PL168348B1

PL168348B1 - Sposób wytwarzania kompozycji i/lub substancji o aktywnosci przeciwnowotworowej PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL168348B1
Application number: PL92297647A
Authority: PL
Inventors: Arrigo Claudio D
Original assignee: Arrigo Claudio D
Priority date: 1991-05-29
Filing date: 1992-05-22
Publication date: 1996-02-29
Also published as: RU2104707C1; IE921545A1; BG61639B1; HUT64233A; DE69213886T2; MX9202547A; BG97371A; FI101042B; ITRM910372A0; HU9300244D0; PT100526A; ATE142886T1; FI930336A0; JPH05507735A; FI930336L; DK0541780T3; NO930271L; ITRM910372A1; ES2094914T3; NO309306B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania kompozycji i/lub substancji o aktywnosci przeciwnowotwo- rowej droga ekstrakcji materialu roslinnego, znamienny tym, ze czesci i/lub produkty ros- lin z rodziny Pittosporacea, w dowolnym stadium ich rozwoju lub dojrzalosci ekstrahuje sie przez macerowanie w alkoholu, a nastepnie skladniki ekstraktu rozdziela sie pomiedzy fazy przez mieszanie lub wytrzasanie powstalego roztworu z chloroformem, co najmniej czes- ciowo mieszajacym sie z alkoholem uzytym do ekstrakcji, po czym poszczególne fazy, nie- zaleznie od siebie, poddaje sie obróbce co najmniej jednym dalszym alkoholem, majacym wlasciwosci rozpuszczalnika dla co najmniej jednego ze skladników ekstraktu, po czym od- sacza sie wszelkie powstale zawiesiny, i rozpuszcza sie stala faze w alkoholu, ewentualnie rozdziela sie skladniki wystepujace w kazdej z cieklych faz i wyodrebnia sie wydzielone skladniki o aktywnosci przeciwnowotworowej i skladniki nie wykazujace tej aktywnosci, przy czym ekstrakty ewentualnie suszy sie i oczyszcza przed kazdym nastepnym etapem procesu PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji i/lub substancji mających przeciwnowotworową aktywność.

Chemioterapia przeciwnowotworową to jeden z bardziej obiecujących kierunków badań nad zwalczaniem chorób nowotworowych. Znane wyizolowane środki antyproliferacyjne pochodzą z bardzo wielu różnych źródeł i mają bardzo różne chemiczne właściwości. Wśród tych środków antyproliferacyjnych znajdują się też pewne substancje wyekstrahowane z roślin, takie jak kolchicyna i winkoleukoblastyna, z których pierwsza wyekstrahowana została z Colchicum Autumnale, a druga z Vinca Rosea. Mimo, że te antyproliferacyjne substancje posiadają mniejszą lub większą aktywność specyficznie przeciwnowotworową, ich selektywność wobec zdegenerowanych komórek jest na ogół słaba. Obawa przed możliwością ich szkodliwego działania na metabolizm zdrowych komórek stanowi ważną przeszkodę dla ich szerokiego stosowania

Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że niniejszy wynalazek umożliwia obejście wspomnianych ograniczeń i dostarcza przeciwnowotworowego środka chemioterapeutycznego opartego na aktywnych materiałach pochodzenia roślinnego o wysokiej selektywnej aktywności przeciwnowotworowej i o znacznie mniejszej toksyczności niż inne leki przeciwnowotworowe.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania substancji i/lub kompozycji o aktywności przeciwnow-otworowej drogą ekstrakcji substancji roślinnych polega na tym, ze części i/lub produkty roślin z rodziny Pittosporacea, w dowolnym stadium ich rozwoju lub dojrzałości ekstrahuje się przez macerowanie w alkoholu, a następnie składniki ekstraktu rozdziela się pomiędzy fazy przez mieszanie lub wytrząsanie powstałego roztworu z chloroformem, co najmniej częściowo mieszającym się z alkoholem użytym do ekstrakcji, po czym poszczególne fazy, niezależnie od siebie, poddaje się obróbce co najmniej jednym dalszym alkoholem, mającym właściwości rozpuszczalnika dla co najmniej jednego ze składników ekstraktu, przy czym odsącza się wszelkie powstałe zawiesiny, i rozpuszcza się stałą fazę w alkoholu, ewentualnie rozdziela się składniki występujące w każdej z ciekłych faz i wyodrębnia się wydzielone składniki o aktywności przeciwnowotworowej i składniki nie wykazujące tej aktywności, przy czym ekstrakty ewentualnie suszy się i oczyszcza przed każdym następnym etapem procesu.

Wśród roślin z rodziny Pittosporacea korzystne są rośliny z rodzaju Pittosporum, zwłaszcza wybrane z grupy obejmującej Pittosporum ondulatum, Pittosporum coriaceum, Pittosporum wridicolor, Pittosporum rhombipholium, Pittosporum eugenoides, Pittosporum crossifolium i Pittosporum Tobira i ich połączenia.

Rodzina Pittosporacea występuje na Dalekim Wschodzie (Japonia, Chiny), jednak dzięki łatwemu przystosowywaniu się, rośliny te rosną również w krajach śródziemnomorskich. W literaturze opisano do tej pory wyłącznie Pittosporum Tobira jako rośliną zawierającą substancje

168 348 o działaniu przeciwbakteryjnym i przeciwwirusowym (Planta Medica 1979, 36, 311-321; Journal of Natural Products 41, (1978), 5, 463-471).

Rozpuszczalnikiem może być alkohol. Dobre wyniki otrzymano przy użyciu alkoholu etylowego.

Stosunek objętościowy ograniczonego rozpuszczalnika do części roślin poddawanych obróbce korzystnie wynosi od 1:10 do 10:1.

Czas obróbki korzystnie wynosi od 5 minut do 3 miesięcy, przy czym tak duży zakres wartości czasu obróbki wynika z faktu, iż poszczególne gatunki roślin z rodziny Pittosporacea są w różnym stopniu podatne na tę obróbkę. Temperatura obróbki może wynosić 5-100°C. Oddzielenie składników od ekstraktu korzystnie prowadzi się drogą chromatografii. Dobre wyniki otrzymano przy zastosowaniu chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym lub kolumny do preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Ekstrakcję można prowadzić z użyciem etanolu, wyodrębniając składniki o czasie retencji (HPLC) około 1,157, 1,545, 1,883, 2,051, 2,273, 2,572 i 2,743.

Należy zaznaczyć, że próby analityczne HPLC, prowadzono przy użyciu chromatografu Perkin-Elmer serii 250 z kolumną RP18 125 mm x 4 mm z fazą ruchomą składającą się z metanolu-H₂O (80:20) przy długości fali 210 nm.

Po ekstrakcji etanolem otrzymany roztwór można wytrząsać c chloroformem z wytworzeniem dwu faz, fazy alkoholowo-chloroformowej o intensywnym zielonym zabarwieniu i fazy wodnej o barwie pomarańczowożóltej W tym przypadku składniki o aktywności przeciwnowotworowej znajdują się w fazie alkoholowo-chloroformowej. Wyodrębnianie składników o aktywności przeciwnowOtworowej prowadzi się chromatograficznie po wysuszeniu fazy alkoholowo-chloroformowej i rozpuszczeniu pozostałości w metanolu. Chromatografię roztworu metanolowego prowadzi się techniką HPLC, zbierając składniki mające czas retencji około 1,969, 2,296 i 2,756

Roztwór alkoholowo-chloroformowy można zatężyć przez odparowanie, po czym dodaje się alkoholu izopropylowego w celu utworzenia zawiesiny, którą przesącza się, stałą fazę suszy się na gorąco i sproszkowuje się w moździerzu Po ponownym rozpuszczeniu w mieszaninie etanol-woda, można ją oczyścić na kolumnie chromatograficznej z węglem aktywnym. Te dwie stałe frakcje (zanieczyszczona i czysta) rozpuszczone w mieszaninie etanol-woda lub w metanolu mogą być chromatograficznie rozdzielone techniką HPLC dla wyodrębnienia składników o czasie retencji około 1,157, 1,545 i 2,264.

Otrzymane sposobem według wynalazku substancje i kompozycje o aktywności przeciwnowotworowej można przeprowadzić w sole, inne związki lub kompleksy w celu nadania im rozpuszczalności w wodzie.

Substancjom i kompozycjom wytworzonym sposobem według wynalazku można nadać postać preparatu farmaceutycznego zawieraj ącego jako czynnik aktywny co najmniej jedną taką substancję lub kompozycję.

Preparatami farmaceutycznymi mogą być wodne roztwory do stosowania pozajelitowego, kapsułki do stosowania doustnego, czopki do stosowania doodbytniczego, globulki do stosowania dopochwowego, maści, balsamy, kremy i żele.

Wodne roztwory można umieszczać w fiolkach zawierających 0,1-2,5g, korzystnie 0,1-1,5 g, a zwłaszcza 0,2-1,0 g czynnika aktywnego.

W przypadku preparatu farmaceutycznego w postaci kapsułki, każda kapsułka zawiera 0,2-2,0 g, a korzystnie 0,8-1,2 g czynnika aktywnego

W prziypadku preparatu farmaceutycznego w postaci czopka do stosowania doodbytniczego, każdy czopek zawiera 0,2-2,5 g, a korzystnie 0,3-1,0 g lub 1,2-1,7 g czynnika aktywnego.

W przypadku preparatu farmaceutycznego w postaci globulki do stosowania dopochwowego, każda globulka zawiera 0,1-2,5 g, korzystnie 0,5-2,5 g, a zwłaszcza 0,3-1,7 g czynnika aktywnego

W przypadku preparatu farmaceutycznego w postaci maści, balsamu, kremu lub żelu miejscowa zaróbka zawiera 0,5-12%, a korzystnie 3-7% czynnika aktywnego.

168 348

Takie preparaty farmaceutyczne stosuje się w leczeniu chorób nowotworowych, korzystnie drogą iniekcji domięśniowych, dożylnych lub do jam ciała.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

Przykład I Sposób ekstrakcji i oczyszczania aktywnych czynników.

kg niedojrzałych owoców Pittosporum Tobira rozdrobniono dokładnie i zalano w temperaturze pokojowej taką samą ilością 55° alkoholu etylowego, tak aby pokryć rozdrobnione owoce (w przybliżeniu 1.1 objętościowo). Mieszaninę pozostawiono w stanie zanurzonym na co najmniej 30 dni, po czym przesączono 1000 ml alkoholowego ekstraktu otrzymanego jak wyżej umieszczono w rozdzielaczu wraz z taką samą objętością chloroformu Po wielokrotnym mieszaniu nastąpił rozdział, który zakończył się po 24 godzinach mieszania: w dolnej części rozdzielacza oddzielił się alkoholowo-chloroformowy roztwór o intensywnie zielonym kolorze, a w górnej części rozdzielacza wodny roztwór o barwie żółtopomarańczowej (orange soluble fraction = OSF), utworzony z substancji rozpuszczalnych w wodzie wyekstrahowanych z wody obecnej na początku w owocach. OSF występuje w ilości w przybliżeniu 20% objętościowych i tworzy się prawie wyłącznie ze składników mających RT w HPLC 1,141 (3,45% powierzchni), 1,440 (24,46% powierzchni), 1,593 (61,93% powierzchni). Substancję OSF równą w przybliżeniu 73% wagowo suchej substancji całego ekstraktu alkoholowego tworzy żółtobiały proszek, który nie tylko jest całkowicie nieaktywny wobec guzów doświadczalnych, ale faktycznie sprzyja ich rozwojowi wywołując jego przyspieszenie. Z tego względu substancję tą się usuwa. Pozostały roztwór alkoholowo-chloroformowy odparowuje się w temperaturze 30°C w wyparce obrotowej i suszy się. Uzyskuje się bezpostaciową substancję, o barwie ciemnozielonej, która po ponownym rozpuszczeniu w metanolu (1 mg/ml) w analizie z użyciem HPLC wykazuje znaczne stężenie aktywnych pików o czasach retencji w zakresie 1,969 (7,83% powierzchni) do 2,296 (40,12% powierzchni) i do 2,756 (1,47% powierzchni).

Przykład II. Sposób oczyszczania aktywnych czynników

Roztwór alkoholowo-chloroformowy powstały w wyniku operacji przeprowadzonych w przykładzie I (przerobiony z całości alkoholowego ekstraktu pozbawionego OSF), odparowuje się w kolbie wyparki obrotowej w temperaturze 45°C aż do zatężenia w przybliżeniu do objętości 30 ml (w przybliżeniu 1/35 całego początkowego ekstraktu alkoholowego). W tym momencie do kolby dodaje się alkohol izopropylowy w ilości równej 30% początkowej ilości ekstraktu alkoholowego (300 ml). Tworzy się zawiesina, ponieważ część substancji otrzymanych w całości alkoholowego ekstraktu pozbawionego OSF, które były rozpuszczalne zarówno w etanolu jak i w metanolu nie są rozpuszczalne w izopropanolu.

Otrzymaną tak zawiesinę przenosi się na filtr z szybko filtrującej bibuły. Osad osadzony na bibule suszy się na ciepło w temperaturze 45 °C Po wysuszeniu rozdrabnia się go dokładnie w porcelanowym moździerzu. Otrzymuje się w ten sposób w przybliżeniu 1500 mg żółtozielonego proszku. Proszek ten (dalej określany jako CIDI) rozpuszczony w metanolu i badany metodą chromatografii HPLC wykazuje RT 1,157 (78,83% powierzchni), 1,545 (16,25% powierzchni) i 2,264 (4,91% powierzchni). Alternatywnie przy użyciu kolumny z kulistym o średnicy 5 um Supelcosil (średnio polarna krzemionka pokryta aminopropylosilanem), fazy ruchomej CH₃CN-H₂O (3:1) przy przepływie z prędkością 1,5 ml/min. i detektora nadfioletu przy 217 nm otrzymuje się następujące wartości RT: 1,889 (stężenie 53,88); 2,640 (20,89); 3,145 (4,61), 3,420 (5,08); 3,942 (6,16); 4,722 (4,53); 5,255 (3,253); 6,287 (0,90) i 6,982 (0,66).

Na kolumnie Chromopack-Lichorsorb RP 18 (niepolarna krzemionka pokryta oktadecylosilanem w kształcie nieregularnych cząstek o średnicy 10 μ) z tym samym eluentem, przepływem i markerem otrzymano następujące piki. 1,460 (stężenie 65,98); 1,965 (20,87); 2,535 (1,86); 2,704 (2,05), 3,097 (1,74); 3,395 (3,38); 4,324 (0,85); 4,609 (0,93); 9,597 (0,88); 10,017(1,42). ,

Substancja CIDI po wyprażeniu pozostawia 3,17% pozostałości/. Analiza elementarna, w procentach wagowych (bez uwzględnienia pozostałości) jest następująca: C - 54,25%; H - 7,58%, C - 38,17%, co odpowiada empirycznemu wzorowi bliskiemu C15H25O8, a temperatura topnienia 196-222°C (rożki). Widmo w podczerwieni (Spektrofotometr IR Perkin-El6

168 348 mer Mod. 683) w pastylce KBr przy stężeniu 1 mg/100 mg wykazuje następujące widoczne pasma. 3400 cm^-1 rozciągnięte związane OH, 2960 cm¹, asymetryczne rozciągnięcie CH,, 2920 cm'⁵ asymetryczne rozciągnięte CH₂, 1720 cm- rozciągnięte C=O, 1610 cm¹ asymetryczne rozciągnięte C=O z COO'; 1460 cm¹ drgające CH; 1380 cm - drgające CH, (typowo z OCOCH3); 1250 cm-1 drgające OH; 1150, 1080 i 1040 cm- rozciągnięte C-O. Widmo w nadfiolecie (spektrofotometr UV-vis Perkin-Elmer mod. Lambda 5)

1. Roztwór w CH₃OH-H₂O (4:1), stężenie 6 x 10² mg/ml; maksimum absorpcji przy 202 nm, absorpcja szybko zmniejsza się aż do 260 nm, pozostaje stała w zakresie 260-330 nm, a następnie zmniejsza się ponownie

2. Roztwór w CH₃CN-H₂O (3:1), stężenie 6 x 10'² mg/ml, absorpcja szybko zmniejsza się od 200 do 260 nm, pozostaje prawie stała w zakresie 260-330 nm, po czym ponownie zmniejsza się.

Proszek 'CIDI jest nierozpuszczalny w acetonie, benzenie, chloroformie, eterze etylowym, eterze naftowym, alkoholu etylowym, alkoholu izopropylowym, rozpuszczalny jest w metanolu i wodzie.

Wodny roztwor CIDI ma pH 6,5

LD₅0 dla myszy Cr1:CD-1 (ICR) BR wynosi 1274,9 mg/kg (wartości skrajne 1041,2-1561,0 mg/kg) doustnie i 25 mg/kg (wartości skrajne 23,0-27,2 mg/kg) śródotrzewnowo.

Przykład III. Następny sposób oczyszczania aktywnych czynników.

g proszku CIDI otrzymanego sposobami z przykładów I i II rozpuszczono w 1000 ml roztworu alkoholu etylowego i wody (41) otrzymując 1% roztwór koloru zielonego. Przygotowano kolumnę chromatograficzną o średnicy 4,5 cm wyposażoną w porowatą przegrodę. Na przegrodę ułożono warstwę waty bawełnianej, a następnie warstwę piasku o wysokości w przybliżeniu 3 cm. Następnie wylano zawiesinę 35 g węgla aktywnego w etanolu Po ścisłym ułożeniu się węgla aktywnego przez kolumnę chromatograficzną przepuszczono roztwór proszku CIDI (rozpuszczonego jak opisano wyżej). Po przejściu przez kolumnę chromatograficzną całego roztworu CIDI, kolumnę przemywa się przez przepuszczenie 1000 ml samego rozpuszczalnika (alkohol etylowy-H₂O 4:1).

Otrzymuje się przezroczysty, bezbarwny roztwór, który zatęża się do maksymalnej granicy w wyparce obrotowej w temperaturze 45°C

Po dodaniu alkoholu izopropylowego następuje krystalizacja Po wysuszeniu nadal w wyparce obrotowej miele się w moździerzu i otrzymuje się biały proszek, który dalej określa sie jako czysty CIDI. Czysty CIDI stanowi 60% wag. CIDI

Proszek czystego CIDI, rozpuszczony w metanolu i badany zwykłą metodą HPLC wykazuje dwa główne piki o wartości RT 1,131 (87,54% powierzchni) i 1,551 (6,16% powierzchni).

Natomiast HPLC z detektorem UV przy 217 nm, z fazą ruchomą CH₃CN-H₂O (3:1), prędkości przepływu 1,5 ml/min daje następujące RT (główne piki):

na kolumnie z kulistym Supercosil LC-NH2-5 μ 1,885 (stężenie 19,60); 16,259 (stężenie 67,51);

2. na kolumnie z nieregularnym Chrompack-Lichrosorb RP18-10 μ: 1,617 (stężenie 87,74); 1,985 (3,69) i 2,134 (2,20).

Czysty CIDI jest białym, rozpuszczalnym w wodzie ciałem stałem, pozostawiającym po prażeniu 3,05% pozostałości.

Analiza elementarna w % wagowych (bez uwzględnienia pozostałości) dodaje: C - 48,82%; H- 7,06%; O - 44,12% o minimalnym wzorze empirycznym bliskim CeHoCL, i temperaturę topnienia 205-255°C (rozkł.).

Widmo w podczerwieni jest praktycznie takie samo jak produktu CIDI.

Widmo w nadfiolecie (spektrofotometr UV-vis Perkin-Elmer mod. Lambda 5):

1. Roztwór w CH₃OH-H₂O (4.1), stężenie 6 x 10'2 mg/ml; maksimum absorpcji przy 203 nm, absorpcja szybko zmniejsza się i praktycznie nie obserwuje się absorpcji powyżej 260 nm.

2. Roztwór w CH₃CN-H₂O (3:1), stężenie 6 x 10-2 _mg/_ml; absorpcja szybko zmniejsza się od 200 do 260 nm, po czym pozostaje prawie stała na poziomie bliskim zera

168 348

Rozpuszczalność czystego CIDI jest taka sama jak CIDI, jak również pH roztworu wodnego ma taką samą wartość.

LD50 śródotrzewnowo czystego CIDI dla myszy Cr1: CD-1 (ICR) BR wynosi

20,2 mg/kg (skrajne wartości 17,8-22,0 mg/kg).

Widma NMR CIDI i czystego CIDI

Widma NMR rejestrowano na aparacie Bruker AC 200 przy 200 MHz (proton) i 50 MHz (węgiel). Próbki spreparowano przez rozpuszczenie 90 mg produktu w 0,6 ml DMSO-ds z dodatkiem 10 mg soli sodowej kwasu 3-(trimetylosililo)-propano-sulfonowego (DSS) jako standardu wewnętrznego

Dla widm Ή 1000 pulsów (skanów) akumulowano przez stosowanie 30° impulsów, FID (swobodny zanik indukcji) poddano multiplikacji z funkcją Gaussa w celu zwiększenia rozdzielczości. Wymianę ruchliwych protonów przeprowadzano przez dodanie D₂O + CF₃COOH.

Dla widm ¹³C 6200 pulsów (CIDI) i 14900 pulsów (czysty CIDI) akumulowano przez stosowanie 90° .impulsów z heteronuklearnym odsprzęganiem w CPD.

Badania widm Ή wykazują obecność szeregu ruchliwych protonów w zakresie 3-5 ppm. Zanotowano obecność szeregu protonów typu alkilowego; alkilowe protony zmniejszają się w niższym zakresie. Możliwa obecność pewnych protonów winylowych i brak protonów aromatycznych.

Widma ¹³C potwierdzają powyższe dane, z obecnością większej liczby węgli alkilowych, mniej lub bardziej podstawionych. Zanotowano obecność pewnych pików w zakresie winylowym i pewnych pików w zakresie karbonylowym, przy czym grupy karbonylowe są typu kwasowego lub estrowego.

Badanie widm nie wykazuje zasadniczych różnic między obu mieszaninami. Możliwe wydają się różnice procentowości różnych składników.

Przykład IV Sposób chromatograficznego rozdzielenia aktywnych czynników.

Roztwór alkoholowo-chloroformowy otrzymany według przykładu I suszy się w wyparce obrotowej i rozpuszcza się w niewielkiej ilości metanolu (100 ml). Stosując ten roztwór przeprowadza się chromatograficzny rozdział zarówno na kolumnie z żelu krzemowego i, z większą dokładnością, na preparatywnej kolumnie HPLC. Otrzymano w ten sposób czyste frakcje, które jak stwierdzono wyżej odpowiadają pikom 1,157; 1,545; 1,883; 2,051; 2,273; 2,572 i 2,743.

Przykład V Próba wykazania aktywności przeciwnowotworowej zarówno in vitro jak in vivo.

Substancje i/lub kompozycje otrzymane według poprzednich przykładów, rozpuszczalne lub rozpuszczające się w wodzie przy użyciu środków powierzchniowo czynnych [Polisorbate 80 (pochodne mono-9-oktadekano poli/okso-1,2-etanodiilo/sorbitanu) lub Geronol (gliceryna-polietylen-glikol rycynylowy)], wykazują znaczną aktywność przeciwnowotworową wraz z dającym się zaakceptować poziomem toksyczności i bez aktywności immunosupresyjnej. Wykazano znakomitą selektywną aktywność przeciwnowotworową wobec komórek rakowych na poziomie histologicznym zarówno in vitro jak i in vivo przez ewidentne zmiany w komórkach rakowych, które uwidoczniają się przez zwiększenie objętości, zlepianie się, wykazują ekstrowersję i strzępienie błony komórkowej, ekstremalnie wodniczkową i spienioną cytoplazmą z hipochronną chromatyny jądrowej i bladymi jąderkami. Dowodem wysokiej selektywności posiadanej przez te substancje jest fakt, że wymienione wyżej uszkodzenia wcale nie występują w normalnych komórkach poddanych takiej samej obróbce

Aktywność przeciwnowotworową in vivo wymienionych wyżej substancji badano na szwajcarskich myszach Sa 180, stosując na ogół dawki w zakresie od 2 do 25 mg/kg/dzień zależnie od użytej substancji, podając śródotrzewnowo w ciągu 8 kolejnych dni, poczynając od następnego dnia po transplantacji. W porównaniu ze średnim czasem przeżycia w ciągu 25,8 dni w grupie zwierząt kontrolnych, odrzucenia raka zaobserwowano u 90% zwierząt poddanych kuracji, które z tego względu należy traktować jako definitywnie uratowane.

168 348

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 150 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kompozycji i/lub substancji o aktywności przeciwnowotworowej drogą ekstrakcji materiału roślinnego, znamienny tym, że części i/lub produkty roślin z rodziny Pittosporacea, w dowolnym stadium ich rozwoju lub dojrzałości ekstrahuje się przez macerowanie w alkoholu, a następnie składniki ekstraktu rozdziela się pomiędzy fazy przez mieszanie lub wytrząsanie powstałego roztworu z chloroformem, co najmniej częściowo mieszającym się z alkoholem użytym do ekstrakcji, po czym poszczególne fazy, niezależnie od siebie, poddaje się obróbce co najmniej jednym dalszym alkoholem, mającym właściwości rozpuszczalnika dla co najmniej jednego ze składników ekstraktu, po czym odsącza się wszelkie powstałe zawieśmy, i rozpuszcza się stałą fazę w alkoholu, ewentualnie rozdziela się składniki występujące w każdej z ciekłych faz i wyodrębnia się wydzielone składniki o aktywności przeciwnowotworowej i składniki nie wykazujące tej aktywności, przy czym ekstrakty ewentualnie suszy się i oczyszcza przed każdym następnym etapem procesu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się rośliny z rodzaju Pittosporum.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się rośliny wybrane z grupy obejmującej Pittosporum ondulatum, Pittosporum coriaceum, Pittosporum viridicolor, Pittosporum rhombipholium, Pittosporum eugenoides, Pittosporum crossifolium i Pittosporum Tobira i ich połączenia.
4. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się etanol.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się alkohol w stosunku objętościowym do części roślin przeznaczonych do obróbki od 1.10 do 10:1.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obróbkę prowadzi się w ciągu od 5 minut do 3 miesięcy.
7. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że obróbkę prowadzi się w temperaturze

5-100 C°.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że składniki ekstraktu rozdziela się chromatograficznie.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze składniki ekstraktu rozdziela się na kolumnie z żelem krzemionkowym.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że składniki ekstraktu rozdziela się na kolumnie do preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
11 Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że składniki ekstraktu rozdziela się techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej na kolumnie RP18 125 mm x 4 mm przy użyciu fazy ruchomej metanol.woda (80:20) oraz detekcji przy długości fali 210 nm i wyodrębnia się składniki o czasie retencji około 1,157, 1,545, 1,883, 2,051, 2,273, 2,572 i 2,743 minut i wyodrębnia się rozdzielone składniki.
12 Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się z użyciem etanolu, otrzymany roztwór wytrząsa się z chloroformem z wytworzeniem dwu faz, fazy alkoholowo-chloroformowej o kolorze intensywnie zielonym zawierającej związki o aktywności przeciwnowotworowej i fazy wodnej o kolorze zółto-pomarańczowym.
13 Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, 'że rozdział składników' o aktywności przeciwnowotworowej prowadzi się chromatograficznie po wysuszeniu fazy alkoholowo-chloroformowej i rozpuszczeniu pozostałości w metanolu
14. Sposób webłuw zastrz 13, znamienny tym, ze rożd ział sziadników o aktywności przeciwnowotworowej prowadzi się drogą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wyodrębnia się składniki o czasie retencji około 1,969, 2,296 i 2,756 minut

168 348
15. Sposób według zastrz 12, znamienny tym, że roztwór alkoholowo-chloroformowy odparowuje się do zmniejszenia objętości w przybliżeniu do 1/35 objętości początkowej roztworu alkoholowego, dodaje się alkohol izopropylowy z wytworzeniem zawiesiny, którą filtruje się, stałą fazę suszy się na ciepło i pozostałość rozdrabnia się do postaci zielonego proszku
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stałą fazę, rozpuszczoną w mieszaninie alkohol etylowy-woda o stosunku objętościowym 4:1 przepuszcza się przez kolumnę z węglem aktywnym, otrzymany przezroczysty bezbarwny roztwór zatęża się, krystalizuje się przez dodanie alkoholu izopropylowego i suszy się z wytworzeniem białego proszku, który w HPLC wykazuje dwa główne piki PT o wartości 1,131/87,54% powierzchni i 1,551/6,16% powierzchni).
17. Sposób według zastrz. 15, albo 16, znamienny tym, że stałe składniki rozpuszczone w metanolu rozdziela się techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wyodrębnia się składniki o czasie retencji około 1,157, 1,545 i 2,264 minut.