NO872130L - Nye immuno-suppressive stoffer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye immuno-suppressive stoffer, heretter angitt ved numrene 55185 RP og 59451 RP, deres fremstilling samt preparater inneholdende disse.

55185 RP og 59451 RP kan oppnås utfra egnede kulturmiljøer av en ny mikroorganisme som defineres nærmere senere, tilhørende genus streptomyces og her kalt Streptomyces sp. S-16328 (CBS 162.86) .

55185 RP og 59451 RP er cyklodepsipeptider som tilsvarer den generelle formel:

der X er et kloratom (55185 RP) eller hydrogen (59451 RP). 55185 RP karakteriseres ved de følgende fysiko-kjemiske egenskaper: utseende: hvitt til blekt gult amorft pulver; oppløselighet: oppløselig i metanol, etanol, etylacetat,

aceton, acetonitril, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, uoppløselig i vann (0,1 til 0,3% alt etter pH-verdi),

etyleter og heksan.

Sammensetning: 55185 Rp tilsvarer bruttoformelen:

CifeH^eCIN-^Oia. Prosentualsammensetning er:

- Smeltepunkt: over 300°C;

20

- rotasjonsevne: [a]D = +20,5° ± 1,4° (c = 0,5; metanol)

Strukturen til 55185 RP er bestemt utfra ultrafiolett, infrarødt, samt PMR og<13>C-resonans;

ultrafiolett spektrum: (bestemt utfra en metanolisk oppløsning av 267,5 ug/ml i 1 mm tykkelse);

Åmax = 274 nm (e! % = 219, e = 20240)

Man observerer en skulder ved 230 nm.

Det ultrafiolette spektrum er ikke modifisert ved tilsetning av saltsyre. Etter tilsetning av soda observeres en bato-krom-foskyvning fra 230 til 247 nm og fra 274 til 295 nm.

Det ultrafiolette spektrum til 55185 RP er vist' i fig. 1; IR-spektrum: (bestemmelse fra tabletter i blanding med

KBr).

IR-spekteret er vist i fig. 2 der abcissen viser bølgetallet i cm-<1>og ordinaten av de optiske densiteter.

Tabell I viser de prinsipielle IR-absorpsjonsbånd for produktet, uttrykt i bølgetall (cm~<l>).

- Massespektrum:

Ved FAB-ionisering (bombardering ved hurtige atomer med et knippe xenon-atomer ved 8 keV) med som matrise en blanding av glyserol og thioglyserol og i et masseområde som befinner seg mellom 400 og 1000 urna, er basistoppen et pseudo-molekylært MH<*->ion = 924 med en massiv isotopisk karakteristikk for nærværet av et kloratom.

Ionene som ble observert ved massene M/z = 650, M/z = 567 og M/z = 506 tilsvarer de nedenfor angitte fragmenter:

Ved desorpsjon/kjemisk ionisering (DCI) med NH3 som reaktant-gass oppvises den sistnevnte topp ved M/z = 880 (MH + - CO^») . Massefragmentene 275 og 753 tilsvarer de følgende strukturer: Elektronisk støt (EI) (elektronbombardement ved 70 eV), observeres ved den sistnevnte topp ved massen M/z = 521. Massefragmentene M/z = 91 og M/z = 120 karakteriseres ved nærværet av fenylalanin (F); - protonet NMR og 13C NMR;

spektrene registreres i DMSO Ds ved å arbeide ved 400,13 MHz for protonspekteret og 100,6 MHz for karbonspekteret, alt ved 40 °C.

Bidragene er gitt i ppm i forhold til den sentrale DMSO-linje (2,5 ppm for proton; 39,5 ppm for karbon).

Analysen av den protonkjernemagnetiske resonnansspektroskopi

er gitt i tabell II:

Koblingskonstanten J er uttrykt i Hz:

d = dublett s = singlett bs = bred singlett m = multiplett T = treonin A = alanin F = fenylalanin FG = fenylglycin

C1P = klorpyrrol.

De resultater som oppnås via<13>C er de følgende:

Ved tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksyd ved bruk av oppløsningsmiddelblandingen diklor:1,2-etanmetanol i volumforholdet 80:20, ligger Rf-verdien nær 0,5. På Merck-plater benyttes oppløsningsblandingen acetonitril:vann inneholdende 3% NaCl i volumforholdet 40:60 og her er Rf-verdien nær 0,14 '(viser en orangéfarging med Ehrlich-reagens).

59451 RP karakteriseres ved følgende fysiko-kjemiske egenskaper: utseende: hvitt til blekt gult amorft pulver; oppløselighet: oppløselig i metanol, etanol, etylacetat,

aceton, acetonitril, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, uoppløselig i vann (0,1 til 0,3 % alt etter pH-verdi),

etyleter og heksan;

sammensetning: 59451 RP tilsvarer bruttoformelen

C^eH^-^N^O Prosentualsammensetning er:

smeltepunkt: 275-280°C (dekomponering)

20

rotasjonsevne: ta]D = +24,3° ±1° (c = 0,5, metanol).

Strukturen til 59451 RP er bestemt utfra ultrafiolett, IR- og proton- og13C-NMR.

Ultrafiolett spektrum (bestemmelse utfra en metanolisk oppløsning med 38jig/ml i 1 cm tykkelse) .

Xmax = 268 nm (e] *m = 223, e = 1 9864)

UV-spektrum for 59451 RP representeres ved fig. 3.

IR-spektrum (bestemmelse utfra tabletter i blanding med

KBr) .

IR-spekteret er representert ved fig. 4 hvori abcissen viser bølgetallet i cm-<1>og ordinatene de optiske densiteter.

I tabell III er det angitt de infrarøde hovedabsorpsjonsbånd for 59451 RP, uttrykt i bølgetall, cm"<1>.

- Massespektrum

Ved FAB-ionisering (bombardement ved hurtige atomer med et xenon-atomknippe ved 8 keV) med som matrise en blanding av glyserol-thioglyserol, er basistoppen det pseudomolekylære ion MH<*>= 890.

Man observerer ioner med masser M/z = 781 og M/z = 650.

Ionet som er observert ved M/z = 650 tilsvarer fragmentet:

Desorpsjon/kjemisk ionisering (DCI) med NH3 som gass-reaktant viser massefragmenter M/z = 241 og M/z = 341, noe som tilsvarer de følgende strukturer:

- proton- og13C NMR.

Spektrene opptas i DMSO De ved å arbeide ved 250 MHz og 100,6 MHz for karbonspektroskopi.

Resultatene er angitt i ppm i forhold til den sentrale DMSO-linje (2,5 ppm for proton-; 39,5 ppm for karbonspektroskopi).

Protonkjernemagnetiske resonnansresultater er gitt i tabell

IV.

1:3,C NMR-spekteret til 59451 RP er identisk med det til 55185 RP ±0,2 ppm bortsett fra pyrroldelen:

Ved' tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksyd og under anvendelse av 1,2-dikloretan:metanol i volumforholdet 80:20 som oppløsningsmiddel ligger Rf-verdien nær 0,5. På Merck-silisiumdioksydplater og ved bruk av acetonitril:vann inneholdende 3% NaCl i volumforholdet 40:60, ligger Rf-verdien nær 0,21 (bestemmelse ved rødfarging ved Ehrlich-reagens) .

55185 RP og 59451 RP kan karakteriseres ved fargereaksjonene med forskjellige fargereagenser. De gir positive reaksjoner med jod, Gibbs reagens, vanillinsvovelsyre, jern III klorid, Greig-Leaback-reagens (klor-tolidin) og Ehrlich-reagens. Forbindelsene gir negative reaksjoner med ninhydrin og Dragendorff-reagensen.

Organismen som produserer 55185 RP og 59451 RP er en aktino-mycetal som er isolert fra en jordprøve funnet i Spania ved Escandon og som er gitt nummeret S-16328. En prøve av denne mikroorganisme er deponert ved "Centraalbureau voor Schimmel-cultures å Baarn" i Nederland der den er gitt. referansenum-meret CBS 162.86.

Denne organisme som oppviser karakteristika som ikke har tillatt å identifisere den innen en ramme som allerede beskrevet, skal anses som et nytt spece og kalles heretter Streptomyces sp. S-16328.

Isoleringen gjennomføres ifølge en generell metode som består av å bringe en liten mengde jord i suspensjon i sterilt desillert vann, og fortynne suspensjonen til forskjellige konsentrasjoner og å trekke av et lite volum av hver fortynn-elsesgradient til overflaten av en Petri-skål inneholdende et gel-næringsmiljø. Etter inkubering noen dager ved 26°C, noe som tillater at mikroorganismene utvikles, blir koloniene man ønsker å isolere for å forfølge dem videre, trukket av og podet igjen på gel-næringsmidler for å oppnå mere rikelige kulturer.

Actinomycetalen S-16328 tilhører familien Streptomycetaceae, genus Streptomyces, da celleveggen inneholder L diamino-2,6 pimelinsyre.

Streptomyces S-16328 danner piggede sylindriske sporer med dimensjonen 0,4 til 0,6 um/1 til 1,2 ] im. De rette eller forgrenede sporkjedene er lange og omfatter hyppig flere titalls sporer. Sporoforene er enkle. På grunn av sporu-leringen plasseres denne stamme i seksjonen Rectus Flexi-bilis i Pridhams klassifisering.

Streptomyces S-16328 oppviser et sporulert luftmycel med beige-rosa farge. Dette utvikles godt ved 28°C. Fargen til det vegetative mycel går vanligvis, alt etter dyrkingsmiljø, fra gullig hvitt til blek kastanje.-

Denne streptomyces gir ikke pigment som er oppløselig i de miljøer der de er observert.

I de kulturer som er oppnådd ved 28°C oppvises følgende biokjemiske karakteristika:

Dyrkingskarakteristika for streptomyces er samlet i tabell V. Det er de kulturer som kom frem til et stabilt utviklings-stadium, dvs. etter 2 - 3 uker ved 28°C. Disse karakteristika observeres på næringsgeler og næringsekstrakter som vanligvis benyttes for å bestemme de morfologiske egenskaper for streptomycesarter.

Dyrkingen på gelmiljø gjennomføres i Petriskåler bortsett fra miljøene ISPe, ISP7 og Waksmanmelanin eller der de gjennom-føres på skrågelkulturer. Referansen eller kulturmiljø-betingelsene er som følger: Ref. 1: "Methods for characterization of Streptomyces species", International Journal of Systematic Bacteriology - E.B. Shirling og D. Gottlieb, vol. 16, n°3, 1966 s. 313-340.

Ref. 2: "Melanin formation medium" S.A. Waksman, The Actino-mycetes, vol. 2, n°42, s. 333, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.

Ref. 3: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria", Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. IIbo-18.

Ref. 4: "The Taxonomy of soil Bacteria" - R.E. Gordon, Ecology of Soil Bacteria, Liverpool University Press 1967, T.R.G. Gray, B. Parkinson Ed.

Ref. 5: "Plain Gelatin" fremstilt i henhold til det som angis i "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacte ria", Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.

IIoo"18•

Ref. 6: Kommersielt fløtepulver, rekonstituert i henhold til fabrikantens indikasjoner. Fremgangsmåten for fremstilling av 55185 RP og 59451 består i det vesentlige av å dyrke Streptomyces sp. S-16328 eller produserende mutanter derav i et miljø og under betingelser som er egnet, og deretter å separere produktet som dannes under dyrkingen.

Dyrkingen av Streptomyces sp. S-16328 kan gjennomføres på en hvilken som helst overflate som er aerob på overflaten eller i dybden, men det sistnevnte er å foretrekke av hensikts-messighetsgrunner. Man benytter for dette formålet de forskjellige typer apparater som benyttes ved fermenteringer.

Man kan spesielt benytte følgende rute ved gjennomføring av fremgangsmåten:

Fermenteringsmiljøet må i det vesentlige inneholde en karbonkilde og en kilde for assimilerbar nitrogen, mineral-elementer og spesielt klor, og evt. vekstfaktorer, alt sammen ting som kan tilføres som definerte produkter eller som komplekse blandinger i denne teknikk.

Som kilde for assimilerbart karbon kan man benytte karbo-hydrater slik som glukose, sakkarose, maltose, dekstriner, stivelse eller andre hydrokarbonforbindelser som sukkeralko-holer (glyserol) eller visse organiske syrer som melkesyre eller sitronsyre. Enkelte animalske eller vegetabilske oljer slik som spekkolje eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige hydrokarbonkilder, eller benyttes sammen med dem.

De hensiktsmessige kilder for assimilerbart nitrogen er meget varierte. Det kan være enkle kjemiske stoffer slik som mineralsalter eller organiske ammoniumforbindelser, urea, visse aminosyrer. De kan også tilveiebringes ved hjelp av komplekse stoffer som hovedsaklig inneholder nitrogen i proteinform slik som kasein, laktalbumin, gluten eller hydrolysater derav, soyamel, arakidmel eller fiskemel, kjøttekstrakt, gjær, maisstøpevæske o.s.v.

Blant mineralelementene som tilsettes kan visse ha en buffer-eller nøytraliserende virkning slik som alkali- eller jordalkalifosfater eller magnesium- og kalsiumkarbonater. Andre tilveiebringer den nødvendige ioniske likevekt ved utvikling av Streptomyces sp. S-16328 og ved elaborering av 55185 RP og 59451 RP slik som alkalimetall- eller jordalkali-metallklorider. Enkelte ytterligere virker mere spesielt som metabolske reaksjonsaktivatorer for Streptomyces sp. S-16328, dette er salter av sink, kobolt, jern, kobber, mangan.

Vekstfaktorene er vitaminnaturprodukter slik som riboflavin, folsyre, pantotensyre.

PH-verdien i fermenteringsmiljøet ved påbegynt dyrking må ligge mellom 5,8 og 7,8 og fortrinnsvis mellom 6,2 og 7,4. Den optimale temperatur for fermentering ligger mellom 25 og 30"C, men tilfredsstillende dyrking oppnås ved temperaturer mellom 23 og 33°C..Beluftningen av fermenteringsreaksjonen kan variere innen store grenser. Man har allikevel funnet at beluftninger i mengder- på 0,3 til 3 liter luft per liter kraft per min. er gunstig.. Det maksimale utbyttet av 55185 RP oppnås etter.2 til 8 timers dyrking idet tiden i vesentlig grad avhenger av det benyttede miljø.

Etter det som er sagt ovenfor tilpasses de generelle betingelser for dyrkingen av Streptomyces sp. S-16328 for frem stilling av 55185 RP og 59451 RP og disse kan varieres innen et vidt spektrum og tilpasses hver nødvendige forholdsregel.

55185 RP og 59451 RP kan isoleres fra fermenteringsmediet på følgende måte: Mediet filtreres ved en pH-verdi som generelt ligger mellom 6 og 8 og fortrinnsvis nær 7 i nærvær av et filtreringshjelpemiddel.

Aktiviteten som blir tilbake i filterkaken ekstraheres ved hjelp av et egnet organisk oppløsningsmiddel, f.eks. et keton slik som aceton eller en alkohol slik som metanol. Rå-produktet kan isoleres fra organiske oppløsninger ved krystallisering etter konsentrering av oppløsningene under redusert trykk, evt. tilsetning av et dårlig oppløsnings-middel eller et ikke oppløsningsmiddel og ved henstand i kjøleskap.

55135 RP og 59451 RP kan separeres og renses ved vanlige metoder slik som omkrystallisering, kromatografi og diverse absorberende bærere eller rnotstrømsfordeling.

59451 RP kan likeledes oppnås ved deklorering av 55135 RP i henhold til i og for seg kjente metoder som tillater å erstatte et kloratom med et hydrogenatom uten å berøre resten av molekylet.

Det er vanligvis fordelaktig å behandle 55185 RP i en metanolisk oppløsning med gassform i hydrogen i nærvær av en katalysator ved en temperatur nær 20°C. Som katalysator benyttes generelt palladium på trekull i nærvær av en syreakseptor slik som magnesiumoksyd.

De følgende eksempler skal ikke være begrensende, de er kun gitt for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1 (Fermentering)

Til en fermentor på 170 liter chargeres med:

PH-verdien justeres til 7,0 ved tilsetning av 30cm<3>10N natriumhydroksyd. Man steriliserer miljøet ved gjennombobling av damp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling er miljøets pH-verdi 6,6.

Man poder med 200 cm<3>av en erlenmeyer-kultur av Streptomyces sp. S-16328, omrørt i 72 timer.

Kulturen utvikles ved 28°C i 36 timer ved en omrørings-hastighet på 250 omdreininger per min. og beluftning med et volum sterilluft på 5 cm<3>per time. Det hele kan så benyttes som podingselement for produksjonskulturen.

Produksjonsdyrkingen gjennomføres i en fermenter på 800 liter til hvilken følgende stoffer chargeres:

PH-verdien justeres til 7,0 ved tilsetning av 440 cm3 10N NaOH.

Man steriliserer miljøet ved gjennombobling av damp ved 122°C i 40 min. etter å ha oppvarmet til 100°C i.15 min.

PH-verdien i miljøet er deretter 6,75.

Man poder med 40 liter dyrkingsinokulum i fermenteren på 170 liter som beskrevet nedenfor.

Kulturen utvikles ved 26°C i 83 timer ved omrøring ved 250 omdreininger per min. og beluftning med et volum steril luft på 20 m<3>per time.

Ved slutten av dyrkingen er pH-verdien i kulturen 8,05 og buljongmengden er 410 liter.

Eksempel 2 (Ekstrahering-rensing)

Man filterer 400 liter fermenteringsbuljong i nærheten av 20 kg "Clarcel" filtreringshjelpemiddel på en filterpresse. Filterkaken med mycel hentes ut og tas opp under sterk omrøring i 200 liter aceton inneholdende 20 % vann. Man filtrerer på en filterpresse i nærvær av filtreringshjelpe-midler. Det oppnådde filtrat konsentreres under redusert trykk for å eliminere acetonet. En vanndig restoppløsning ekstraheres ved en pH-verdi nær 7 med 2 ganger 50 liter etylacetat. Denne organiske fase separeres ved dekantering og konsentreres så til tørr tilstand under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa). Man oppnår således 183 g av en restolj e.

Denne oppløses i 1,5 liter metanol og blir så bragt til fordamping under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa) på 500 cm3 harpiks "Dudite S 861". Harpiksen chargeres til toppen av en kolonne med diameter 7,5 cm inneholdende 3 liter Duolite S 861 ekvilibrert i en 50:50 volumblanding metanol-vann. Man eluerer til å begynne med med 640 cm<3>per time og fraksjonerer alle 30 min. og eluerer suksessivt med:

- 50:50 volumdeler metanol:vann : fraksjonene 1 til 34

- 70:30 volumdeler metanol:vann : fraksjonene 35 til 71

- 80:20 volumdeler metanol:vann : fraksjonene 72 til 100.

Hver fraksjon kontrolleres ved tynnsjiktkromatografi på silica gel ved eluering med systemet 80:20 i 1,2-dikloretan: metanol (volumbasis) og man fremkaller det ved en Rf-verdi nær 0,5 med Gibbs reagens som gir en karakteristisk blå-farging i forbindelser med fenolfunksjon.

Hovedandelen av 55185 RP befinner seg i fraksjonene 87 til 97 som forenes og så avsettes ved fordamping under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa) på 400 cm3 silica gel "GRACE 60 Å (40-63 w).

Det oppnådde tørre pulver bringes på en kolonne med diameter 7,5 cm og høyde 110 cm av silisiumdioksyd, ekvilibrert i 1,2-dikloretan:metanol i volumandeler 80:20. Man gjennom-fører en isokratisk eluering på 600 cm<3>per time. 55185 RP elueres i fraksjonene 6 til 15. De tre siste fraksjoner som viser et gult pigment elimineres. Etter fordamping under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa) blir fraksjonene 6 til 12 forenet, og man oppnår 6,8 g av et fast gummiaktig beige materiale.

Det således oppnådde produkt tas opp i 50 cm<3>metanol. Oppløsningen filtreres og konsentreres deretter til et volum på 5 cm<3>og bringes så i en kolonne med diameter 5 cm og en høyde 138 cm med "Sephadex LH 20" i metanol. Man eluerer med metanol i en mengde av 300 cm<3>per time og gjenvinner fraksjoner ..hver 20 minutt. Fraksjonene.kontrolleres ved tynnsjiktkromatografi. Fraksjonene 10 til 13 som inneholder 55185 RP forenes og konsentreres til 100 cm<3>. Man tilsetter så 150 cm<3>cykloheksan. Etter omrøring og dekantering blir metanolfasen konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa). Man oppnår således 2,32 g 55185 RP inneholdende 6 % 59451 RP.

Eksempel 3

Man filtrerer 400 liter fermenteringsmedium i nærvær av 20 kg "Clarcel" filteringshjelpemiddel ned på en filterpresse. Filtreringskaken inneholdende mycel tas opp under sterk omrøring i 200 liter aceton inneholdende 20 % vann. Man filtrerer igjen i nærvær av filtreringshjelpemiddel. Det oppnådde filtrat konsentreres under redusert trykk for å fjerne aceton. Den vanndige restoppløsning ekstraheres ved en pH-verdi nær 7 med 2 ganger 50 liter etylacetat. Den organiske fase separeres ved dekantering og konsentreres så til tørr tilstand under redusert trykk (2-3 torr; 0,27-0,4 kPa). Man oppnår således en restolje.

Den oppnådde restolje tas opp i 5 liter metanol. Man tilsetter under omrøring 15 liter cykloheksan. Etter dekantering blir den metanolske fase fordampet under redusert trykk og resten dispergeres i 1 liter etyleter. Det oppnås 32,5 g fint pulver som separeres ved filtrering.

Man tar opp 26 g oppnådd pulver i 500 cm<3>metanol og den oppnådde oppløsning absorberes på 185 g silica gel (35 til 70 jim, porøsitet 60 Å) . Det' tørre pulver chargeres til en kolonne på 400 cm<3>, fylt med silica gel. Man eluerer med 1 liter ren etylacetat. Den oppnådde oppløsning gir etter konsentrasjon til tørr tilstand 11,7 g av et gult pulver.

Man tar opp 10 g av det tidligere oppnådde pulver i 150 cm<3>metanol og den oppnådde oppløsning absorberes på 100 cm<3>podet silisiumdioksyd "C 18" (20 nm, porøsitet 100 Å). Det oppnådde tørre pulver chargeres'til en "for-kolonne" med diameter 7,5 cm og høyde 10 cm som så fylles med podet silisiumdioksyd. Etter lukking av "for-kolonnen" blir innstengt luft drevet ut ved hjelp av en strøm av destillert vann hvoretter destillert vann erstattes med 400 cm3 40 %ig acetonitril.

Man kobler deretter "for-kolonnen" til en kolonne med diameter 7,5 cm og høyde 50 cm, inneholdende den samme kromatografiske bærer, ekvilibrert i acetonitril (40 %). Man gjennomfører en isokratisk eluering i en hastighet på 150 cm per min. og gjenvinner fraksjoner på 500 cm<3>. Disse under- søkes ved tynnsjiktkromatografi på Merck-plater, eluert med en acetonitril:natriumklorid (3 %) oppløsning i volumforholdet 40:60.

De eluerte produkter skiller seg ved sin farging med Erlich reagens samt Rf-verdien.

Fraksjonene 12 til 15 inneholder 0,46 g av et produkt hvis Rf-verdi er 0,21, utvikles til murstensrødt og tilsvarer 5S451 RP.

Fraksjonene 18 til 51 inneholder 5,96 g av et produkt hvis Rf-verdi er 0,14, fargeutvikles orange og tilsvarer 55185 RP.

Man tar opp 1,13 g av produktet hvis Rf-verdi er 0,21 i 15 cm3 65:35 metanol:vann.

Denne oppløsning injeseres i en kolonne med diameter 5 cm og lengde 50 cm med MCI gel "CHP 20P", ekvilibrert i den samme oppløsningsmiddelblanding. Man gjennomfører en isokratisk eluering i en mengde på 17 cm<3>per min. og gjenvinner 50 fraksjoner på 100 cm<3>hvoretter man eluerer med 72:28 metanol:vann under de samme betingelser. Man oppnår på denne måte 60 ytterligere fraksjoner.

Fraksjonene 78 til 110 gir 0,59 g ren 59451 RP.

Man tar"opp 10, 5 g av produktet hvis Rf-verdi er 0,14, i 350 cm3 65 %ig metanol. "Den oppnådde oppløsning injeseres på en kolonne med diameter 5 •cm og lengde 50 cm av MCI gel "CHP 20P", ekvilibrert i 65 %ig metanol. Man eluerer under de samme betingelser som tidligere i en mengde av 17 cm<3>per min. med 4 liter 65 %ig metanol, deretter med 4 liter 85 %ig metanol og gjenvinner fraksjoner på 100 cm<3>.

Fraksjonene 46 til 56 gir-9,78'g ren 55185 RP..

Eksempel 4

Man tilsetter 14 g ren 55185 RP til en suspensjon av 3,5 g

5 % palladium på trekull og 3,5 g magnesiumoksyd i 120 cm<3>metanol.

Man sender så boblevis en hydrogenstrøm ved en temperatur nær 20°C og under 760 mm KG (101,3 kPa) gjennom blandingen i 15 timer.

En høyytelses væskekromatografianalyse viser at dekloreringen av 55185 RP til 59451 RP er kvantitativ.

Reaksjonsblandingen filtreres i nærvær av "Celite" filtrer-ingshj elpemiddel . Deretter oppnås etter fordamping av filtratet til tørr tilstand 15,2 g av et hvitt pulver inneholdende gjenværende metanol.

Man tar opp 11 g av det således oppnådde pulver i 150 cm<3>metanol. Oppløsningen absorberes på 60 cm<3>podet silisiumdioksyd "C 18" med partikkelstørrelse 35 til 70 jim.

Det oppnådde tørre pulver chargeres i tørr tilstand til en "for-kolonne" med diameter 7,5 cm og høyde 10 cm, komplettert med den samme podete silisiumdioksyd. Etter lukking av "for-kolonnen" blir inneholdt luft fortrengt ved hjelp av en strøm av destillert vann og denne-sistnevnte blir fortrengt med 400 cm<3>40 %ig acetonitril.

Man forbinder deretter "for-kolonnen" med en kolonne på 7,5 cm diameter og 50 cm lengde, fylt med den samme podete "C 18" silisiumdioksyd, men der granulometrien er 20- jim, ekvilibrert i 40 %ig acetonitril.

Man gjennomfører en isokratisk eluering i en mengde av 150 cm<3>per min. og samler fraksjoner på 500 cm<3>etter gjennomløp av 1,3 liter elueringsmiddel.

Fraksjonene 8 til 12 gir etter fordamping under redusert trykk 8,9 g 59451 RP som renses under de betingelser som er beskrevet i eksempel 3.

55185 RP og 59451 RP oppviser bemerkelsesverdige immuno-suppressive egenskaper. Helt spesielt er 55185 RP og 59451 RP cellulære immunitets-immuno-suppressorer.

In vitro inhiberer 55185 RP og 59451 RP i molare konsentrasjoner mellom 10-<0>og 10-° på bemerkelsesverdig måte: - den sytostatiske aktivitet til peritonéale makrofager fra mus, indusert ved thioglykolat og spesielt hvis de er stimulert ved tilsetning av 2-interleukin til lymfosyter under inkuberingsperioden, - produksjon av interleukin-2 av human lymfosyter stimulert med fytohemagglutinin, PHA, eller med murintymosyter stimulert med PHA og interleukin-1,

gammainterferonproduksjonen til humanlymfosyter eller murintymosyter.

In vitro .manifesterer 55185 RP og 59451 RP ikke inhibitor-virkningen på antistoffsekresjon (teknikk i henhold til P.H. Klesius, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (1970) og H. Van Dijk og N. Bloksma, J. Immunol. Methods, 1_4, 325

(1977)) og er i praksis ikke sytotoksiske for leukemi P388 celler.

55185 RP og 59451 RP, administert til mus i doser mellom 25 og 50 mg per kg intraperitonialt en dag før prøven, inhiberer NK aktiviteten målt vis-å-vis YAC/1 celler.

Administrert oralt i en dose på 50 mg per kg i 10 dager forsinker 55185. RP og 59451 RP signifikant avstøtningen ved allogen hudpodning (Co7Bl/6) hos mus Balb/c eller semi-allogen (BeD2Fi) hos mus CW7Bl/6.

Videre manifesterer ikke 55185 RP og 59451 RP noen virkning eller oppviser en stimulerende virkning på produksjonen av "cellules formatrices de plages" (teknikk i henhold til N.K. Jerne og A.A. Nodin, Science, 140, 405 (1963). De er uten virking på formering av leukemi P388 hos mus når de admini-streres i doser mellom 12,5 og 50 mg per kg intraperitonialt i 4 dager.

I humanterapien blir 55185 RP og 59451 RP spesielt brukt for å bekjempe transplantasjonsavvisninger av organer eller vev og for å behandle autoimmune sykdommer slik som reumatisme, insulinavhengig diabetes, plak-sklerose, myasteni, lupus, psoreasis eller Crohns sykdom.

I humanterapien avhenger dosene av den tilsiktede virkning og varighetsbehandlingen. De ligger generelt mellom 0,5 og 100 mg per kg per dag oralt og mellom 0,1 og 20 mg per kg per dag parenteralt for en voksen person.

Generelt er det legen som bestemmer posologien utfra alder, vekt, tilstand og tilsiktet mål.

De farmasøytiske preparater inneholdende 55185 RP og/eller 59451 RP i ren tilstand eller i nærvær av en bærer kan gis oralt, rektalt eller parenteralt.

Som faste preparater for oral administrering skal nevnes piller, pulvere eller granuler. I disse preparater benyttes et produkt som beskrevet ovenfor, blandet med et eller flere inerte fortynningsmidler som sakkarose, laktose eller stivelse. Disse kan videre omfatte andre stoffer enn fortynningsmidlene, f.eks. smøremidler slik som magnesium-stearat.

Som flytende preparater for oral administrering benyttes farmasøytisk aksepterbare emulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer som inneholder inerte fortynningsmidler som vann eller parafinolje. Disse blandinger kan likeledes omfatte andre stoffer enn fortynningsmidlene, f.eks. fuktemidler, aromatiske stoffer o.s.v.

Preparater for parenteral administrering kan være vanndige eller ikke vanndige sterile oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Som oppløsningsmiddel eller bærer kan man benytte propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, spesielt olivenolje, og injeserbare organiske estere, f.eks. etyloleat.

Preparatene kan likeledes inneholde tilsetningsstoffer, spesielt fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergerings-midler.. Steriliseringen kan skje på flere måter, f.eks. ved hjelp av et baktereologisk filter, ved i preparatet å innarbeide steriliserende midler, ved bestråling eller ved oppvarming. De kan likeledes fremstilles i form av faste sterile blandinger som kan oppløses på bruksøyeblikket i et sterilt injeserbart miljø.

Preparater for rektal administrering er suppositorier som bortsett fra aktiv forbindelse kan inneholde drøyemidler slik som kakaosmør eller semisyntetiske triglyserider.

De følgende eksempler er illustrerende og ikke begrensende.

Eksempel A

Man.fremstiller på vanlig måte tabletter, dosert til 25 mg 55185 RP med følgende sammensetning^

Eksempel B

På vanlig . måte fremstiller man en parenteralt administrerbar oppløsning med følgende sammensetning:

Eksempel C

Man fremstiller på vanlig måte tabletter dosert til 25 mg 59451 RP med følgende sammensetning:

Eksempel D

På vanlig måte fremstiller man en parenteral administrerbar oppløsning med følgende sammensetning:

Claims (1)

1. Nye immuno-suppressive stoffer kalt 55185 RP og 59451 RP, karakterisert ved at de er cyklodepsipeptider med den generelle formel:

der X betyr et kloratom (55185 RP) eller et hydrogenatom (59451 RP). Immuno-suppressive stoffer kalt 55185 RP, karakterisert ved at: - det er et amorft hvitt til blekgult pulver, oppløselig i metanol, etanol, etylacetat, aceton, acetonitril, dimetyl formamid, dimetylsulfoksyd, uoppløselig i vann, etyleter og heksan, - det tilsvarer bruttoformelen C^eH^eClN-^O 13!; - det har en elementsammensetning nær: C % = 58,29 H % = 5,30 Cl % = 3,84 N % = 10,13 og 0 % = 22,57 - det har et smeltepunkt på over 300°C; - det har en optisk dreievne i metanol på [a]p°= +20,5° + 1,4°; - har et ultrafiolett spektrum i metanol som viser en skulder ved 230 nm og et absorbsjonsmaksimum ved 274 nm (E, 1 ° =219;

3 i cm e = 20240; - et IR-spektrum, bestemt i tabletter blandet med KBr, som oppviser karakteristiske absorbsjonstopper som følger: 3380, 3300, 3090, 3060, 3030, 2980, 2940, 2880, 2700, 2500, 2340, 2160, 1950, 1880, 1740, 1680, 1655, 1625, 1605, 1555, 1520, 1500, 1455, 1440, 1425, 1405, 1380, 1340, 1310, 1285, 1215, 1205, 1160, 1120, 1030, 1060, 1050, 1030, 1010, 1000, 980, 950, 925, 900, 850, 795, 785, 750, 700, 690, 635, 625, 605, 580, 525, 510, 495, 455, 450, og 355 cm- <1> ; - har en Rf-verdi på 0,5 ved tynnsjiktkromatografi på silica gel med 1,2-dikloretan:metanol i volumforholdet 80:20 som oppløsningsmiddel.

3 . Immuno-suppressive stoffer ifølge krav 1, kalt 59451 RP, karakterisert ved at: - det er et blekgult til hvitt amorft stoff, oppløselig i metanol, etanol, etylacetat, aceton, acetonitril, dimetyl-sulf oksyd, uoppløselig i vann, etyleter og heksan; - har bruttof ormelen C^gH^N-tO i = ; - har en elementsammensetning nær: C % = 62,09 H % = 5,32 0 % = 21,57 N % = 11,02; - har et smeltepunkt på 275-280'C (dekomponering); - har en rotasjonsevne, bestemt i metanol på: [cc]D = +24,3° + 1 °; har et UV-spektrum i metanol som oppviser en maksimal absorpsjon ved 268 nm (e = 19864); - har et IR-spektrum, bestemt i tabletter i blanding med KBr som oppviser karakteristiske absorpsjonstopper som følger: 3360, 3480, 3400, 3280, 3060, 3040, 2980, 2940, 2880, 2680, 2520, 2160, 2060, 1950, 1880, 1740, 1675, 1655, 1640, 1625, 1605, 1555, 1530, 1500, 1455, 1445, 1415, 1380, 1340, 1310, 1295, 1275, 1245, 1230, 1190, 1170, 1145, 1110, 1090, 1070, 1060, 1040, 1030, 1000, 990, 970, 960, 930, 920, 900, 885, 870, 850, 830, 785, 750, 740, 700, 690, 645, 620, 605, 585, 550, 520, 505, 470, 445, 400 og SOOcm- <1> .

4. Fremgangsmåte for fremstilling av nye stoffer i hehold til et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at man på aerob måte dyrker Streptomyces sp. S-16328 (CBS 162.86) eller produserende mutanter derav i et klassiske hensiktsmessig miljø og under de vanlige betingelser for denne type dyrking og deretter separerer 55185 RP og 59451 RP og renser forbindelsen.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av 59451 RP, karakterisert ved at man gjennomfører en hydrogenolyse av 55185 RP ved hjelp av hydrogen i nærvær av en katalysator ved en temperatur nær 20°C.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man som katalysator benytter palladium på trekull.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5 eller 6, karakterisert vedat man arbeider i nærvær av en- syreakseptor.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at syreakseptoren er magnesiumoksyd.

9. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder en tilstrekkelig mengde 55185 RP og/eller 59451 RP ifølge kravene 1, 2 eller 3, i ren eller oppblandet tilstand eller i forbindelse med et farma-søytisk akseptabelt middel.