PL169972B1

PL169972B1 - Czujnik do pomiaru ilosci skladnika w roztworze PL PL

Info

Publication number: PL169972B1
Application number: PL92296491A
Authority: PL
Inventors: Michael Graetzel; David Fraser; Shaik M Zakeeruddin; Jean-Paul Randin; Erik J Frenkel
Original assignee: Asulab Sa
Priority date: 1991-02-21
Filing date: 1992-02-19
Publication date: 1996-09-30
Also published as: HU212451B; FR2673289A1; US5378628A; BG96988A; ATE147107T1; FR2673289B1; CA2080840C; DE69216319T2; EP0526602A1; FI924726A0; SK316592A3; DE69216319D1; FI924726A; JP2770250B2; JPH05506102A; HUT66200A; WO1992014836A1; CA2080840A1; EP0526602B1; AU1221992A

Abstract

1. Czujnik do pomiaru ilosci skladnika w roz- tworze, zawierajacy przynajmniej jedna elektrode po- m iaro w a i je d n a e le k tro d e p o ró w n a w c z a, odizolowane od siebie i kontaktujace sie ze wspo- mnianym roztworem, przy czym wspomniane elektro- dy zawieraja odpowiednio styki elektryczne przy- stosowane do podlaczenia do urzadzenia do obróbki sygnalu dostarczanego przez wspomniany czujnik, przy czym elektroda pomiarowa zawiera przynajmniej jeden odbierak pradu elektrycznie podlaczony do jed- nego ze styków elektrycznych, pokryty mieszanina zawierajaca przynajmniej jeden enzym utleniajaco- -redukujacy specyficzny dla wspomnianego skladnika i przynajmniej jeden czynnik, posredniczacy przeno- szacy elektrony pomiedzy wspomnianym enzymem i wspomnianym odbierakiem pradu, znam ienny tym, ze czynnik posredniczacy w mieszaninie (38) jest wybrany sposród kompleksów metalu przejsciowego z przynajmniej jednym ligandem bipirydyny, trójpiry- dyny lub fenantroliny podstawionym przez przynaj- mniej jedna grupe dostarczajaca elektrony. P L 169972 B 1 Fig. 4 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest czujnik do pomiaru ilości składnika w roztworze, przeznaczony do stosowania w urządzeniach amperometrycznych dla pomiaru stężenia wspomnianego składnika w roztworze. Czujnik ten jest w szczególności użyteczny do analizowania glukozy.

Wielu pacjentów z cukrzycą często musi mierzyć swój poziom glukozy we krwi, albo glikemię. Jeżeli wykazują stan hiperglikemii, muszą natychmiast zażyć lekarstwo dla wyregulowania swojego poziomu glukozy. Dla ułatwienia codziennego życia tych pacjentów pojawiło się na rynku wiele zminiaturyzowanych urządzeń pomiarowych glukozy, które mogą być użyte przez laików.

Proponuje się również wszczepienie pompek insulinowych diabetykom. Te pompki insulinowe mogą być dostarczane z urządzeniami do pomiaru glukozy, które mogą być również wszczepione i które jako funkcję zmierzonej glikemii dostarczają informację do pompki i ewentualnie uruchamiają ją.

Większość tych urządzeń do pomiaru glikemii używa enzymu specyficznego dla glukozy - oksydazy glukozowej (GOD).

Enzym GOD jest flawoproteiną (otrzymaną na przykład z uformowania), która katalizuje utlenianie glukozy, na przykład glukozy krwi, do glukonolaktonu z utworzeniem nadtlenku wodoru H2O2, zaczynając od cząstek O2 obecnych w testowanym roztworze, w tym przypadku we krwi.

Ten enzym (GOD) i tlen są często stosowane w urządzeniach do pomiaru glukozy, w których utlenianie glukozy było wykrywane przez przetwornik elektryczny lub optyczny.

Podobnie enzym (GOD) i tlen są często stosowane w urządzeniach amperometrycznych i ich użycie jest opisane w literaturze.

Te urządzenia amperometryczne składają się z urządzenia pomiarowego wyposażonego w przynajmniej dwa elektryczne styki połączone z amperomierzem i wyświetlaczem oraz z czujnika, który może być wymienny i który może być połączony do owych dwóch elektrycznych styków. Czujnik ten zawiera przynajmniej jedną elektrodę pomiarową i jedną elektrodę porównawczą, odizolowane od siebie i kontaktujące się ze wspomnianym roztworem, przy czym wspomniane elektrody zawierają odpowiednio styki elektryczne przystosowane do podłączenia do urządzenia do obróbki sygnału dostarczanego przez wspomniany czujnik, przy czym elektroda pomiarowa zawiera przynajmniej jeden odbierak prądu elektrycznie podłączony do jednego ze styków elektrycznych, pokryty mieszaniną zawierającą przynajmniej jeden enzym utleniająco-redukujący specyficzny dla wspomnianego składnika i przynajmniej jeden czynnik pośredniczący, przenoszący elektrony pomiędzy wspomnianym enzymem i wspomnianym odbierakiem prądu.

Kiedy testowany roztwór jest osadzany na elektrodzie pomiarowej, wówczas testowany produkt (glukoza) reaguje z ezymem (utleniony GOD) umieszczonym na elektrodzie tworząc glukonolakton, podczas gdy GOD przechodzi do stanu zredukowanego [GOD(H2)(_Zred)l· Ten zredukowany GOD reaguje następnie z tlenem O2, który przechodzi do stanu zredukowanego H2O i który potem przenosi elektrony e’ w kierunku przewodnika elektrycznego C, którego potencjał jest ustalony na poziomie 650 mV. Fakt, że konieczna jest praca przy podwyższonych potencjałach powoduje dodatkowe problemy. Tlen odgrywa zatem rolę czynnika pośredniczącego, ponieważ pozwala na przenoszenie elektronów. To przenoszenie elektronów, które jest proporcjonalne do ilości glukozy obecnej w testowanym roztworze jest następnie mierzone przez amperomierz i ilość glukozy obecnej w roztworze jest pokazywana na wyświetlaczu urządzenia pomiarowego.

Dodatkowe badania wykazały, że urządzenia amperometryczne stosujące niefizjologiczne, organiczne, nieorganiczne lub metaloorganiczne czynniki pośredniczące mogą zastąpić urządzenia używające tlen jako czynnik pośredniczący. Urządzenia stosujące tlen jako czynnik pośredniczący nie mogą być stosowane do roztworów w których zawartość stechiometryczną tlenu jest mniejsza niż stężenie mierzonego składnika. Z utlenionym enzymem jest zdolna przereagować całkowita ilość składnika mierzonego, tworząc enzym zredukowany, jednakże tylko część całkowitej ilości zredukowanego enzymu może reagować z obecnym tlenem, proporcjonalnie do tej ilości tlenu. Reszta zredukowanego enzymu nie może przereagować i ilość elektronów przenoszonych do przewodnika jest mniejsza niż powinna.

169 972

W konsekwencji, w tego typu urządzeniu ma miejsce ograniczenie nakładane przez odpowiednie stężenie tlenu i składnika mierzonego albo występuje konieczność użycia membrany ograniczającej dyfuzję wspomnianego składnika. Z tego właśnie względu czyniono wysiłki aby opracować urządzenie amperometryczne wykorzystujące specyficzny czynnik pośredniczący dla zastąpienia tlenu.

W literaturze proponuje się bardzo wiele czynników pośredniczących, takich jak monomeryczne ferroceny (Cass, A.E.G. i in. (1984), Anal.Chem. 56, 667-671; Degani, Y. i Heller, A. (1987), J.Phys.Chem. 91,1285-1289), ferroceny szczepione na polimerze (Foulds, N.C. i Lowe, C.R. (1988) Anal.Chem. 60, 2473-2478), sole przewodzące przenoszące ładunek (Albery, WJ. Bartlett, P.N. i Craston, D.H. (1985) J.Electroanal.Chem.Interfacial. Electrochem. 194, 223235), cykliczne związki niklowe (Taniguchi, I., Matsushita, K., Okamoto, M.,Collin, J-P (1990) J.Electroanal. Chem.Interfacial. Electrochem. 280, 221-226) i składniki organiczne takie jak chinony i benzochinony (Kulys, JJ. i Cenas, N.K. (1983) Biochim. Biophys. Acta 744, 57).

Dzięki głównej pracy Hill i in., na przykład Frew, J.E., i Hill.H.A.O. (1987) Phil.Trans. R.Soc. Lond. B316, 95-106), szerokie zastosowanie jako czynnik pośredniczący dla GOD i innych flawoprotein znalazła rodzina składników ferrocenowych. W rezultacie, znany czujnik wykorzystuje jako czynnik pośredniczący składnik z rodziny ferrocenów.

Niestety, dostępne czynniki pośredniczące rzadko mają wymagane idealne własności, a mianowicie potencjał elektrochemiczny dostosowany do wybranego enzymu, odpowiednią rozpuszczalność i dobrą chemiczną odporność na światło, temperaturę i pH oraz szybkie oddziaływanie z wybranym enzymem.

Co więcej, tlen, który może być obecny w testowanych roztworach, konkuruje z niektórymi czynnikami pośredniczącymi. Czynnik pośredniczący obecny na przewodniku reaguje ciągle z niektórymi cząsteczkami zredukowanego GOD, przez co możliwe jest, że pewna ilość tlenu O2, który może być obecny, także reaguje z innymi cząsteczkami zredukowanego GOD tworząc H2O2, jak opisano poprzednio.

Gdy pomiary są dokonywane przy niskim potencjale między elektrodą pomiarową i elektrodą porównawczą, wówczas H2O2 wyłapuje elektrony pochodzące z reakcji między GOD i tlenem, które to elektrony nie przechodzą już w kierunku elektrody.

Ponieważ ilość tlenu w roztworze może być zmienna, zatem zmienia się także ilość wyłapanych elektronów. W rezultacie, nie ma proporcjonalnej zależności pomiędzy ilością elektronów przechodzących w kierunku elektrody, a ilością glukozy w roztworze testowanym. W tych warunkach także takie czujniki nie dają niezawodnych wyników.

Celem wynalazku jest opracowanie czujnika, w którym będą wyeliminowane powyższe niedogodności.

Czujnik do pomiaru ilości składnika w roztworze, zawierający przynajmniej jedną elektrodę pomiarową i jedną elektrodę porównawczą, odizolowane od siebie i kontaktujące się ze wspomnianym roztworem, przy czym wspomniane elektrody zawierają odpowiednio styki elektryczne przystosowane do podłączenia do urządzenia do obróbki sygnału dostarczanego przez wspomniany czujnik, przy czym elektroda pomiarowa zawiera przynajmniej jeden odbierak prądu elektrycznie podłączony do jednego ze styków elektrycznych, pokryty mieszaniną zawierajacą przynajmniej jeden enzym utleniająco-redukujący specyficzny dla wspomnianego składnika i przynajmniej jeden czynnik pośredniczący, przenoszący elektrony pomiędzy wspomnianym enzymem i wspomnianym odbierakiem prądu według wynalazku charakteryzuje się tym, że czynnik pośredniczący w mieszaninie jest wybrany spośród kompleksów metalu przejściowego z przynajmniej jednym ligandem bipirydyny, trójpirydyny lub fenantroliny podstawionym przez przynajmniej jedną grupę dostarczającą elektrony.

Mieszanina elektrody pomiarowej korzystnie zawiera również materiał aktywnie przewodzący, zaś czynnik pośredniczący przenosi elektrony pomiędzy enzymem i tym materiałem aktywnie przewodzącym.

Metalem przejściowym jest korzystnie żelazo, ruten, osm lub wanad.

Grupą dostarczającą elektrony jest korzystnie grupa hydroksylowa, alkoksylową, aryloksylowa lub pierwszorzędową, drugorzędowa lub trzeciorzędowa grupa aminowa.

169 972

Enzymem utleniająco-redukującymjest oksydaza lub flawoproteina, a zwłaszcza oksydaza glukozowa w przypadku pomiaru ilości glukozy obecnej w roztworze. Szczególnie korzystnie, w tym przypadku czynnikiem pośredniczącym jest tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)osm lub bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydyno)osm.

Materiałem aktywnie przewodzącym jest pył węglowy, złoto, platyna, pallad lub tlenek metalu przewodzącego.

Materiałem aktywnie przewodzącym może też być cienka warstewka polimeru przewodzącego.

Mieszanina elektrody pomiarowej korzystnie zawiera dodatek tworzący unieruchamiającą sieć enzymu czynnika pośredniczącego i/lub aktywnego materiału przewodzącego na powierzchni odbieraka prądu elektrody pomiarowej.

Dodatkiem tym korzystnie jest albumina osocza krwi bydlęcej, glutaraldehyd, diamid węglowy lub polimer rozpuszczalny w wodzie.

Mieszanina osadzona na odbieraku prądu elektrody pomiarowej zawiera pomiędzy 1 do 2000 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego i pomiędzy 1 a 10 000 gmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego, korzystnie pomiędzy 10 i 300 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego i pomiędzy 10 a 300 μmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego, a nakorzystniej około 100 IU oksydazy glukozowej' na mg pyłu węglowego i około 50 μmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.

Dzięki zastosowaniu nowego czynnika pośredniczącego, otrzymano rodzinę czujników posiadających szeroki zakres niskich potencjałów utleniająco-redukujących, które pozostają trwałe w powietrzu i umożliwiają znacznie szybszy odczyt niż inne czujniki znane ze stanu techniki.

Przedmiot wynalazku jest uwidoczniony w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia rozkład glukozy w obecności oksydazy glukozowej GOD, fig. 2 i 3 - wykresy różnych reakcji chemicznych zachodzących na powierzchni czujników, fig. 4 - widok z góry urządzenia pomiarowego wyposażonego w czujnik pomiarowy według wynalazku, fig. 5 cykliczne krzywe woltametryczne kompleksu tri(4,4’-dwumetoksy-2,2’-dwupirydyny) osmu w nieobecności GOD i glukozy przy różnych prędkościach odczytu, fig. 6 - takie same krzywe jak na fig. 5, ale w obecności GOd i glukozy, fig. 7 - trzy krzywe ilustrujące zmienność gęstości prądu osiągniętej po 30 sekundach (D30) w funkcji stężenia glukozy w roztworze fizjologicznym dla pomiarów dokonanych przy użyciu trzech typów czujników według wynalazku, w których zmienia się ilość pyłu węglowego, fig. 8 - gradient i rzędną w punkcie wyjściowym krzywej z fig. 7 w funkcji ilości pyłu węglowego, fig. 9 - trzy krzywe ilustrujące zmienność gęstości prądu osiągniętej po 30 sekundach (D30) w funkcji stężenia glukozy w roztworze fizjologicznym dla pomiarów prowadzonych za pomocą typów czujnika według wynalazku, w których zmienia się ilość oksydazy glukozowej, fig. 10 - gradient i rzędną w punkcie wyjściowym krzywej z fig. 9 w funkcji ilości oksydazy glukozowej, fig. 11 - trzy wykresy ilustrujące zmienność gęstości prądu osiągniętej po 30 sekundach (D30) w funkcji stężenia glukozy w roztworze fizjologicznym dla pomiarów prowadzonych za pomocą trzech typów czujników według wynalazku, w których zmienia się ilość czynnika pośredniczącego, fig. 12 - gradient i rzędną w punkcie wyjściowym z fig. 11 w funkcji ilości czynnika pośredniczącego, fig. 13 - pomiary gęstości prądu w funkcji stężenia glukozy, przy czym pomiary te były przeprowadzone we krwi i w buforze fosforanowym za pomocą czujników glukozowych wyposażonych odpowiednio w jeden z dwóch zalecanych czynników pośredniczących według wynalazku, fig. 14 - pomiary gęstości prądu uzyskane w funkcji stężenia glukozy, przy czym pomiary te prowadzone są za pomocą czujników według wynalazku w próbkach krwi mających różne hematokryty, fig. 15 i 16 - pomiary gęstości prądu uzyskane w funkcji stężenia glukozy, przy czym pomiary te są przeprowadzone przy użyciu czujników według wynalazku w próbkach roztworu fizjologicznego mających różne stężenia odpowiednio acetaminofenolu i kwasu askorbinowego.

Na fig. 1 przedstawiono rozkład glukozy krwi w obecności oksydazy glukozowej GOD. GOD jest flawoproteiną (otrzymaną na przykład z uformowania), która katalizuje utlenianie glukozy, w tym przypadku glukozy krwi, do glukonolaktonu z utworzeniem nadtlenku wodoru H2O2, zaczynając od cząstek O2 obecnych w testowanym roztworze, w tym przypadku we krwi.

169 972

Na fig. 2 przedstawiono wykres ilustrujący przebieg reakcji chemicznych zachodzących na powierzchni elektrody pomiarowej, gdy czynnikiem pośredniczącym jest tlen. Kiedy testowany roztwór jest osadzany na elektrodzie pomiarowej, wówczas testowana substancja (w tym przypadku glukoza) reaguje z enzymem (w tym przypadku w utlenionym GOD) umieszczonym na elektrodzie tworząc glukonolakton, przez co GOD przechodzi do stanu zredukowanego [GOD(H2)(zred)]· Ten zredukowany GOD reaguje następnie z tlenem O2, który przechodzi do stanu zredukowanego H2O2 i który potem przenosi elektrony e' w kierunku przewodnika elektrycznego C, którego potencjał jest ustalony na poziomie 650 mV. Fakt, że konieczna jest praca przy podwyższonych potencjałach powoduje dodatkowe problemy. Tlen odgrywa rolę czynnika pośredniczącego, ponieważ umożliwia przenoszenie elektronów. To przenoszenie elektronów, które jest proporcjonalne do ilości glukozy obecnej w testowanym roztworze, jest następnie mierzone przez amperomierz, a ilość obecnej w roztworze glukozy jest pokazywana na wyświetlaczu urządzenia pomiarowego.

Jak przedstawiono na fig. 2 urządzenia stosujące tlen jako czynnik pośredniczący nie mogą być używane w roztworach gdzie zawartość stechiometryczną tlenu jest mniejsza niż stężenie składnika mierzonego.

Na fig. 3 przedstawiono wykres ilustrujący przebieg reakcji chemicznych zachodzących na powierzchni elektrody pomiarowej w przypadku zastosowania czynnika pośredniczącego Med na przewodniku C.

Czynnik pośredniczący Med, obecny na przewodniku C, reaguje z niektórymi cząsteczkami zredukowanego GOD, jednakże pewna ilość tlenu O2, który może być obecny, także reaguje z innymi cząsteczkami zredukowanego GOD tworząc H2O2, jak poprzednio przedstawiono na fig. 2. Gdy pomiary są dokonywane przy niskim potencjale między elektrodą pomiarową i elektrodą porównawczą, wówczas H2O2 wyłapuje elektrony pochodzące z reakcji między GOD i tlenem i elektrony te nie przechodząjuż w kierunku elektrody. Ponieważ ilość tlenu w roztworze może być zmienna, zatem zmienia się także ilość wyłapanych elektronów. W rezultacie nie ma proporcjonalnej zależności pomiędzy ilością elektronów przechodzących w kierunku elektrody a ilością glukozy w testowany roztworze.

Na fig. 4 przedstawiono urządzenie pomiarowe 2 do pomiaru ilości danego składnika w roztworze, które zawiera czujnik 6 według wynalazku i urządzenie 4 do obróbki sygnału dostarczanego przez wspomniany czujnik. Urządzenie 4 ma ogólny wygląd pióra. Wynalazek oczywiście nie wprowadza ograniczenia tego kształtu.

Urządzenie posiada na jednym końcu 8 wydrążenie 10, w którym są umieszczone dwa. styki elektryczne 12, 14 połączone elektrycznie z amperomierzem ( nie pokazanym). Amperomierz jest połączony z wyświetlaczem 16 pokazującym stężenie badanego składnika w danym roztworze. Stężenie to jest wyświetlane na przykład w mg/dl lub w mmol1. Urządzenie 4 zawiera także zatyczkę 18, która przykrywa jego koniec 8 i chroni styki 12, 14 gdy urządzenie 4 nie jest w użyciu.

Czujnik 6 według wynalazku jest ukształtowany na przykład jako izolacyjna prostokątna płytka, która może być wprowadzonajednym ze swoich końców 19 do wydrążenia 10 urządzenia 4. Czujnik 6 jest wymienny.

Czujnik 6 ma elektrodę pomiarową 20 i elektrodę porównawczą 22 rozmieszczone na przykład wzdłużnie równolegle na czujniku 6. Elektroda porównawcza 22 zawiera taśmę 24 wykonaną z materiału przewodzącego elektryczność. Ta taśma 24 ma trzy strefy, mianowicie pierwszą strefę 26 określoną jako styk elektryczny, położoną przy końcu 19 wspomnianego czujnika 6, środkową strefę 28 określaną jako ścieżkę przewodzącą i strefę 30 położoną przy drugim końcu czujnika 6 i określoną jako odbierak prądu. Podobnie elektroda pomiarowa 20 ma taśmę 32 wykonaną z materiału przewodzącego elektryczność. Ta taśma 32 ma również trzy strefy, styk elektryczny 34, ścieżkę przewodzącą 36 i odbierak prądu 37, pokryty w przeciwieństwie do odbieraka 30, mieszaniną 38.

Pokazany na fig. 4 odbierak 37 nie jest wyraźnie widoczny, ponieważ zakryty jest przez mieszaninę 38. Należy zauważyć, że w każdej z tych elektrod odbierak prądu i przewodnik prądu mogą być w postaci dwóch części połączonych elektrycznie ze sobą, zamiast w postaci pojedynczej taśmy 24 lub 32. Mieszanina 38 zawiera przynajmniej jeden enzym utleniająco-redukujący,

169 972 specyficzny dla mierzonego składnika i przynajmniej jeden czynnik pośredniczący przenoszący elektrony pomiędzy wspomnianym enzymem a odbierakiem prądu utworzonym w taśmie 32.

Wspomniana wyżej mieszanina 38 może zawierać również przynajmniej jeden aktywny materiał przewodzący i/lub przynajmniej jeden dodatek, który będzie opisany poniżej. W przypadku mieszaniny 38 zawierającej aktywny materiał przewodzący, czynnik pośredniczący przenosi elektrony pomiędzy enzymem a aktywnym materiałem przewodzącym, który z kolei przenosi elektrony w kierunku odbieraka prądu.

Kropla 40 próbki testowanego roztworu jest umieszczona na obu elektrodach 20 i 22 jak przedstawiono na fig. 4. W ten sposób obwód elektryczny złożony z amperomierza, styków 14 i 26, ścieżki przewodzącej 28, odbieraka 30, kropli roztworu 40, mieszaniny 38, odbieraka 37, ścieżki przewodzącej 36 oraz styków 34 i 12 stanowi obwód zamknięty.

Urządzenie pomiarowe 2 opisane powyżej jest przystosowane do wykonywania pomiarów in vitro, jakkolwiek oczywiste jest, że czujnik 6 może być użyty in vivo we wszczepialnych urządzeniach pomiarowych. W tym przypadku kształt i wymiary takiego czujnika 6 są przystosowane do tego nowego zastosowania.

Co więcej, aby zapewnić długotrwałą dokładność, możliwe jest dodanie drugiej elektrody pomiarowej identycznej z elektrodą pomiarową 20 ale bez enzymu lub z enzymem zdenaturowanym.

Kropla 40 testowanego roztworu może mieć naturę biologiczną, na przykład może to być ludzka lub zwierzęca krew, mocz lub środowisko fermentacyjne mikroorganizmów. Może być również pochodzenia sztucznego, na przykład może stanowić syntetyczny roztwór buforowy zawierający elementy analizowane.

Zastosowanym enzymem utleniająco-redukującym jest enzym specyficzny dla składnika mierzonego. Według wynalazku zaleca się, by zastosowany enzym był wybrany spośród oksydaz i flawoprotein. Jeśli pożądane będzie wykonanie czujnika glukozowego, wówczas stosuje się oksydazę GOD, na przykład GOD mającą aktywność około 250 IU, otrzymaną przy użyciu kultury Aspergillus niger.

Zaleca się, by zastosowany aktywny materiał przewodzący miał postać pyłu węglowego, grafitowego, złotego, platynowego, palladowego lub przewodzącego tlenku metalu, na przykład tlenku rutenu względnie aby miał postać cienkiej warstewki przewodzącego polimeru, na przykład polipirolu.

Jak wspomniano, możliwe jest również zastosowanie dodatku tworzącego unieruchamiającą sieć enzymu z czynnika pośredniczącego i/lub aktywnego materiału przewodzącego na powierzchni odbieraka 37 elektrody pomiarowej 20. Dodatkiem tym jest na przykład albumina osocza krwi bydlęcej (BSA), glutaraldehyd, diamid węglowy i rozpuszczalne w wodzie polimery.

Taśmy materiału 24, 32 przewodzącego elektryczność są na przykład z materiału wybranego spośród złota, srebra, platyny, palladu, węgla, grafitu lub tlenku metalu przewodzącego na przykład takiego jak tlenek rutenu. Zaleca się, by taśma 24 stanowiąca elektrodę porównawczą była srebrna, a taśma 32 stanowiąca elektrodę pomiarową 20 była platynowa. Dokładniej, część taśmy 24 odpowiadająca odbierakowi prądu 30 jest częściowo chlorowana.

Odkryto, że jako czynnik pośredniczący dobre właściwości ma nowa rodzina kompleksów metalu przejściowego z przynajmniej jednym ligandem bipiridynowym, terpiridynowym lub fenantrolinowym podstawionym przez przynajmniej jedną grupę dostarczającą elektrony.

Zaleca się by grupą dostarczającą elektrony była grupa OH, grupa alkoksy, grupa aryloksy lub pierwszorzędową, drugorzędowa lub trzeciorzędowa grupa aminowa.

W przypadku czujnika glukozowego, kiedy stosowanym enzymem jest oksydaza glukozowa (GOD), zaleca się by z wyżej wspomnianych czynników wybrać kompleks tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy)osmu lub bis(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy)-mono (4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy)osmu.

W przypadku czujnika glukozowego, mieszanina 38 umieszczona na odbieraku elektrody pomiarowej 20 zawiera na 1 ml buforu fosforanowego 10 mM dostosowanego do pH 6,8 i 1 do 1000 mg pyłu węglowego, korzystnie 1 do 100 mg lub najkorzystniej około 10 mg, 1 do 2000 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego, korzystnie 10 do 300 IU lub najkorzy8

169 972 stniej 100 IU i 1 do 10000 gmol czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego, korzystnie 10 do 300 gmol lub najkorzystniej 50 μmol. Ta mieszanina jest rozmieszczona na poziomie od 10 do 300 μΕ^² powierzchni czynnej, korzystnie 30 do 150 gl/cm2, a najkorzystniej 70 gl/cm².

W gotowym, wysuszonym czujniku 6 mieszanina 38 powinna zatem zawierać 1 do 2000 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego, korzystnie 10 do 300 IU a najkorzystniej 100 IU i 1 do 10000 gmol korzystnie 10 do 300 gmol i najkorzystniej 50 gmol czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.

Czujnik według wynalazku w którym zastosowane są wyżej wymienione czynniki pośredniczące wykazuje własności, które zmieniają się jako funkcja zastosowanych ligandów i podstawień dokonanych na tych ligandach.

Poniżej przedstawiono kilka przykładów zastosowania czujnika według wynalazku, które udowadniają korzystne działanie i wydajność nowych czynników pośredniczących, i w których uzyskano polepszenie warunków pracy różnych elementów stanowiących elektrodę pomiarową.

Przykład I. W przykładzie tym przetestowano czujnik według wynalazku, w którym zastosowano rozmaite czynniki pośredniczące, przy użyciu metody chronowoltamperometrii cyklicznej.

a) Testowanie kompleksu tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowego)osmu.

Wyżej wspomniany kompleks testowano przy użyciu chronowoltamperometrii cyklicznej w prądzie stałym, ażeby z jednej strony określić jego normalny potencjał oksydoredukcyjny E° a z drugiej strony określić stały współczynnik k, odpowiadający reakcji przeniesienia elektronu począwszy od GOD w kierunku czynnika pośredniczącego. Chronowoltamperometria cykliczna polega na zestawieniu elektrody roboczej, przeciw-elektrody oraz elektrody porównawczej w roztworze analizowanym, odczycie potencjału elektrody roboczej przy stałej prędkości między dwoma zaciskami oraz pomiarze natężenia otrzymanego prądu. Krzywe z fig. 5 i 6 przedstawiają uzyskane rezultaty. Przy pomiarze zastosowano szklistą węglową elektrodę roboczą, elektrodę porównawczą z chlorku rtęci, przeciwelektrodę platynową oraz ogniwo elektrochemiczne o pojemności 5 do 20 ml. Pomiarów dokonano w buforze fosforanowym PBS (NaCl, 100 mM, NaH2PO4 10 mM, ustawionym na pH 7,4; EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) 0,1 mM; PMSF (fluorek fenylometylosulfonianu) 0,01 mM i z wyżej wspomnianym substratem w stężeniu 5.10'⁴M. Zastosowano różne prędkości odczytu potencjałów; 5, 10,25,50 i 100 mV.s*‘. Uzyskano krzywe pokazane na fig. 5 oraz wartość dla E° wynoszącą 225 mV. Dodanie nasyconego roztworu glukozy nie miało wpływu na krzywe z fig. 5, które mają normalny przebieg, ponieważ nie ma obecnej oksydazy glukozowej (GOD).

Dodanie oksydazy GOD (w ilości większej niż 5.10'⁸M, korzystnie 4.10‘⁶) spowodowało podniesienie przebiegu krzywych z fig. 6, przedstawiających charakterystyczny kształt tak zwanej fali katalitycznej. W pomiarze, które rezultaty przedstawiono na fig. 6, zastosowano prędkości pomiaru potencjału odpowiednio 10, 25, 50 i 100 mV. s’1

Pierwsza reakcja przebiegała w następujący sposób:

Czynnik pośredniczący(utlemony) + GODrzredukowany)

Czynnik pośredniczący^redukowany) + GOD(utleniony)

Reakcja ta jest nieodwracalna (ze stałą k).

Druga reakcja:

Czynnik pośredn. (zredukowany) + e' — Czynnik pośredn.(utleniony) jest elektrochemicznie odwracalna i niezwykle szybka.

Czynnik pośredniczący wywołuje elektrochemicznie odwracalne przeniesienie elektronu w kierunku wcześniej opisanych odbieraków prądu.

Podczas pierwszej reakcji zmierzono drugorzędową stałą k. Dla kompleksu tutaj badanego otrzymano k=2,5.106 ± 0,5 M^.s-.

Testowanie innych kompleksów.

Testowanie to przeprowadzono podobnie jak opisano powyżej.

Tabela 1 podaje otrzymane wartości stałego współczynnika k oraz normalne potencjały oksydoredukcyjne E° (w mV) względem elektrody porównawczej z chlorku rtęci (SCE).

169 972

Tabela 1

Kompleks	E°(mV/_Sce) k(M-1 s-1)
1. Kompleks tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy) osmu	225	2,5.10⁶
2. Kompleks bi(4,4’-dimetoksy-2,2-bipirydyno)mono(4,4’-
-dimetylo 2,2’-bipirydynowy) osmu	340	2.10⁶
3. Kompleks bi(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetoksy
2,2’-bipirydynowy) osmu	390	N.O.
4. Kompleks mono(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono- (4,4-dihydroksy-	pH <4,5	340 N.O.
-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy) osmu	pH > 4,5	190 2.10⁵
5. Kompleks tri(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy) osmu	425	1,5.10⁶
6. Kompleks tri(4,4’-dihydroksy-2,2’-bipirydynowy) osmu	-1000	0
7. Kompleks tri(4,4-diamino-2,2’-bipirydynowy) rutenu	170	1,6.106
8. Kompleks tn(4,4’-diamino-2,2’-bipirydynowy) żelaza	70	1,4.10⁵

N.O = nie określono

Na podstawie rezultatów zestawionych w Tabeli 1 można zauważyć, że ta rodzina czynników pośredniczących zastosowanych w czujniku według wynalazku ma bardzo szeroki zakres potencjałów redoks, wahający się pomiędzy -1000 mV i +425 mV (w stosunku do elektrody porównawczej z chlorku rtęci SCE). Dolna granica tego zakresu jest o wiele niższa niż wszystkie potencjały redoks znanych dotychczas czynników pośredniczących. Co więcej, ten zakres potencjałów jest również o wiele szerszy niż otrzymywany w przypadku rodziny ferrocenów. Jest to wynikiem ogromnej ilości podstawników, które mogą być zastosowane, i jeszcze większej liczby kombinacji możliwych podstawników.

Drugorzędowa stała kf, odpowiadająca stałej szybkości reakcji utleniania-redukcji pomiędzy enzymem a czynnikiem pośredniczącym czujnika według wynalazku jest o wiele większa niż w przypadku innych znanych czynników pośredniczących i większa niż w przypadku tlenu. Tlen ma stałą k wynoszącą zaledwie 1,5.10 M’ .s’ . W ten sposób eliminuje się wspomniane wyżej problemy konkurencji pomiędzy tlenem a czynnikiem pośredniczącym podczas reakcji przeniesienia elektronu z GOD. Co więcej, ponieważ inne konkurencyjne reakcje zachodzą o wiele wolnej, zatem nie wpływają na wskazanie urządzenia pomiarowego.

Czynniki pośredniczące wybrane dla czujników glukozowych były kompleksami 1 i 2 z Tabeli 1, które mają wysoką stałą k i niski normalny potencjał oksydoredukcyjny E°, chociaż większy niż -300 mV, który odpowiada normalnemu potencjałowi grup FAD/FADH2 w enzymie GOD.

Przykład II. W przykładzie tym przeprowadzono badania odnośnie optymalizacji różnych składników mieszaniny elektrody pomiarowej. Po wyznaczeniu dwóch czynników pośredniczących, najodpowiedniejszych dla czujnika glukozowego, poczyniono próbę określenia optymalnych ilość różnych składników umieszczonych na odbieraku elektrody pomiarowej.

Dokonano tego przez przygotowanie mieszaniny 38 zawierającej jeden lub dwa wyżej wspomniane zalecane kompleksy 1 i 2 z Tabeli 1, pył węglowy, unieruchomioną oksydazę glukozową oraz jako dodatek albuminę z osocza krwi bydlęcej i glutaraldehyd, a następnie na części odbieraka prądu 37 taśmy 36 przewodzącej elektryczność umieszczono 70 (ll tej mieszaniny na cm² tak, aby utworzyć elektrodę pomiarową 20. Następnie wykonano różne typy elektrod pomiarowych przez stopniowe zmienianie jednego ze składników mieszaniny i utrzymywanie pozostałych chłodników na stałym poziomie.

Otrzymane w ten sposób różne czujniki wykorzystano do pomiarów potencjostatycznych przy potencjale 300 mV wielu próbek krwi zawierających różne ilości glukozy. Wyniki pomiarów przedstawionych poniżej.

a) Optymalizacja ilości pyłu węglowego.

Wykonano trzy różne czujniki przez zmieszanie z 3 ml buforu fosforanowego PBS stałej ilości GOD (36,9 mg), stałej ilości kompleksu bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)-mono(4,4-dimetylo-2,2’-bipirydynowego) osmu (3,0 mg) użytego jako czynnik pośredniczący, stałej ilości

169 972 gutaraldehydu przy 25% (25 gl), stałej ilości albuminy z osocza krwi bydlęcej przy 15% (290 gl) i odpowiednio 25, 50 i 250 mg pyłu węglowego. Zastosowany bufor fosforanowy PBS jest buforem o 10 mM ustawionym na pH 6,8.

Te trzy typy czujnika były następnie testowane w roztworze fizjologicznym zawierającym różne ilości glukozy (pomiędzy 0 a 20 mM glukozy) i zmierzono gęstość prądu uzyskaną po 30 sekundach (D30). Roztwór fizjologiczny stanowił 115 mM NaCl, 25 mM KCL, 5 mM HPO4.3H2O i 0,5 mM KH2PO4.

Otrzymane wyniki są przedstawione na fig. 7. Proste linie a, b, c odpowiadają wynikom zarejestrowanym dla czujników zawierających odpowiednio 25,50 i 250 mg węgla w 3 ml buforu fosforanowego PBS albo przybliżone stężenie 8,17 i 83 mg nami. Następnie wyliczono gradient (m) dla wszystkich linii prostych a, b, c reprezentujących całość przeprowadzonych pomiarów i wartości te przedstawiono na fig. 8 (krzywa Ci), gdzie oś odciętych reprezentuje ilość węgla w mg na ml buforu fosforanowego PBS. Podobnie wyliczono rzędną w punkcie wyjściowym tych linii prostych i te wartości przedstawiono na fig. 8 (krzywa C2). Rzędna w punkcie wyjściowym odpowiada wartości punktu przecięcia linii prostej z fig. 7 oraz osi rzędnych, to znaczy wartości prądu szczątkowego.

Należy zauważyć, że krzywa Cjest zasadniczo pozioma dla wartości pomiędzy 17 a 83 mg węgla, co oznacza, że między tymi dwiema wartościami ilość węgla ma niewielki wpływ na wskazania czujnika, tym niemniej, ponieważ cienka warstwa węgla wykazuje lepsze własności mechaniczne i dyfuzyjne, zatem korzystne okazało się użycie możliwie najmniejszej ilości węgla. Co więcej należy zauważyć, że wartość rzędnej w punkcie wyjściowym linii prostej a (8 mg węgla na ml) jest mniejsza, co wskazuje, że w tym przypadku osiągnięto najmniejszy prąd szczątkowy.

- Zaleca się zatem użycie około 10 mg węgla na ml buforu fosforanowego PBS.

b) Optymalizacja ilości enzymu (GOD).

Wykonano trzy różne czujniki przez zmieszanie z 3 ml buforu fosforanowego PBS na stałej ilości węgla (25 mg), stałej ilości (3 mg) tego samego czynnika pośredniczącego co w punkcie a), stałej ilości glutaraldehydu przy 25% (25 gm) i albuminy z osocza krwi bydlęcej przy 15% (290 gl) i odpowiednio 2175,4375 i 8750 IU oksydazy glukozowej GOD co dało stężenie GOD odpowiednio 87, 175 i 350 IU oksydazy glukozowej (GOD) na mg węgla.

Przeprowadzono taką samą serię pomiarów i obliczeń co w punkcie a). Linie proste a, b, c z fig. 9 odpowiadają rezultatom uzyskanym za pomocą czujników zawierających odpowiednio 87, 175 i 350 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego. Krzywe Ci C2 z fig. 10 przedstawiają odpowiednio gradient (m) i rzędną w punkcie wyjściowym. Oś odciętych na fig. 10 wyraża ilość GOD w IU na mg pyłu węglowego.

Dla wartości pomiędzy 75 a 350 IU GOD na mg pyłu węglowego krzywa C1 jest zasadniczo pozioma co oznacza, że pomiędzy tymi dwiema wartościami ilość GOD ma mały wpływ na wyniki. Co więcej, rzędna w punkcie wyjściowym linii jest najmniejsza, co oznacza najmniejszy prąd szczątkowy.

Tak więc zaleca się użycie około 100 IU GOD na mg pyłu węglowego.

c) Optymalizacja ilości czynnika pośredniczącego

Wykonano trzy różne czujniki przez zmieszanie z 3 ml buforu fosforanowego PBS stałej ilości węgla (25 mg), stałej ilości GOD (36,9 mg), stałych ilości glutaraldehydu przy 25% (25 gl) i albuminy z osocza krwi bydlęcej przy 15% (290 gl) i odpowiednio 825,1675 i 3325 gl mol kompleksu bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)-mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowego) osmu, odpowiadających stężeniu czynnika pośredniczącego odpowiednio 33,67 i 133 gmol na mg pyłu węglowego.

Następnie przeprowadzono takie same serie pomiarów i obliczeń jak w punkcie a). Linie proste a, b, c z fig. 11 odpowiadają wynikom obserwowanym przy odpowiednio 33,67 i 133 gmol tego kompleksu na mg węgla. Krzywe C1 C2 z fig. 12 reprezentują odpowiednio gradient (m) i rzędną w punkcie wyjściowym. Oś odciętych fig. 12 przedstawia ilość czynnika pośredniczącego w gmol na mg pyłu węglowego.

Należy zauważyć, że krzywe C1 i C2 są zasadniczo poziome. Dla wartości czynnika pośredniczącego niższych niż 50 gmol konieczne jest dokonanie pomiarów przy potencjale

169 972 wyższym niż 300 mV. Ponieważ zaleca się pracować przy najniższym możliwym potencjale, zatem zaleca się użycie około 50 pmol czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.

Optymalizacje uzyskane dlakompleksu bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowego) osmu odnoszą się również do kompleksu tri(4,4’-dimetoksy-2,2’bipirydynowego)osmu.

Przykład III. W przykładzie tym przeprowadzono wzorcowanie czujnika według wynalazku we krwi i w buforze. Przeprowadzono pomiary potencjostatyczne za pomocą czujników mających jako czynnik pośredniczący dwa zalecane kompleksy według wynalazku. Wzorcowania dokonywano poprzez zmianę stężenia glukozy w próbkach krwi lub buforu fosforanowego PBS. Pomiary dokonywano przy 300 mV a odczyty gęstości prądu D20 dokonano po 20 sekundach. Wyniki są przedstawione na fig. 13.

Pokazane na fig. 13 krzywe C1 i C3 odpowiadają pomiarom przeprowadzonym odpowiednio w buforze fosforanowym i we krwi za pomocą czujnika wykorzystującego kompleks tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy)osmu, zaś krzywe C2 i C4 odpowiadają pomiarom przeprowadzonym odpowiednio w buforze fosforanowym i we krwi za pomocą czujnika wykorzystującego kompleks bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)-mono (4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy)osmu.

Jak przedstawiono na fig. 13 krzywe te mają wystarczająco stromy gradient aż do wartości 200 mM glukozy. Tak więc, u pacjenta u którego wartości fizjologiczne glukozy mogą zmieniać się zwykle pomiędzy 3 do 20 mM, czujnik według wynalazku daje wystarczająco dokładne wskazanie, ponieważ mała zmiana stężenia glukozy odpowiada wystarczająco dużej zmianie gęstości zmierzonego prądu.

Różnice obserwowane pomiędzy pomiarami wykonanymi w buforze PBS i w pełnej krwi wynikają z tego samego powodu co różne opisane w Fogh-Andersen N. i in. (1990), Clin.Chim.Acta 189, str,33-38, dla plazmy i pełnej krwi, a więc głownie z objętości protein w pełnej krwi.

Przykład IV. W przykładzie tym badano wpływ hematokrytu na wyniki podawane przez czujnik według wynalazku.

Próbki krwi przygotowano w następujący sposób. Plazmę oraz komórki krwi rozdzielano przez odwirowanie przy 3000 obrotach na minutę przez 15 minut w 4°C. Następnie krew rekonstruowano tak aby otrzymać różne wartości hematokrytu (0,35; 0,50 i 0,60) i do tych próbek dodawano znane ilości glukozy. Stężenie glukozy mierzono przy użyciu wzorcowego urządzenia laboratoryjnego, na przykład urządzenia porównawczego 23A z firmy Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio. Pomiary potencjostatyczne przeprowadzono przy 300 mV za pomocą czujnika mającego jako czynnik pośredniczący kompleks-bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy)osmu. Pomiary gęstości prądu przeprowadzono po 30 sekundach.

Krzywe z fig. 14 przedstawiają zmiany w gęstości prądu (D30) otrzymane po 30 sekundach jako funkcja stężenia glukozy w sztucznie zrekonstruowanej krwi ludzkiej.

Krzywe C1, C2 i C3 odpowiadają próbkom zawierającym odpowiednio 35% komórek i 65% plazmy, 50% komórek i 50% plazmy oraz 60% komórek i 40% plazmy.

Krzywa C2 odpowiada normalnemu hematokrytowi. Stwierdzono, że krzywa C3 (hematokryt 0,60) odpowiadająca podniesionemu hematokrytowi bardzo nieznacznie różni się od krzywej C2.

W przeciwieństwie, do tego, krzywa C1 (hematokryt 0,35) odpowiadająca hematokrytowi pacjenta anemicznego różni się od krzywej C2.

Tak więc czujnik według wynalazku daje niezawodne wyniki u pacjenta mającego podwyższony hematokryt, jednakże mniej niezawodne u pacjenta anemicznego.

Przykład V. W przykładzie tym badano wpływ pH na aktywność czynnika pośredniczącego, którym jest kompleks tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy)osmu i kompleks bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo-2,2’-bipirydynowy) osmu, w czujniku według wynalazku.

Te dwa kompleksy zmieszano w buforze PBS roztworu fosforanu o zmiennym pH, w którym mierzono normalny potencjał oksydoredukcyjny E°. Stabilny potencjał E° obserwowano

169 972 dla pH pomiędzy 1 a 12. Ten potencjał E° wynosił + 225 mV dla pierwszego kompleksu i + 340 mV dla drugiego. Ponieważ pH krwi ludzkiej wynosi około 7,4, zatem można stwierdzić, że drobne zmiany w pH krwi nie wpływają na odczyt glikemii podawany przez czujnik według wynalazku.

Przykład VI. W przykładzie tym badano wpływ obecności pewnych leków na wyniki podawane przez czujnik. Badania przeprowadzono w celu sprawdzenia czym na wyniki podawane przez czujnik według wynalazku mogą mieć wpływ leki obecne we krwi w chwili pomiaru, bowiem przed pomiarem glikemii pacjenta może przyjąć leki takie jak aspiryna czy witamina C.

Zmierzono zatem wpływ kwasu acetylosalicylowego, acetaminofenolu i kwasu askorbinowego na wyniki podawane przez czujnik według wynalazku.

Badania przeprowadzono za pomocą czujnika wykorzystującego jako czynnik pośredniczący kompleks tri(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydynowy) osmu.

Pomiary potencjostatyczne przeprowadzono przy 300 mV. Gęstość prądu (D30 odczytywano po 30 sekundach. Na fig. 15 i 16 przedstawiono krzywe reprezentujące zmiany gęstości prądu w funkcji stężenia glukozy, kiedy w próbce roztworu fizjologicznego są obecne różne ilości każdego z testowanych leków.

Na fig. 16 przedstawiono otrzymane krzywe C1, C2 i C3 odpowiadające stężeniom odpowiednio 0, 100 i 100 μΜ kwasu askorbinowego na ml krwi. Wartość 100 μΜ (krzywa C2) odpowiada wartościom stwierdzonym u pacjentów przyjmujących normalną dawkę witaminy C, podczas gdy wartość 100 μΜ (krzywa C3) odpowiada nadmiarowi kwasu askorbinowego.

Stwierdzono, że w przypadku nadmiaru kwasu askorbinowego (krzywa C3), wszystkie wartości i stężenia glukozy są wyższe niż normalne, natomiast krzywa C2 jest w zasadzie identyczna z krzywą C1. Tak więc można stwierdzić, że w zakresie wartości fizjologicznych obecność kwasu askorbinowego nie wpływa na wyniki podawane przez czujnik według wynalazku.

W przypadku kwasu acetylosalicylowego stwierdzono, że aż do 25 mM otrzymywano zależność według linii prostych, które były w zasadzie identyczne do odpowiadających ilości 0 mM kwasu acetylosalicylowego. Dlatego też wywnioskowano, że obecność kwasu acetylosalicylowego nie wpływa na wyniki podawane przez czujnik według wynalazku.

169 972

Fig.16

169 972

Fig.15

169 972 °30

Ο 5 10 15 20 25 glukoza (mM)

Fig.14

169 972

Fig. 13

169 972

węglowego

Fig.12

169 972

Fig.9

R,_s.«

169 972

Fig.7

Fig.8 rzędna przy początku (pAcm'^1

169 972

169 9 72

GOD

GODlHj) (red)

Glukoza toxy]

Glukonolakton

Fig. 3

169 972

Glukoza

Glukonolakton

Fig.1

H2O2 °2

GOD

GOD (H₂) (red)

Glukoza

Glukonolakton

Fig.2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Czujnik do pomiaru ilości składnika w roztworze, zawierający przynajmniej jedną elektrodę pomiarową i jedną elektrodę porównawczą, odizolowane od siebie i kontaktujące się ze wspomnianym roztworem, przy czym wspomniane elektrody zawierają odpowiednio styki elektryczne przystosowane do podłączenia do urządzenia do obróbki sygnału dostarczanego przez wspomniany czujnik, przy czym elektroda pomiarowa zawiera przynajmniej jeden odbierak prądu elektrycznie podłączony do jednego ze styków elektrycznych, pokryty mieszaniną zawierającą przynajmniej jeden enzym utleniająco-redukujący specyficzny dla wspomnianego składnika i przynajmniej jeden czynnik, pośredniczący przenoszący elektrony pomiędzy wspomnianym enzymem i wspomnianym odbierakiem prądu, znamienny tym, że czynnik pośredniczący w mieszaninie (38) jest wybrany spośród kompleksów metalu przejściowego z przynajmniej jednym ligandem bipirydyny, trójpirydyny lub fenantroliny podstawionym przez przynajmniej jedną grupę dostarczającą elektrony.
2. Czujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina (38) elektrody pomiarowej (20) zawiera również materiał aktywnie przewodzący, zaś czynnik pośredniczący przenosi elektrony pomiędzy enzymem i tym materiałem aktywnie przewodzącym.
3. Czujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że metalem przejściowym jest żelazo, ruten, osm lub wanad.
4. Czujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że grupą dostarczającą elektrony jest grupa hydroksylowa, alkoksylową, aryloksylowa lub pierwszorzędową, drugorzędowa lub trzeciorzędowa grupa aminowa.
5. Czujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że enzymem utleniająco-redukującym jest oksydaza lub flawoproteina.
6. Czujnik według zastrz. 5, znamienny tym, że enzymem jest oksydaza glukozowa w przypadku pomiaru ilości glukozy obecnej w roztworze.
7. Czujnik według zastrz. 6, znamienny tym, że czynnikiem pośredniczącym jest tri(4,4’dimetoksy-2,2’-bipirydyno)osm lub bi(4,4’-dimetoksy-2,2’-bipirydyno)mono(4,4’-dimetylo2,2’-bipirydyno)osm.
8. Czujnik według zastrz. 2, znamienny tym, że materiałem aktywnie przewodzącym jest pył węglowy, złoto, platyna, pallad lub tlenek metalu przewodzącego.
9. Czujnik według zastrz. 2, znamienny tym, że materiałem aktywnie przewodzącym jest cienka warstewka polimeru przewodzącego.
10. Czujnik według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że mieszanina (38) elektrody pomiarowej (20) zawiera dodatek tworzący unieruchamiającą sieć enzymu czynnika pośredniczącego i/lub aktywnego materiału przewodzącego na powierzchni odbieraka prądu (37) elektrody pomiarowej (20).
11. Czujnik według zastrz. 10, znamienny tym, że dodatkiem jest albumina osocza krwi bydlęcej, glutaraldehyd, diamid węglowy lub polimer rozpuszczalny w wodzie.
12. Czujnik według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że mieszanina (38) osadzona na odbieraku prądu (37) elektrody pomiarowej (20) zawiera pomiędzy 1 do 2000 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego i pomiędzy 1 a 10 000 gmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.
13. Czujnik według zastrz. 12, znamienny tym, że mieszanina (38) osadzona na odbieraku prądu (37) elektrody pomiarowej (20) zawiera pomiędzy 10 i 300 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego i pomiędzy 10 a 300 gmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.
14. Czujnik według zastrz. 13, znamienny tym, że mieszanina (38) osadzona na odbieraku prądu (37) elektrody pomiarowej (20) zawiera około 100 IU oksydazy glukozowej na mg pyłu węglowego i około 50 gmola czynnika pośredniczącego na mg pyłu węglowego.

* * *

169 972