PL167547B1 - Sposób wytwarzania biopreparatu do ochrony korzeni podkładek drzew owocowych i róży przed guzowatością korzeni - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania biopreparatu do ochrony korzeni podkładek drzew owocowych i róży przed guzowatością korzeni, zawierającego żywe bakterie Agrobacterium radiobacter, szczep K-84, znamienny tym, że prowadzi się proces biosyntezy w wieloetapowej hodowli wgłębnej w fermentorach przemysłowych przy użyciu pożywki o składzie: pepton 0,1%, ekstrakt drożdżowy 0,3%, sacharoza 1%, azotan potasu 0,07%, fosforan potasu II zas. 0,1%, fosforan amonu I zas. 0,052%, inne sole mineralne i mikroelementy 0,015 - 0,020%, korzystnie przy pH 6,8 - 6,9, po czym wytworzoną kulturę bakterii zabezpiecza się przez wytworzenie koloidu ochronnego, otrzymanego w wyniku dodawania pochodnych celulozy, korzystnie tylozy, nie oddzielając jej od podłoża.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biopreparatu do ochrony korzeni podkładek drzew owocowych i róży przed guzowatością korzeni, zawierającego żywe bakterie Agrobacterium radiobacter, szczep K-84.

Guzowatość wywołana przez bakterie Agrobacterium tumefaciens jest ważnym problemem gospodarczym, ponieważ powoduje duże straty w szkółkarstwie. Stosowana dotychczas w Polsce ochrona roślin przed tą chorobą za pomocą metod agrotechnicznych oraz chemicznych nie zawsze daje zadawalające rezultaty. Natomiast metoda biologiczna z użyciem szczepu K-84jest bardziej efektywna i ostatnio nabiera coraz większego znaczenia. Metoda ta jest obecnie stosowana w różnych krajach (Glenister, 1987, American Nurseryman 165/8/: 102-105; Kerr, 1980, Plant Disease 64,1: 25-30; Lopez i in. 1987, Bulletin OEPP/EPPO 17:273-279; Moore, 1979, Soil-borne Plant Pathogens: 553-567, Acad.Press, London; Psallidas, 1988, Bulletin OEPP/EPPO 18: 61-66). Opisał ją po raz pierwszy Allen Kerr w Australii, który wykazał, że szczep K-84 wyizolowany z populacji bakterii występujących w glebie, jest bardzo zbliżony do patogena guzowatości korzeni, ale nie ma zdolności chorobotwórczych w stosunku do roślin (Kerr, 1972, J.Appl. Bacteriol, 35: 493-497; New, Kerr 1972, J.Appl Bacteriol. 35:2179-287). Wykazuje natomiast właściwości antagonistyczne w stosunku do wielu szczepów Agrobacterium tumefaciens. Zjawisko antagonizmu oparte jest głównie na wytwarzaniu przeszczep K-84 bakteriotoksyny o nazwie agrocyna 84. Jest to wysoce specyficzny antybiotyk nukleozydowy hamujący wzrost bakterii powodujących guzowatość korzeni oraz nawiązanie przez nie pasożytniczego stosunku z rośliną (Kerr, Htay, 1974, Physiol. Plant Path. 4: 37-44; Kerr, Tate, 1984, Microb. Sciences: 1-4).

Wysoka efektywność biologicznej metody, którą wykazano w licznych doświadczeniach upoważniała do prowadzenia badań nad opracowaniem metod hodowli Agrobacterium radiobacter, K-84 na dużą skalę oraz preparatu ochronnego dla potrzeb szkółkarstwa. W Australii szkółkarze otrzymują żywe bakterie na podłożu agarowym w butlach lekarskich o pojemności 250 cm³ (Kerr, informacja niepublikowana). W Stanach Zjednoczonych produkowane są preparaty: Norbac 84 C, w którym K-84 zawieszone są w płynnym podłożu oraz Galltrol zawierający bakterie na płytkach agarowych (Glenister, 1987, American Nurseryman 165 /8/: 102-105. W Nowej Zelandii preparat o nazwie Dygali zawiera bakterie K-84 (Dye, 1983 Horticulture News). We Włoszech szkółkarze otrzymują bakterie K-84 w formie liofilizatu w ampułkach (Bazzi, 1982, Proc.Int. Workshop on Crown Gall: 1-15, Swiss Federal Res.Station, Wadenswil). Na Węgrzech próby otrzymania bio167 547 preparatu zawierającego bakterie K-84 zawieszone na torfie podejmował przemysł farmaceutyczny (Siile, 1978, Phyt. Zeitschroft 91: 273-275). Hodowlę A.radiobecter, K-84 w fermentorach stalowych systemem napowietrzania prowadzono także w Hiszpanii (Lopez i in. 1981, Proc.Fifth Int.Corf.Pl.Path. Bacteria, Cali, Colombia: 538-548). Płyn pohodowlany mieszano z torfem.

W Polsce po raz pierwszy doświadczenia ze szczepem Agrobacterium radiobacter, K-84 przeprowadzono w Instytucie Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach (Sobiczewski, Piotrowski, 1983, Fruit Sc.Rep. 189-194, (Sobiczewski, 1985, Ochrona Roślin 2/3:

7-10), gdzie również wyprodukowano w skali laboratoryjnej preparat zawierający bakterie K-84. Ogromne potrzeby polskiego szkółkarstwa w tym zakresie skłoniły do prowadzenia doświadczeń nad opracowaniem przemysłowej metody wytwarzania biopreparatu. Nieoczekiwanie stwierdzono, że przy odpowiednio dobranych pożywkach i parametrach wzrostu szczepu K-84 można korzystnie rozmnażać go w wieloetapowych hodowlach wgłębnych, co jest warunkiem przemysłowego wyprodukowania biopreparatu. Sposobem według wynalazku biopreparat wytwarza się w procesie dwu lub więcej etapowej hodowli wgłębnej kultury K-84 na pożywkach zawierających przyswajalny azot, węglowodany, sole mineralne i mikroelementy. W końcowej fazie ostatniego etapu wzrostu do odpowiednio rozmnożonej kultury dodaje się substancje będące pochodnymi wielocukrów, szczególnie celulozy mające właściwości tworzenia roztworów koloidalnych. Utworzony w ten sposób roztwór koloidalny spełnia rolę ochronną dla bakterii K-84. Gotowy preparat ma formę płynną zagęszczoną.

Materiałem wyjściowym do wytwarzania biopreparatu jest wyselekcjonowana kultura K-84, A.radiobacter hodowana na skosach agarowych. Kulturę tę testuje się wstępnie w celu określenia aktywności antagonistycznej w stosunku do wrażliwych szczepów Agrobacterium tumefaciens. W celu wyhodowania inokulum świeżą kulturę pobraną ze skosów agarowych szczepi się płynną pożywkę o składzie: pepton 0,10%, sacharoza 1,00%, fosforan potasu II zas. 0,10%, azotan potasu 0,07%, fosforan amonu I zas. 0,052%, inne sole mineralne i mikroelementy 0,015% do 0,02%. Pożywka ma pH naturalne, które po sterylizacji utrzymuje się w granicach 6,8-6,9. Inokulum stanowi materiał do zaszczepienia pożywki w tankach fermentacyjnych. Hodowlę w tankach prowadzi się dwu, lub trzy lub czteroetapowo. Ostatni etap jest etapem produkcyjnym. Etapy poprzedzające są etapami posiewowymi. Dla hodowli materiału posiewowego stosuje się pożywkę o takim samym składzie jak dla hodowli inokułamych. W hodowli dwuetapowej kulturę szczepu K-84 wyhodowaną w tanku posiewowym przeszczepia się do pożywki w tanku produkcyjnym. Pożywka w tanku produkcyjnym różni się od pożywki stosowanej w tanku posiewowym tym, że wzbogacona jest dodatkiem ekstraktu drożdżowego w ilości 0,30%. Biosyntezę w tanku produkcyjnym prowadzi się w warunkach mieszania i napowietrzania do momentu uzyskania różnicy ekstynkcji ok. 1,5, co odpowiada gęstości bakterii ok. lxlO¹⁰ w 1 cm³ płynu hodowlanego. Wyhodowaną kulturę zabezpiecza się przez wytworzenie koloidu ochronnego otrzymanego w wyniku dodania pochodnych celulozy, korzystnie tylozy, nie oddzielając jej od podłoża. Zagęszczony roztwór jest gotową formą preparatu.

Zaletą wynalazku jest uzyskanie biopreparatu o wysokiej aktywności biologicznej zawierającego żywe bakterie K-84 o koncentracji ok. 1χ10^1θ komórek w 1 cm³ roztworu. Preparat jest łatwy do zastosowania w produkcji szkółkarskiej. Produkuje się go przy użyciu typowych urządzeń w przemyśle biotechnologicznym, na pożywkach zawierających łatwo dostępne surowce. Ich skład jest tak dobranym że nie zachodzi potrzeba korekty pH, co wyklucza ryzyko niekorzystnych zmian w jakości pożywki. Substancje dobrane do uzyskania koloidu ochronnego zapewniają wysoką trwałość biopreparatu.

Przykład I. Kulturą zebraną z dwóch skosów agarowych zaszczepia się kolbę stożkową o poj. 1000 cm³ zawierającą 150 cm³ sterylnej pożywki o składzie: pepton - Ig, sacharoza - lOg, fosforan potasu II zas. - lg, fosforan amonu I zas. - 0,52g, azotan potasu 0,70g, inne sole mineralne i mikroelementy - 0,15g, olej słonecznikowy - 0,50g, woda destylowana - uzupełnia do 1 dm³, pH pożywki naturalne: 6,8 - 6,9. Warunki sterylizacji 120°C, 0,1 MPa, 30 minut. Inkubację prowadzi się w warunkach tlenowych na wytrząsarce obrotowej w temp. 24-25°C w ciągu 24h.

167 547

Trzy kolby z tak rozmnożonym inokulum przeszczepia się do 15 dm³ pożywki o składzie jak wyżej przygotowanej w tanku metalowym o poj. 25 dm3. Hodowlę prowadzi się przy mieszaniu 300 obr./min i napowietrzaniu 0,8 dm3/dm3/min., w temp, 24-25°C w ciągu 18-22h. W czasie trwania procesu przyrost biomasy kontroluje się pomiarem różnicy ekstynkcji. Po uzyskaniu ekstynkcji ok. 1,0 kulturę przeszczepia się do tanku produkcyjnego zawierającego 1501 sterylnej pożywki o składzie: pepton - 1g, ekstrakt drożdżowy - 3g, sacharoza - 10g, fosforan potasu II zas. - 1g, azotan potasu - 0,7g, fosforan amonu I zas. - 0,52g, inne sole mineralne i mikroelement - 0,15g, olej słonecznikowy - 0,5g, woda destylowana - uzupełnia do 1 dm3, pH pożywki naturalne:

6,8 -6,9, warunki sterylizacji - 120°C, 0,1 MPa, 30 minut. Hodowlę kultury prowadzi się przy mieszaniu 300 obr./min, i napowietrzaniu 0,8 dm3/dm3/min., temp. 24-25°C. W czasie trwania procesu przyrost biomasy kontroluje się pomiarem różnicy ekstynkcji. Przy różnicy ekstynkcji ok. 1,5, co odpowiada 18-20 h proces hodowli kończy się, po czym wytworzoną kulturę bakterii zabezpiecza się przez wytworzenie koloidu ochronnego otrzymanego w wyniku dodawania pochodnych celulozy, korzystnie tylozy nie oddzielając jej od podłoża. Tak otrzymana koloidalna zawiesina zawiera ok. 1xl0¹⁰ żywych komórek Agrobacterium radiobacter, szczep K-84.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania biopreparatu do Ochrony korzeni podkładek drzew owocowych i róży przed guzowatością korzeni, zawierającego żywe bakterie Agrobacterium radiobacter, szczep K-84, znamienny tym, że prowadzi się proces biosyntezy w wieloetapowej hodowli wgłębnej w fermentorach przemysłowych przy użyciu pożywki o składzie: pepton 0,1%, ekstrakt drożdżowy 0,3%, sacharoza 1%, azotan potasu 0,07%, fosforan potasu II zas. 0,1%, fosforan amonu I zas. 0,052%, inne sole mineralne i mikroelementy 0,015 0,020%, korzystnie przy pH 6,8 - 6,9, po czym wytworzoną kulturę bakterii zabezpiecza się przez wytworzenie koloidu ochronnego, otrzymanego w wyniku dodawania pochodnych celulozy, korzystnie tylozy, nie oddzielając jej od podłoża.