PL15085B1 - Sposób rozdzielania proteinaz i karboksywielopeptydaz. - Google Patents

Description

Trypsyna sklada sie z mieszaniny dwóch proteaz, a mianowicie z wlasciwej rozszczepiajacej proteinazy i z enzymu, rozszczepiajacego wielopeptydy. Enzym ten odróznia sie od peptydaz erepsyny tern, ze dziala tyllko na lancuchy welopep- tydów, zawierajacych wolna grupe karbo¬ ksylowa, podczas gdy znane dotychczas peptydazy rozszczepiaja tylko peptydy, zawierajace wolne grupy aminowe. Z tego powodu oznaczono wielopeptydaze try- psyny jako karboksy-wielopeptydaze.Oddzielenie zawartej w trypsynie pro¬ teinazy od karibokisywielopeptydazy zdola¬ no przeprowadzic przez absoirbcje zapomo- ca szczególnych gatunków tlenku glinu.Wynik oddzielenia zalezy stanowczo od nalezytego wytwarzania preparatu tlenku glinu. Straty enzymów przy tej metodzie rozdzielania sa zawsze znaczne. Sposób ten nie jest odpowiedni do zastosowania na iduza skale w procesach technicznych.Stwierdzono obecnie, ze proteinazy i karboksywielopeptydazy trypsyny daja sie rozdzielic na podstawie wlasnosci ich rozpuszczalnosci, poniewaz proteinaza rozpuszcza sie naogól latwiej niz kariboksy- wielopeptydaza. Do rozdzielenia uzywa sie znanych srodków dio stracania enzymów, jak np. acetonu, alkoholi lub nadajacych sie do tego cdlu soli, np. siarczanu amonu.Przy zastosowaniu acetonu lub alkoholównadaja sia A& tegtf cdu najlepiej wodne raptyf&rY tych * rozpuszczalników o steze¬ niu, wfnosz^eln c&olo 50%, Rozdzielenie to mozna z jednej sfarony przeprowadzic w ten sposób, ze roztwory enzymów zadaje sie srodkami straca jacemi az do osiagnie¬ cia pozadanego stezenia. Mozna natural¬ nie potepowac i w ten sposób, ze stale mie¬ szaniny enzymów wyciaga sie zapomoca roztworów o wymienionem stezeniu. Pro- teinaza nagromadza sie przytem w -roz¬ tworach, podczas gdy karboksywielopepty- daza znajduje sie w osadzie, wzglednie w pozostalosciach nierozpuszczonych. Z wy¬ zej wymienionych roztworów, w których nagromadzila sie proteinaza, mozna otrzy¬ mac profteinaze w czystym stanie i posta¬ ci stalej, np. zapomoca stracania przez do¬ danie znanych srodków stracajacych, jak np. acetonu, alkoholu i innych lub tez za¬ pomoca imnych sposobów, nadajacych sie do tego celu, jak np. zapomoca ostroznego odparowania roztworu i ostroznego susze¬ nia otrzymanej pozostalosci. Przy zastoso¬ waniu odpowiednich' warunków mozna juz zapomoca jednorazowego stracania wzglednie rozpuszczania osiagnac daleko idace (rozdzielenie, które w razie potrzeby moze byc wykoname powtórnie. Przy tym sposobie pracy straty enzymów sa nie¬ znaczne tak, ze sposób ten nadaje sie do procesu technicznego na duza skale.Jest rzecza nadspodziewana, ze tak bli¬ sko z soba spokrewnione enzymy jak pro- teteazy i karboksywielopeptydazy daja sie oddzielic od siebie przez proste czastkowe (frakcjonowane) trafctowamie znanemi srodkami do (stracania enzymów.Posziczególfle enzymy, otrzymywane wgcfclttg sposobu niniejszego moga, znalezc zastosowanie w przemysle farmaceutycz¬ nym.Przyklad L 5%-owy wodny roztwór zupelnie zaktywowanej (t. j. w najwyz¬ szym stopniu czynnej) trypsyny (dzialal¬ nosc której wifc nie moze byc Juz wiecej podwyzszona przez enterokinaze) zadaje sie ta sama iloscia objetosciowa acetonu.Powstaly osad zawiera okolo 80% karbo- kisywielopeptydazy i okolo 15 — 20% pro¬ teinazy. Osad ten wyosabnia sie zapomoca przesaczenia lub odwirowania i przerabia go zapomoca znanych sposobów na prepa¬ raty saiche. Z lugów macierzystych wydzie¬ la sie najwieksza czesc proteinazy (okolo 80% przez podwyzszenie stezenia acetonu) prawie do 70% i otrzymuje sie ja w sposób zwykly. Zawiera ona jeszcze male ilosci kariboksywielopeptydazy. Przez powtórze¬ nie tego procesu mozna przeprowadzic roz¬ dzielenie jeszcze dokladniej.W celu oznaczenia proteinazy metoda analityczna mozna poslugiwac sie jej zdol¬ noscia rozpuszczania zelatyny, a w celu o- kreslenia karboksywielopeptydazy — jej zdolnoscia rozkladania chlorowco-acylo- wanych kwasów aminowych, jak chloroa- cetylo-tyrozyny lub chloroacetylo-fenyloala- niny, np. przez okreslanie uwolnionych grup aminowych sposobem van Slyke.Przyklad II. 10 czesci wagowych trypsyny poddaje sie w ciagu jednej go¬ dziny 'dzialaniu 100 czesci wagowych wod¬ nego roztworu, zawierajacego 50%-ów objetosciowych acetonu. Nierozpuszczalna czesc wyosabnia sie zapomoca odsaczenia Inib odwirowania. Zawiera ona okolo 80% k^dboksywielopeptydazy obok nieznacz¬ nych ilosci proteinazy. Proteinaze straca sie z lugw macierzystych przez dodanie równej ilosci acetonu i otrzymuje sie ja z wydajnoscia okolo 80%.Przyklad III. Wodny roztwór trypsy¬ ny zada,}* sie w celu stracenia 1,2 czescia¬ mi objetosciowemu n-alkoholu propylowe¬ go. Osad zawiera okolo 75% kariboksywie¬ lopeptydazy; z oddzielonego od niej lugu pokrystalicznego otrzymuje sie przez do¬ danie dwukrotnej ilosci n-alkoholu propy¬ lowego protemaze z wydajnoscia okolo 80%, zmieszana z mala iloscia kadboksy- wielopeplydazy.W wymienianych przykladach mozna aceton i alkohole zastapic innem! odpo¬ wiedniemi srodkami stracajacemi lub wy¬ ciagajacemi. Otrzymanie pozostalej w roztwonze enzymu moze odbywac sie za¬ miast przez stracanie równiez pnzez su¬ szenie zapomoca rozpylania lub zapomoca innych sposobów. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe. Sposób rozdzielania proteinaz i kadbo- ksywielopeptydaz, znamienny tern, ze mie¬ szaniny obu enzymów poddaje sie czast¬ kowej (frakcjonowanej) ekstrakcji albo stracaniu zapomoca rozpuszczalników lub soli, znanych jako srodki do stracania en¬ zymów. # Kalle & Co. Aktiengesellschaft. Zastepca: M. Skrzypkowski, rzecznik patentowy. Druk L. Boguslawskiego i Ski, Warszawa. PL