NO874882L - Fremgangsmaate ved konsentrering av faktor viii. - Google Patents

Description

Metode for isolering av koagulasjonsfaktor VIII

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for isolering av koagulasjonsfaktor VIII fra blod.

Hemofili A er en arvelig blødersykdom som skyldes at pasienten mangler evnen til å syntetisere et protein, Faktor VIII, som er nødvendig for at blod skal kunne koagulere. Det viktigste behandlingsprinsipp ved oppståtte blødninger hos hemofili A pasienter er tilførsel av Faktor VIII.

Faktor VIII isoleres fra plasma fra friske blodgivere.

Ved en vanlig blodtapping vil man få ca. 200 ml plasma. Den

lave konsentrasjonen i plasma gjør at Faktor VIII må oppkonsen-treres før den kan benyttes i behandlings-øyemed. Dette skjer ved kryopresipitering, det vil si at plasmaet fryses ned til - 70°C for minst et døgn og tines deretter langsomt. Ved denne prosessen vil en del plasmaproteiner felles ut og deriblandt Faktor VIII. På grunn av proteinets varmelabilitet vil imidlertid denne prosedyren medføre et betydelig tap av Faktor Vlll-aktivitet (50-70% tap).

For å fremstille en behandlingsenhet Faktor Vlll-konsentrat trengs plasma fra 5-6 blodgivere (vel 1 liter plasma). En pasient på 60 kg. trenger én Faktor VIII enhet ved en mindre blødning, mens det ved en større blødning eller en tyngre pasient trengs flere enheter. Pasientene vil dessuten etter hvert danne nøytraliserende antistoffer mot Faktor VIII - noe som medfører at behandlingsdosene måøkes.

På verdensbasis er Faktor Vlll-konsentrat mangelvare.

Et alvorlig problem i forbindelse med Faktor VIII behandling er risikoen for overføring av smittestoffer. Sjansen for at Faktor VIII konsentrat fremstilt etter dagens metoder skal inneholde vira som hepatitt B, non A non B hepatitt eller AIDS-virus er ikke ubetydelig. Tiltak som kan redusere smitte-risikoen har høy prioritet. Idag benyttes varmebehandling for å inaktivere virus, men denne prosessen medfører samtidig en betydelig ødeleggelse av Faktor VIII aktiviteten, slik at den totale gevinsten ved varmebehandling er usikker.

Halveringstiden for Faktor VIII er omkring 10 timer, og det betyr at hastigheten for nysyntese er tilsvarende stor. Økt blødningsrisiko hos giver oppstår ikke før Faktor VIII konsentrasjonen reduseres til under 10% av normalverdien. Dette innebærer at en blodgiver kan donere Faktor VIII mengder langt utover innholdet i 200 ml plasma som oppnås ved en vanlig blodgiving.

Mot denne bakgrunn vil man foreslå et nytt prinsipp for isolering av Faktor VIII som reduserer infeksjonsrisikoen og øker Faktor VIII mengden pr. donasjon. Prinsippet består i at man lar giverens blod passere et filter, plasmaseparator, som skiller blodceller fra plasma. Blodcellene føres tilbake til pasienten, mens plasmaet ledes via et filter 2, plasma filter, med en maskestørrelse som gjør at proteiner av størrelse som Faktor VIII (molekylvekt 180000) holdes tilbake. Andre plasmakomponenter som f.eks. albumin (65000) vil passere filteret og ledes tilbake til pasienten. Dersom filter 1, plasmaseparatoren, har en maskestørrelse som holder tilbake komponenter større enn f.eks. 20 nm, så vil viruspartikler ikke kunne passere membranen, og man vil derved forhindre at infeksiøst materiale overføres sammen med Faktor VIII.

På grunn av Faktor VIII's labile karakter vil det være en fordel om denne isoleringsprosedyren foregår ved lav temperatur.

Målet for foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe en fremgangsmåte for isolering av Faktor VIII i blodplasma som fører til at man får en bedre utvinningsgrad enn tidligere og samtidig reduserer faren for å overføre smittestoffer til mottaker.

Dette oppnås ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ved at man fører blod som inneholdere Faktor VIII gjennom et ikke-ekskluderende første filter (plasmaseparator)

som holder tilbake blodceller og eventuelle smittestoffer og videre fører plasmaet (filtratet) til et ekskluderende andre filter (plasmafilter) som holder Faktor VIII tilbake, men er permeabelt for mindre komponenter som f.eks. albumin, og samler opp det Faktor Vlll-anrikede retentat.

Fortrinnsvis føres retentatet i resirkulasjon til plasma-strømmen mellom første og andre filter.

Særlig vil man ifølge foreliggende oppfinnelse oppnå dette ved at plasmaet fra plasmaseparator føres inn i en avkjølt beholderanordning hvorfra plasma føres videre til et plasmafilter som i det vesentlige holder tilbake Faktor VIII men slipper gjennom mindre komponenter som albumin. Det tilbakeholdte plasmaet (retentatet) i plasmafilteret føres via et kjøle-element tilbake til beholderanordningen hvor plasmaet fra plasmaseparatoren først kommer og blandes med dette, som så igjen føres til plasmafilteret slik at plasmamengden som filtreres gjennom plasmaseparatoren i volum i det vesentlige tilsvarer filtratvolumet fra plasmafilteret, og etter en ønsket operasjonstid tappes plasmaet i resirkulasjonskretsen (beholderanordningen) som er sterkt anriket på Faktor VIII.

Som et kjøle-element i dette sirkulasjons-systemet anvender man fortrinnsvis et peltierelement. Med fordel drives dette peltierelement slik at plasmaet har en temperatur på 3-5° C-

Også temperaturen i beholderanordningen holdes på 3-5° C under sirkuleringen i systemet.

Med fordel kan plasmaet i resirkulasjonen kjøres med en hgastighet på ca. 500 ml/min.

Filtratet fra plasmafilteret vil ledes via et varme-element slik at det antar en temperatur på 37° C før det returneres til blodgiver.

I Fabio's apheresesystem, Fasting Biotech A/S, Trondheim, Norge som er beskrevet i norsk patentsøknad 86.4728, benyttes et resirkulasjonssystem mellom filter 1, plasmaseparator, og filter 2, plasmafilter. Dette resirkulasjonsprinsippet hindrer tiltetting av filter 2. I resirkulasjonskretsen er det dessuten inkorporert et kjøleelement som gjør at man i re-sirkulas jonskretsen kan oppnå en temperatur på f.eks. 4°C. Dette vil virke stabiliserende på et varmelabilt protein som Faktor VIII.

Eksperimentelt

For å undersøke muligheten for isolering av Faktor VIII ved dobbelt membran-filtrering, benyttet man Fabio's apheresesystem Fasting Biotech A/S, Trondheim, Norge med ASAHI filter AP05H (ASAHI Medical Co., Tokyo, Japan) som filter 1 med cut off 3 x IO<6>og ASAHI filter AC 1760 som filter 2 med cut off 10s . I resirkulasjonskretsen var det innkoblet en bag med volum ca. 0,5 liter, slik at det totale plasmavolum i resirkulasjonskretsen var 0,7 liter. Faktor Vlll-aktiviteten ble målt med Cephotest (Nycomed A/S, Oslo, Norge) etter metode beskrevet av produsenten.

Faktor VTII-aktiviteten i plasma fra blodgiver var 0,9 enheter pr. ml. Faktor VTII-aktiviteten i resirkulasjonskretsen etter at 1,5 liter plasma hadde passert filter 1 var 1,8

enheter pr. ml., mens konsentrasjonen av Faktor VIII etter at 3 liter plasma hadde passert filter 1 var 2,5 enheter pr. ml.

Med et antatt plasmavolum på 3 liter innebærer dette at man ved denne metoden har isolert ca. 65% av Faktor VIII aktiviteten. Analysene indikerer også at den biologiske aktivitet av Faktor VIII er besvart under isoleringsprosedyren. \

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved konsentrering av Faktor VIII, karakterisert ved at man fører blod som inneholdere^ Faktor VIII gjennom et ikke-ekskluderende første filter (plasmaseparator) som holder tilbake røde blodceller og videre fører plasmaet (filtratet) til et ekskluderende andre filter som holder Faktor VIII tilbake, men er permeabelt for albumin, og samler det Faktor Vlll-anrikede retentatet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at retentatet føres i resirkulasjon til plasmastrømmen mellom det første og andre filter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2 ved konsentrering av Faktor VIII fra blod, karakterisert ved at blodet føres gjennom et første membranfilter (plasma-J> separator) som ho- lder tilbake blodlegemer og smi.ttestoffer , ^Filtratet føres mn i en avkjølt beholderanordnmg, fortrinnsvis med en tappeanordning, videre som plasma, fra nevnte beholderanordning til et andre membranfilter som i det vesentlige holder tilbake Faktor VIII, men slipper gjennom albumin med en molekylvekt på ca. 65.000, den tilbakeholdte strøm (retentatet) i membranfilteret føres tilbake gjennom et kjøle-element til beholderanordningen hvortil plasmaet fra det første membranfilteret først kommer, blandes med dette, og føres på nytt sammen med dette til plasmafilteret og fra dette resirkulasjonssystem tappes blodplasma som er anriket på Faktor VIII, fortrinnsvis fra beholderanordningen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 og 3 karakterisert ved at det som kjøle-element anvendes et peltierelement.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2 og 3 karakterisert ved at kjøle-elementet drives ved en temperatur på ned til 3 - 5° C.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at temperaturen i beholderanordningen holdes på ned til 3 - 5°C under sirkuleringen i systemet.