PL166834B1

PL166834B1 - Sposób otrzymywania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz

Info

Publication number: PL166834B1
Application number: PL91289769A
Authority: PL
Inventors: Maciej Siewinski
Original assignee: Akad Medyczna
Priority date: 1991-04-04
Filing date: 1991-04-04
Publication date: 1995-06-30
Also published as: PL289769A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz metoda chromatografii powinowactwa, z zastosowaniemjako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, z wstępnym i końcowym oczyszczaniem, znamienny tym, że wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu, eluent odstawia się, zaś biosorbent wypakowuje się do wody i zawieszawwodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatuiy pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowujew temperaturze 253 K. 2. Sposób otrzymywania zmoczu inhibitorów tiolowych proteinaz metodą chromatografii powinowactwa z zastosowaniemjako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, z wstępnym i końcowym oczyszczaniem, znamienny tym, że wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu, biosorbent wypakowuje się do wody zaś eluent doprowadza do pH od 1 do 4, ogrzewa w temperaturze 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej i zobojętnia do pH = 7, po czym nanosi co najmniej dwukrotnie na kolumnę chromatograficzną z immobilizowaną papainą lub ficyną, eluent odstawia się, a biosorbent wypakowuje do wody i zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze 253 K.

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób otrzymywania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz, przeznaczonych do stosowania w leczeniu i diagnozowaniu chorób inwazyjnych.

Znane są sposoby otrzymywania inhibitorów tiolowych proteinaz metodą chromatografii powinowactwa, z moczu lub innych płynów ustrojowych, przy użyciu jako biosorbentów papainy immobilizowanej na nośniku Sepharose 4B i zmodyfikowanej przy pomocy rodanku potasu, co zostało przedstawione w publikacji: M. Jórvinen Acta Chem. Scand. Ser. B. 30, 933-940, bądź przy użyciu karboksymetylopapainy związanej z nośnikiem Sepharose 4B, co zostało opisane w publikacji: M.Abrahamson i inni, J. Biol. Chem. 261.1128211289,1986. Inhibitory związane zwymienionymi sorbentami wymywa się buforami zasadowymi opHod 11 do 12.

Wydajność obu metod nie przekracza 10-25%. Otrzymane inhibitory tiolowe proteinaz charakteryzują się bardzo małą trwałością, nie przekraczającą 24 godzin.

Wynalazek przedstawia sposób otrzymywania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, z wstępnym i końcowym oczyszczaniem. Istota wynalazku polega na tym, że wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu i eluent odstawia się. Natomiast biosorbent wypakowuje się do wody i zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 333-373 K

166 834 przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze 253 K.

Istota wynalazku polega na tym, że z odstawionego eluentu reaktywuje się związane w kompleksy inhibitory tiolowych proteinaz poprzez doprowadzenie go do pH od 1 do 4, ogrzewanie w temperaturze 333-373 K przez co najmniej 10 minut, ochłodzenie do temperatury pokojowej i zobojętnienie do pH = 7. Następnie eluent nanosi się na kolumnę chromatograficzną z immobilizowaną papainą lub ficyną, eluent odstawia się, a biosorbent wypakowuje do wody, zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze 253 K.

Otrzymywane tymi sposobami aktywne inhibitory tiolowych proteinaz, poprzez zakwaszanie i podgrzewanie biosorbentu wyodrębnionego z moczu chorego na chorobę inwazyjną, w tym nowotworową, podawane są w okolice ciała zmienione chorobowo lub dożylnie, co prowadzi do hamowania zachodzących zmian inwazyjnych . mhhibitoy wolne i reaktywowane sposobem według wynalazku z kompleksów zawartych w moczu chorego, mają ponadto zastosowanie przy diagnozowaniu rozwoju choroby inwazyjnej i przy ocenie skuteczności obrony organizmu.

Otrzymywanie tych inhibitorów sposobami według wynalazku odbywa się z bardzo wysoką wydajnością, wynoszącą nie mniej niż 90%. Uzyskane inhibitory charakteryzują się praktycznie nieograniczoną trwałością, mogą być przechowywane w zamrażarkach przez wiele miesięcy i nie tracą swoich właściwości.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wykonania.

Przykład 121 moczu pacjenta z chorobą nowotworową wiruje się przy 6000 x g przez 20 minut, zagęszcza na wyparce próżniowej w 313 K do 100 ml i dializuje do wody przez 24 godziny. 100 ml tak oczyszczonego wstępnie moczu nanosi się na kolumnę chromatograficzną o wymiarach 1,5 x 15 cm z papainą lub ficyną immobilizowaną na nośniku Sepharose 4B. Kolumnę równoważy się buforem 0,01 M fosforan; 0,2 M NaCl; 0,002 M EDTA; 0,002 M l-cysteina; 0,01% merkaptoetanol. Proces ten powtarza się trzykrotnie, aż aktywność izolowanych inhibitorów w moczu zmniejszy się do wartości poniżej 5% ilości początkowej. Kolumnę przemywa się 2,01 buforu użytego do jej równoważenia i następnie 100 ml wody destylowanej, po czym eluent odstawia się. Biosorbent z kolumny wypakowuje się do wody i mieszaninę tę doprowadza się do pH = 2 przy pomocy 1M HCl oraz ogrzewa do temperatury 353 K przez 20 minut. Następnie roztwór chłodzi się do około 293 K i zobojętnia 1M NaOH do pH = 7, po czy zagęszcza do dowolnej objętości na wyparce próżniowej przy 313 K i dializuje do wody. Dodatkowe oczyszczenie inhibitorów prowadzi się na kolumnie chromatograficznej z nośnikiem Sephadex G75. Otrzymuje się około 90% wolnych inhibitorów tiolowych proteinaz, przeznaczonych do prowadzenia terapii poprzez iniekcje do okolicy zmienionej nowotworowo lub dożylnie. Przez podaniem preparat oczyszcza się na filtrach bakteryjnych i bada jego jałowość.

Przykład II. Eluent odstawiony w trakcie realizacji procesu opisanego w przykładzie I doprowadza się do pH = 2 przy pomocy 1M HC1 i ogrzewa do temperatury 353 K przez czas 20 minut po czym chłodzi do temperatury 313 K i zobojętnia do pH = 7. Tak przygotowany roztwór nanosi się na nową kolumnę chromatograficzną z immobilizowaną papainą lub ficyną i dalej postępuje tak jak zostało opisane w przykładzie I. Bezpośrednio przed podaniem preparatu pacjentowi sączy się go na filtrach bakteryjnych i bada jego jałowość.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,100 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz metoda chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, z wstępnym i końcowym oczyszczaniem, znamienny tym, że wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu, eluent odstawia się, zaś biosorbent wypakowuje się do wody i zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze 253 K.
2. Sposób otrzymywania z moczu inhibitorów tiolowych proteinaz metodą chromatografii powinowactwa z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, z wstępnym i końcowym oczyszczaniem, znamienny tym, że wstępnie oczyszczony mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH około 6 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu, biosorbent wypakowuje się do wody zaś eluent doprowadza do pH od 1 do 4, ogrzewa w temperaturze 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej i zobojętnia do pH = 7, po czym nanosi co najmniej dwukrotnie na kolumnę chromatograficzną z immobilizowaną papainą lub ficyną, eluent odstawia się, a biosorbent wypakowuje do wody i zawiesza w wodzie, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa do temperatury 333-373 K przynajmniej przez 10 minut, następnie schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia do pH = 7, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze 253 K.