano w szczepie DH5α E. coli w Central Bureau voor Schimmelcultures (Baarn, Holandia w dniu 11 marca 1991 r. pod numerem CDB 156.91).

Gen abfB koduje białko o długości 499 aminokwasów, posiadające przewidywaną masę cząsteczkową 52 523 Da (figura 6, wzór 5) jak określono na podstawie sekwencji genu abfB (figura 5) i potwierdzono przez sekwencję cDNA abfB. N-końcową sekwencję, jak określono w przykładzie 12.2 (wzór 14), poprzedza hydrofobowa sekwencja o długości 18 aminokwasów. Określone sekwencje fragmentów CNBr (wzory 15, 16 i 17) stwierdzono w sekwencji od pozycji aminokwasowej odpowiednio 203 do pozycji 219, 267 do 286 i 294 do 312. Dojrzałe białko ABF B ma długość 481 aminokwasów,

170 943 a niezglikozylowane białko posiada przewidywaną masę cząsteczkową 50 663 Da i teoretyczny punkt izoelektryczny 3.8.

W przypadku enzymu ABF A przygotowano bibliotekę cDNA po indukcji mRNTA

NA —

T +n1n iolz· * ...........* j^a irinlrz^nnor i_r c^^ryp-nia AcrsorcnlliK’ nirtor <. ____________ .. , _

Wyizolowano poli A+ RNA i zastosowano do syntezy cDNA. który z kolei zligowano z wektorem bakteriofagowym lambda. Przeszukano bibliotekę ekspresyjną cDNA i fagi.. w których zaszła ekspresja białka fuzyjnego. zawierającego część białka α-Ε--ΉΗηοίήarnozydrzy A (ABF A) zidentyfikowano przez sondowanie sączków antysurowicą skierowaną przeciw α-L-arabinofurαnozydazie A. a następnie detekcję z zastosowaniem koniugatu alkalicznej fosfatazy. Klon zawierający największą wstawkę (1.3 kb). oznaczony pC1X1. poddano ograniczonej analizie restrykcynej (figura 12).

Skonstruowano również i przeszukano pod kątem genu abfA bibliotekę genomową Aspergillus niger. Przeprowadzono hybrydyzację łysinek. z zastosowaniem replik na nitrocelulozie. i zidentyfikowano 18 hybrydyzujących łysinek pojawiających się na obu sączkach replik: lambda,-,bfA1 do lambdraifA38. DNA wyizolowany z fagów lrmbdr_ai(A3. lambdaabfA4_J lambdαaifA6 i lrmburaifA32 analizowano przez analizę restrykcyjną Otrzymano częściową mapę restrykcyjną regionu genomowego genu abfA. Fragment Ad/I/XbaI o długości 8.5 kb faga lambdaabfA5 zligowano z wektorem pGEM-7Zf(+). otrzymując plazmid pIM900. Plazmid pIM900 analizowano dalej stosując enzymy restrykcyjne. otrzymując mapę restrykcyjną przedstawioną na figurze 13. Plazmid pIM900 zawierający gen ab/A ponownie sklonowano w E. coli JM109 i zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baarn. Holandia. w dniu 17 marca 1992 r.. pod numerem CBS 187.92). Sekwencję genu abf przedstawiono na figurze 14 (wzór 20).

Gen abZA koduje białko o długości 628 aminokwasów (figura 15. wzór 21). jak określono na podstawie sekwencji cDNA abfA. N-końcową sekwencję aminokwasową. jak określono w przykładzie 12.1 (wzór 12) poprzedza 25-aminokwasowa sekwencja hydrofobowa. Sekwencję aminokwasową określoną dla peptydu CNBr (wzór 13) stwierdzono w sekwencji od pozycji 38 do pozycji 52. Dojrzałe białko ABF A ma długość 603 aminokwasów. a białko niezglikozylowane posiada przewidywaną masę cząsteczkową 65 378 Da i teoretyczny punkt izoeiektiyczny 3.7.

W przypadku enzymu ABN A wykonano bibliotekę cDNA po indukcji mRNA w szczepie Aspergillus n/ger. stosując L-arbitol jako czynnik indukujący. Szczep hodowano i grzybnię zbierano w regularnych odstępach czasu. Wyizolowano RNA i zastosowano do syntezy cDNA i skonstruowano biblioteki ekspresyjnej. Bibliotekę zamplifikowano i przeszukano stosując przeciwciała skierowane przeciw ABN A. Wyizolowano pojedynczy dodatni klon. Długość wstawki DNA określono przez strawienie EcoRI/XhoI. a następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment cDNA miał długość około 700 bp.

Skonstruowano również. i przeszukano pod kątem genu abnA bibliotekę genomową Aspergillus niger. Hybrydyzację łysinek przeprowadzono jak dla enzymu ABN A i wyizolowano 6 hybrydy zujących łysinek. Z każdego z fagów wyizolowano DNA i zastosowano go do analiźy restrykcyjnej. w wyniku której otrzymano częściową mapę restrykcyjną. Wykorzystując mapę restrykcyjną wybrano fragment HindIII o długości 3.1 kb do zsubklonowania genu abnA w wektorze pEMBL19. w wyniku czego otrzymano plazmid pIM950. Plazmid ten analizowano dalej stosując enzymy restrykcyjne. otrzymując mapę restrykcyjną przedstawioną na figurze 18. Plazmid pIM950. zawierający -gen abnA. ponownie sklonowano w E. coli JM109 i zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baam. Holandia. w dniu 17 marca 1992 r.. pod numerem CBS 188.92). Sekwencję genu abnA przedstawiono na figurze 19 (wzór 22).

Gen abnA koduje białko o długości 346 aminokwasów. posiadające masę cząsteczkową 37 184 Da (figura 20) wzór 23). jak określono na podstawie sekwencji cDNA abnA. N-końcową sekwencję określoną w przykładzie 12.3 (wzór 18) poprzedza sekwencja hydrofobowa o długości 19 aminokwasów. Sekwencję aminokwasową określoną dla peptydu CNBr (przykład 12.3. wzór 19) s^^^le^dz^ono od pozycji 106 do pozycji 125

170 943 sekwencji aminokwasowej. Dojrzałe białko ma długość 327 aminokwasów, a niezglikozylowane ma przewidywaną masę cząsteczkową 35 204 Da i teoretyczny punkt izoelektryczny 3,6.

nnąctomln TWT A Αζτλγ4-ι-ιιπγόλ Rorlopir τντττο/'ίτγιί/'νΙ-Λχτνη αησιπη

X_X<JOl.\^2-^/XlWiJV/ VA4|OIVVZJU J_XX ΊΧ X XXWXXtX|ćpsypj U/i^WX£Vjr 2^>ł '*-'*·· 1 III ii ki » ZjtliiłWl VdUVłUlUU V'XXXjj'XXX degradujący arabinan umożliwia konstruowanie zmutowanych enzymów degradujących arabinan przez ukierunkowaną mutagenezę. Jeśli trzeciorzędowa struktura enzymu degradującego arabinan jest znana, a jego domeny katalityczna i wiążąca substrat zlokalizowane, do mutagenezy można wybrać aminolwasy (na przykład przy pomocy modelowania komputerowego), które najprawdopodobniej są odpowiedzialne za funkcje katalityczną i/lub wiązania substratu. Jeśli struktura trzeciorzędowa białka nie jest dostępna, można albo tworzyć losowe mutany w całej sekwencji kodującej, lub trzeciorzędową strukturę białka można przewidzieć przez porównanie z podobnymi, znanymi enzymami degradującymi arabinan wyizolowanymi z innego mikroorganizmu.

W celu ułatwienia wstawienia fragmentu DNA zawierającego tę samą cząsteczkę DNA kodującą enzym degradujący arabinan do konstrukcji ekspresyjnych zawierających jeden lub więcej heterologicznych regionów regulacyjnych, do wprowadzania odpowiednich miejsc restrykcyjnych w końcach 5’ i 3’ sekwencji kodującej można zastosować reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (PCR Tec/mology Pri^icip/es and Applications for DNA Amplification, (1989), H. A. Ehrlich, red., Stockton Press, Nowy Jork). Wybór miejsc restrykcyjnych zależy od sekwencji nukleotydowej wektora ekspresyjnego, tj. obecności innych miejsc restrykcyjnych w cząsteczce DNA.

Dla otrzymania wzmocnionej ekspresji konstrukcji DNA do wydarzania będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan w oryginalnych (homologicznych) gatunkach wytwarzających, lub alternatywnie, w heterologicznym szczepie grzybowym, cząsteczkę DNA kodującą będący przedmiotem zainteresowania enzym, obejmującą jego natywne regiony regulacyjne, można wprowadzić do wybranego gospodarza ekspresyjnego dla zwiększenia liczby kopii konstrukcji i, w konsekwencji, ekspresji białka.

Jeśli korzystny jest heterologiczny gospodarz ekspresyjny i wybiera się szczep drożdżowy lub grzybowy, do konstruowania heterologicznej konstrukcji genetycznej stosuje się nieprzerwaną (pozbawioną intronów) cząsteczkę DNA w celu uniknięcia możliwości, że sygnały wycinania mieszczące się we fragmencie genomowym nie są rozpoznawane przez heterologicznego gospodarza. Tę nieprzerwaną cząsteczkę DNA można otrzymać z biblioteki cDNA skonstruowanej na podstawie mRNA wyizolowanego z komórek indukowanych do syntezy enzymów degradujących arabinan. Bibliotekę tę można przeszukiwać sondą oligonukleotydową lub cDNA, otrzymaną jak opisano uprzednio. Alternatywnie, nieprzerwaną cząsteczkę DNA można otrzymać przez przeprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy' z zastosowaniem 5’- i 3’-końcowych oligonukleotydów na pierwszej nici cDNA syntetyzowanej na podstawie RNA komórek indukowanych arabinanem.

Wzmocnioną ekspresję cząsteczki DNA kodującej będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan można także osiągnąć przez wybór heterologicznych regionów regulatorowych, np. regionów promotora, lidera sekrecji i terminatora, które służą do zwiększenia ekspresji i, jeśli jest to pożądane, poziomów sekrecji pożądanego białka z wybranego gospodarza ekspresyjnego i/lub do zapewnienia indukowalnej kontroli ekspresji będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan.

Oprócz natywnego promotora genu kodującego będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan, do kierowania jego ekspresją można zastosować inne promotory. Promotor można wybrać tak aby efektywnie kierował ekspresą, będącego przedmiotem zainteresowania, enzymu degraduj ącego arabinan w pożądanym gospodarzu ekspresyjnym.

170 943

W innym rozwiązaniu do kierowania ekspresją pożądanego enzymu degradującego arabinan można wybrać promotor konstytutywny. Taka konstrukcja ekspresyjna może zapewnić dodatkowe korzyści, ponieważ omija potrzebę hodowli gospodarza ekspresyjnego na podłożu zawierającym arabinany jako substrat indukujący.

Przykłady silnych promotorów konstytutywnych i indukowalnych, które są korzystne do stosowania w grzybowych gospodarzach ekspresyjnych, są te promotory, które można otrzymać z grzybowych genów ksylanazy (xlnA), fitazy, syntetazy ATT, pod-jednostki 9 (o/żC), izomerazy triozofosforanowej (tpi), dehydrogenazy alkoholowej (ad/zA), a-amylazy (amy), amyloglukozydazy (AG - z genu g/aA), acetoamidazy (amdS) i dehydrogenazy aldehydu 3--osfogllcerynowego (gpd).

Przykładami silnych promotorów drożdżowych są te promotory, które można otrzymać z genów dehydrogenazy alkoholowej, laktazy, kinazy S-fosfoghceirynanowej i izomerazy triozofosforanowej. Przykładami silnych promotorów bakteryjnych są promotory a--imylazy i Spo2, jak również promotory genów zewnątrzkomórkowych proteaz.

Dla polepszenia indukowalnej regulacji konstrukcji ekspresyjnych korzystne może być także zastosowanie promotorów hybrydowych.

Często pożądana jest sekrecja będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan z gospodarza ekspresyjnego do podłoża hodowlanego, skąd enzym ten można łatwo odzyskać.

Według mniejszego wynalazku, do uzyskania sekrecji enzymu degradującego arabinan można zastosować natywną sekwencję lidera sekrecji będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan.

Jednakże, wynikiem wzrostu ekspresji enzymu degradującego arabinan czasami staje się wytwarzanie białka na poziomie przekraczającym ten, przy którym gospodarz ekspresyjny zdolny jest do procesowania i sekrecji, tworząc zator, tak, że produkt białkowy ulega akumulacji w komórce. A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza także heterologiczne sekwencje liderowe w celu zapewnienia najwydajniejszej sekrecji enzymu degradującego arabinan z wybranego gospodarza ekspresyjnego.

Według niniejszego wynalazku, lider sekrecyjny można wybrać na podstawie pożądanego gospodarza ekspresyjnego. Można wybrać heterologiczny lider sekrecyjny, który jest homologiczny do innych regionów regulacyjnych konstrukcji ekspresyjnej. Na przykład, lider białka amyloglukozydazy (AG) o wysokim poziomie sekrecji można zastosować w połączeniu z samym promotorem amyloglukozydazy (AG), jak również w połączeniu z innymi promotorami. Dla potrzeb niniejszego wynalazku można również korzystnie stosować hybrydowe sekwencje sygnałowe.

Przykładami korzystnych heterologicznych sekwencji lidera sekrecji są te pochodzące z genu grzybowej amyloglukozydazy (AG) (g/aA - wersje zarówno 18-, jak i 24--minokwasowe, np. z Asperg/Zws), genu czynnika a (drożdży, np. Saccharomyce? i K/uzyneromyces) lub genu α-amylazy (BaczYlus).

Ogólnie rzecz biorąc, terminatory nie uważa się za elementy o zasadniczym znaczeniu dla wzmocnionej ekspresji genów. Jeśli jest to pożądane, terminator można wybrać z tych samych genów co promotory, lub, alternatywnie, wykorzystać można terminator homologiczny.

Poza wspomnianymi powyżej fragmentami genomowymi, transformujący DNA może zawierać marker selekcyjny do odróżnienia komórek, które posiadają włączony pożądany gen z puli komórek niestransformowanych. Ten marker selekcyjny, dostarczony z odpowiednimi 5’- i 3’-końcową sekwencjami regulacyjnymi, może znajdować się na tej samej cząsteczce DNA zawierającej pożądany gen, lub może być obecny na oddzielnej cząsteczce. W tym drugim przypadku musi zostać przeprowadzona kotransformacja. Stosunek wektor ekspresyjny/wektor selekcyjny musi zostać ustawiony w taki sposób, że wysoki procent wyselekcjonowanych transformantów posiada także włączony wektor zawierający konstrukcję ekspresyjną będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan.

170 9^^^

Najodpowiedniejszymi układami selekcyjnymi dla mikroorganizmów przemysłowych są te utworzone przez grupę markerów selekcyjnych, które nie wymagają mutacji organizmu gospodarza. Przykładami grzybowych markerów selekcyjnych są geny acetoami(flay C—)7S^ ATtp rtlaipzyydti O ΡηΛΥΡ ΠαΙγό-—Vov1q/— rsr/KrHcs^ft_k_^,..ir\ cfnranowej (pyrA), oporności na fleomycynę (Durand i in. (1991) Cum Genet., 19,149) i benomyl (benA). Przykładami niegrzybowych markerów selekcyjnych są bakteryjny gen oporności G418 (można go także stosować u drożdży, ale nie u grzybów), gen oporności na ampicylinę (E. coli), gen oporności na neomycynę (BaciYlus) i gen uidA E. coli kodujący β ^^ll^lmi^c^i^i^dazę (GUS).

Po złożeniu pożądanej konstrukcji ekspresyjnej, transformuje się nią odpowiedniego gospodarza klonującego, takiego jak E. coli, w celu jej powielenia. Następnie, konstrukcję ekspresyjną wprowadza się do odpowiedniego gospodarza ekspresyjnego, w którym konstrukcja genetyczna korzystnie ulega integracji z genomem. Pewnych gospodarzy, takich jak gatunki Bacil/us, można stosować jako gospodarzy zarówno klonujących, jak i ekspresyjnych, unikając w ten sposób dodatkowego etapu transformacji.

Według niniejszego wynalazku, jako gospodarzy do wytwarzania będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan można stosować szereg organizmów. Jeśli wytwarzany ma być więcej niż jeden pożądany enzym degradujący arabinan, do tego samego gospodarza ekspresyjnego można wprowadzić wiele wektorów, z których każdy zawiera konstrukcję ekspresyjną dla pożądanego enzymu degradującego arabinan (np. ABF A, ABF B i/lub ABN A). Alternatywnie, każdy pożądany enzym degradujący arabinan można wytwarzać niezależnie w oddzielnych gospodarzach ekspresyjnych.

W jednym rozwiązaniu niniejszego wynalazku można stosować homologicznego gospodarza ekspresyjnego. Obejmuje ono wprowadzenie konstrukcji ekspresyjnej z powrotem do szczepu, Z którego wyizolowano cząsteczkę kodującą enzym degradujący arabinan, albo w podwyższonej liczbie kopii genu, albo, jak opisano powyżej, pod kontrolą heterologicznych regionów regulacyjnych, albo stosując jedno i drugie.

W innym rozwiązaniu, jeden lub więcej, będących przedmiotem zainteresowania, enzymów degradujących arabinan można wytwarzać przez wprowadzenie i ekspresję jednej lub więcej cząsteczek DNA kodujących pożądany enzym(y) degradujący arabinan, każdej pod kontrolą odpowiednich regionów regulacyjnych, do gospodarzy heterologicznych, takich jak bakterie, drożdże lub grzyby. W tym celu cząsteczkę DNA kodującą pożądany enzym degradujący arabinan korzystnie poddaje się ekspresji pod kontrolą sekwencji promotora i terminatora pochodzących z gospodarza heterologicznego. Może być ponadto konieczne zastąpienie natywnej sekwencji lidera sekrecji genu pożądanego enzymu degradującego arabinan sekwencją liderową homologiczną wobec gospodarza ekspresyjnego w celu osiągnięcia najwidoczniejszej ekspresji i sekrecji produktu.

Ważną rolę w wyborze gospodarza ekspresyjnego odgrywają takie czynniki, jak wielkość (masa cząsteczkowa), konieczność właściwej glikozylacji lub celowość zewnątrzkomórkowej sekrecji będącego przedmiotem zainteresowania enzymu degradującego arabinan.

Gram-uje mną bakterię E. co/i powszechnie stosuje się do ekspresji genów heterologicznych. Duże ilości heterologicznego białka wykazują jednakże tendencję do akumulacji wewnątrz komórek. Oczyszczenie pożądanego białka z puli białek wewnątrzkomórkowych E. coli może czasami być trudne.

W przeciwieństwie do E. co/z, bakterie z rodzaju Baczllus są bardzo odpowiednie jako gospodarze heterologiczni z powodu ich zdolności do sekrecji białek do podłoża hodowlanego. Innymi bakteriami odpowiednimi jako gospodarze są te z rodzajów Streptomyces i Esezu-omonas.

W zależności od charakteru cząsteczki DNA kodującej będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan i/lub celowości dalszego procesowania białka ulegającego ekspresji, mogą być korzystni gospodarze eukariotyczni, jak drożdże lub

170 943 grzyby. Ogólnie rzecz biorąc, komórki drożdżowe są korzystniejsze niż komórki grzybowe, ponieważ manipulacja nimi jest łatwiejsza. Jednakże, niektóre białka ulegają słabej sekrecii z komórek drożdżowych. albo w pewnvch przypadkach nie są właściwie sie' w» J > X X J X C · x ηαρ/ΛΤ,τητΛ Zi (ΑΙΑ /-'Ił-Or-rz-lrT»»'» AU 7 <-»!-» «-»«-»»»r-«Χ-» w λ wouWUHU ^Up. Yb UlGAUŁaLllj. TT vjvu dię wyuidL grzybowy organizm gospodarza.

Można także wybrać gospodarza heterologicznego, w którym będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan wytwarzany jest w postaci, która jest zasadniczo wolna od innych enzymów degradujących polisacharydy. Można to osiągnąć wybierając gospodarza, który nomalnie nie wytwarza takich enzymów, takiego jak Kluyveromyces lachs.

Przykładami korzystnych gospodarzy ekspresyjnych dla niniejszego wynalazku są grzyby, takie jak gatunki Aspergillus (opisane w europejskich zgłoszeniach patentowych 0 numerach 184.438 i 284.603) i gatunki Trrchoderma; bakterie, takie jak gatunki Bacillus (opisane w europejskich zgłoszeniach patentowych o numerach 134.048 i 253.455), gatunki Streptomyces i gatunki Pseudomonas oraz drożdże, takie jak gatunki KZuyvarowyces (opisane w europejskich zgłoszeniach patentowych o numerach 96.430 i 301.670) i gatunki Saccharomyces.

Szczególnie korzystnych gospodarzy ekspresyjnych można wybierać spośród Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigensis, AspergZZus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, BaciYZus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliąuefaciens, KZuywromyces lachs i Saccharomyces cerevzsiate.

Według niniejszego wynalazku, wytwarzanie będącego przedmiotem zainteresowania enzymu(ów) degradującego arabinan przeprowadza się przez hodowanie gospodarzy ekspresyjnych będących mikroorganizmami, których strasfonnowano jedną lub więcej konstrukcjami DNA według niniejszego wynalazku, w konwencjonalnym odżywczym podłożu fermentacyjnym.

Podłoże fermentacyjne składa się ze zwykłego podłoża hodowlanego zawierającego źródło węgla (np. glukozę, maltozę, melasę itp.), źródło azotu (np. siarczan amonowy, azotan amonowy, chlorek amonowy' itd.), organiczne źródło azotu (np. ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, pepton itp.) i nieorganiczne źródła składników odżywczych (np. fosforan, magnez, potas, cynk, żelazo itp.). Ewentualnie można włączyć czynnik indukujący (np. arabinan buraka cukrowego).

Wybór odpowiedniego podłoża może opierać się na wyborze gospodarzy ekspresyjnych i/lub na wymaganiach regulacyjnych konstrukcji ekspresygnej. Podłoża takie są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Podłoże może, jeśli jest to pożądane, zawierać dodatkowe składniki sprzyjające stransformowanym gospodarzom, a nie innym potencjalnie zanieczyszczającym mikroorganizmom.

Fermentację prowadzi się w ciągu 0,5 - 20 dni prowadząc hodowle okresowe lub zasilane składnikami odżywczymi w temperaturze w zakresie pomiędzy 20 a 37°C i pH pomiędzy 3 i 9. Odpowiednie warunki wybiera się w oparciu o wybór gospodarza ekspresyjnego.

Po fermentacji komórki usuwa się z brzeczki fermentacyjnej przez wirowanie albo sączenie. Po usunięciu komórek można następnie odzyskać i, jeśli jest to pożądane, oczyścić i wyizolować konwencjonalnymi sposobami będący przedmiotem zainteresowania enzym degradujący arabinan.

Produktowi nadaje się trwałą płynną lub suchą postać. Dla pewnych zastosowań korzystna może być immobilizacja enzymu na stałym nośniku.

Będące przedmiotem zainteresowania enzymy degradujące arabinan wytworzone sposobami niniejszego wynalazku można stosować albo pojedynczo, albo jako mieszaninę aktywności enzymów degradujących arabinan (tj. kombinacji aktywności ABF A i/lub ABF B, i/lub ABN A), a ewentualnie wraz z innymi wybranymi enzymami w szeregu procesów wymagających działania enzymów degradujących arabinan. Ponadto, grzybowe

170 943 enzymy degradujące arabinan według niniejszego wynalazku, które na ogół mają niższe optima pH niż enzymy degradujące arabinan pochodzenia bakteryjnego, szczególnie dobrze nadają sie do stosowania w procesach przemysłowych, które prowadzi się w niskim pH.

wFwaIia tu, kilijjLu za Uzaaia ijnu nz αιαυηιυζΛΌ rj niskim stopniu oligomeryzacji, enzym ABF B chętniej hydrolizuje reszty L-arab.inozy łańcuchów bocznych (z pewną aktywnością endolityczną), a ABN A działa optymalnie na arabinan liniowy, mieszaniny enzymu ABF A i/lub ABF B działają synergistycznie w połączeniu z arabinanazą o aktywności endolitycznej (ABN A). Niniejszy wynalazek umożliwia specjalistom wytwarzać mieszaniny pożądanych aktywności enzymów degradujących arabinan o optymalnych proporcjach aktywności pożądanych do specyficznych zastosowań przemysłowych.

Według niniejszego wynalazku stwierdzono, że enzymy degradujące arabinan wytwarzane sposobem według niniejszego wynalazku można stosować w wytwarzaniu zagęszczonych soków, szczególnie owocowych (np. jabłkowego, gruszkowego i podobnych) lub warzywnych, do eliminowania zmętnienia arabinanowego.

Włączenie ABF B do, na przykład, preparatu enzymatycznego (takiego jak ten otrzymywany z gatunków Aspen/lus), który z kolei dodaje się do miazgi przed wytłaczaniem, zapewnia zwiększoną wydajność wytwarzania soku, bez obecności niepożądanego zmętnienia arabinanowego w zagęszczonych bądź niezagęszczonych postaciach soku. Mieszaninę wszystkich trzech enzymów degradujących arabinan wytworzonych według niniejszego wynalazku można włączyć w procesie wytwarzania zagęszczonych soków z owoców posiadających wyższe ilości arabinanów (np. soku gruszkowego). Dla optymalnych wyników można dodać dodatkową, aktywność enzymatyczną, taką jak aktywność peklynazy, o czym może zadecydować specjalista w tej dziedzinie.

Ponadto, włączenie enzymów degradujących arabinan, wytworzonych według niniejszego wynalazku, do soków owocowych i warzywnych polepsza przesączalność soków, takich jak soki winogronowe. W celu rozłożenia arabinogalaktanów, o których wiadomo, że powodują lepkość, sok najpierw traktuje się mieszaniną enzymów posiadających wysokie ilości arabinanaz i aaabinofuaano/yda/ wytworzonych według niniejszego wynalazku, a następnie β-1-3- i e-1-6-gałaktanazami.

Alternatywnie, α--L·arab-nofuranozydazy, szczególnie enzym ABF B, można stosować do wspomagania uwalniania związków aromatycznych z takich substratów', jak soki lub wina, jak opisali Gunata i in. ((1989) i (1990), supra). Osiąga się to w dwuetapowym procesie, w którym pierwszy etap obejmuje stosowanie α-L·arabmolurano/ydazy, korzystnie posiadającej aktywność podobną do ABF B, do katalizowania uwalniania reszt arabinozy z monoterpenylo-α-L-arabmofurano:/yloglukozydów zawartych w soku owocowym lub warzywnym przez ao/s/czepianie wiązania (1 ->6) pomiędzy końcową jednostką arabinofuranozylową a pośrednią glukozą monoterpeπylo-α-L·Iaab-nofuramozyloglukozydu. Wskazane jest, aby α -L-arabmolurίanozyda/a była w postaci oczyszczonej dla uniknięcia niepożądanej' degradacji innych składników soku, co może być niekorzystne dla ostatecznej jakości soku. Otrzymany monoterpenyloglukozyd pozbawiony reszt arabinozy traktuje się następnie β-ggukozydazą w celu uzyskania wolnego terpenolu. Jeśli jest to pożądane, oba etapy reakcji można prowadzić w tym samym naczyniu reakcynym bez potrzeby izolowania produktu pośredniego (Gunata i in. (1989), supra).

Uwalnianie tych związków aromatycznych poprawia smak soku lub wina. Ponadto, w przypadku wina, kontrola uwalniania /wią/ków aromatycznych zapewnia wina o bardziej zgodnym smaku, obniżając zatem lub eliminując niepożądany wpływ złego rocznika.

Enzymy degradujące arabinan można także dodawać do pasz zwierzęcych bogatych w arabinan. Po dodaniu do pasz (włącznie z kiszonkami) dla zwierząt posiadających żołądek jednokomorowy (np. drobiu lub świń), które zawierają zboża, takie jak jęczmień, pszenicę, kukurydzę, ryż lub owies, bądź produkty uboczne ze zbóż, takie jak otręby pszenne lub kukurydziane, enzym znacząco polepsza rozkład ścian komórek roślinnych, co prowadzi do lepszego wykorzystania odżywczych składników roślinnych

170 943 przez zwierzęta. W konsekwencji szybkość wzrostu i/lub wykorzystanie paszy ulegają polepszeniu. Ponadto, enzymy degradujące arabinan można stosować do obniżenia lepkości pasz zawierających arabinany.

tg dAnr^^ionu OjpKincn rrv uv^iuuujl|w luuuniuii iii rin tar

1Γ* rr O C* Tł 1A1 r\In! ^rli ^/ClOZjjr 1UU korzystna jest pasza wstępnie namaczana lub mokra. Korzystniej, enzymy degradujące arabinan wytworzone według niniejszego wynalazku kontynuują hydrolizę arabinanów znajdujących się w paszy in vzvo. Grzybowe enzymy degradujące arabinany, które na ogół posiadają niższe optima pH, zdolne są do uwalniania ważnych składników odżywczych w takich kwaśnych środowiskach, jak żołądek zwierzęcia spożywającego taką paszę wzbogaconą enzymami degradującymi arabinan.

Enzymy degradujące arabinan wytworzone według niniejszego wynalazku znajdują też zastosowania w przemyśle celulozowo-papierniczym. Często podaje się, że korzystne jest stosowanie ksylanaz w usuwaniu lignin i terpenoidów z reszt celulozy i hemicelulozy szkieletu hemicelulozowego, zasadniczym etapie obróbki drewna, ścieru drzewnego lub produktów pochodnych drewna w wytwarzaniu papieru. Dodanie enzymów deg^^idujących arabinan wytworzonych według niniejszego wynalazku w etapie traktowania ksylanazą wspomaga degradację szkieletu hemicelulozowego zawierającego arabinan, a zatem zapewnia polepszone, skuteczniejsze usuwanie zarówno lignin, jak i terpenoidów. Stosowanie enzymów degradujących arabinan jest szczególnie korzystne w obróbce drewna miękkiego, w którym szkielet hemicelulozowy zawiera ksylany arabinoglukuronowe.

Ponadto, enzymy degradujące arabinan wytworzone według niniejszego wynalazku można stosować w innych procesach, takich jak enzymatyczna hydroliza miazgi buraka cukrowego o podwyższonej wydajności, przy czym otrzymaną zhydrolizowaną frakcję można stosować w podłożu hodowlanym dla mikroorganizmów oraz hydroliza drewna jaworowego, gumy arabskiej lub resztek rolnych takich jak dama pszenicy.

Poniższe przykłady przedstawiono aby dać speccalistom w tej dziedzinie pełny obraz wynalazku, a opis wykonania i stosowania wynalazku nie ma na celu ograniczania jego zakresu. Podjęto wysiłki w celu zapewnienia dokładności podawanych wartości liczbowych (np. ilości, temperatury, pH itp.) ale należy wziąść pod uwagę pewne błędy i odchylenia doświadczalne. O ile nie wskazano inaczej', temperatura podawana jest w stopniach Celsjusza, a ciśnienie jest równe lub bliskie ciśnieniu atmosferycznemu.

Przykład 1. Oznaczenia enzymatyczne

Zawartość białka, stosowaną do wyznaczania aktywności właściwej enzymu, mierzono według metody Lowry’ego i in. ((1951) J. Biol. Chem. 193, 265), z wyj'ątkiem, gdzie stwierdzono inaczej'.

Aktywność arabinofuranozydazy można określić przez dodanie 0,250 ml roztworu enzymu do 8 mM p-nitrofenylo-αaLarabinofuranozydu (PNA - w 0,1 M buforze octanu sodowego; pH 4,4). Po inkubacji w ciągu 10 minut w temperaturze 40^OC reakcję zatrzymano przez dodanie 2 ml 0,5 M buforu glicynowego, pH 9,0. Stężenie p-nitrofenolu (pNP) określano przez odczyt absorbancji przy długości fali 400 nm. 1 nkat aktywności odpowiada uwolnieniu 1 nmola pNP na sekundę w warunkach testowych. Alternatywnie, aktywność arabinofuranozydazy można wyrazić w jednostkach na mililitr (U/ml), gdzie jednostkę aktywności arabmofuranozydazy zdefiniowano jako ilość enzymu, która uwalnia 1 μ mol pNP na minutę z PNA (patrz van der Veen i in. (1991) supra).

Aktywności β-D-alukopiranozydαzy i α--LIaπmopiranozydazy mierzono w tych samych warunkach, zgodnie z ich działaniem odpowiednio na substraty p-nitaofenylo-β -D-glukopiranozyd i p-nitrofenylo-α -ILIamnopiranozyd.

Aktywność endolitycznej 1,5-α-L-arabinanrzy przesączów hodowlanych mierzono i obliczano stosując zestaw testowy ArabinaZyme™ produkowany przez Megazyme Pty. Ltd. (North Rocks, Nowa Południowa Walia, Australia), zgodnie z instrukcjami producenta. Jedną jednostkę aktywności definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do uwolnienia 1 μ mola cukrowych równoważników redukujących arabinozy z karboksymetylowego liniowego (1->5)-αna minutę w warunkach oznaczenia.

170 943

Przykład 2. Oczyszczanie α-L-aarZbilofuaanozyda2y B (ABF B)

Aspergillus niger

Schematyczny diagram procedury, którą stosowano do oczyszczania enzymu /Ύ-Τ -ΠΤΛΉΐΙΤΊίΛ'Ρ'Ι'ΙΤΩ'ΓΙΟ'ΤνΗίί’Τν f Δ *7 ΤΊΓ7Ρςορσπ οπρπη nłrrnrmanorrn 70 i , *-*A KWA ** / ** XXWWO TłlUllV^U vi Zij ΧΧΧΧΧΧ1 \l£\J XjV/ UPVZ.V|JU

HEM A. niger przedstawiono na figurze 1. Do oczyszczania stosowano pięć etapów:

1) frakcjonowanie przez wytrącanie siarczanem amonowym;

2) sączenie molekularne;

3) chromatografia jonowymienna;

4) filtracja żelowa i

5) chromatografia adsorpcyjna.

Wyeluowane frakcje analizowano pod kątem aktywności degradowania arabinanu, ramnozydazy i glukopiranozydazy metodami kolorymetrycznymi jak opisano w przykładzie 1. Zawartość białka mierzono stosując mikrotest Bradford na mikropłytkach do miareczkowania (Margaret i in. (1985) Anal. Biochem. 147. 144). Doświadczenia chromatograficzne prowadzono w temperaturze 5°C.

Przykład ^L-Frakcjonowanie przez wytrącanie (NH^SOą

Próbkę przesączu hodowlanego otrzymanego ze szczepu HEM A. niger, zawierającego między innymi enzym ABF, doprowadzono rozcieńczonym kwasem octowym do pH 5,5 (punkt izoelektryczny α-L-aaaαinofuranozydazy) i odzyskano przez frakcjonowanie przez wytrącanie (iNH^zSOi w stężeniach 50, 60, 70, 80 i 90% nasycenia w temperaturze 5°C. Osad rozpuszczono w buforze octanu sodowego (pH 4,5; 0,05 M) i poddano diafiltracji w tym samym buforze w celu usunięcia soli. Charakterystyki różnych frakcji podsumowano w tabeli 1.

Tabela 1

Aktywności enzymatyczne osadów

Aktywność enzymatyczna nkat/ml	% (NH4)2SO4
50	60	70	80	90
a-L--aramofuranozydaza	1160	1100	260	43	12
e-D--łukopiranozydaza	1300	1700	230	37	12
a-L--rmnopiranozydaza	131	140	63	62	2,7

Przykład 2.2: Sącze/nie molekularne na B7O-GEL P10

Kolumnę BIO-GE1 P 10 (BIO-RAD; Richmond, Va., USA) zrównoważono wstępnie buforem octanu sodowego (pH 4,5; 0,05 M) przy szybkości przepływu 60 ml/godzinę. Na kolumnę nałożono 100 ml próbkę osadu 50% (NHąjzSOą. Białka eluowano w tych samych warunkach. Zbierano frakcje o objętości 20 ml i oznaczano w nich aktywność a -L--aramofuranozydazy. Frakcje 14 do 22 połączono i zatężono przez ultrafiltrację (granica przepuszczalności = 10 000 x D) do objętości początkowej.

Przykład 2.3: Chromatografia anionowymienna na DEAE ART LS Kolumnę DEAE ART LS (5,2 x 36 cm; IBF Biotechnics, Francja) zrównoważono wstępnie 0,05 M buforem octanu sodowego o pH 4,5 przy szybkości przepływu 100 ml/godzinę. Na kolumnę nałożono 100 ml połączonych frakcji α-L-aaaaiπofuranozydazy otrzymanych w przykładzie 2.2 (powyżej). Białko eluowano stosując gradient chlorku sodowego od 0 do 0,5 M w buforze wyjściowym. Zbierano frakcje o objętości 15 ml i oznaczano aktywności enzymatyczne.

Pik a-L-rrmnazydazy pojawił się blisko objętości swobodnej kolumny, wskazując, że enzym ten miał w tym pH postać obojętną lub kationową (pula CY183 III-1).

170 943 β-D-glukopiranozydazę i α-L-aaabbnoftlranozydαzę wyeluowano oddzielnie z dobrą rozdzielczością stosując gradient chlorku sodowego.

Frakcje 164 do 166 połączono (pula CY183 II--3); poddano ultrafiltracji i stabirU#a-rn Γ'Ήα-ταV+Arve1-vVi τΑ'τητζηΙ-ι τνηΐ nnHciimowarin w tnfipli 9

XXXV Wl J 1VJ X dł-ti-LJ WX« XX A di d.d μχχχκ-/ ll » τ df ^ζχχ m » ςη/^η ri/ rr

ΓτΊτ r»#=»ł·, ^UWi ·

Tabela 2

Charakterystyki glukozydaz oczyszczonych na DEAE TRISACRYL A RT LS

Produkt	Aktywność enzymatyczna
α-L-A*	α-L-R**	β-D-G***
R.amnoprranozydaza (A. niger)	34,5	231	15,0
Glukopiranozydaza (A. niger)	0	0	243
Arabi^nc^l^ur^ar^c^^daza (A. niger)	4240	0	14,8

* ** *** α-g---aablllofural]ozydazd α'-l-ramnopiranozydaza β-D-głukopirano/yda/a

Przykład 2.4: Fi/tracja żelowa

Kolumnę BIO-GEL P60 (2,8 x 30 cm; BIO-RAD; Richmond, Va., USA) zrównoważono wstępnie 0,01 M buforem fosforanowym (sodowym) (pH 8,8) przy szybkości przepływu 30 ml/godzinę. Na kolumnę nałożono 5 ml próbkę α-L-aaabinofurαnozΛ'dαzy stabilizowanej glicerolem 1/1 w/w, otrzymaną z chromatografii na DEAE ART LS (przykład 2.3 powyżej). Eluowane białko wykrywano stosując detektor UV przy długości fali absorbancji 280 nm.

Zbierano frakcje o objętości 5 ml i analizowano w nich aktywność wobec p-nitrofenylo-α-L-gaabmofuranozydk. Białka uległy elucji w jednym ostrym piku, który zawierał aktywność α-L-aaabinofuranozydαzy.

Przykład 2.5: Chromatografia adsorpcyjna na BIO-GEL HTP

Kolumnę BIO-GEL HTP (2,8 x 20 cm; BIO-RAD; Richmond, Va., USA) zrównoważono wstępnie 0,01 M buforem fosforanowym (sodowym) (pH 8,8) przy szybkości przepływu 30 ml/godzinę. Pulę α-]LgaαbmoCuranozyda/y z BIO-GEL P60 (35 ml) (otrzymaną w przykładzie 2.4 powyżej) nałożono na zrównoważoną wstępnie kolumnę BIO-GEL HTP i poddano chromatografii przy szybkości przepływu 30 ml/godzinę. Białka wyeluowano odpowiednim gradientem buforu fosforanowego (sodowego) (pH 8,8) od 0,01 do 0,2 M. ' '

Zbierano frakcje o objętości 5 ml i analizowano je pod kątem aktywności α-Larrnbinofuranozydazy, β-D-głukopiranozydazy i α-L--amnopiaanozydazy. W standardowych warunkach nie wykryto tych ostatnich dwóch enzymów. Enzym ABF B został wyeluowany w pierwszym głównym piku.

Przykład 3. Cha^r^^k^e^ryziacja ocz^^^i^^i^uego α-I--aaaa^inof^krano/yda/y (ABF B) Aspergillus niger

Przykład 3.1:: IWysokosprawna chromatografia sączema molekuaamggo (HPSEC) na 7’SK G3000 SW

Dla określenia homogenności enzymu i oszacowania masy cząsteczkowej, frakcje 63, 64, 65, 66 i 67 (otrzymane w przykładzie 2 powyżej) poddano chromatografii na kolumnie TSK G3000 SW (LKB, Produckter AB; Bromma, Szwecja) w następujących warunkach. 100 μΐ próbki każdej frakcji iniekowano na kolumnę TSK G3000 SW, którą równoważono wstępnie buforem fosforanowym (sodowo-fosforanowym) (pH 7,00; 0,1 M) przy szybkości przepływu 0,5 ml/minutę. Eluowane białka wykrywano spektiOfotometrycznie

170 943 przy długości fali absorbancji 280 nm. Zbierano frakcje o objętości 0,5 ml i ilościowo testowano aktywność α-L-arab-nofuranozyda/y testem kolorymetrycznym na płytkach do mikromiareczkowania.

Kolumnę wykallbrowano białka^m standardów mas cząsteczkowych (zestaw kalibracyjny sączenia molekularnego Pharmacia Gel; Pharmacia AB, Uppsala, Szwecja). Profil chromatograficzny ujawnia wysoką homogenność białka ulegającego elucji we frakcjach 63 do 66. Masę cząsteczkową enzymu α-L-arab-nofurano/ydαzy B wyznaczono na około 70 kDa, co pozostaje w dobrej zgodności z masą cząsteczkową tego samego enzymu podaną przez van der Veena i in. ((1991) supra).

Przykład 3.2. EZektaofoae/a SDS-PAGE

Frakcje 62 do 66 (otrzymane w przykładzie 2 powyżej) połączono i zatężono przez ultrafiltrację (granica przepuszczalności = 10 000 x D). Określono charakterystykę tej próbki i podsumowano poniżej:

- stężenie białka: 0,25 mg/ml

- aktywność wobec pNP-arabinofuranozydu: 38 nkat/ml

- aktywność właściwa: 153 nkat/mg

Elektroforeza SDS-PAGE potwierdza wysoką czystość enzymu i masę cząsteczkową określoną przez HPSEC.

Przykład 4. Okrei/eme sekwencji aminokwasowej N-końców dojrzałego białka ABF B i dwóch fragmentów pepydowych uzworzonych CNBr

Około 10 fig oczyszczonej ABF B poddano elektroforezie w 7,5% żelu poliakryloamidowym i elektroblottingowi na membranę Immobilon (Millipore) według metody opisanej przez Matsudairę ((1987) J. Biol. Chem., 262. 10035). Odpowiedni prążek wycięto i przesłano do określenia sekwencji (E^uiOseąuence, Groningen). Uzyskano następującą sekwencję N-końcową:

Gly-Pro-Xaa-Asp-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro-XaaVal-Ala-Ala (wzrr 1)

Około 100 fig czystego ABF B trawiono przez noc w temperaturze pokojowej, w objętości 150 μΐ 0,15 CNBr w 70% kwasie mrówkowym. Produkty trawienia rozdzielono w 15% żelu poliakryloamidowym z SDS i poddano elektroblottingowi na Immobilon (Millipore; Matsudaira, supra). Wycięto i zsekwencjonowano (Eurósequence, Groningen, Holandia) dwa prążki o 29 i 15 kDa. Uzyskano następujące sekwencje odpowiednio dla fragmentu o masie cząsteczkowej 29 kDa (wzór 2) i 15 kDa (wzór 3):

Gly-Pro-Xaa-Asp-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro-XaaVal-Ala-Ala (wzór 1)

Xaa-Lys-Glu-Xaa-Ala-Ile-Ile-Leu-Gly-Ile-Gly-Gly-Asp-XaaXaa-Asn-Gly-Ala (wzrr 1)

Sekwencja aminokwasowa przedstawiona we wzorze 2 jest identyczna z N-końcową sekwencją białka ABF B (patrz wzór 1), prążek 29 kDa odpowiada N-końcowemu fragmentowi białka, podczas gdy fragment o masie cząsteczkowej 15 kDa odpowiada fragmentowi wewnętrznemu.

Przykład 5. Konstruowanie biblioteki genomowej Aspergillus niger g grzybni A. niger HEM ucierano w moździerzu w ciekłym azocie do otrzymania drobnego białego proszku. Proszek poddano lizie w 35 ml TES (10 mM Tris · HCl, pH 7,5; 50 mM EDTA; 150 mM NaCl) + 1% SDS w temperaturze 55°C w ciągu okresu 2-4 godzin. Lizat ekstrahowano raz jedną objętością fenolu i k'lka razy jedną objętością

170 943 /enolu-chloro/oamu. do momentu aż przestała być widoczna interfaza. Po końcowej ekstrakcji jedną objętością chloroformu DNA wytrącono etanolem. Osad rozpuszczono w TE (10 mM Tris: 1 mM EDTA: nH 8.0) i dodano RNaze do steżenia μρ/ml.

ttrr ΓΊΝΤ Δ ύρ c Pi rvxi rr\ pfrnunnrtn Γ/π/'ΙΛΤ itt

XV tyc. WŁW JL/i X VI \J ύ il Ult lUllC kJ 14 *Ύ . -, 1z-i n-r-\ηΛλ λά+ττ·»·» γ-τ-χλ/-i£·»·-» <-» taki spuouu. że utizymanu flag

JL/Ni X Vfj^c menty o średniej długości 10 - 20 kb. Powstałe końce Sau3AI częściowo wypełniono polimerazą Klenowa stosując nukleotydy dGTP i dATP i zligowano z ramionami odpowiadającymi połowom miejsca XhoI LambdaGEM -11 (Promega). Ramiona te zawierają częściowo wypełnione miejsca Xhol (dTTP i dCTP) i otrzymano je gotowe do użycia od producenta. Zligowany DNA upakowano stosując układ do upakowywania in vitro Packagene (Promega). Określenie miana tej pierwotnej biblioteki genomowej na E. coli MB406 dało w wyniku 8000 jednostek łysinkotwórczych (pfu). Przykład 6. Przeszukiwanie biblioteki genomowej A. niger pod kątem genu α-L-arabi'no/uaαno.zj’dαzj B (ab/B) i częściowa charakteryzacja bybą^id^²^ⁱu'ą^cy^h klonów fugowych.

Szczegóły technik klonowania molekularnego opisali Sambrook i in. w Molecular Cloning; A Laboratory Manual. wyd. 2 (1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press). Inkubacje enzymów prowadzono zgodnie z instrukcjami opisanymi przez producenta.

Sekwencje aminokwasowe przedstawione we wzorach 1 i 3 zastosowano do skonstruowania mieszanin oligonukleotydów AB1719 i AB2306 (patrz figury 2 i 3). W przypadku degeneracji kodu genetycznego czterech lub więcej nukleotydów zastosowano nukleotydy inozynowe.

Bioty Southema 10 μ g DNA A. niger HEM strawionego BamHI. Bg/II. EcoRI lub HindIII hybrydyzowano przez noc w temperaturze 35^OC w 6 x SSC. 5 x roztwór Denhardta. 0.5% SDS i 100 pg/ml zdenaturowanego DNA grasicy cielęcej z 15 pmolami tych mieszanin oligonukleotydów. po czym bioty przemywano dwa razy podczas 10 minut w temperaturze 35^OC 6 x SSC. 0.1% SDS. Oligonukleotyd ABT719 (figura 2. wzór 1a) dawał wzór kilku odrębnych prążków hybrydyzacyjnych dla każdego produktu trawienia enzymatycznego.

Do przeszukiwania biblioteki genomowej A. niger HEM wysiano 2 x 10³ pfu na trzech płytkach o średnicy 15 cm. wyJ^i^nzy:^tlejąc murawę z E. coli MB406. Dla górnej i dolnej warstwy stosowano odpowiednio podłoże TB (10 g/htr Bactotrypton; 5 g/htr NaCl) plus 0,9% i 0,75% agar. Z każdej płytki przygotowano dwa sączki (nitroceluloza; Millipore) i przeszukano oligonukleotydem AB1719 stosując warunki hybrydyzacji i przemywania podobne do zastosowanych przy hybrydyzacjach biotów Southerna. Można było wykryć pięć podwójnie hybrydyzujących łysinek. Każdą łysinkę usunięto pipetą pasterowską i fagi wyeluowano z krążków agarowych 0.5 ml buforu dla fagów (20 mM Tris · HCl. pH 7.5; 100 mM NaCl; 10 mM MgSO4). Łysinki oczyszczono przez powtarzane wysiewanie fagów wyeluowanych z wyizolowanych krążków agarowych. a następnie przeszukiwanie oligonukleotydem AB1719. Stwierdzono. że pięć łysinek hybrydyzuje w różnym stopniu z oligonukleotydem AB1719:

Łysinka	Sygnał hybrydyzacyny
7	+ + + + +
8	+ + + + +
12	±
45	+ +
53	+ + + + +

Po oczyszczeniu łysinek. z fagów pochodzących z pojedynczych hybrydyzujących łysinek wyizolowano DNA. Numer 12 pominięto z powodu niskiego sygnału hybrydyzacyjnego. Na 15 cm płytkach wysiano pomiędzy 30 000 - 50 000 łysinek. stosując TB bez NaCl i agarozę zamiast agaru w dolnej i górnej warstwie. Po inkubacji przez noc. fagi

170 943 wyeluowano z górnej warstwy agarowej przez ciągłe wytrząsanie płytki na wytrząsarce wahadłowej w ciągu 90 minut z 15 ml buforu dla fagów. Po upływie połowy tego czasu płytki przestawiono o kąt 90°. Zawiesinę fagów zebrano z płytek i odwirowano dla usunięcia pozostałości komórek, Dodano DNazę i RNazę do końcowego stężenia 1 μg/ml i zawiesinę fagów inkubowano w ciągu 45 minut w temperaturze 37°C. Fagi wytrącano PEG w ciągu jednej godziny na lodzie w 1 M NaCl i 10% PEG 6000. Po odwirowaniu osad fagów zawieszono ponownie w 1 ml buforze dla fagów, a nierozpuszczalną pozostałość usunięto przez odwirowanie. Dodano SDS i EDTA do końcowego stężenia 0,2% i 15 mM, po czym dodano proteinazę K do 50 μg/ml i mieszaninę inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 65°C. Po kolejnych ekstrakcjach równymi objętościami fenolu, fenolu/chloroformu i chloroformu, DNA wytrącono z fazy wodnej izopropanolem. DNA rozpuszczono w TE zawierającym 0,1 μ g/ml RNazy.

Skonstruowano częściową mapę restrykcyjną DNA każdego faga (patrz figura 4 - klon fagowy 7). Dwa z klonów fagowych (8 i 53) zawierały fragment z tego samego regionu genomu A. niger, podczas gdy inne (7 i 45) zawierały różne fragmenty genomowe.

Przykład 7. /zo/owanie i’ c/zarak/eryz'^^ genu ab/B

Fagowy DNA całkowicie strawiono enzymami rozpoznającymi sekwencję czterech kolejnych nukleotydów i powstałe fragmenty zligowano z pTZ18R lub pUC18. Otrzymane kolonie przeniesiono na membrany nitrocelulozowe i przeszukano oligonukleotydem AB1719 dla wyselekcjonowania fragmentów z hybrydyzującą wstawką. Wstawki dostatecznie małe zsekwenojonowrno dla zidentyfikowania wstawki. Analizę sekwencji fragmentu SacI o długości 2,8 kb klonu fagowego 7 przeprowadzono stosując zestaw odczynników Sequenase^R wersja 2.0 (United States Biochemiorl) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyniki analizy sekwencji (figura 5, wzór 4) dały sekwencję, w której można wykryć zarówno sekwencję nukleotydową oligonukleotydu AB1719, jak i sekwencję aminokwasową N-końca białka ABF B (porównaj wzór 1 i figura 6, wzór 5).

Fragment SacI o długości 2,8 kb sklonowano w plazmidzie pUC18 E. coli. Otrzymany plazmid otrzymał oznaczenie pGBabfB i zdeponowano go w szczepie DH5a E. coli w Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baam, Holandia, w dniu 11 marca 1991 r. pod numerem CBS 156.91).

Przykład 8. Wprowadzenie genu abfB do Aspengi^lu^ niger N 593 przez kotnans/onwacj^

DNA klonu fagowego 7, otrzymany w przykładzie 6, wprowadza się do Aspergillus niger przez kotransformację szczepu N593 Aspergilus niger z zastosowaniem genu pyrA Aspergilus niger jako markera selekcyjnego w plazmidzie pGW635 (Goosen i in. (1989) Mol. Gen. Genet. 219. 282) i DNA klonu fagowego 7 jako DNA kotransformującego. Do kotransformacji dodano transformujących DNA w stosunku molowym 1:20 w celu zwiększenia częstości kotnans/onmrojl.

Dla oznaczenia częstości kotransformacji jako kotransformujący DNA zastosowano plazmid pNOM102 (Roberts i in. (1989) Curr. Genet., 15, 177) niosący gen uidA E. coli., kodujący β-glukurorndazę (GUS).

Następnie transformanty PYRA+ przeniesiono do podłoża z X-glukuronidem (Clontech, Palo Alto, CA, USA) i obliczono pod względem aktywności GUS. Kolonie o barwę niebieslriej zllczano jako fenoby) GUS⁺, bezbarwne jako fenotyp GUSA. niger skotransformowane plazmidami pNOM102 i pGW635 dla odpowiednio transformacji/selekcji, dawały częstości kotransformacji do 85%.

Z grzybni przygotowano protoplasty przez hodowanie Aspergillus niger N593 na podłożu minimalnym, wzbogaconym o 50 mM glukozę, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,2% hydrolizat kazeiny i 10 mM urydynę, w ciągu 20 godzin w temperaturze 30°C. Podłoże minimalne miało następujący skład (na 1000 ml): 6,0 g NaNO3, 1,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 · 7H2O, 0,5 g KCl, 1 ml roztworu Visniaca (Visniac, W. i Santer, M. (1957) Bact. Rev., 21, 195), źródło węgla jak wskazano, pH 6,0. Przygotowanie protoplastów

170 943

A. niger N593 i procedurę transformacji przeprowadzono jak opisali Goosen i in. (1987) Current Genet., 11, 499.

Powstałe transformanty PYR+ wyizolowano, oczyszczono i testowano pod kątem wytwarzania arabinofuranozydazy w kolbach do wytrząsania (patrz przykład 9). Ponieważ nie istnieje dostępne oznaczenie na płytkach kotransformowanych genów, jako szybki test do identyfikacji tych transformantów niosących riewyseIekcjonowαny gen wykorzystano test amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), opracowany przez D. Setha (Biotech International Ltd., Australia). Test amplifikacji w PCR przeprowadzono w następujący sposób;

- Kilka młodych strzępek grzybni transfonnantów PYR+ umieszczono w 1,5 ml probówkach;

- do tej probówki dodano 50μ l 2% SDS i ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 10 minut;

- ogrzaną próbkę rozcieńczano 100 razy wyjałowioną wodą o wysokim stopniu czystości;

- 5 μ l rozcieńczonej próbki stosowano do amplifikacji PCR;

- reakcję łańcuchową polimerazy prowadzono zgodnie z instrukcją dostawcy polimerazy AmpliTaq™ (Perkin Elmer Cetus). Po denaturacji (8 minut w temperaturze 100^OC) i dodaniu 1 μl polimerazy AmpliTaq™, mieszaninę reakcyjną poddano 25 cyklom amplifikacji (każdy: 2’ w temperaturze 94°C, 2’ w temperaturze 55°C, 3’ w temperaturze 72°C w amplifikatorze DNA PHC-2 (Techne). Po ostatnim cyklu etap polimeryzacji w temperaturze 72°C wydłużono do 7 minut dla zakończenia syntezy wszystkich nici;

- Produkty PCR analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Dla tego przeszukiwania pyrA/PCR częstości kotransformacji pozostawały w zakresie 5 - 45%.

Przykład 9. Przeszukiwanie kotransfozwantów pod kątem ekspresji genu abfB

Otrzymane w przykładzie 8 transformanty PYR+ analizowano pod kątem ekspresji genu abfB. Transformanty PYR+ niosące DNA bakteriofaga lambda 7 poddano selekcji testem amplifikacji PCR.

Spores tych transformantów zebrano z komórek hodowanych w ciągu 5 dni w temperaturze 34°C na płytkach z ziemniaczuno-dekstrozowym podłożem agarowym (Difico).

Wytwarzanie arabinofuranozydazy testowano w kolbach do wytrząsania w następujących warunkach:

Zarodnikami w ilości około 1 x 10⁶ zaszczepiono 100 ml podłoża do hodowli wstępnej zawierającego (na litr): 30 g sacharozy, 2 g NaNO3, 1 g K2HPO3, 0,5 g MgSO4 · 7H2O, 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO4 · 7H2O, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g ekstraktu słodowego i 3 g karboksypolimetylenu (B. F. Goodrich Company), pH doprowadzono NaOH do 6,1.

Po hodowli w ciągu 48 godzin w temperaturze 34°C na wytrząsarce obrotowej (250 obrotów na minutę), 5 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml podłoża głównej hodowli zawierającego (na litr): 5 g mączki sojowej, 4,4 g miazgi buraczanej, 3 g (NH4)2SO4, 3 g glicyny, 12 g (NH4)JHPO4 i 0,24 g MnSO4 · H2O, pH doprowadzono H3PO4 do 6,2.

Grzybnię hodowano w ciągu co najmniej dalszych 100 godzin w temperaturze 34°C· i przy 250 obrotach na minutę. W wybranych odstępach pobierano próbki. Grzybnię usunięto przez sączenie i przesącz hodowli analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS i przez oznaczanie brbbmofurαnozydazy, jak opisano w przykładzie 1.

Wyniki oznaczeń arabmofuranozydiizy przedstawiono w tabeli 3.

170 943

Tabela 3

Wytwarzanie aaabinofuarnozydrzy przez kotransformaqęA. niger N593 klonem Lambda 7

-!----Aktywność α-ILararmoruaanozyαazy

Tr-nsform-nt PYR+ szczepu N593	Oznaczenie PCR-	(nkrt/ml)
godziny po inokulacji
24	48	72	96
*2	-	8	13	22	6
*6	-	12	30	34	22
*7	-	13	31	36	25
*9		17	33	30	19
*1	+	37	50	43	35
*8	+	33	52	49	37
*21	+	44	57	62	48
*34		46	53	59	41

- wskazuje na nieobecność fragmentu DNA z PCR + wskazuje na obecność fragmentu DNA z PCR po elektroforezie w żelu agarozowym.

Na podstawie wyników przedstawionych w tabeli 3 można wyciągnąć wniosek, że transformanty dodatnie w PCR wytwarzają tylko 1,5-2 razy więcej arabinofuranozydazy niż transformanty ujemne w PCR, tj. te, = które otrzymały tylko marker selekcyjny pyrA z plazmidu pGW635.

Przykład 10. Ekspresja arabinofuranozydazy w AspergiZluk stransjo^rmowanym wektorami ekspresyjnymi zawierającymi fuzję genu abfB sefcwenccami promotora i sygnałową genu amylog/ukozydazy (gZaA) A. niger.

Przykład 10.1: ^c^o^^i^wwe^ wrkeora ekspeesyjnego

Wszystkie konstrukcje wykonano stosując standardowe procedury biologii molekulrrnej opisane w, na przykład, S-mbrook i in. (1986) Mole^^uar C/yn/'ng: A l-bora/ory manual, 2 wyd., Cold Spring Harbor Labyratyry Press, N. Y..

Dl- otrzymania zwiększone']' ekspresji -aabmofuranozsd-zs w AspergiZluk niger wykonano dodatkową kasetkę ekspreiyną, w której gen abfB jest pod kontrolą promotoramsloglukozsdαzs (AG) A. niger połączonego z ^^-^-mt^^^asi^^ą sekwencją sygnałową genu gZ-A.

Przykład 10.2.: Konstruowanie pAB6-1, pAB--6-3, jA.Bb-4, pAB6-31 i pAGEK1

Gen amslyglukyzsdazs (AG), (gZ-A) A. niger wyżylywany z biblioteki plazmidowej z-wierającej fragmenty EcoRI o długości 3 - 4 kb lub fragmenty HindUI o długości 13 - 15 kb w wektorze E. coli pUC19 (Yanisch-Peiron i in. (1985) Gene, 33, 103; możliwych do ytazym-ni- od np. Pharmacia LKB Biotechnology, Szwecja) stosując następujące yligonuklcytyds specyficzne dla AG:

AG - 1 : 5' - GACAATGGCTACACCAGC ACCGC AACGGAC ATTGTTTGGCCC - 3 ' (wzór 6)

AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' (wzór 7) obydwa oparte na sekwencji nukleotydowej opublikowanej dla A. niger (Boel i in. (1984) EMBO J., 3, 1097 - 1102; Boel i in. (1984) Mol. Cell. Biol., 4, 2306). Sondy oligonukleotydywc pochodzą z sekwencji ot-czającej intron 2: yligonuklcytsd AG-1 po170 943 łożony jest w kierunku 3' od intronu i posiada polamość identyczną z mRNA AG, a oligonukleotyd AG-2. znajduje się przed intronem 2 i został wybrany jako antyrównolegfy do mRNA AG.

w wyniku tego przeszukwania otrzymano plazmid pAB 6-1, który zawiera gen glaA we fragmencie HindIII o długości 14,5 kb (patrz figura 7).

Z plazmidu pAB6-1 wykonano kilka subkłonÓw w pUC19; pAB6-3, który zawiera fragment EcoRI o długości 1,8 kb bezpośrednio przed genem g/aA i prawdopodobnie zawiera sekwencje regulacyjne; pAB6-4, który zawiera fragment HinIII - BgIII o długości 4,6 kb obejmujący promotor genu g/aA i część 5’-końca tego genu.

Następnie, plazmid pAB6-3 strawiono częściowo EcoRI i traktowano polimerazą T4. Z plazmidem tym zligowano fragment HindIII i EcoRI plazmidu pAB6-4, znowu po traktowaniu polimerazą T4. Otrzymaną konstrukcję oznaczono pAB6-31; konstrukcja ta zawiera fragment o długości 3,6 kb leżący przed genem g/aA, ze /niszc/onym miejscem EcoRI w środku i unikalnym miejscem EcoRI bisko genu glaA..

Z plazmidu pAB6-31 zsubklonowano fragment KpnI/EcoI o długości 3,4 kb niosący te same sekwencje przed genem glaA w wektorze pTZ18R (Pharmacia, Szwecja). Otrzymany plazmid oznaczono pAGEKl.

Przykład 10.3: Konstruowanie pAGabfB1

Fuzję promotora AG i 1.8-aminokwasowej sekwencji liderowej genu g/aA to z genem strukturalnym kodującym dojrzałe białko przeprowadzono metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak przedstawiono schematycznie na figurze 8.

Jako startery do amplifikacji przez PCR przygotowano cztery syntetyczne oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

starter 2796: 5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3' specyficzna dla AG sekwencja wokół miejsca EcoRI około 250 bp przed kodonem inicjacji ATG.

(wzór 8) starter 2626: 5'-GTAGATGTCACAGGGGCCTGCCAACCCTGTGCAGAC-3' odwrócona dojrzała abfB <----> odwrócony 18aminokwasowy lider AG (wzór 9) starter 2629: 5 -GTCTGCACAGGGTTGGCAGGCCCCTGTGACATCTAC-3' amrnokwasowy lider AG <----> dojrzała abfB (wzór 10) starter 2630: 5'-GCTTAGCCCGGGGGTGCTTGGGTCAGG-3'

Sekwencja specyficzna dla abfB mieści sie w miejscu

SmaI w pozycji 483.

(wzór 11)

170 943

PCR przeprowadzono jak opisali Pomp i Medrano (1991) BIotechniqkes, 10, 58, z niewielkimi modyfikacjami (patrz przykład 8).

W celu otrzymania fuzji sekwencji AG z sekwencjami kodującymi abfB pα/eprowadzono dwie oddzielne PCR.:

- pierwszą reakcję (PCR(l) na figurze 8), z zastosowaniem pAB6-1 jako matrycy i oligonkkleotydów 2796 i 2628 jako starterów, do amplifikacji fragmentu DNA o długości 230 bp zawierającego 3’-końcowy fragment promotora AG i sekwencję 18-aminokwasowego lidera AG flankowanego przy 3’-końcowej sekwencji gαanic/nej pα/e/ nuklectydy genu abfB;

- drugą reakcję (PCR(2) na figurze 8), z zastosowaniem pGBabfB1 jako matrycy i oligonkkleotydów 2629 i 2630 jako starterów, do amplifikacji fragmentu DNA o długości 300 bp zawierającego 5’-końcową część genu dojrzałej arabinofakktofuaanc>2ydazy B (abfB) flankowanego przy 5’-końcowe- sekwencji granic/neJ przez 18 aminokwasów peptydu ^^yg^^^owego amyloglukozydazy (AG).

Dwa wytworzone przez PCR fragmenty DNA oczyszczono stosując elektroforezę żelową i zestaw Sephaglas™ Band (Pharmacia, Szwecja).

Te dwa oczyszczone fragmenty DNA zastosowano jako matryce w trzeciej reakcji (PCR(3) na figurze 8), z zastosowaniem oligonukleotydów 2796 i 2630 jako starterów, do utworzenia fuzji AG-αrαbinofurano/yda/a B. Fragment DNA o długości 530 bp strawiono SmaI, oczyszczono stosując elektroforezę w żelu agarozowym i zestaw Sephaglas™ Band oraz zligowano ze strawionym Smal wektorem pTZ18R.

Zligowanym DNA stransformowano elektrokompetentne komórki Pop10 E. coli w sposób opisany przez dostawcę (Invitrogen Corporation; San Diego, CA, USA). Selekcję przeprowadzono na płytkach z bulionem Luria zawierającym Xgal (5-bramo-4chloroG-indolUo-S-D-gaialrtozyd), IPTG (i/opαopylotiogalaktozyd) i ampicylinę. Plazmidowy DNA z transformantów dających kolonie barwy białej przygotowano jak opisał Andreoli, P. (1985) Mol. Gen. Genet., 199. 372, i analizowano enzymami restr^lkcyi^^ni EcoRI i Smal. Transformanty te, zawierające fuzyjny fragment DNA o długości 530 bp, Owencjonowano i c/nac/ono pAGabfB1.

Schemat konstruowania plazmidu pAGabfB1 przedstawiono na figurze 8.

Przykład 10.4: K'onfZαkowanie pAGabfB2 i pAGabfBJ

Schemat tych dwóch konstrukcji plazmidowych przedstawiono na figurze 9.

Wektor E. coli pBhiescript II SK(+), możliwy do otrzymania ze Stratagene Cloning Systems (La Jolla, Ca, USA), strawiono EcoRI i XhoI i oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym.

Wyizolowano fragment EcoRI-SmaI o długości 530 bp z plazmidu pAGabfBl i fragment SmaI-^oI o długości 1,8 kb z pGBabfB1 (zawierający dojrzały gen abfB) (patrz przykład 7). Te dwa fragmenty zligowano z wektorem pBlkefcript II SK(+) strawionym EcoRI-^oI i stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5α, przygotowane według zmodyfikowanej procedury Hanahana ((11983) J. Mol. Biol., 166. 557). Selekcję przeprowadzono na płytkach LB zawierających Xgal, IPTG i ampicylinę. Przygotowano plazmidowy DNA z transformantów dających kolonie barwy białej i analizowano enzymami restrykcyjnymi EcoRI i XhoI. Plazmid, który posiadał pożądany fragment EcoRI-X/ioI o długości 2,3 kb oznaczono pAGabfB2.

W celu skonstruowania pAGabffi3, pozostały region o długości 3,4 kb przed promotorem AG otrzymano przez strawienie plazmidu pAGEK.1 KpnI i EcoRI i oc/ys/czono przez elektroforezę w żelu αgaαo/cwym.

Fragment .EcoRI - Xhol o długości 2,3 kb, zawierający fuzję genową AG-arabinoza oczyszczono z plazmidu pAGabfB2.

Te dwa fragmenty zligowano z wektorem pBlkescαipt II SK(+) (który strawiono KpnI-AEoI) i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. cdi DH5α jak opisano powyżej.

170 943

Po wyizolowaniu plazmidowego DNA i analizach enzymami restrykcyjnymi, otrzymano pożądaną kasetkę ekspresyną pAGabfB3 (patrz figura 9).

Przykład 10.5: Konstruowane pAGa/f^

Dla wprowadzenia homnlc^gioznego markera selekcyjnego transformacji szczepu N593 Aspergilus niger (Goosen i in. (1987) supra), fragment XbaI o długości 3,8 kb plazmidu pGW635, zawierający gen pyrA (Goosen i in. (1989) supra), wstawiono do unikalnego miejsca XbaI kasetki ekspresyjnej pAGabffi3. Powstały plazmid ekspresyny/selekcyjny oznaczono pAGabffi4 i przedstawiono na figurze 10.

Przykład 10.6: Konstruowanie pAGabfB5

Wyizolowano fragment H/ndlU-AbnI o długości 3,8 z plazmidu pFYT3 (van Gorcom, R. F. i in. (1991) europejskie zgłoszenie patentowe numer 0 420 351 A1), zawierający gen selekcyny amdS Aspergilus niduians (Corrick i in. (1987) Gene, 53, 63), i wstawiono go do plazmidu pAGabfB3 strawionego HindIH--X>aI. Otrzymany plazmid ekspnesyjny/.selekoyjny oznaczono pAGabfB5 i przedstawiono na figurze 11.

Przykład 10.7: Wproz>adeanje kas eUk ekspnesojnych aAG3bfB3 i pAGa6/B4 do Asperg7lus niger _N5.93

Plazmid pAGabfB3 wprowadzono do A. niger przez kotransformację szczepu N593 z zastosowaniem genu pyrA jako markera sełekcyjnego w plazmidzie pGW635 (Goosen i in. (1989) supra i kasetki ekspresyjnej pAGabfB3 jako kotransformującego DNA.

Transformację szczepu N593 kasetką ekspresyną pAGabfB4 przeprowadzono jak opisali Kusters-van Someren i in. (1991) Curr. Genet., 20, 293.

Otrzymane tnans/onmanty PYR+ wyizolowano, oczyszczono i przetestowano pod kątem wytwarzania anabinoί'jπrmozydrzy w kolbach do wytrząsania, stosując sposób opisany w przykładzie 11.

Jako kontrolę testowano transformanty zawierające tylko wektor pGW635.

Przykład 10.8: Wprowadzanie kasetki, eksprjkynej' pAGabjB5 do szczepu CBS 513.88 Aspergilus niger

Plazmid pAGabfB5 wprowadzono do szczepu CBS 513.88 Aspergilus niger (zdeponowanego 10 października 1988 r.) stosując procedury transformacji opisane przez Tilburna i in. (1983) Gene, 26, 205 oraz Kelly’ego i Hynesa (1985) EMBO J., 4, 475 z następującymi modyfikacjami:

- grzybnię hodowano w ciągu 16 godzin w temperaturze 30°C na wytrząsarce obrotowej przy 300 obrotach na minutę na podłożu minimalnym dla Aspergillus (Cove (1966) Biochem. Biophys. Acta, 113. 51) wzbogaconym o 10 mM argininę i 10 mM prolinę;

- do tworzenia protoplastów zastosowano tylko Novozym 234 (NOVO Industri) bez helikazy;

- po 90 minutach tworzenia protoplastów do zawiesiny protoplastów dodano 1 objętość buforu STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCk) i wirowano przy 2500 g, w temperaturze 4°C w ciągu 10 minut w roztworze z wychylnymi kubełkami. Protoplasty przemywano dwukrotnie i ponownie zawieszono w buforze STC w stężeniu 108 komórek/ml;

- plazmidowy DNA dodano w objętości 10 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) do 100 μ l zawiesiny protoplastów;

- po inkubacji zawiesiny DNA-protoplasty w temperaturze 0°C w ciągu 15 minut, kroplami dodano 200 μ l roztworu PEG (25% PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 50 mM CaCk) i inkubację kontynuowano w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. Następnie powoli dodano 1 ml roztworu PEG (60% PEG 4000 w 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCb) z powtarzanym mieszaniem probówki. Po inkubacji w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut zawiesinę rozcieńczono buforem STC, zmieszano przez odwrócenie i wirowano przy 2000 x g w temperaturze 4°C w ciągu 10 minut. Protoplasty ponownie delikatnie zawieszono w 200 μ l buforu

170 943

STC i wyssano na selekcyjnym podłożu minimalnym dlaAspeagllus z 10 mM acetamidem jako jedynym źródłem azotu i 1M sacharozą, zestalonym 0,75% agarem bakteriologicznym numer 1 (Oxoid). Wzrost prowadzono w temperaturze 3Q^OC w ciągu 6 _- 10 dni.

Otrzymane ΐaanifoamaπty replikowano na płytki z selekcyjnym podłożem minimalnym z acetamidem, zestalonym 1,2% agarozą i inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 4-7 dni.

Po 4 -7 dniach pojawiały się szybko rosnące i dobrze zarodnikujące transformanty przy bardzo niskim tle.

Transformanty AMDS+ oczyszczono przez posiew redukcyjny z pojedynczych kolonii na płytkach selekcyjnego podłoża minimalnego z acetamidem, zestalonym 12% agarozą i testowano pod kątem wytwarzania arabinofuranozydazy w kolbach do wytrząsania, stosując sposób opisany w przykładzie 11.

Przykład 11. Ekspresja genu arabmofuranc^zydazy B pod kon/rolą promotora AG i 18-tnmmokwasowej sekwencji lidera AG w Aspergillus niger

Zarodniki oczyszczonych taansfcamant0w zebrano z komórek hodowanych w ciągu 3 - 5 dni w temperaturze 34°C na płytkach z agarowym podłożem ziemniaczano-dekitao/owym (Difco).

Zarodnikami w ilości około 1 x 10⁸ zaszczepiono 100 ml podłoża do hodowli wstępnej zawierającym (na litr) : 1 g KH2PO3; 30 g sacharozy (maltozy); 5 g ekstraktu drożdżowego; 10 g hydrolizatu kazeiny; 0,5 g MgSO 4 · 7H2O i 3 g Tween 80. pH doprowadzono do 5,5.

Po wzroście przez noc w temperaturze 34°C na wstrząsarce obrotowej (250 obrotów na minutę), 1 ml tej hodowli zaszczepiono 100 ml główną hodowlę zawierającą (na litr): 1 g KH2PO3; 70 g maltodekstryny (Maldex MD03, Amylum); 12,5 g ekstraktu drożdżowego; 25 g hydrolizatu kazeiny; 2 g K2SO4; 0,5 g MgSO4 · 7H2O; 0,03 g ZnCb; 0,02 g CaCh; 0,05 g MnSO4 · 4H2O i 0,3 g FeSO4. pH doprowadzono do 5,6.

Grzybnię hodowano w ciągu co najmniej dalszych 140 godzin w temperaturze 34°C i przy 250 obrotach na minutę. W wybranych odstępach czasu pobierano próbki. Grzybnię usuwano przez sączenie i przesącz hodowli analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS i przez oznaczenie arαbinofuranozyda/y opisane w przykładzie 1.

Transformanty N593 niosące kasetkę ekspresyjną pAGabfB3 lub pAGabfB4 wykazywały wzmocnione wytwarzanie enzymu ABF B w porównaniu z transformantami N593 niosącymi tylko marker selekcyjny pyrA.

Transformanty CBS 513.88 niosące kasetkę ekspresyjną wykazywały wzmocnione wytwarzanie enzymu ABF B w porównaniu z transfonmantami niosącymi kasetkę ekspresyjną p18FYT3.

Przykład 12. Okreśanie sekwencji aminokwasowych

Przykład 12.1: Określanie sekwencji aminokwasowej α-L-arabincfuaano/ydazy A (ABF A)

Około 1 - 2 nmoli α-L-aιabmofuaanozyda/y A (ABF A) otrzymanej z przesączu hodowli A. niger N400, oczyszczonej jak opisali van der Veen i in. ((1991) supra), zastosowano do iekwencjonowama w fazie gazowej (SON Facility, Leiden, Holandia). Określono następującą sekwencji

Xaa-Xaa-(Leu)-Lys-Val-Xaa-Thr-Gln-(Gly)-(Gly) (wzór 12)

Ponadto 2-4 nmoli białka strawiono CNBr stosując następujące metody: białko dializowano wobec dwukrotnie destylowanej wody w ciągu 18 godzin, po czym białko /liofili/cwano. Paci/ek zawieszono ponownie w 70% kwasie mrówkowym w stężeniu

170 943 mg/ml. Do tego roztworu dodano 200-loOtny nadmiar CNBr odpowiednio do ilości oczekiwanych reszt metioniny i roztwór białkowy inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną zliofilizowano i dwukrotnie ______crnA H. .......____-........._I3_

U1U. W tlllV CJ A W ▼» AAA1Ć£ »Vł_/<AUJ.

(50 mM Tris pH 6,8; 100 mM ditiotreitol; 2% SDS; 0,1% błękit bromofenolowy i 10%o glicerol). Roztwór ten ogrzewano w ciągu 3 minut w temperaturze 100^OC, po czym peptydy rozdzielono w 15%o żelu poliakryloamidowym z SDS, a następnie blotting na membranę Immobilon-P (Millipore) według metody opisanej przez Matsudairę, P. ((1987) J. Biol. Chem., 262. 10035). Fragmenty membrany zawierające 2 -3 nmole określonego peptydu przemyto wodą dwukrotnie destylowaną i poddano analizie sekwencyjnej zgodnie z metodą opisaną przez Amosa, R. ((1987) FEBS Lett., 212. 68). Określono następującą sekwencję

U ł’ V*AVA W V.

styl nużono \\ir\r AWTfLAAlL·^ łłUk ri r» ΓΛίτ m i p V» AlAky

H7

O t-Pł aItσο,ιπαοη................... .... ...........

rv uuiuxzjV vavj piuuun.

Leu-Gln-Asn-Pro-Gly-Leu-Gln-Gly-Thr-Ala-Pro-Xaa-Leu-Thr-Ala (Gly) (wzór 13)

Przykład 12.2: Okreśanie sekwennji aminokwasowej α-Labαbiirυfιuranozydbzy B (ABF B)

Próbkę białka α-L-ababinofurarozydbzy B (ABF B) otrzymano z przesączu hodowli A. niger N400 i oczyszczono jak opisali van der Veen i in. ((1991) supra). Określono następującą N-k.ońcową sekwencję ammokwasową w sposób opisany w przykładzie 12.1:

Xaa-Pro-Xaa-Asp-lle-Tyr-Glu-Ala-Gly-Asp-Thr-Pro (wzór 14)

Poza tą sekwencją N-koncową, otrzymano dodatkowe sekwencje przez zsekwencjonowanie peptydów CNBr, jaK opisano w przykładzie 12. 1:

Glu-Asn-Asn-Leu-PHe-Ser- (Gly) -Ala-Asp-Glu- (Gly) -Tyr-Asn-Ser(Tar) -Asp-Fro-Thr (wzór 15)

Ser-Lys-Glu-Gly-Ala-Ile-Ile-Leu-Gly-lle-Gly-Gly-Asp-Asn-SerAsn-Gly-Ala-Gln-Gly (wzór 16)

Thr-Ser-Gly-Tyr-Pro-Ser-Asp-Asp-Val -Glu-Asn- (Ser) -Val-XaaGln-Ile-Val-Ala (wzór 17)

W otrzymanej sekwencji aminokwasowej stwierdzono także sekwencje aminokwasowe o wzorach 14 - 17, jak przedstawiono na figurze 6. Potwierdza to konserwatywność enzymu ABF u różnych szczepów Aspe/g/lws niger.

170 943

Przykład 12.3: Określanie sekwencji aminokwasowej endolitycznej

1,5-a-L-aaabmanazy (ABN A)

Próbkę białka endolitycznej 1,5-a-L-aaabinanazy (ABN A) otrzymano z przesączu hodowli A. niger N400 i oczyszczono jak opisali van der Veen i in. ((1991) supra). Określono następującą N-końcową sekwencję aminokwasową w sposób opisany w przykładzie 12.1:

Tyr-Ala-Asp-Pro-Gly-Ala-Xaa-Ser-Gly-Val-Xaa-Thr-Thr (wzór 18)

Poza tą sekwencją N-końcową, otrzymano dodatkowe sekwencje przez zsekwencjonowanie peptydów CNBr, jak opisano w przykładzie 12.1:

Glu-Tyr-Gly-Ser-Trp-Thr-Asp-His-Gly-Ser-Thr-Gly-Ile-Ala-Ser(Arg)-Xaa-Ala-Lys-Ile (wzór 19)

Przykład 13. Klonowanie molekularne i analiza genu a-L-arabinojuranozydazy A (abfA)

Przykład 13.1: Konstruowanie biblioteki ekspre^/ne/' cDNA

Przykład 13.1.1: indukcja i izolacja mRNA

A. niger N572 (Witteveen i in. (1989) J. Gen. Microbiol., 135. 2163) hodowano wstępnie w ciągu 24 godzin na podłożu minimalnym zawierającym 1% D-glukozę jako źródło węgla, po czym grzybnię zebrano przez sączenie i przemyto jałową solą fizjologiczną. Następnie grzybnię przeniesiono do świeżego podłoża zawierającego 1% (w/v) L-arabitol. Po 16 godzinach indukcji grzybnię ponownie zebrano przez sączenie i przemyto dokładnie jałową solą fizjologiczną. Grzybnię zamrożono następnie w ciekłym azocie, po czym sproszkowano je stosując Microdismembrator (Braun). Z proszku z grzybni wyizolowano całkowity mRNA metodą z monotiocyjanianem guanidyny/Li Cathala i in. ((1983) DNA 2, 329), z wyjątkiem pominięcia SDS w buforze solubilizującym. Z 1 mg całkowitego RNA wyizolowano poliA⁺-RNA przez chromatografię na oligo(dT)-celulozie (Aviv i Leder (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 69, 1408; Sambrook i in., (1989) Mo/ccu/zi Cloning: a Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork) z następującymi modyfikacjami: jako bufor zastosowano 10 mM HEPES pH 7,6 i we wszystkich buforach pominięto SDS, a bufor do nakładania wzbogaconego o 9% (v/v) dlmetylosułfotłenek.

Przykład 13.1.2: Konstruowanie i immunochemiczne przeszukiwanie biblioteki ekspressyinej cDNA

Na matrycy 5 μ g poliA⁺-RNA zsyntetyzowano cDNA i zligowano z bakteriofagiem lambda Uni-ZAP XR stosując zestaw do syntezy ZAP™-cDNA (Stratagene) według instrukcji producenta. Po ligacji cDNA z ramionami wektora Uni-ZAP XR, fagowy DNA upakowano stosując ekstrakty Packagene™ (Promega). W wyniku ligacji 200 ng cDNA z 1 μg ramion wektora, a następnie upakowania jednej piątej mieszaniny reakcyjnej otrzymano pierwotną bibliotekę złożoną z 2 x 10⁵ zrekombinowanych fagów. Pierwotną bibliotekę zamplifikowano stosując E. coli PLK-F’, określono miano i przechowywano w temperaturze 4°C.

Przeszukiwanie otrzymanej biblioteki ekspresyjnej cDNA przeprowadzono zasadniczo jak opisali Young i Davies ((1983) Science 222. 778). W skrócie, 5000 jednostek łysinkotwórczych (pfu) zamplifikowanego roztworu podstawowego wysiano na podłożu NZYCM (na 1000 ml: 10 g aminy NZ, 5 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 1 g hydrolizatu kazeiny, 2 g MgSO4 · HzO, pH 7,5 - dla płytek dodano 12 g agaru, a dla górnej warstwy agarozowej 7 g (agarozy) jako komórki gospodarza stosując E. coli BB4 (Stratagene) w 0,6% górnej warstwie agarozowej. Płytki inkubowano w ciągu 5 godzin

170 943 w temperaturze 37°C. po czym przykryto je sączkami nitrocelulozowymi. które uprzednio moczono w 10 mM IPTD i suszono na powietrzu. Płytki inkubowano dalej w ciągu 6 godzin w temperaturze 37°C. Płytki schłodzono do temperatury 4°C i przed usunięciem sączków zaznaczono ich położenie na płytkach. Sączki inkubowano w ciągu 15 minut w 0.5 M NaCl; 0.05% Tween 20 (BiOTad). 20 mM Tris-HCL pH 7.5 delikatnie wytr:^^:ąsając i powtórzono to jeszcze raz. Pozostałości bakterii usunięto przez ostrożne starcie rękami w rękawiczkach. Fagi. dla których zachodziła ekspresja białka fuzyjnego. zawierającego część białka α-L-aaabmo/uaanozydrzy A (ABF A). zidentyfikowano przez testowanie sączków z antysurowicą skierowaną przeciw ('r-L-arabinofuraπozydrz'e A. a następnie detekcję z zastosowaniem koniugatu alkalicznej fosfatazy. zgodnie z procedurą opisaną dla biotów Western w instrukcjach producenta (Biorad). W dwóch doświadczeniach przeszukano 5 x 103 i 5 x 104 pfu zamplifikowanej biblioteki pod kątem ekspresji cDNA α-L-aaabmo/urαnozydazy A: znaleziono odpowiednio dwa i dziewięć klonów dodatnich. Po oczyszczeniu i wycięciu wyizolowano plazmidy przez hodowlę otrzymanych kolonii przez noc w podłożu LB (na 1000 ml: 10 g trypsynowego peptonu kazeiny (BBL). 5 g ekstraktu drożdżowego (BBL). 10 g NaCl. 0.5 mM Tris-HCl pH 7.5) zawierającym 100 μg/ml ampicyliny. Plazmidowy DNA wyizolowano z hodowli metodą lizy alkalicznej. opisaną przez Maniatisa i in. ((1982) Muleciu/ar Cloning. a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Nowy Jork. 368 - 369). Długość wstawki cDNA określono przez strawienie EcoRI i XhoI. a następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Klon zawierający najdłuższą wstawkę (1.3 kb). oznaczony pC3X3. poddano ograniczonej analizie restrykcyjnej (figura 12).

Przykład 13.2: Przeszukiwanie biblioteki genomowej A. niger pod kątem genu α-L-arabinofuranozydazy A (Τ£/«) i izolowanie genu

Przykład 13.2.1.: Przeszukiwanie biblioteki genomowej A. niger pod kątem genu abfA

Bibliotekę genomowąA. niger N400 skonstruowano w sposób opisany przez Harmsena i in. ((1990) supra). Dla przeszukania biblioteki pod kątem genu abZA. 104 ^/_u na płytkę wysiano w górnej warstwie agarozowej NZYCM zawierającej 0,7% agarozy na płytkach o średnicy 85 mm NZYCM (1,2% agar) jak opisali Maniatis i in. (1982) supra. 64.

Hybrydyzację łysinkową. z zastosowaniem replik nitrocelulozowych. przeprowadzono w następujący sposób: 6 x 104 pfu wyssano z komórkami E. coli BB4 w 0,6% górnej warstwie agarozowej. Po inkubacji przez noc płytek w temperaturze 37°C. wykonano dwie repliki każdej płytki na sączkach nitrocelulozowych. jak opisali Maniatis i in. ((1982) supra. 320). Sączki zwilżono i przemywano w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej w 3 x SSC. po czym prehybrydyzowano je w temperaturze 68°C w ciągu dwóch godzin w buforze do prehybiydyzacji. zawierającym: 6 x SSC. 0,5% SDS. 5 x roztwór Denhardta i 100 μ g/ml zdenaturowanego termicznie DNA spermy śledzia (Boehaingea Mannheim). Roztwór SSC przygotowano z 20 x SSC roztworu podstawowego (na 1000 ml: 175.3 g NaCl. 107.1 g cytrynńanu sodowego -5,5^0. pH 7.0). 5 x roztwór Denhardta przygotowano z 100 x roztworu podstawowego (na 500 ml: 10 g Ficoll-400,10 g poliwinylopirolidonu. 10 g albuminy surowicy bydlęcej (Pentax. frakcja V). Po dwóch godzinach paehybaydyzacjr, bufor do paehybaydyzacji zastąpiono buforem do hybrydyzacji. który był identyczny z buforem do prehybaydyzacji. z tym wyjątkiem. że zawierał znakowany 3^ZP fragment PstI o długości 1,0 kb z klonu cDNA pC1X1 (figura 12). wyizolowany i wyznakowano jak opisali van den Broeck i in. ((1992) europejskie zgłoszenie patentowe numer 0 463 706 A1 - patrz przykład 2.1 i 7.1).Sączki hybrydyzowano w ciągu 18 godzin w temperaturze 68°C. Po hybrydyzacji sączki dwukrotnie przemywano w temperaturze 68°C w ciągu 30 minut w 2 x SSC/0,'1%SDS. a następnie dwa razy w ciągu 30 minut w temperaturze 68°C w 0.2 x SSC/0,1% SDS. Wysuszone na powietrzu sączki umieszczono na arkuszu bibuły Whatman 3MM. oznaczono radioaktywnym tuszem i bibułę Whatman oraz sączki przykryto Saran Wrap™. Hybrydyzujące łysinki zidentyfikowano

170 943 przez ekspozycję błony rentenowskiej Kodak XAR w ciągu 18 godzin w temperaturze -70^oC z zastosowaniem ekranu wzmacniającego.

Zidentyfikowano 18 hybαydyzk-ącyqh łysinek pojawiających się na obu sączkach replik: , lambdaabffA1 do lambaa-^A^. Każdą dodatnią łysinkę pobrano z płytki stosując pipetę pa sterowską i fagi wychowano z krążka agarowego 1 ml buforu SM. (na 1000 ml: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO.4 7H2O, 50 ml 1 M Tris-Hcl pH 7,5 5 ml 20% żelatyny) zawierającego 20/zl chloroformu, jak opisali Maniatis i in. ((1982) supra, 64). Otrzymane fagi oczyszczono przez powtórzenie procedury opisanej powyżej z zastosowaniem replik płytek na sączkach, zawierających 50 - 100 łysinek wyizolowanych fagów.

Po oczyszczeniu fagi namnożono przez wysianie 5 x 10³ fagów na podłożu NZYCM. Po inkubacji przez noc w temperaturze 37°C otrzymano płytki ze spó-nymI warstwami, z których wyeluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM i przechowywanie płytek w ciągu 2 godzin w temperaturze 4⁰C z przerywanym wytrząsaniem. Po zebraniu supernatantów pipetą, z roztworu usunięto bakterie przez wirowanie przy 4 000 x g w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Do supernatantów dodano 0,3% chloroform i liczbę jednostek łysinkotwórc/ych określono przez miareczkowanie, jak opisali van den Broeck i in. ((1992), supra, patrz przykład 2.4). Te roztwory podstawowe fagów zawierały około 101° pfu/ml.

Przykład 13.2.2. Izolowanie DNA z bakteriofaga lambda

Cztery z wyizolowanych fagów (lambdaabbAl. lambdaabfA5, lambdaabA6 i lambdaabfA12) namnożono przez połączenie 5 x 10' bakterii E. coli LE392 (Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet., 150. 53) w 300 μl buforu SM z 2 x 10⁶ fagów i inkubację w temperaturze 37°C w ciągu 15 minut. Po okresie inkubacji zainfekowane bakterie zastosowano do zaszczepienia 100 ml uprzednio ogrzanego (temperatura 37°C) podłoża NZYCM, a następnie inkubowano w ciągu 9-12 godzin w temperaturze 37°C na wstrząsane obrotowej New Brunswick przy 250 obrotach na minutę, po którym to okresie bakterie lizowały. Pozostałości bakteryjne usunięto przez wirowanie w ciągu 10 minut przy 10 000 obrotów na minutę w temperaturze 4°C w wirówce Sorvall High Speed. Z otrzymanego supernatantu (100 ml) wytrącono fagi przez dodanie 10 g glikolu polietylenowego 6000 i 11,7 g NaCl i przechowywanie roztworu przez noc w temperaturze 4°C. Wytrącone fagi zebrano przez wirowanie przy 14 000 x g w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Supernatant usunięto przez zasysanie, a ostatnie ślady płynu usunięto stosując papierowy ręcznik. Fagi ostrożnie ponownie zawieszono w 4 ml buforu SM i raz wyekstrahowano równą objętością chloroformu.

Przed wyt^^;^it^Łah^c^^irriem DNA z cząstek fagowych, DNA i RNA pochodzące ze zlizowanych bakterii usunięto przez inkubację zawiesiny fagów z DNazą I i RNazą A (obie 100 μg/ml) w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Fagowy DNA uwolniono następnie z fagów przez dodanie EDTA do końcowego stężenia 20 mM, a białko usunięto z roztworu przez dwukrotną ekstrakcję równą objętością roztworu fenolu/chloαofoαmu/alkoholu izoamylowego (25:24:1). Po rozd/ielenik faz przez wirowanie z zastosowaniem wirówki Sorvall (14 000 x g, 10 minut), fazę wodną ekstrahowano raz równą objętością roztwOru chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Fazy rozdzielono przez wirowanie, po czym DNA wytrącono z fazy wodnej przez dodanie 0,1 objętości 5 M nadchloranu sodowego i 0,1 objętości izopropanolu, a następnie inkubację na lodzie w ciągu 30 minut. DNA odzyskano przez wirowanie w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C (14 000 x g). Supernatant usunięto przez zasysanie, po czym DNA ponownie zawieszono w 400 μl buforu TE. DNA ponownie wytrącono z tego roztworu przez dodanie 0,1 objętości 3 M octanu sodowego i 2 objętości etanolu. DNA zebrano przez wirowanie w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C (14 000 x g). Supernatant usunięto przez zasysanie, pozostały osad krótko suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym DNA ponownie zawieszono w 125 μ bbkocα TE z/aWeιaiąąqeo 00 μμ/ml RNazz A. Wynikiem i^ ppαcqduIα ocqzss/ czania było wyizolowanie około 50 - 100 fig DNA każdego faga.

170 943

Przykład 13.2.3: Analiza restrylkyyna fagów /dni'eaaj'ąyych abfA

DNA wyizolowany z fagów lambdaabtA1, lambdaabfA5, lambdaabfA6 i lambdaabfA12 analizowano metodą Southema. DNA strawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożone’ z następujących ao/twcrOw: 5 μ l (około 1 μ g) roztworu DNA; 2 μl odpowiedniego 10 x buforu React (BRL); 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (BRL) i jałowa woda destylowana do objętości końcowej 50 μl. Po strawieniu DNA wytrącano przez dodanie 0,1 objętości 3 M octanu sodowego i 2 objętości etanolu. DNA zebrano przez wirowanie w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej (14 000 x g). Supematant usunięto przez zasysanie, a po/citały osad krótko suszono pod /mniejizonym ciśnieniem i ponownie zawieszono w 20 μΐ jałowej wody destylowanej. Po dodaniu 4 μΐ buffou do nakładuma DNA (0,255% (w/v) łbętót brumofenolowy, 00,55% (W/vv cyy janolu ksyłenowego, 15% (w/v) Ficoll 400 w HO), próbki inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 65°C i szybko schłodzono na lodzie, przed nałożeniem próbek na 0,6% żel dgαro/owy w buforze TAE (bufor 50 x TAE na 1000 ml; 242,0 g Trizma base (Sigma), 57,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0). Fragmenty DNA aoz0/ielono przez elektroforezę przy napięciu 25 V w ciągu 11-18 godzin.

Po elektroforezie DNA przeniesiono i /0enatuaowano przez zasadowy blotting pod /mniej'izonym ciśnieniem (VacuGene XL, Pharmacia LKB) na membranę nylonową (Gene Dind 45, Pharmacia LKB), jak opisano w instrukcji (str. 25 - 26), a następnie wstępnie hybrydyzowano i hybrydyzowano stcsι^u’ey znakowany ³²P fragment PstI o długości 1 kb i warunki hybrydyzacji jak opisano w przykładzie 12.2.1. Wzór hybrydyzacji otrzymano przez ekspozycję błony rentgenowskiej Kodak XAR-5 w ciągu 18 godzin w temperaturze - 70°C stosując ekran wzmacniający.

Otrzymane wzory restrykcyjne zastosowano do przygotowania częściowej mapy restrykcyjnej genomowego regionu genu abfA. Do subklonowania wybrano fragment Ns/I/XbaI o długości 8,5 kb.

Przykład 13.2.4: Subklonowanie genu abfA A. niger

Z faga lαmbUaι-fΑ5 wyizolowano fragment NsrI/NbaI o długości 8,5 kb przez strawienie fagowego DNA, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment wycięto z żelu agαao/owego, po czym odzyskano go ze skrawka agaao/y przez elektroelucję stosując naczynka ISCO. Membranę diali/ayyjną zamontowano na zarówno dużym, jak i małym zbiorniku tego naczynka. Następnie naczynko umieszczono w aparacie do elektroelucji, duży zbiornik w komorze katodowej zawierającej TAE, a mały zbiornik w komorze anodowej zawierającej TAE/3 M octan sodowy. Fragmenty poddano elektroelucji przy napięciu 100 V przez okres 2 godzin. Po tym okresie naczynko wyjęto z aparatu do elektroelucji i z dużego zbiornika usunięto bufor, a z małego zbiornika bufor usunięto tylko z górnej części. Pozostały bufor (200 fil), zawierający fragmenty DNA dializowano w naczynku wobec wody destylowanej przez okres 30 minut. Ostatecznie, DNA wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3 M octanu sodowego (pH 5,6) i 2 objętości zimnego (temperatura -20°C) etanolu. DNA zebrano przez wirowanie (wirówka EppenOcrf) w ciągu 30 minut przy 14 000 w temperaturze 4°C. Po usunięciu ^^j^i^matantu osad DNA wysuszono stosując próżniową wirówkę Savant SpeeOvac. DNA rozpuszczono w 10 fil buforu TE i określono stężenie przez elektroforezę w żelu agaro/owym, stosując DNA lambda o znanym stężeniu jako odnośnik i barwienie bromkiem etydyny do wykrywania DNA.

Otrzymany fragment zligowano ze strawionym NsiI i XbaI wektorem pGEM7Zf(+), przygotowanym w następujący sposób: 1 μ! (1 μg/ul) pGEM-7Zf(+) zmies/ano z 2 μ l 10 x React 1 (BRL), 1 μ l (10 U/μ l) NsiI, 1 μ l (10 U/μ l) XbaI i 16 μ l jałowej wody destylowanej. DNA trawiono w ciągu 1 go0/iny w temperaturze 37°C. Wektor wyizolowano z 0,6% żelu agaro/owego j'ak opisano powyżej.

Fragment Nsil/Nbal o długości 8,5 kb zligowano z wektorem, otrzymując plazmid pIM900, według następującej procedury: 100 ng fragmentu pGEM-7Zf(+) /miei/αno z 100 mg fragmentu NsiI/XbaI o długości 8,5 kb i 4 μ l 5 x buforu do

170 943 ligaj (skład: 500 mM Tris-HCl (pH 7,6); 100 mM MgCh; 10 mM ATP; 10 mM ditiotreitol; 25% PEG-6000) i do mieszαnins tej dydany 1 μΐ (1,2 U/ul) lig-zy DNA T4 (BRL) do objętości końcowej 20 /ii. Po inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę aozcieńczyny do 100 fil jałową wodą. 10 pl rozcicńczynej mieszaniny zastosowano do strrniformowanir kompetentnych komórek E. coli JM101 (Yanish-Perron i in. (1985) Gene, 33, 103), przygotowanych metodą CM1, CM2, jak opisano w instrukcji Pharmacia do układu do klo^^wanLir^/sek^^^cjj^^^^^a M13. Wybranych sześć z otrzymanych kolonii hodowano przez noc w podłożu LB zawierającym 100 μg^zml ampicyliny. Z hodowli wyizolowano metodę lizy alkalicznej, opisaną przez M-ni-tis- i in. ((1982) supra, 368), plazmidowy DNA, który zastosowano w analizie restrykcyjnej do wyselekcjonowania klonu niosącego pożądany plazmid, pIM900. Na dużą ikrlę plazmidowy DNA wyizolowano z 500 ml hodowli E. coli JM101 zawierającej pIM900. Hodowle prowadzono w podłożu LB z-wier-jącym 100 μg/ml ampicyliny ((Maniatis i in. (1982) supra, 86). Plazmid oczyszczono przez wirowanie w gradiencie CsCl, ekstrahowano fenolem, wytrącono etanolem i rozpuszczono w 400 μ l TE. Otrzymano około 500 μ g.

Plazmid p!M900 analizowano dalej stosując enzymy restrykcyjne, otrzymując mrpę restrykcyjną przedstawioną na figurze 13.

Pl-zmid pIM900, zawierający gen abfA, ponownie sklonowano w E coli JM109 i zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baam, Holandia, 17 marca 1992 r., pod numerem CBS 187.92).

Przykład 13.3: Struktura piίcrwkzoaz^dywa genu abfA

Przykład 13.3.1: Analiza rekwenqi genu abfA A. niger

Sekwencję genu abfA A. niger, jego promotyrowego regionu regulacyjnego, genu struktury i regionu terminacji, określono przez zsubklonowanie fragmentów z pIM900 w M13mp18/mp19, w połączeniu z zastosowaniem specyficznych oZigonukleotsdów j-ko starterów w reakcjach sekwencjynyw-nia.

Do analizy sekwencji nuklco1ydywej wyizolowano fragmenty restrykcyjne w sposób opisany w przykładzie 13.2.4, a następnie sklonowano w DNA wektorów bakteriofagowych M13 mp18/19 RF (Messing, J. (1983) Methods in Enzymology, 101C, 20; Nyarandca i in. (1983) Gene, 26, 101), które kira^inno odpowiednimi enzymami reakcyjnymi. Sekwencje oligonukleotydowe określono według procedury terminacji łańcucha didcyksynuklcytsdami (Sanger i in. (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 74 5463) stosując zestaw do sekwencconowania z polimer-zą DNA T7 Pharmacia. Analizę komputerową przeprowadzono stosując program PC/GENE. Określoną sekwencję nukleolsdywą genu abfA przedstawiono na figurze 14 (wzór 20). Sekwencję aminokwasową bi-łk- ABF A, określoną na podstawie sekwencji cDNA abfA, przedstawiono na figurze 15 (wzór 21).

Przykład 13.3.2: Charakteryzacja genu abfA

Sekwencję obejmującą gen struktury abfA (figura 14, wzór 20) poprzedza region o długości 1246 nukleotydów. Nie stwieadzyny żadnej przypuszczalnej sekwencji typu TATA, najbardziej taką sekwencję przypomina sekwencja TTAATlT w pozycjach 1156 - 1162. Jednakże, regiony, które srą stoa-me bogate w CT, siwieedzono przed miejscem inicjacji translacji (Gurr i in. (1987) w: Gene Structure in Eukaiyotc Mfcrobes, tom 22, Kinghorn, J. R. (red.), IRL Press, Oxford, 93).

Strukturalna część genu abfA znajduje się od pyzsc]i 1247 do pozycji 3483 i zawiera siedem intronów. Intron A jest intronem przypuszczalnym, w oparciu o sekwencję konsensusu intronów grzybowych (Gurr i in. (1987) supra), pozycje sześcm innych intronów ustalyny przez iekwencjonowania fragmentu cDNA w pC1X1 i pC2X1.

Gen abfA koduje bi-łko o długości 628 aminokwasów (figura 15, wzór 21), jak określono na podstawie sekwencji cDNA abfA. N-końcową sekwencję aminokwasową, j-k ykrcślyny w przykładzie 12.1 (wzór 12), poprzedza sekwencja hydrofobowa o długości 25 aminokwasów. Sekwencję aminokw-sową określoną dl- peptydu CNBr (wzór 13) stwierdzono w sekwencji od pozycji 38 do pozycji 52. Dojrzałe bi-łko ABF A ma długość 603 aminokwasów i posiada przewidywaną masę cząsteczkową 65 378 Da, - teoretyczny

170 943 punkt izoelektryczny 3,7. Przewidywana wartość masy cząsteczkowej tego enzymu różni się od wspomnianych powyżej wartości podawanych w literaturze (patrz Rombouts i in., supra oraz van der Veen i in., supra). Najprawdopodobniej jest to spowodowane tym, że oznaczeń literaturowych dokonano dla zglikozylowanego białka, podczas gdy przewidywana masa cząsteczkowa białka ABF A stwierdzona w niniej'szym przykładzie oparta jest na białku całkowicie niezglikozylowanym.

Przykład 14. Ekspresja sklonowanego genu abjA w A. niger i A. nidulans

Przykład 14.1: Wprowadzanie genu abjA do A. niger N593 i A. niduians G191 przez koZransformację

Plazmid pIM900 wprowadzono do A. niger przez kotransformację A.niger N593 z zastosowaniem genu pyrA A. niger, położonego w plazmidzie pGW613 (Goosen i in. (1987) supra), jako markera selekcyjnego, i plazmidu pIM900 jako plazmidu kotransformującego. Analogicznie, stosując wspomniane powyżej plazmidy, wprowadzono gen do A. nidulans G191 (Balance i Turner (1985) Gene, 36, 321).

Protoplasty obu szczepów przygotowano z grzybni otrzymanej po wzroście w ciągu 20 god:zin w temperaturze 30^OC na podłożu minimalnym wzbogaconym o 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,2% hydrolizat kazeiny, 50 mM glukozę i 10 mM urydynę. Przygotowywanie protoplastów i procedurę transformacji przeprowadzono jak opisali Goosen i in. ((1987) supra), stosując 3 μ g pGW613 i 50 μ g pIM900.

Otrzymane transformanty PYR+ analizowano pod kątem ekspresji genu a&fA przez SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie Brilliant Blue R250 lub analizę biotu Western i przez pomiar aktywności w przesączu hodowlanym.

Przykład 14.2: Przesziufciwanie transformantów pod kątem ekspresji genu abfA

Transformanty otrzymane w przykładzie 14.1 analizowano pod kątem ekspresji produktu genu abfA, białka ABF A. Wyselekcjonowano cztery transformanty każdego szczepu i hodowano je na podłożu minimalnym zawierającym 1 % miazgę buraka cukrowego jako jedyne źródło węgla, wzbogaconym o 0,1% ekstrakt drożdżowy. Po 24 godzinach wzrostu w temperaturze 30^OC grzybnię usunięto przez sączenie i mierzono aktywność rrabinofuranozydrzy w przesączu hodowlanym stosując para-nltrofenylo-α-L·arabinofuranozyd (PNA), jak opisali van der Veen i in. ((1991) supra). Ponadto, przesącz hodowlany analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS (Laemmli, U. K. (1970) Nature, 220. 680), stosując żel zawierający 10% akryłamid, a następnie barwienie Coomassie Brilliant Blue R250 (w przypadku transformantów A. nidulans·) i blotting Western (w przypadku transformantów A. niger). Białko ABF A wykrywano na nitrocelulozie po elektroblottingu i inkubacji z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw białku ABF A, które oczyszczono jak opisano w przykładzie 12.1. Związane przeciwciała wykrywano po inkubacji z kozim przeciwciałem skierowanym przeciw immunoglobulinom myszy skoniugowanym z alkaliczną fosfatazą, zgodnie z instrukcją Biorad.

Wszystkie cztery analizowane transformanty obu szczepów wykazywały zwiększone wytwarzanie białka ABF A, jak stwierdzono przez barwienie Coomassie Brillant Blue (figura 16A) lub blotting Western (figura 1óB). Ponadto, w przesączach hodowlanych obu szczepów stwierdzono podwyższony poziom aktywności (tabela 4 i tabela 5).

170 943

Tabela 4

Aktywność hndIΌlizk-ąca PNA w podłożu hodowlanym Asp^jg'i'/us nidu/ans typu dziOIegoWGO96 (Uitzetter, J. H. A. A. (1982)

Studies on carbon metabolism in wild type and mutants ofAspeag7/us nidulans, praca doktorska, Wageningen Agaickltkaal Univeosity, Wageningen, Holandia) i transformantów abfA po 24 godzinach wzrostu na miazdze buraka cukrowego jako źródle węgla.

Szczep	Aktywność (U/ml podłoża hodowlanego)
WG096	0,16
G191:: pIMS00-1	1,34
G191:: p'IM9M-2	2,64
G191:: pIM900-3	2,13
G191:: pIM900-4	2,63

Tabela 5

Aktywność hndroli/k-ąca PNA w podłożu hodowlanym Afpeαg7/us niger typu dzikiego N402 i transformantów abfA po 24 godzinach wzrostu na miazdze buraka cukrowego jako źródle węgla..

Szczep	Aktywność (U/ml podłoża hodowlanego)
N402	0,35
N593:: pIM900-1	2,48
G593:: pIM900-2	1,25
G593:: pIM900-3	1,99
G593:: pIM90)0-4	1,79

Przykład 15. Klonowanie mclekklaαre genu endolί^nc/nc/ 1,5-α-I--aaai)inanazn (abnA) As'peαg^ίluf· niger

Przykład 15.1: Konftαkowanie biblioteki eOcfpaef^nnej cDNA

Przy kład 15.1.1: indukcja i izolowanie mRNA

A. niger N572 hodowano wstępnie w ciągu 24 godzin na podłożu minimalnym, zawierającym 1 % glukozę jako źródło węgla, i wzbogaconym o 0,1 % ekstrakt drożdżowy i 1 mg/litr amidu kwasu nikotynowego, po czym grzybnię zebrano przez sączenie i przemyto jałową wodą. Grzybnię podzielono następnie na osiem różnych części i każdą część przeniesiono następnie do 250 ml kolby Eαlenmenera zawierającej 50 ml podłoża minimalnego z 1% arabitolem. Hodowle te inkubowano następnie w temperaturze 30°C w ciągu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 godzin. W każdym punkcie czasowym grzybnię zbierano, przemywano zimną solą fizjologiczną, zamrażano stosując ciekły azot i przechowywano w temperaturze -70°C. Wzory indukcji endolitycznej 1,5-α --Lgi·abinana/n A (ABN A) i ABF B badano przez analizę biotów Western 50--kOtnie zatężonych próbek hodowli w każdym z pobranych punktów czasowych. ABF B była obecna w podłożu hodowlanym i godzinę po pα/eni'efienlk, podczas gdy ABN A stwierdzono po 2 godzinach (figura 17).

Z grzybni zebranej w punktach czasowych 1, 2, 3, 4, 5 i 6 godzin inkubacji wyizolowano RNA w sposób opisany w przykładzie 13.1.1.

P r z y k 1 a d 15.1.2: Konstruowanie i immunochemiczne pzzefZk0ίWίini'e biblioteki eOypae.5fnneι cDNA

Połowę RNA z każdego punktu czasowego połączono i połączone próbki RNA zastosowano do ^^^ezy cDNA i skonstruowania biblioteki ekspresyjnej, jak opisano w pα/n0ład/ie 13.1.2. Po ligacji cDNA z wektorem, a następnie upakowaniu DNA otrzymano pierwotną bibliotekę 3 x 10⁴ fagów. Bibliotekę tę /αmpliίI0owanc i pα/efzu0aro stosując przeciwciała skierowano przeciw ABN A (van der Veen i in. (1991) supra) jak opisano w przykładzie 13.1.2. W wyniku przeszukania 5 x 104 fagów wyizolowano

170 943 pojedynczy dodatni klon. Długość wstawki cDNA określono przez strawienie EcoRI/XhoI i następnie elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment cDNA ma długość 700 bp.

Przykład 15.2: Przeszukiwanie biblioteki genomowej A. niger nn/7 lentem otwu pnzłriliturmpi 7 ^-ζύ-Ζ -nrnhinfliinTM „„j -A-r -U- -j (abnA) i izolowanie genu

Stosując fragment Kpnl o długości 550 bp (który otrzymano z cDNA opisanego w przykładzie 15.1.2. i wyizolowano i wyznakowano jak opisano w przykładzie 13.2.1), bibliotekę genomową A. niger N400 przeszukano pod kątem genu abnA, jak opisano w przykładzie 13.2.1. W wyniku przeszukania 6 x 10⁴ fagów wyizolowano sześć hybrydyzujących fagów. Fagi te oczyszczono jak opisano w przykładzie 13.2.1, po czym z każdego z fagów wyizolowano DNA, jak opisano w przykładzie 13.2.2. Otrzymany DNA zastosowano do analizy restrykcyjnej, jak opisano w przykładzie 13.2.3, w wyniku czego otrzymano częściową mapę restrykcyjną. Wykorzystując tę mapę restrykcyjną, do subklonowania genu abnA w wektorze pEMBL19, jak opisano w przykładzie 13.2.4, wybrano fragment HindIII o długości 3,1 kb, w wyniku czego otrzymano pIM950. Plazmid ten analizowano dalej stosując enzymy restrykcyjne, otrzymując mapę restrykcyjną przedstawioną na figurze 18.

Plazmid pIM950, zawierający abnA, ponownie sklonowano w E. coli JM109 i zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmcljułturcs (Baam, Holandia, 17 marca 1992 r., pod numerem CBS 188.92).

Przykład 15.3: Przeszukiwanie klonów cDNA hybr^<dy^^zują^ch z 5’--wicem genu abfB i genu abnA

Opisaną w przykładzie 15.1.1 i 15.1.2 bibliotekę cDNA przeszukano stosując fragmenty znakowane P . Jako sondę genu abfB zastosowano fragment EcoRI/SaiI o długości około 550 bp z plazmidu pGBabfBl. Jako sondę genu abnA zastosowano fragment SphI/BamHi o długości około 300 bp z plazmidu pIM950. Bibliotekę cDNA wysiano i przeszukano znakowanym fragmentami jak opisano w przykładzie 13.2.1. W wy^iiku przeszukania 104 fagów wyizolowano 36 fagów hybrydyz ujących z fragmentem abnA i 8 fagów hybrydyzujących z fragmentem abfB. Dla obu genów oczyszczono trzy fagi, plazmidy wydęto i wyizolowano jak opisano w przykładzie 13.1.2. Zsekwencjonowanie ό^οηο^ tych fragmentów cDNA wykazało identyczne końce 5’ wszystkich trzech klonów zarówno genu abfB, jak również genu abnA. cDNA genu abfB zaczyna się w pozycji 120 (figura 5, wzór 4), a cDNA genu abnA zaczyna się w pozycji 1163 (figura 19, wzór 22).

Przykład 15.4: Pierwszorzędowa struktura genu abnA

Przykład 15.4.1: Analiza sekwencj genu abnA

Sekwencję genu abnA A. niger, jego promotorowego regionu regulacyjnego, genu struktury i regionu terminacji, określono przez subklonowanie fragmentów pIM950 w wektorach M13mpl8/mpł9, pGEM-7Zf(+) i pBluescript, w połączeniu z zastosowaniem specyficznych oligonukleotydów jako starterów reakcji sekwencjonowania.

Do analizy sekwencji nukleotydowej wyizolowano fragmenty restrykcyjne, jak opisano w przykładzie 13.2.4, a następnie sklonowano w bakteriofagowych wektorach DNA M13 mpl8/19 RF (Messing (1983) supra; Norrander i in. (1983) supra), strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Sekwencje nukleotydowe określono zgodnie z procedurą teaminacjl łańcuchów dideoksynukleotydami (Sanger i in. (1977) supra) stosując zestaw do sekwenqonowania z polimerazą DNA T7 Pharmacia. Analizę komputerową przeprowadzono stosując program PC/GENE. Określoną sekwencję nukleoiydową przedstawiono na figurze 19 (wzór 22).

Przykład 15.4.2: Charakteryzacja genu abnA

Sekwencję obejmującą gen struktury abnA (figura 19, wzór 22) poprzedza region o długości 1177 nukleotydów, posiadający przypuszczalną sekwencję typu TATA w pozycjach 1106 - 1113.

Strukturalna część genu abnA położona jest od pozycji 1178 do pozycji 2378 i zawiera trzy introny. Pozycję intronów ustalono przez zsck'wenqjonowallie fragmentu

170 943 cDNA otrzymanego w przykładzie 4.3. Introny te stwierdzono w pozycjach 1445 do 1494. 1972 do 2030 i 2117 do 2167.

Gen abnA koduje białko o długości 346 aminokwasów. posiadające masę cząsteczkową 37 184 Da (figura 20. wzór 23) prze-wdzianą na podstawie sekwencji cDNA abnA. Sekwencję N-końcową. określoną w przykładzie 12.3 (wzór 18). poprzedza hydrofobowa sekwencja o długości 19 aminokwasów. Sekwencję aminokwasową określoną dla peptydu CNBr (przykład 12.3. wzór 19) stwierdzono od pozycji 106 do pozycji 125 sekwencji aminokwasowej. Dojrzałe białko ma długość 327 aminokwasów i posiada przewidywaną masę cząsteczkową 35 204 i teoretyczny punkt izoelektryczny 3₅6.

Przykład 16. Ekspresja sklonowanego genu abnA w A. niger i A. niduians

Przykład 16.1: Wprowadzanie genu abnA w A. niger N593 i A. nidulans WG191 przez ko/rans/'oamacJ'e

Plazmid pIM950 wprowadzono do A. niger przez kotransformację A. niger N593 z zastosowaniem genu pyrA A. niger. położonego w plazmidzie pGW61.3 (Goosen i in. (1989) supra) jako markera selekcyjnego i plazmidu pIM950 j'ako plazmidu kotaansformującego. Analogicznie. stosując wspomniane powyżej plazmidy. gen wprowadzono do A. niduians G191. Transformację obu szczepów przeprowadzono jak opisano w przykładzie 14.1.

Przykład 16.2: Przeszukiwanie tran^ormantów pod kątem ekspresji.

genu abnA

Tarnsfoamrnty otrzymane w przykładzie 16.1 analizowano pod kątem ekspresji produktu genu abnA. białka ABN A. Wyselekcjonowano transformanty A. niduZans i czternaście tran^fomantów A. niger i hodowano je na podłożu minimalnym zawierającym 1% miazgę buraka cukrowego jako jedyne źródło węgla. Po 24 godzinach wzrostu A. niduZans w temperaturze 37°C i A. niger w temperaturze 30°C. grzybnię usuwano przez sączenie i w przesączach hodowlanych mierzono aktywność endolitycznej 1.5-α-Larabinanazy stosując tabletki ArabinaZyme (Megazyme Pty. Ltd.. North Rocks. Nowa Południowa Walia. Australia) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyniki dla obu szczepów podsumowano w tabeli 6 i tabeli 7.

Tabela 6

Aktywność endolitycznej 3,5-α-L-arabinanazy w podłożu hodowlanym Aspergillus niduians typu dzikiego i taansformantów abnA po 24 godzinach wzrostu na miazdze buraka cukrowego jako źródle węgla.

Szczep	Aktywność (U/ml podłoża hodowlanego)
G191:: pGW635	0.31
G191:: pIM950-1	0.83
G191:: pIM950-2	0.83
G191:: pIM950-6	0.79
G191:: pIM950-7	1.88
G191:: pIM950-11	1.17
G191:: pIM950-12	0.70
G191:: pIM950-16	0.70
G191:: pIM950-17	2.34
G191:: pIM950-18	1.18
G191:: pIM950-20	2.26

170 943

Tabela 7

Aktywność enOclitycznej 1,5-αw podłożu hodowlanym AsperągY/us niger typu dzikiego i transformantów abnA po 24 godzinach wzrostu na miazdze buraka cukrowego jako źrÓdle węgla.

Szczep	Aktywność (U/ml podłoża hodowlanego)
N402	0,17
N593 :: pIM950-1	0,91
G593:: pIM950-2	0,35
G593:: pIM950-3	0,25
G593:: pIM950-4	1,13
G593 :: pIM950-5	1,23
G593 :: pIM950-6	0,28
G593:: pIM950-7	1,13
G593:: pIM950-8	1,31
G593 :: pIM950-9	1,09
G593:: pIMlŁ9f^0-10	0,22
G593:: pIM950-11	1,23
G593:: pIM950-12	0,28
G593:: pIM950-13	0,32
G593:: plM950-14	0,91

Przesącze hodowlane analizowano ponadto przez blotting Western w sposób opisany w przykładzie 14.2 (figura 21 A i B - transformanty A. nidu/ans; figura 22 A i B - taansfoamanty A. nzger).

Przykład 17. Charakteryzacja genu abfB

Sekwencję obejmującą gen strukturalny abfB (figura 5, w/óa 4), stwierdzoną we fragmencie SacI o długości 2,8 kb (patrz przykład 7), popa/edzd region o długości 166 nukleotydów. Pr/ypus/czalna sekwencja typu TATA rozciąga się od pozycji 54 do pozycji 60.

Strukturalna część genu abfB położona jest od pozycji 167 do pozycji 1666 i nie zawiera intronów, jak określono przez ziekwencjonowαnie fragmentu cDNA otrzymanego w przykładzie 15.3.

Gen abfB koduje białko o długości 499 aminokwasów posiadające pa/ew'iOywaną masę cząsteczkową 52 523 Da (figura 6, wzór 5) jak określono na podstawie sekwencji genu abfB i potwierdzono przez sekwencję cDNA abfB. N-końcową sekwencję aminokwasową, jak określono w przykładzie 12.2 ('^^^^ór 14), popr/edza sekwencja hydrofobowa o długości 18 aminokwasów. Sekwencje aminokwasowe określone dla peptydów CNBr (wzory 15, 16 i 17) stwierdzono w sekwencji odpowiednio od pozycji aminokwasowej 203 do pozycji 219, 267 do 286 i 294 do 312. Dojrzałe białko ABF B ma długość 481 aminokwasów, pr/ewiOywaną masę cząsteczkową 50 663 Da i teoretyy/ny punkt izoelektryczny 3,8. Przewidywana wartość masy cząsteczkowej enzymu ABF B różni się, jak wspomniano powyżej, od podawanej w literaturze (patrz Rombouts i in., supra, oraz van der Veen i in., supin). Najprawdopodobniej spowodowane jest to tym, że c/naczenia literaturowe wykonano na białku /gliko/ylowdnym, podczas gdy przewidywana masa cząsteczkowa stwierdzona w niniejszym przykładzie opiera się na białku całkowicie niezglikozylowanym.

Przykład 18. Aktywność ć’nzynaZy<yzla ABF B wobec /awieaającyyh aaabinczy^;0 ekstraktów gZiko/yUowyc/z otrzymanych z winogron

Ekstrakt gliko/y0owy otrzymano przez ekstrakcję moszczu winogron odmiany Muscat de Frontignan zgodnie z metodą opisaną przez Gunata i in. ((1989) supra).

170 943

Protokół doświadczalny enzymatycznej hydrolizy ekstraktu glikozydowego z zastosowaniem enzymu ABF B był taki, jak opisali Gunata i in. ((1989) supaa).

Do 200 μ l ekstraktu glikozydowego dodano 50 μΐ (0,15 nkat, jak określono zgodnie z metodą opisaną przez Gunata i in. ((1989) izy (ABF B)

TłUlU ΙΛ⁼ΙΑ.Α i inkubowano w ciągu 16 godzin w temperaturze 40^oC, pH 4,4. Roztwór ekstrahowano następnie 5 x 250 μΐ pentanu. Hydrolizę monitorowano przez chromatografię cienkowarstwową i gazową.

Następnie, do roztworu dodano 50 μΐ (0,15 nkat, jak określono zgodnie z metodą opisaną przez Gunata (1989) supra) roztworu β-glukozydbzy. Otrzymany w ten sposób roztwór ponownie inkubowano w ciągu 16 godzin w temperaturze 40°C, pH 4,4, i ekstrahowano 5 x 250 μ l pentanu. Hydrolizę monitorowano przez chromatografię cienkowarstwową i gazową.

Otrzymane wyniki wykazały, że enzym ABF B był zdolny do hydrolizowrnia 70% glukozydu arabinozylowego z ekstraktu ...glikozydowego.

Przykład 19. Prawienie in nitro miazgi buraka cukrowego β-aL-grokkanirzą i/lub α-aLarabinoO^:uranozy<—rzą

W układzie modelowym symulującym warunki wyssępujące w żołądku i jelicie cienkim świni, miazgę buraka cukrowego inkubowano odpowiednio z a-L-arabmofuranozydazą (ABF B), β-L-aaiabtanazą i mieszaniną obu enzymów.

Miazgę buraka cukrowego inkubowano najpierw w ciągu trzech godzin w pH 3,0 i temperaturze 39°C (warunki w żołądku świni). Następnie, miazgę inkubowano przez dodatkowe trzy godziny w pH 6,5 i temperaturze 39°C (warunki w jelicie cienkim świni).

Po enzymatycznej inkubacji mierzono różnicę pomiędzy początkową suchą masą a masą nierozpuszczalnych pozostałości po hydrolizie enzymatycznej (substancję suszono w ciągu 24 godzin w temperaturze 103 ^dC). Tę różnicę suchej masy uważano względną miarą trawienia in vitro miazgi buraka cukrowego. Wyniki doświadczeń podsumowano w tabeli 8.

Tabela 8

Procent trawienia wyrażony jako sucha masa miazgi buraka cukrowego po enzymatycznej inkubacji w warunkach żołądka i jelita cienkiego świni

	% strawienia
Kontrola	15,9
«-Ηηηίπηοΐΐηαηοζ'—αζι (ABF B)	15,8
β-L-aaiaktanaza	16,0
α-L-arabmofurbrozydbza (ABF) plus β-L-aaiaktanaza	24,8

Podobne wyniki otrzymano dla otrębów pszenicznych.

Chociaż niniejszy wynalazek opisano w odniesieniu do jego szczegółowych rozwiązań, powinno być zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, że można dokonać różnych zmian i wprowadzać równoważne rozwiązania bez odchodzenia od ducha i zakresu wynalazku. Ponadto, można dokonać adaptacji określonych sytuacji, materiału, procesu i etapu lub etapów procesu do przedmiotu, ducha i zakresu wynalazku. Zamiarem jest, aby wszystkie takie modyfikacje pozostawały w zakresie dołączonych tu zastrzeżeń.

170 943

170 943

Schematyczny diagram procedury oczyszczania w celu otrzyma ma enzymu α-L-aΓaa^lnofkαano/nda/n (egzo B) z A. niger

Figura 1

170 943 g

cd

N o

W 0)

0) «Ρ ε

td 13
•fc	E-<
o	-s
σ
+j
o
<u	O
	Ό
X
			co
£	P,
	w		<
cd	<		1
			rd
o			lf> «—<
C	4·		<
<u			1
			«-Η
X	•o		cd
CD	«		>
Vł	<4		i
	£		td
	X		cd
	o		X
G	G		i
<u	H		o
te	ε		£
-«H	(0		ft			Λ1
c	CD		1			(4
	M		3			Ρ
<	£					Ρ
	(ϋ		i			ae
w	+>		ft	z—\		Ή
	V)		o w	’-”'		b.
o	Ό		<	P
N	O		I	Ό
te	0.		s
CD
	rd		σ		*
i	£		I cd		ro !
>.	£				O
N	o		<		E-<
G	S		1		< C5
<U	G		G		E-t
	rd
(4	ε		o		< σ
υ	R		1		<c
•c	N		£		E-t
o	£		>n		< σ
X	-P		Et		υ
1	o		i		Ε-ι
Z			Φ		5-ι O
	o		in —i		O
(β			ł—1		σ
*	c-		l		Μ
O			ft		υ
«	m				υ
<4	<		<		H
*			ł		υ
s;	*		cd		Η
o	•o		cd		< ο
G	•o		X		En
			I		Ο
e	-P		O		►Μ
(3	o		£		1
	V		ft		%
nj		•P	1		ΙΓ>
	*		is
o	3	υ	wH »—«		..
G	G	c	U		α
0)	o	<D			*-<
*	ae	*			b-
Λ4	»H	X			*Μ
<u		0			ft
W	O	W			<

170 943

Φ ·»» υ

c φ

* χ

φ

Ο

Ν υο φ

Φ

X <*κ

Φ •w

Λ

Φ

Q

X ΐί>

υ ο

«Μ *d (Ο ο

w φ

£

X ο

G

Ή ε

« (U

Ή

Φ «Ρ

TJ ο

α φ

G

G υ

ί*

G

Φ <

►. <—( ο ι

C <

i

Φ

ΙΩ Φ X 1

Φ

Φ

X ι

Ρ, <

I +>

Ο

Ο ι

	<0		><	Ό
u	o			N
m	fO		O
z	CU		ł	*—'
o	«		Φ
	<		O
			w4 ·—<
♦>	£		1
c	•o		S
<u	T3		^4
ε	ifi		σ
06	-fi		1
Cfl	o		0		ro
fi	(U		Φ		1
Ή	1—4 v*		U
	3		Φ		$	σ
m	fi				h
υ	o		h-ł		<
fi	06		1		<2	σ
o	Ή		Φ		σ
X					<
1	o		h-1		n
Z		Ή	1		O
	>7	·*“>	Φ		O
Ifl	fi	υ	ΐΩ «-Η		t~<
•i		G	<		H
o	c	Φ	f		<
w	Φ		Φ		i	o
(0	N	X	Φ		O
*	0	Φ	X		o
	Φ	0	1		l-t
o	Ή		3		υ
c:	ε	*>	r4		o
—H		Φ	σ		I-I
β		«Ρ	l		O
Φ	nt		0		E<
	S		X
	o		u		V
Φ	X}	0	1		ΙΩ
		<	Φ
O	-t->		»4 (0		..
G	o		X		<0
Φ	0	ro			O
>	r-t	ττΗ			fO
X					CU
Φ		O			m
W	fi	Ό			<

ΓΟ

Φ

G

Ρ

-»-Η

ΰ.

170 943

Częściowa mapa restrykcyjna bybrydyzującego klonu fagowego

7. Fragment hybrydyzujący z mieszaniną oligonukleotydów

AB1719 wskazano grubą linią.

BamHI

Smal

EcoR? HindlJE Bglll

SacI Smal KpnI tXhoI

SacI — HindIII _ EcoR?

- BgIJI

Figura 4

170 943

FIGURA 5 (1 strona z 3) (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2753 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ni) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ZRODŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Aspergillus niger (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 161...1660 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE: /Kodon_start - 161/produkt = alfa-L-arabinofuranozydaza B^M/dowód = DOS WIADCZALNY/gen z egzoB (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd (B) LOKALIZACJA: 161...214 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptyd (B) LOKALIZACJA: 215...1660 (wzór 4)

GAGCTCGATC	TTGCATTTCA	TGCATAGGCA	CTGACTGCAG	TAAAGAATAT	AAATAAGCCT	60
CCCTTCGCAC	CCTAGTAGCA	TGATTTCTTT	CTCCAAGCGG	CCTATCTCAC	TGTCTCCTCT	120
CCTAGCCCAG	AACTTACTGA	GCAGGCAGTA	ATCCTCCACC	ATGTTCTCCC	GCCGAAACCT	180
CGTCGCCCTA	GGGCTGGCAG	CCACCGTCAG	CGCCGGCCCC	TGTGACATCT	ACGAAGCCGG	240
CGACACGCCC	TGCGTAGCCG	CGCACAGCAC	CACCCGCGCC	CTATACAGCT	CCTTCAGCGG	300
CGCCCTCTAC	CAGCTCCAAC	GTGGCTCCGA	CGACACCACC	ACCACCATCT	CCCCGCTCAC	360
AGCCGGCGGC	GTCGCCGACG	CCTCCGCCCA	AGACACCTTC	TGTGCCAACA	CCACCTGCTT	420
GATCACCATC	ATCTACGACC	AATCCGGCAA	CGGCAACCAC	CTGACCCAAG	CACCCCCGGG	480
AGGCTTCGAC	GGCCCCGACG	TCGACGGCTA	CGACAACCTC	GCCAGCGCCA	TCGGCGCCCC	540
CGTCACCCTC	AATGGCCAAA	AGGCCTACGG	CGTGTTCATG	TCCCCCGGCA	CGGGCTACCG	600

170 943

FIGURA 5 (2 strona z 3)

TAACAACGAA	GCCACCGGCA	CCGCCACCGG	CGACGAACCC	GAAGGCATGT	ACGCCGTCCT	660
GGACGGCACG	CACTACAACG	ACGCCTGCTG	CTTCGACTAC	GGCAACGCCG	AGACCAGCAG	720
CACCGACACT	GGCGCCGGCC	ACATGGAGGC	CATCTACCTC	GGGAACAGCA	CCACCTGGGG	780
CTACGGCGCC	GGTGACGGGC	CCTGGATCAT	GGTCGATATG	GAGAACAACC	TCTTCTCCGG	840
TGCTGATGAG	GGATATAACT	CCGGAGATCC	CTCGATCAGC	TACAGCTTTG	tcactgccgC	900
GGTCAAGGGC	GGGGCTGATA	AGTGGGCTAT	TCGCGGTGGT	AATGCTGCCT	CTGGGTCCCT	960
CTCTACTTAC	TACAGCGGCG	CTCGCCCGGA	TTACTCCGGC	TATAACCCCA	TGAGCAAGGA	1020
GGGCGCTATC	ATCCTGGGTA	TCGGCGGTGA	CAACAGCAAC	GGCGCCCAGG	GTACCTTCTA	1080
CGAGGGTGTC	ATGACCTCCG	GCTACCCGTC	GGACGATGTC	GAGAACTCCG	TCCAGGAGAA	1140
CATCGTGGCT	GCGAAATACG	TCTCCGGCTC	GCTGGTCAGC	GGCCCGTCGT	TCACCTCCGG	1200
AGAGGTGGTC	TCGCTGCGTG	TCACTACCCC	CGGTTACACG	ACGCGGTATA	TTGCGCACAC	1260
TGACACCACT	GTGAACACGC	AGGTCGTGGA	CGACGATAGT	TCCACCACGC	TGAAGGAGGA	1320
GGCTAGCTGG	ACCGTGGTGA	CAGGTCTGGC	TAATAGTCAG	TGCTTCTCGT	TCGAGTCGGT	1380
TGATACCCCT	GGTAGCTATA	TCCGGCATTA	CAACTTTGAG	TTGCTGCTTA	ATGCCAACGA	1440
TGGCACGAAG	CAGTTCCATG	AGGATGCTAC	TTTCTGTCCT	CAGGCGCCGT	TGAATGGAGA	1500
AGGTACTTCG	TTGAGATCGT	GGAGTTATCC	GACCAGGTAT	TTCAGGCATT	ATGAGAATGT	1560
CCTGTATGCT	GCTAGTAATG	GTGGTGTGCA	GACGTTTGAT	TCCAAGACGT	CGTTTAATAA	1620
TGATGTTAGC	TTTGAGATTG	AGACGGCGTT	TGCTTCGTAA	GGGGGGAATT	GGGGGTTGTT	1680

170 943

FIGURA 5 (3 strona z 3)

TGGTGGTTTG	GGTGTGGGGT	TGTATCTGCC	TGTGTTGGCG	GGGAGAGTGG	TTTGTAAATA	1740
GGTCATTTTT	GGTATATAGC	ATACGAATAC	TATACGATAG	TATACATGAT	AGTGGTTGTT	1800
TCATGTAATC	GAGAAATTAT	TCAAGGCTTG	CAATACAATA	TCTTATTACT	GTATCTCGTG	1860
GAGCATTCAC	AGACTGAACG	GCTGCACAAT	GATTCTTATG	CGGTGATATT	GACTGTGATT	1920
AGATGATATA	TTCAGGTGTG	CTATTTTTCT	TGTATTTATG	CTTCATGCGA	ATATATGTAT	1980
TTCACGACAG	ACAGAGAGGT	TAAACAAAGC	ATACTAACGA	GCGATTCAGA	TATGGCATGT	2040
ATGAATAAGA	CAAAAGTACT	GCGACACTCA	AGACCAACAC	AAACCAGTAT	ACTTCATAAC	2100
AATATATGCT	AGGCAGTACC	TCCGATTCTA	CGATGAGCTT	TACCAGAAAA	TGGATTTCTT	2160
TGTCCCTCGT	CATTCTCAAT	TTTTGGGCCT	TCCACGGCTG	CGGCAACCTG	TTGAGCAAGA	2220
CGTGTTCTCT	CGTACGGATG	GACGTTGATC	TTCTTCTCGA	GCAGGTCCAA	TTGCTCTTTC	2280
TCCAAATGGC	GGACTCTGAC	CTCACCGGAG	GAATCACTCG	GCAAGCATAT	CTGGTAAGTC	2340
GCTGAAAATT	TCTTCTCGAA	ACTGGCGTAG	CTTGGTGGCC	ACTGCGGGAA	GCGTCGGAAG	2400
TATTTGCCTG	TCCAGACGGT	CAATATGAAT	GAGTCGGATA	CTTCAATGCC	CGCCTGCCTT	2460
CTACGGTCGA	AGAAATGCTG	GCCGATGCTT	CTCACGGAGG	CATAGTTTAT	AACAGGCTTG	2520
ATGGGGTTTT	GTATGTCGAG	GAGACCTAAT	TCAAAGTGCA	TAGATAGGCT	CCTGAGATTG	2580
TGAAAACCGG	TTGCTAGTTT	GTCGAAGACG	TCGTTGGGCT	GTTGTGTGGT	TATAGTTCAG	2640
TTCATGGGAT	GTACTAAGAG	GATTCTTTGG	CTTACCCATT	GATCGTTCTC	TCTCTTGACT	2700

CCCACCTGCA GTGACTTCAG TTTGGGACAG CTAACATCGA GGTGGCTGAG CTC

2753

170 943

FIGURA 6 (1 strona z 2) (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 499 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (wzór 5)

Met Phe Ser -18

Arg Arg Asn Leu Val Ala Leu Gly Leu Ala Ala

Thr

Val

-15

-10

-5

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Asp

Ile

Tyr

Glu

Ala

Gly

Asp

Thr

Pro

Cys

Val

-1

+ 1

5

10

Ala

Ala

His

Ser

Thr

Thr

Arg

Ala

Leu

Tyr

Ser

Ser

Phe

Ser

Gly

Ala

15

20

25

30

Leu

Tyr

Gin

Leu

Gin

Arg

Gly

Ser

Asp

Asp

Thr

Thr

Thr

Thr

Ile

Ser

35

40

45

Pro

Leu

Thr

Ala

Gly

Gly

Val

Ala

Asp

Ala

Ser

Ala

Gin

Asp

Thr

Phe

50

55

60

Cys

Ala

Asn

Thr

Thr

Cys

Leu

Ile

Thr

Ile

Ile

Tyr

Asp

Gin

Ser

Gly

65

70

75

Asn

Gly

Asn

His

Leu

Thr

Gin

Ala

Pro

Pro

Gly

Gly

Phe

Asp

Gly

Pro

80

85

90

Asp

Val

Asp

Gly

Tyr

Asp

Asn

Leu

Ala

Ser

Ala

Ile

Gly

Ala

Pro

Val

95

100

105

110

Thr

Leu

Asn

Gly

Gin

Lys

Ala

Tyr

Gly

Val

Phe

Met

Ser

Pro

Gly

Thr

115

120

125

Gly

Tyr

Arg

Asn

Asn

Glu

Ala

Thr

Gly

Thr

Ala

Thr

Gly

Asp

Glu

Pro

130

135

140

Glu

Gly

Met

Tyr

Ala

Val

Leu

Asp

Gly

Thr

His

Tyr

Asn

Asp

Ala

Cys

145

150

155

Cys

Phe

Asp

Tyr

Gly

Asn

Ala

Glu

Thr

Ser

Ser

Thr

Asp

Thr

Gly

Ala

160

165

170

Gly

His

Met

Glu

Ala

Ile

Tyr

Leu

Gly

Asn

Ser

Thr

Thr

Trp

Gly

Tyr

175

180

185

190

Gly

Ala

Gly

Asp

Gly

Pro

Trp

Ile

Met

Val

Asp

Met

Glu

Asn

Asn

Leu

195

200

205

Phe

Ser

Gly

Ala

Asp

Glu

Gly

Tyr

Asn

Ser

Gly

Asp

Pro

Ser

Ile

Ser

210

215

220

170 943

FIGURA 6 (2 strona z 2)

Tyr

Ser

Phe Val Thr Ala Ala Val

Lys Gly

Gly

Ala

Asp 235

Lys

Trp Ala

225

230

Ile

Arg

Gly

Gly

Asn

Ala

Ala

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Ser

240

245

250

Gly

Ala

Arg

Pro

Asp

Tyr

Ser

Gly

Tyr

Asn

Pro

Met

Ser

Lys

Glu

Gly

255

260

265

270

Ala

Ile

Ile

Leu

Gly

Ile

Gly

Gly

Asp

Asn

Ser

Asn

Gly

Ala

Gin

Gly

275

280

285

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Val

Met

Thr

Ser

Gly

Tyr

Pro

Ser

Asp

Asp

Val

290

295

300

Glu

Asn

Ser

Val

Gin

Glu

Asn

Ile

Val

Ala

Ala

Lys

Tyr

Val

Ser

Gly

305

310

315

Ser

Leu

Val

Ser

Gly

Pro

Ser

Phe

Thr

Ser

Gly

Glu

Val

Val

Ser

Leu

320

325

330

Arg

Val

Thr

Thr

Pro

Gly

Tyr

Thr

Thr

Arg

Tyr

Ile

Ala

His

Thr

Asp

335

340

345

350

Thr

Thr

Val

Asn

Thr

Gin

Val

Val

Asp

Asp

Asp

Ser

Ser

Thr

Thr

Leu

355

360

365

Lys

Glu

Glu

Ala

Ser

Trp

Thr

Val

Val

Thr

Gly

Leu

Ala

Asn

Ser

Gin

370

375

380

Cys

Phe

Ser

Phe

Glu

Ser

Val

Asp

Thr

Pro

Gly

Ser

Tyr

Ile

Arg

His

385

390

395

Tyr

Asn

Phe

Glu

Leu

Leu

Leu

Asn

Ala

Asn

Asp

Gly

Thr

Lys

Gin

Phe

400

405

410

His

Glu

Asp

Ala

Thr

Phe

Cys

Pro

Gin

Ala

Pro

Leu

Asn

Gly

Glu

Gly

415

420

425

430

Thr

Ser

Leu

Arg

Ser

Trp

Ser

Tyr

Pro

Thr

Arg

Tyr

Phe

Arg

His

Tyr

435

440

445

Glu

Asn

Val

Leu

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Gly

Gly

Val

Gin

Thr

Phe

Asp

450

455

460

Ser

Lys

Thr

Ser

Phe

Asn

Asn

Asp

Val

Ser

Phe

Glu

Ile

Glu

Thr

Ala

465

470

475

Phe Ala Ser 480

170 943

Figura 7

170 943

Fuzja, genowa Acr

G abfB otrzymana metodą PRC

EcoRI

STARTERY ·>

——- pAB6-i

3-końcowa część : promotor AG

stosowane w \ pAGabfBI: 2796 2628

PCR 1

ATG

EcoR I

EcoRI

2796

GGC — pGBabfBl 5'-końcowa część: dojrzała abf B

GGC /

2629

Smal -<2630

PCR 2 iGGCr!'

2630

Sma I

PCR 3

Smal

Smal

18-aminokwas owa sekwencja liderowa AG trawienie

Smal wektor PTZ18R Smal trawi eni e ligaćja

Figura 8 pAGabfBI

3.4kb

170 943 wektor pBiuescript I SK(+) pAGabfBI pGBabfBl

	EcoRI	Smal
trawienie	trawienie	trawienie
	r Smal 5	r Xhol |

izolowanie

EcoRI

Xhol

0.5kb izolowanie

EcoRI SmaT Smal

Γ” Xhol Xhol izolowanie Amp ori

2.9kb

EcoRI trawienie pAGEKI KpnI EcoRI izolowanie ligaćja abfB2 pAGat

EcoRI

Xhol izolowanie wektor pBiuescript JT SK(+) trawienie trawienie

KpnI

Xhol izolowanie promotor AG ηβΕΜΑχαβαβΜηα l34kb

KpnIT

2.3kb

EcoRI EcoRI XhoT ori Amp ¹ 2.9kb Ϊ

Xhol KpnII ligacja pAGat>fB3

KpnI | promotor AG —>

Χ'ηοΤ

5.7kb %

+ t /

wektor pBiuescript SKI (+)

2.9kb

Figura 9

170 943 pGW635 pAGabfB3

pAGabfB4 12.4kb

Figura 10

170 943 trawienie

PFYT3 Hind U

Xbal pAGabfB3 trawienie

Hind U

Xbal izolowanie amdS

3.8kb Hind Ht

Xba I Xba I izolowanie ori Amp promotor AG —.

' 8.6kb KpnI

Hind <

ligacja pAGabfB5 amdS

HindH ori Amp

I 12.4kb

Xbal promotor AG

KpnI

HindUI

Figura 11

170 943 pC1 Χ1

5’ (Pstl) (EcoRI)

-Xhol

500bp I_I

Figura 12

170 943

Nsił

KpnI

KpnI

Xhol

Pstl

Pstl

Xhol

1kb

5’

Xbal

170 943

FIGURA 14 (1 strona z 5) (l) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3958 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (m) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ZRODLO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Aspergillus niger (IX) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 1247...1390 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mtron (B) LOKALIZACJA: 1391...1442 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 1443. . . 1957 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 1953. . . 2005 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2006. . . 2039 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 2090. .. 2137 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2138. ..2214 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 2215...2262 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2263, , . 2295 (IX) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 2296. . . 2346 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2347. . . 2493 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 2499. . . 2543 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2549. . . 3037 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 3038. . . 3092

170 943

FIGURA 14 (2 strona z 5) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 3093...3485 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: połączone (1247. .1390,

1443. .1957, 2006..2089, 2138. .2214, 2263..2295, 2347 2496

2549. . 3037, 3093. . 3485) (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE: /kodon_start i 1247,/produkt alfa-L-arabinofuranozydaza A/dowód : DOS WIADCZALNY/gen - egzoA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd (B) LOKALIZACJA: 1247..1321 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptyd (B) LOKALIZACJA: 1322..3485 (wzór 20)

AAGGGACTGA	CTGAACTCAG	TGAGATGTGC	CGCGAAGTAA	CTAAGCGCTG	TGCCTGCAGT	60
GAGGCGTGAT	GGAACACTGC	ATCCGATCTC	CAAGACCCCG	ATATGAACCT	TAATGACAAT	120
GGTCTAAGTT	TTTTTGTCAT	CTCGCATAGC	ACGGTAGGCG	ACTAAGTTGA	AGGATAAAGA	180
GAGCAGGATT	AGGATGGCTC	GAG AT CA AAT	TGAAAGTAAT	AGAGTAACAG	GGGAAAACTC	240
TAACAGTTGG	CTATGACGAA	GGTGGCAGCG	ACTTCCCGGA	GAGAGATTAA	GCCGGGTAGA	300
ACCAAGGGAC	GGCTGTGGCT	GGATCAGGAA	CCCAAATCTA	TTCCAGTATC	GGAGGATACT	360
CAGGGGTCCC	GCCGGGGTTT	TCCCTTGATC	GGAGAACATC	AACCACATCA	AAATGCGGAG	420
TAACGATGAG	GGGGAAGTGC	ACGGCCGACG	TCAGAGTTTC	GCTTGGGTGG	ATCTGCAATG	480
TTTAGGCGGC	CGACTAGACC	GACAGTCCAG	CACCTGCCCT	GGGAGTTCAA	GACAGTGGTT	540
TGACCATCTT	TTGAGAAGAC	TGAAATTCCC	GTAGATTCCA	TCAAGATTAT	TCATGTATCA	600
CTAGCGACTC	AGCACTGGGT	AAGCTGCACC	CACGGATTTT	CTCAGCTATC	TGAATGTATC	660
AGAGACAAAG	ATCTTCGTGG	ATGGAGGCCA	TCAACCGAGC	TTTAATGCGC	CAAACCTACT	720
GTATGACTGA	ATAATGGATG	GATCGGCATG	TCGTACGATC	GGGTAAGGGT	CCTAAAAATG	780

170 943

FIGURA 14 (3 strona z 5)

GAGGGCCGGG	GAATTCTGGG	GTTAGCCGTC	GGGATTATTT	CGGTACGACA	AACTCACTGT	840
TCACTTTGAT	CTCGGCGTGG	TTGCGGCTAA	AAAGATGACC	TTGAAGGTGG	AGCGAACAAC	900
TGGAGGTGCT	CGGAGGGACG	CGGAGAAGAG	AGGATCCAAG	ACATCGGGGC	AGGGAAGTCC	960
ATGCCGCGTG	CAGTCACGCT	TTTCCTCCCT	CTGCTCTCTT	CTCCTCCACA	TTCCACATTC	1020
CACCTCCACA	CTCCTCCACT	CTTCCTCTGG	CACCTTCCTC	TTCCTCGATT	TCTTGGCTTC	1080
TCGGTTGATT	GTCTTCGACC	TCGTTGCGAT	GACCCCACCG	CATTTTCTGC	TGCCTTGGCC	1140
TGTCTGATGC	CCCGGTTAAT	TTCACGAAAG	TCCGGTCATA	AAAGGCGTTG	TATCCTCCCT	1200
TTGCAACAAT	GACACCAGGC	TCAGCTTCCT	CCAGACAGCC	GGCAACATGG	TGGCCTTTTC	1260
AGCTCTTTCG	GGCGTCAGCG	CCGTTTCTTT	ACTACTATCC	CTCGTTCAAA	ATGCACACGG	1320
AATCTCCTTG	AAGGTCTCCA	CCCAGGGTGG	CAACTCATCC	AGCCCCATCC	TATATGGCTT	1380
CATGTTTGAG	GTAGGCCGCA	GACTAAGCAG	TAAAAGACAA	TTGGTTCTCT	GACGGTGATT	1440
AGGATATCAA	TCACTCAGGA	GATGGAGGAA	TTTATGGGCA	AATGCTGCAG	AACCCTGGCC	1500
TTCAGGGAAC	GGCGCCTAAT	CTGACTGCCT	GGGCGGCTGT	CGGTGACGCT	ACCATCGCCA	1560
TTGATGGCGA	CAGTCCATTG	ACCTCTGCCA	TCCCCAGCAC	CATCAAGCTT	AATATTGCGG	1620
ACGATGCTAC	CGGTGCGGTG	GGTCTCACCA	ATGAGGGATA	TTGGGGCATC	CCAGTCGATG	1680
GCAGCGAATT	CCATAGTTCC	TTCTGGATAA	AGGGAGA1TA	CTCCGGCGAC	ATCACCGTCC	1740
GACTGGTTGG	AAACTACACC	GGCACGGAGT	ACGGCTCTAC	CACTATCACC	CATACGTCCA	1800
CAGCAGACAA	CTTCACCCAA	GCCTCCGTCA	AGTTCCCCAC	CACCAAGGCT	CCAGATGGCA	1860

170 943

FIGURA 14 (4- strona z 5)

ACGTTTTGTA CGAGCTCACA GTTGATGGAA GCGTGGCTGC TGGCTCGTCT TTGAACTTCG 1920

GCTACTTGAC GCTTTTTGGC GAAACCTATA AGTCAAGGTT TGCTTCCCTA TACTCCGAAG 1980

AGTGAATTAG GGGCTAATTG TGTAGGGAAA ATGGCCTGAA GCCCCAGCTT GCCAATGTGT 2040

TGGATGATAT GAAAGGATCC TTCCTGAGAT TTCCCGGCGG TAACAACCTG TAAGTCTCAG 2100

CTCGCCCGGT AAGTGTATAG AAGCTCATCA GAGGTAGTGA GGGAAACAGC GCAGAAAACC 2160

GCTGGAAGTG GAACGAGACA ATCGGCGATC TTTGTGATCG TCCCGGACGT GAAGGTATGT 2220

CTCATTATTA GGATTGAAGC ATTCATCCCT GACGGTATAT AGGCACTTGG ACTTACTATA 2280

ACACCGACGG ACTGGGTAAG TAAAGGGCTA TATACAAGTA CCTAGATACT GTACTAACGC 2340

TTGTAGGCCT TCACGAATAC TTTTACTGGT GTGAGGATTT GGGGCTCGTA CCGGTGCTCG 2400

GTGTCTGGGA TGGGTTCGCT CTGGAGTCGG GTGGCAACAC CCCCCTCACG GGCGACGCAC 2460

TGACCCCTTA TATCGACGAT GTCTTGAACG AGCTCGAGGT ATGTTGAGCG GCATATCAAA 2520

TTGATAGCTG AAGCTAACCC ATTGGCAGTA CATCTTGGGT GATACGAGCA CGACCTATGG 2580

AGCGTGGCGC GCGGCAAACG GACAGGAGGA GCCGTGGAAC CTTACCATGG TCGAGATTGG 2640

CAATGAGGAC ATGCTGGGAG GCGGATGCGA GTCCTACGCG GAACGTTTCA CTGCCTTCTA 2700

TGATGCGATT CATGCTGCTT ATCCGGACCT TATCCTGATT GCCAGCACCA GCGAGGCGGA 2760

TTGCT-TGCCC GAGTCAATGC CCGAGGGTAG CTGGGTCGAC TACCACGACT ACAGCACGCC 2820

TGATGGACTG GTGGGCCAGT TCAACTACTT CGACAATTTA AACCGCTCGG TACCATACTT 2880

CATCGGCGAG TACTCGCGCT GGGAGATTGA CTGGCCCAAC ATGAAGGGAT CGGTCGCTGA 2940

170 943

FIGURA 14 (5 strona z 5)

AGCCGTCTTC ATGATCGGGT TCGAGAGGAA

GCCfTTGCTC CAGCTAATCA ACTCGACTCA

GTTTCAGGTA TGAATGAGCT AACGAGTGGT

CCGGTGACAT TTTCCTGTCG ACCAGCTACT

GTGATACAAT TAAGGAGGTG ACGTCGGACA

CGAGCGCCGG GGACTCGTAC TACGTGAAGC

TCACGGTGAG CATCCCAGGA ACGAGCACAG

CGGATGCGTA TAACTCGGAC ACCCAGACGC

CGAGCAATGG CACTTTTACC TTTAGTTTGC

ACTAGCGTTG ATTGGGGCGA GCTCGTATGG

GTGTCATGTA CTGCAGTATT TCTGATTAAC

GCTTGTATAT CCAAGGCATT TATCCAATGA

ATACTAGTCA GGAGGTAGTA GAGTGACTGA

GTTGAATGAC CCCAATTAAC AGAACCGCCT

TAIATTTCTT GTTAAAGCCC CCCAGAAACA

CAAGGCACTG GTAAGCGAAG GAGGGAAAAA

CAGCGACGTG GTGAAGATGG CGGCGTATGC

GTGGACGGTA AGTCACGACT GAGCAGCGGG

AGCCGGACCT GATCGGATAC ACGCAGTCAC

ACGTGCAGGA GATGTTCTCG CGCAACCGGG

GCGACTTCGG ACCGTTGTAC TGGGTTGCGT

TGGCCAACTA TGGCTCCGAG ACGCAAGACC

GCAAGTTGAC GGTGCTGGCG GACAGTGATC

TGGTCACGCC GAGTGAATCG ACGGTGCAGG

CGGCATGGGC GGTGGCTGTC CTGGCGGCGA

GCGGCAAGTC GAATATTATC TGCAGGTGTG

GATAGAGAGA TAGATCCATG CTATATACCT

TAGGCAACGC CaCCACACGT GGCTATGCAC

CTGCTATGTA GCGGTCGGCC GGGGATAGCA

GACTCTCCAA CGTGTACCTC TAGGTTATTT

CAACCGAAGA ATCAATGGAT GCGATGAAAA

CAAGCGGATT GGTTGGTTGT GGCCCGATGC

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

AAACGGGCGG CCTCTCCACT CGAATTGGAC AGAAGCGAAG GCCGTGCGCC GAGACGGG

3958

170 943

FIGURA 15 (1 strona z 3) (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 626 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ll) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (wzór 21)

Met Val Ala Phe Ser

Ala

Leu Ser Gly

Val Ser Ala Val Ser Leu Leu

-24

-20

-15

-10

Leu

Ser

Leu

Val

Gin

Asn

Ala

His

Gly

Ile

Ser

Leu

Lys

Val

Ser

Thr

-5

-1

+1

5

Gin

Gly

Gly

Asn

Ser

Ser

Ser

Pro

Ile

Leu

Tyr

Gly

Phe

Met

Phe

Glu

10

15

20

Asp

Ile

Asn

His

Ser

Gly

Asp

Gly

Gly

Ile

Tyr

Gly

Gin

Met

Leu

Gin

25

30

35

40

Asn

Pro

Gly

Leu

Gin

Gly

Thr

Ala

Pro

Asn

Leu

Thr

Ala

Trp

Ala

Ala

45

50

55

Val

Gly

Asp

Ala

Thr

Ile

Ala

Ile

Asp

Gly

Asp

Ser

Pro

Leu

Thr

Ser

60

65

70

Ala

Ile

Pro

Ser

Thr

Ile

Lys

Leu

Asn

Ile

Ala

Asp

Asp

Ala

Thr

Gly

75

80

85

Ala

Val

Gly

Leu

Thr

Asn

GlU

Gly

Tyr

Trp

Gly

Ile

Pro

Val

Asp

Gly

90

95

100

Ser

Glu

Phe

His

Ser

Ser

Phe

Trp

Ile

Lys

Gly

Asp

Tyr

Ser

Gly

Asp

105

110

115

120

Ile

Thr

Val

Arg

Leu

Val

Gly

Asn

Tyr

Thr Gly

Thr

Glu

. Tyr Gly Ser

125

130

135

Thr

Thr

Ile

Thr

His

Thr

Ser

Thr

Ala

Asp

Asn

Phe

Thr

Gin

Ala

Ser

140

145

150

Val

Lys

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Gly

Asn

Val

Leu

Tyr

Glu

155

160

165

Leu

Thr

Val

Asp

Gly

Ser

Val

Ala

Ala

Gly

Ser

Ser

Leu

Asn

Phe

Gly

170

175

180

Tyr

Leu

Thr

Leu

Phe

Gly

Glu

Thr

Tyr

Lys

Ser

Arg

Glu

Asn

Gly

Leu

185

190

195

200

Lys

Pro

Gin

Leu

Ala

Asn

Val

Leu

Asp

Asp

Met

Lys

Gly

Ser

Phe

Leu

205

210

215

Arg

Phe

Pro

Gly

Gly

Asn

Asn

Leu

Glu

Gly

Asn

Ser

Ala

Glu

Asn

Arg

220

225

230

170 943

FIGUra 15 (2 strony z 3)

Trp

Lys

Trp

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Asp

Leu

Cys

Asp

Arg

Pro

Gly

Arg

235

240

245

Glu

Gly

Thr

Trp

Thr

Tyr

Tyr

Asn

Thr

Asp

Gly

Leu

Gly

Leu

Kis

Glu

250

255

260

Tyr

Phe

Tyr

Trp

Cys

Glu

Asp

Leu

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Gly

Val

265

270

275

280

Trp

Asp

Gly

Phe

Ala

Leu

Glu

Ser

Gly

Gly

Asn

Thr

Pro

Leu

Thr

Gly

285

290

295

Asp

Ala

Leu

Thr

Pro

Tyr

Ile

Asp

Asp

Val

Leu

Asn

Glu

Leu

Glu

Tyr

300

305

310

Ile

Leu

Gly

Asp

Thr

Ser

Thr

Thr

Tyr

Gly

Ala

Trp

Arg

Ala

Ala

Asn

315

320

325

Gly

Gin

Glu

Glu

Pro

Trp

Asn

Leu

Thr

Met

Val

Glu

Ile

Gly

Asn

Glu

330

335

340

Asp

Met

Leu

Gly

Gly

Gly

Cys

Glu

Ser

Tyr

Ala

Glu

Arg

Phe

Thr

Ala

345

350

355

360

Phe

Tyr

Asp

Ala

Ile

His

Ala

Ala

Tyr

Pro

Asp

Leu

Ile

Leu

Ile

Ala

365

370

375

Ser

Thr

Ser

Glu

Ala

Asp

Cys

Leu

Pro

Glu

Ser

Met

Pro

Glu

Gly

Ser

380

385

390

Trp

Val

Asp

Tyr

His

Asp

Tyr

Ser

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Gly

Gin

395

400

405

Phe

Asn

Tyr

Phe

Asp

Asn

Leu

Asn

Arg

Ser

Val

Pro

Tyr

Phe

Ile

Gly

410

415

420

Glu

Tyr

Ser

Arg

Trp

Glu

Ile

Asp

Trp

Pro

Asn

Met

Lys

Gly

Ser

Val

425

430

435

440

Ala

Glu

Ala

Val

Phe

Met

Ile

Gly

Phe

Glu

Arg

Asn

Ser

Asp

Val

Val

445

450

455

Lys

Met

Ala

Ala

Tyr

Ala

Pro

Leu

Leu

Gin

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr

Gin

460

465

470

Trp

Thr

Pro

Asp

Leu

Ile

Gly

Tyr

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Asp

Ile

Phe

475

480

485

Leu

Ser

Thr

Ser

Tyr

Tyr

Val

Gin

Glu

Met

Phe

Ser

Arg

Asn

Arg

Gly

490

495

500

Asp

Thr

Ile

Lys

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

Ser

Asp

Phe

Gly

Pro

Leu

Tyr

505

510

515

520

170 943

FIGURA 15 (3 strona z 3)

Trp	Val	Ala	Ser	Ser 525	Ala	Gly	Asp
Tyr	Gly	Ser	Glu 540	Thr	Gin	Asp	Leu
Thr	Gly	Lys 555	Leu	Thr	Val	Leu	Ala. 560
Ser	Asp 570	Thr	Gin	Thr	Leu	Val 575	Thr
Ser 585	Asn	Gly	Thr	Phe	Thr 590	Phe	Ser

Ser	Tyr 530	Tyr	Val	Lys	Leu	Ala 535	Asn
Thr 545	Val	Ser	Ile	Pro	Gly 550	Thr	Ser
Asp	Ser	Asp	Pro	Asp 565	Ala	Tyr	Asn
Pro	Ser	Glu	Ser 580	Thr	Val	Gin	Ala
Leu	Pro	Ala 595	Trp	Ala	Val	Ala	Val 600

Leu Ala Ala Asn 604

170 943

2 3 4 5 6

2 3 4 5 6

Figura 16

170 943

2345678g

Figura 17

170 943

ρΙΜ950

500 bp

5’ gen abnA

3’

Figura 18

170 943

FIGURA 19 (1 strona z 4) (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(11)	(A) DŁUGOŚĆ: 3147 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(111)	HIPOTETYCZNA: me
(IV)	ANTYSENSOWNA: nie
(VI)	ZRODLO ORYGINALNE:
(ix)	(A) ORGANIZM: Aspergillus niger CECHA:
(IX)	(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 1178...1444 CECHA:
(IX)	(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 1445. . . 1494 CECHA:
(ix)	(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 1495...1971 CECHA:
(ix)	(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 1972. .. 2030 CECHA:
(IX)	(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2031...2116 CECHA:
(ix)	(A) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 2117, ..2157 CECHA:
(ix)	(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 2168...2378 CECHA:
1495. .	(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: połączone (1178..1444, 1971, 2031..2116, 2168..2378)
	(C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymenta1

(D) INNE INFORMACJE: /kodon_start χ 1178/produkt χ endolityczna 1,5-alfa arabinanaza/dowód χ DOŚWIADCZALNY/ gen = abnA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: syg_peptyd (B) LOKALIZACJA: 1178..1234 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptyd (B) LOKALIZACJA: 1235. . 2378 (wzór 22)

AAGCTTGGTC GTGTCCGCGG TAGTACTACC TCCGIAGAGA CTCTCTCTGG ATCTTCTCAA AAGGGGGTTT CGTGTTCTGG TACAGACTCT TCTAGTTCTC GCTTACGGCT CCACCCATTG

120

170 943

FIGURA 19 (2 strona z 4)

CTGAAGAACC	CCACTCCTGC	TGTTTCCCAT	TTATGTTCCG	GTCTAACGAT	GGCTTCTCCA	180
CCAAGAAATG	GAAGTGTGCT	CTCCTCTCAA	AACTCTCCAA	TTCTGGTTTG	ATCGATGTGA	240
GCTTACCAAG	AAAGAGCGAA	GACTTCCATC	TTGTACTTAC	GGACCCGATT	AGCTATGCTT	300
CCTACACGTT	NAANGACGAT	NGACATATNN	TGCTACCTGT	TACTTGTCAG	ATGGTCTCTC	360
TAACGCTGGC	GGNATGTGGA	CCAGATTCTC	TTCAAAGTTA	TGCCAAGATT	CGCATGGGCC	420
AATCCTGAAA	AGCGAAAAGC	GCAAGGAGGC	GCAGCTGAGA	CAGAATCCCC	TTTCTGCGAG	480
TCACATCTCG	AGTCCCTTAA	GGCCACCGTC	GAGTGGTGGG	CGATAAACTC	CGCATATCTG	540
CCACCTGAAA	AATATCGGTC	AATACATCTA	TGGCCTAATG	AGACCAGTGG	TCAGAATACG	600
CCTAAGGCCG	GAAACTACTC	CCGCAAATTG	CTGCGACGAA	GACGAGGGGG	GCGTAGTCAT	660
AAATTTGCGT	GTCGTGTGCC	TATGATAATT	TCTTGGGGTC	CGAAGAGCAC	GCTAGGGATG	720
TCAGAACAAC	TAATGTTGCA	GGATTGGTCT	CCATCTCATC	CCTGTCACTG	ACATCATATT	780
ACTTCCTAGT	ATATCATGTT	CACCATTGTA	TAGAGAGACG	CGCCCATCGC	AACGCACGTG	840
TTGGTGAGCA	CCTCCACTAA	AAGTGTCACT	GTTGTCTACA	CACCACTCGT	TTCACGCTGA	900
TGTGCCGAAT	CATACTACAT	GCATCGGCCA	TCGGCTTATA	CCACCAGGTG	CCTCCGGAAT	960
TTTGCTGTTT	CAAAATGTTC	TTTGTAACTC	CCTGAAACGA	CCAAAGTATC	ACGGAGGTAG	1020
CTCCGGACAG	GCGGAAAACA	CAACCACTTT	GTCCACGAAT	CGACACAGTA	GTCTTCCGGT	1080
GGGTTTAGTT	GTCGCTTCAT	GATAGTATAT	ATAGTAATAG	TAGATCTGGA	TGCTTGGGAT	1140
AAGTCATCCA	GTGGTGACAG	CGCCTACCTA	AATCGTCATG	TATCAACTCC	TATCAGTTGC	1200

170 943

FIGURA 19 (5 strona z 4)

CTCGGTTCCT	CTGCTGGCCA	GCCTCGTGCA	TGGCTATGCT	GACCCCGGAG	CATGCTCGGG	1260
TGTTTGTACC	ACCCATGACC	CCGGTTTGAT	CCGGAGAGAG	TCGGACGGTA	CATACTTCCT	1320
CTTCTCTACA	GGAAACAAAA	TCTCCTACGT	CTCTGCATCA	TCCATCGAAG	GACCATGGAC	1330
CAGCGTTGGG	TCTATGCTGC	CGGATGGATC	GTCCATCGAC	CTCGATGGCA	ACGATGATCT	1440
TTGGGTAACT	ATGTCCCACT	GCAAACATGA	TTGGCCTGTC	TGACACTAGC	CCAGGCCCCG	1500
GATGTCTCCT	ATGTAGATGG	TCTCTATTAT	GTATACTACG	CTGTGTCGAC	CTTTGGATCC	1560
CAAGATTCCG	CCATCGGACT	TGCAACGTCC	GAGACGATGG	AATATGGCTC	TTGGACGGAT	1620
CATGGCTCCA	CTGGCATTGC	GTCTTCCTCA	GCCAAGATTT	ATAATGCGAT	CGACCCCAAC	1680
CTGATCTACG	CCGATGGCAC	CTACTACATC	AACTTTGGGT	CGTTCTGGGA	TGACATTTAC	1740
CAAGTCCCGA	TGAAGTCGAC	CCCAACGGCA	GCTGCCTCTT	CCTCCTACAA	TCTTGCGTAT	1800
GACCCGTCGG	GTACCCATGC	GGAGGAGGGT	TCCTATATGT	TTCAGTACGG	TGACTACTAC	1860
TACCTCTTTT	ACTCGGCAGG	TATCTGCTGT	GGATACGATA	CATCCATGCC	CGCTTCCGGA	1920
GAGGAGTATC	ATATCAAGGT	CTGCCGITCG	ACTTCGCCCA	CGGGTGATTT	CGTAAGTATA	1980
TCCGACATTT	AGAGAAAATA	CTAAGTAGGG	AAAGCTAACC	TGGTGCTAAG	GTTGACTCCG	2040
ACGGTACGGC	GTGCACGGAT	GGCGGGGGCA	CGATGGTGCT	CGAAAGCCAT	GGAGAAGTCT	2100
ATGGCCCTGG	CGGACAGTAA	GTGATTCTGC	AGCTGCCCCA	CCGATATTTA	TGCTTATCAT	2160
GTTTTAGGGG	TGTGTATGAC	GATCCCAACC	TTGGTCCGGT	TCTTTACTAC	CACTACATGA	2220
ACACCACGAT	TGGATACGCG	GATTCTGACG	CGCAGTTTGG	GTGGAACACG	ATCGACTTCT	2280

170 943

FIGURA 19 (4 strona z 4)

CTGACGGATG	GACCGGTTGT	ATAAGCATCT	TGGTTGGCGA	TGGAAATGGT	GCTGCCTACG	2340
AGAGGGTCTA	CAAGTTGTAT	ATAGGATTGC	GGCTATGAAC	TCGGCCGAGA	TATAGTTAGT	2400
TAGTAACTAC	ATAGTGGAAT	CGTTAGTCAC	TAATGCAGCC	CGCATGAGTG	CTCTGCCTGA	2460
GGCTTCAGTA	CTGTCCCTCA	ATTTCTGTTT	CTGTTTTTAG	TTTAAGCTCT	GCAGCTGCTC	2520
CCCACCCATT	CATCCACTCA	TTTGGTGAAG	ACATTCATTC	TTCCCTTCAA	CCACTCTATT	2580
AGAGCATTTC	CATCTTCTCA	CACTGATCAT	CGTAATGCAG	ATTCAAGATC	AGTTTGGATT	2640
GAGATCCCTA	CTGCATGCAC	TGTGTGCGTG	ACAGAAGCTG	GAACTGGTAC	TCGCTCGATC	2700
CGTGCAGCGC	GAGTCAGTCA	CATCCGCCCT	GCGCTTCAGA	CTAGCCTGCC	AATAGTGACT	2760
ATCACAAGGG	CCGTACTAAG	ATCGAATAAC	AGCTTTCCTA	ACAACATCGC	GTTAACGTGT	2820
TACTTTCCTC	CAGCTTACAT	TTTGCTATTG	AAGCCATATA	CGATCCCTTC	GATGCGCTCG	2880
GTTTAACTTC	TGCCACGATC	ACCCGTTCAT	CGAAGATTCT	GGGAGTCTGT	CGGTCTTCAT	2940
GCCAGCAAAG	ATCGACTCAA	ATACACACAG	TCAGCAACAT	CTGTTGCTTG	TTACGGATGG	3000
TGCCTATTAT	AATGCATGAA	TAGGGGACCA	AGCAATTCTC	CGCTGTCGGC	GATGTTGAAT	3060
TAAGGAGGGA	TAATATTTGA	TCGAATGACA	AAGGGAAGAA	TTGTGCGACA	CGAGGGAACC	3120

TTATACTTGT CTACGGCCTA GCAGCAA

3147

170 943

FIGURA 20 (i strona z 2) (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DLUGOSC: 346 aminokwasów
(B)	TYP: aminokwasowa
(C)	ILOSC NICI	: jedna
(D)	TOPOLOGIA:	1 miowa
(ii) RODZAJ	CZĄSTECZKI:	białko

(wzór 23)

Met Tyr Gin Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Pro Leu Leu Ala Ser Leu

-19

-15

-10

-5

Val

His

Gly

Tyr

Ala

Asp

Pro

Gly

Ala

Cys

Ser

Gly

Val

Cys

Thr

Thr

-1

+1

5

10

His

Asp

Pro

Gly

Leu

Ile

Arg

Arg

Glu

Ser

Asp

Gly

Thr

Tyr

Phe

Leu

15

20

25

Phe

Ser

Thr

Gly

Asn

Lys

Ile

Ser

Tyr

Val

Ser

Ala

Ser

Ser

Ile

Glu

30

35

40

45

Gly

Pro

Trp

Thr

Ser

Val

Gly

Ser

Met

Leu

Pro

Asp

Gly

Ser

Ser

Ile

50

55

60

Asp

Leu

Asp

Gly

Asn

Asp

Asp

Leu

Trp

Ala

Pro

Asp

Val

Ser

Tyr

Val

65

70

75

Asp

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Val

Tyr

Tyr

Ala

Val

Ser

Thr

Phe

Gly

Ser

Gin

80

85

90

Asp

Ser

Ala

Ile

Gly

Leu

Ala

Thr

Ser

Glu

Thr

Met

Glu

Tyr

Gly

Ser

95

100

105

Trp

Thr

Asp

His

Gly

Ser

Thr

Gly

Ile

Ala

Ser

Ser

Ser

Ala

Lys

I1&

110

115

120

125

Tyr

Asn

Ala

Ile

Asp

Pro

Asn

Leu

Ile

Tyr

Ala

Asp

Gly

Thr

Tyr

Tyr

130

135

140

Ile

Asn

Phe

Gly

Ser

Phe

Trp

Asp

Asp

Ile

Tyr

Gin

Val

Pro

Met

Lys

145

150

155

Ser

Thr

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala

Ser

Ser

Ser

Tyr

Asn

Leu

Ala

Tyr

Asp

160

165

170

Pro

Ser

Gly

Thr

His

Ala

Glu

Glu

Gly

Ser

Tyr

Met

Phe

Gin

Tyr

Gly

175

180

185

Asp

Tyr

Tyr

Tyr

Leu

Phe

Tyr

Ser

Ala

Gly

Ile

Cys

Cys

Gly

Tyr

Asp

190

195

200

205

Thr

Ser

Met

Pro

Ala

Ser

Gly

Glu

Glu

Tyr

His

Ile

Lys

Val

Cys

Arg

210

215

220

170 943

FIGURA 20 (2 strona z 2)

Ser Thr

Thr Asp

Gly Pro 255

Leu Tyr 270

Ala Gin

Cys Ile

Ser Pro 225

Gly Gly 240

Gly Gly

Tyr His

Phe Gly

Ser Ile 305

Thr Gly

Gly Thr

Gin Gly

Tyr Met 275

Trp Asn 290

Leu Val

Asp	Phe
Met	Val 245
Val 260	Tyr
Asn	Thr
Thr	Ile
Gly	Asp

Val Asp 230

Leu Giu

Asp Asp

Thr Ile

Asp Phe 295

Gly Asn 310

Ser Asp

Ser His

Pro Asn 265

Gly Tyr 280

Ser Asp

Gly Ala

Gly Thr 235

Gly Glu 250

Leu Gly

Ala Asp

Gly Trp

Ala Tyr 315

Ala Cys

Val Tyr

Pro Val

Ser Asp 285

Thr Gly 300

Glu Arg

Val Tyr Lys Leu Tyr Ile Gly Leu Arg Leu 320 325

170 943

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 21

170 943

A 12345678

Β 12345678

Figura 22

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 6.00 zł

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wzmacniania ekspresji enzymu wykazującego aktywność degradowania arabinanu, zwłaszcza enzymu z grupy arabinofuranozydaz, znamienny tym, że hoduje się mikroorganizm gospodarza stransformowany cząsteczką DNA kodującą enzym wykazujący zdolność do rozszczepiania wiązań (1->2)-α-iL-arabinozydowych, wiązań (1—3)α-L-arabinozydowych lub wiązań (1—5)-α-L-arabmozydowych albo wiązania (1—6) pomiędzy terminalną jednostką arabinofuranozylową, a pośrednią jednostką glukozylową monoterpenylo-α-L·arabinofuranozyloglukozydów, przy czym jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej:

   1) cząsteczkę DNA posiadającą sekwencję nukleotydową od pozycji 161 do 1660 na fig. 5;
2. 2) cząsteczkę DNA, która obejmuje, w następującej kolejności egzony biegnące od nukleotydów 1247 do 1390, od 1443 do 1957, od 2006 do 2089, od 2138 do 2214, od 2263 do 2295, od 2347 do 2498, od 2519 do 3037, od 3093 do 3485 na fig. 14;
3. 3) cząsteczkę DNA, która obejmuje, w następującej kolejności egzony biegnące od nukleotydów 1178 do 1444, od 1495 do 1971, od 1972 do 1930, od 2031 do 2116 i od 2168 do 2378 na fig. 19;
4. 4) cząsteczkę DNA, która jest genetycznym wariantem cząsteczek DNA wyszczególnionych w powyższych podpunktach 1-3;
5. 5) cząsteczkę DNA, która jest zdolna do hybrydyzacji z cząsteczkami zdefiniowanymi w powyższych podpunktach 1-3, a następnie odzyskuje się enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu.

   2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako cząsteczki DNA stosuje się cząsteczki pochodzące z mikroorganizmu grzybowego.

   3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako cząsteczki DNA stosuje się cząsteczki DNA pochodzące ze szczepu grzybowego Aspergillus.

   4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA możliwą do otrzymania z gatunków grzybowych wybranych z Aspergillus nlger, Aspergillus niger var. tubgeusis, Aspergllus niger vor awamori, Aspergillus aculeatis, Dichotomitus sąualenes, Corticium rafii, Penicellium chrysogenum i Rhodtorula flava.

   5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA możliwą do otrzymania z gatunków grzybowych wybranych z Aspergillus niger, Aspergillus niger var. /ubigensis lub Aspergllus niger var. awamorL

   6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA kodującą enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu dodatkowo włączoną do konstrukcji DNA zdolnej do kierowania wzmocnioną ekspresją z cząsteczką DNA kodującą enzym wykazujący aktywność degradowania arabinanu, przy czym wspomniana cząsteczka DNA jest połączona w sposób umożliwiający działanie z regionami regulacyjnymi zdolnymi do kierowania wzmocnioną ekspresją enzymu degradującego arabinan w odpowiednim gospodarzu.

   7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, w której dodatkowo regiony regulacyjne obejmują promotor połączony w sposób umożliwiający działanie ze wspomnianą cząsteczką DNA, w której promotor jest możliwy do otrzymania z następujących genów: genu grzybowej endolitycznej α-ν·!ΐ&binanazy (abnA); genu grzybowej α-L-araαinoluranozydazy A (abfA); genu grzybowej α-L-araainofuranozydazy B (abfB); genu grzybowej ksylanazy (x1nA); genu grzybowej

   170 943 fitazy; genu grzybowej syntetazy ATP; genu grzybowej podjednostki 9 (oliC); genu grzybowej izomerazy triozofosforanowej (tpi); genu grzybowej dehydrogenazy alkoholowej (adhA); genu grzybowej a-amylazy (amy); genu grzybowej amyloglukozydazy (glaA); gegn πτηζΗηινρί rnrptnomifmT) gamrKY» nbnn nrnmnwpi HplwHrnfTPngw 'iLfncfuiTlizybmwwggo (gpd); genu drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej; genu drożdżowej laktazy; genu drożdżowej kinazy 3—c^i^lFc^igice^i^anowej; genu drożdżowej izomerazy triozofosforanowej; genu bakteryjnej α-amylazy; genu bakteryjnej Spo2 i genów bakteryjnych proteaz zewnętrznokomórkowych.

   8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się cząsteczki DNA, w których dodatkowo regiony regulacyjne obejmują sekwencję lidera sekrecji, przy czym lider sekrecji jest możliwy do otrzymania z następujących genów: genu 18-aminokwasowego lidera AG grzybowej amyloglukozydazy (glaA); genu 24-aminokwasowego lidera AG grzybowej amyloglukozydazy (glaA); genu drożdżowego czynnika i genu bakteryjnego α-amylazy.

   9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się konstrukcję DNA dodatkowo włączoną do wektora.

   10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stransformowanego gospodarza będącego mikroorganizmem, zdolnym do wzmocnionej ekspresji enzymu wykazującego aktywność degradowania arabinanu, dodatkowo wybranego z następujących rodzajów Aspergz/lws, K7iyveromyces, T/rc/ioderma, Sacchmomyces i BacIZ/ns.

   11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się gospodarza będącego mikroorganizmem, dodatkowo wybranego z następujących gatunków Aspergillus niger, Aspergń7us niger var. awamzori, Aspergllws var. iubigemiii, Aspergillus acuZeaZus, AspergillMs oryzae, T7rcΛodenwr reesei, Bacillus sub/ifo, Baci/lus licheniformis, KZiyeromyces lacflj i Saccharomyces cerewsiae.