PL103193B1 - Sposob oczyszczania insuliny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania in¬ suliny, pochodzacej ze zwierzecych gruczolów trzustko¬ wych.

Znane sa liczne metody oczyszczania insuliny, polegajace na jedno lub wielokrotnym wysalaniu insuliny z jej roz¬ tworów, wytracaniu w punkcie izoelektrycznym, sorpcji na zywicach jonowymiennych lub krystalizacji polaczenia cynkowego insuliny, przy czym w procesie oczyszczania zazwyczaj stosuje sie kilka z tych metod w róznej kolejnosci.

Handlowe preparaty insuliny, wytwarzane przy zasto¬ powaniu wyzej wymienionych metod oczyszczania, zawieraja przecietnie okolo 10% zanieczyszczen organicznych, które wywoluja u pacjentów niekorzystne objawy uboczne, takie jak odczyny alergiczne i powstawanie przeciwcial.

Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania insu¬ liny metoda ekstrakcji do rozpuszczalnika organicznego, nie stosowana dotychczas w tej dziedzinie.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze zanieczysz¬ czony roztwór insuliny poddaje sie wstepnemu oczysz¬ czeniu przez ekstrakcje insuliny do alkoholu alifatycznego o 3 — 4 atomach wegla w czasteczce przy wartosci pH nie wiekszej od 6, korzystnie przy wartosci pH = 1,5 ^- 3,5, i w obecnosci rozpuszczalnej w wodzie soli nieorganicznej.

Z otrzymanego roztworu alkoholowego insuline reekstrahuje sie do fazy wodnej przy wartosci pH = 6 — 10, korzystnie 7 — 9, lub wytraca za pomoca acetonu i rozpuszcza w wo¬ dzie wytracony osad. Jako rozpuszczalna w wodzie sól nieorganiczna korzystnie stosuje sie chlorek sodowy, zwlasz¬ cza w ilosci 5—25% wagowych w stosunku do ilosci wyjs¬ ciowego roztworu insuliny. 29 Jako wyjsciowy wodny roztwór insuliny stosuje sie; zazwyczaj roztwór, otrzymany po zageszczeniu kwasnego, surowego ekstraktu wodnoetanolowego insuliny i oddziele¬ niu substancji tluszczowych, lecz mozna równiez stosowac czesciowo oczyszczone roztwory insuliny, na przyklad roztwór, otrzymany przez rozpuszczenie w wodzie ciasta solnego po wysoleniu insuliny lub eluat z zywic jono¬ wymiennych.

Alkohol alifatyczny, na przyklad propanole lub butanole, stosuje sie w ilosci okolo 10 —100% objetosciowych w stosunku do wodnego roztworu insuliny.Proces ekstrakcji prowadzi sie zazwyczaj w temperaturze pokojowej. W takich warunkach do fazy alkoholowej przechodzi okolo 95% insuliny, znajdujacej sie w roztworze wodnym, natomiast wiekszosc zanieczyszczen pozostaje w wyjsciowym roz* tworze wodnym.

Reekstrakcje insuliny dofazy wodnej prowadzi sie korzyst¬ nie w obecnosci buforu, zwlaszcza buforu fosforanowego, zawierajacego jony sodowe i w temperaturze pokojowej lub nieco obnizonej (okolo +5°C h25°C).

Jesli do ekstrakcji stosuje sie alkohol alifatyczny, mie¬ szajacy sie z woda nieograniczenie, na przyklad propanol, to wtedy z otrzymanego po ekstrakcji roztworu alkoholowego wytraca sie insuline nadmiarem, acetonu (100 — 300% objetosciowych acetonu w stosunku do roztworu alkoholo¬ wego). Otrzymany osad insuliny rozpuszcza sie w wodzie, otrzymujac oczyszczony roztwór.

Z otrzymanego oczyszczonego roztworu insuline wysala sie za' pomoca chlorku sodowego przy wartosci pH = = 7,7 — 8,3, przy czym korzystnie stosuje sie 3 — 12% 103 193< 3 , wagowych chlorku sodowego w stosunku do roztworu insuliny.

Z wytraconego osadu oczyszczonej insuliny otrzymuje sie polaczenie cynkowe insuliny znanymi metodami.

W tym celu osad oddziela sie, rozpuszcza w 2%-wym roztworze kwasu cytrynowego i prowadzi sie krystalizacje przy wartosci pH = 5,8 — 6,8 w obecnosci kationu cyn¬ kowego, stosowanego w ilosci 0,033 g/g insuliny, znajdujacej sie w roztworze i w obecnosci acetonu, stosowanego w ilosci % objetosciowych w stosunku do wyjsciowego roztworu insuliny.

Preparaty insuliny, otrzymane przy uzyciu ekstrakcyjnej metody oczyszczania, wykazuja bardzo mala zawartosc organicznych zanieczyszczen wielkoczasteczkowych (2 — — 5%) i posiadaja wysoka aktywnosc biologiczna (24,5 — — 26,5j.m/mg).

Sposób wedlug wynalazku jest objasniony nastepujacymi przykladami: Przyklad!. Do 3000 ml wodnego roztworu insuliny (pH = 2,9, sucha masa 75 mg/ml, zawartosc insuliny 0,2 mg/ml), otrzymanego po oddzieleniu etanolu i tlusz¬ czów z wodnoetanolowego ekstraktu trzustki, dodaje sie przy energicznym mieszaniu 1500 ml n-propanolu, 10 ml % HC1 i 600 g NaCl. Po 1 godzinie rozdziela sie fazy na szybkoobrotowej wirówce. W fazie n-propanolowej (1440 ml) znajduje sie 96% insuliny, zawartej w wyjscio¬ wym roztworze. Otrzymany ekstrakt n-propanolowy za¬ geszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 800 ml i wytraca sie surowa insuline 2 objetosciami acetonu przy pH = 6,0. Osad odsacza sie, przemywa acetonem i suszy.Zawiera on 85% wyjsciowej ilosci insuliny.

Przyklad II. Do 3000 ml wodnego roztworu insuliny (otrzymanego, jak w przykladzie I) dodaje sie przy energicz¬ nym mieszaniu 1000 ml n-butanolu, 20 ml 10% roztworu HC1 i 750 g NaCl. Po 30 minutach rozdziela sie fazy na wirówce, roztwór wodny ekstrahuje sie powtórnie 300 ml n-butanolu i rozdziela fazy. Do polaczonych ekstraktów butanolowych (1320 ml) dodaje sie 400 ml wody destylo¬ wanej i przy mieszaniu koryguje sie pH do wartosci 7,85 % NaOH, a pó 45 minutach rozdziela sie fazy. Do warstwy wodnej (370 ml, sucha masa 16 mg/ml, 85% wyjs¬ ciowej ilosci insuliny), nie zawierajacej alkoholu n-butylo- wego, dodaje sie 48 g NaCl, po wymieszaniu pozostawia sie na 4 godziny, krystaliczny osad insuliny odwirowuje sie, przemywa mieszanine aceton — woda 1:3 (v/v) i suszy.

Otrzymana substancja o aktywnosci 22 j/mg zawiera 80% insuliny, zawartej w wyjsciowym roztworze.

Przyklad III. 100 1 zageszczonego ekstraktu z trzus¬ tki bydlecej, nie zawierajacego alkoholu etylowego i tlusz- W193 / 4 czów, o zawartosci insuliny 0,25 mg/ml, ekstrahuje sie 20 I alkoholu n-butylowego w obecnosci 20 kg NaCl przy wartosci pH = 2,45.

Ekstrakcje prowadzi sie w reaktorze przez 30 minut przy szybkim mieszaniu (2880 obr./min.), a nastepnie rozdziela sie fazy na ultrawirówce (18000 obr./min.).

Faze organiczna (19*5 1) ekstrahuje sie 5 litrami 0,1 N bu¬ foru fosforanowegoprzy pH = 7,8 przez 20 minut i rozdziela sie fazy. Do fazy wodnej (5,25 1), nie zawierajacej alkoholu io n-butylowego, dodaje sie 700 g NaCl, miesza przez 6 godzin w temperaturze +20°C i oddziela osad insuliny na wirówce.

Insuline rozpuszcza sie w 1 12% roztworu kwasu cytryno¬ wego, podnosi sie pH do wartosci 8,1, usuwa osad, a do klarownego roztworu dodaje sie 11,5 ml 10% roztworu ZnCl2J 150 ml acetonu i obniza sie pH roztworu 10%-owym HC1 do wartosci 6,65. Po pojawieniu sie krysztalów insuliny chlodzi sie roztwór do temperatury +18°C, a nastepnie utrzymujac w tej temperaturze, obniza sie pH- 10%-wym HC1 do wartosci 5,9 w ciagu 24 godzin. Krystaliczny roz- twór insuliny oddziela sie na wirówce przemywa acetonem, eterem i suszy w temperaturze +35°C. Otrzymuje sie 16,75 g insuliny a aktywnosci biologicznej 25,5 j/mg (wydajnosc 67%).

Claims (4)

Zastrzezenia pa ten to w e

1. Sposób oczyszczania insuliny, w którym zanieczysz¬ czony roztwór insuliny poddaje sie wstepnemu oczyszcza¬ niu, a nastepnie insuline wysala sie z oczyszczonego roz¬ tworu i krystalizuje z buforu cytrynianowego w obecnosci 30 kationów cynkowych, znamienny tym, ze wstepne oczyszczanie zanieczyszczonego roztworu prowadzi sie przez ekstrakcje insuliny do alkoholu alifatycznego o 3 — 4 atomach wegla w czasteczce przy wartosci pH nie wiekszej od 6, korzystnie przy wartosci pH = 1,5 — 3,5, i w óbec- 35 nosci rozpuszczalnej w wodzie soli nieorganicznej, a naste¬ pnie reekstrakcje z fazy alkoholowej do fazy wodnej przy wartosci pH = 6 — 10, korzystnie 7 — 9, lub wytracenie z fazy alkoholowej za pomoca acetonu i rozpuszczenie w wodzie. 40

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako rozpuszczalna w wodzie sól nieorganiczna stosuje sie chlorek sodowy w^ilosci 5 — 25% wagowych w stosunku do ilosci wyjsciowego zanieczyszczonego roztworu insuliny.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reekstra- 45 keje insuliny z fazy alkoholowej do fazy wodnej prowadzi sie w obecnosci buforu, korzystnie buforu fosforanowego, zawierajacego jony sodowe.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze insuline wysala sie przy wartosci pH = 7,7 — 8,3. Cena 45 zl LZG Z-d 3, zam. 676-79, nakl. 95+20 egz.