NO833023L - Baeremedium for immobiliserte mikroorganismer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en uløselig, hydrolysebestandig polymerskumbærer på hvilken mikroorganismer kan bindes.

Det er tidligere kjent^å fremstille aspartinsyre med mikroorganismer som enzymatisk overfører ammoniumfumarat til aspartinsyre, og å binde mikroorganismene til et porøst skummet polyuretansubstrat. Se US patentansøkning nr. 187.938 av 17.9.1980 og artikkelen "Immobilization of Escherichia coli Cells Containing Aspartase Activity

with Polyurethane and Its Application for L-Aspartic Acid Production" av M.C. Fusee et al i Applied and Environmental Microbiology, Vol. 42, nr. 4 (oktober 1981) sidene 6 72-6 76. Imidlertid ble polyuretanene som brukes

i fremgangsmåten som beskrives i artikkelen dannet fra

—toluendiisocyanat (TDI) og inneholdt derfor uretanbind-ingene som var ømfindtlige overfor alkalisk hydrolyse

i sterkt alkalisk reaksjonsmedium. Etter ca. 2 uker kan""hydrolysen bevirke sammenbrudd av skumbærersjiktet.

Det er ett mål for foreliggende oppfinnelse å fremstille

et område av hydrolysebestandig polyuretanpolymerskum

som kan brukes for å bære microorganismer.

Det er et videre mål for foreliggende oppfinnelse å fremstille L-aspartinsyrer under høye pH-betingelser med mikroorganismer bundet til en rekke hydrolysebestandigé polyuretanpolymerskum.

Disse og videre mål vil fremgå klarere i løpet av beskriv-elsen av oppfinnelsen.

En rekke polymerer er fremstilt som kan binde mikroorganismer og samtidig danne en skumbærer med sterkt forbedret hydrolysebestandighet. Polymerene er laget

av MDI-dekkede prepolymerer i stedet for fra TDI-dekkede prepolymerer.

Polymerene i foreliggende oppfinnelse kan bredt beskrives som dannet fra en etylenoksybasert diol såsom "Carbovoks" 1.000, et kryssbindingsmiddel såsom en polyol med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol såsom trimetylolpropan, og

ethvert polyisocyanat innbefattet diisocyanater utledet fra metylen-bis (fenylisocyanat) vanlig kjent som MDI.

Polymerer som brukes i foreliggende oppfinnelse har i mot-setning til slike som har vært brukt i tidligere lignende søknader ikke hydrolytisk ustabile bindinger og varer derfor meget lenger under de alkaliske betingelser i aspar-tinsyreprosessen.

De elastiske skum som brukes i foreliggende oppfinnelse er generelt vannabsorberende og de er laget fra en isocyanat-dekket prepolymer ved bruk av et MDI-avledet isocyanat som eneste isocyanat. Prepolymerene kan være laget på to måter. I den ene måte er vekten av MDI, her beskrevet som høy-MDI-måten, minst 50 % av totalvekten av MDI, diol og kryss-"bindingsmiddel i fremstillingen av prepolymeren. I den andre måten, her beskrevet som lav-MDI-måten, er vekten av

MDI mindre enn 50 vekt-% MDI, diol og kryssbindingsmiddel

i fremstillingen av prepolymeren.

De resulterende skum i høy-MDI-måten er laget fra prepolymerer utledet fra en poly(oksy C2_^alkylen)diol med minst 50 vekt-% oksyetylengrupper, et difenylmetandiisocyanatholdig isocyanatprodukt med større funksjonalitet enn 2,0 omfattende en blanding av MDI og isocyanat inneholdende derivater av MDI, og et monomert polyolkryssbindingsmiddel med en hydroksyfunksjonalitet på 3 eller

4. Disse prepolymerer er videre beskrevet i US ansøkning

nr. 314,537 av 26.10.1981. Denne prepolymer kan reagere med vann i fravær av en katalysator og danne et varig polyuretanskum med mange av egenskapene til en cellulose-svamp. Disse skum er hvite av farge.

De foretrukne bestanddeler for høy-MDI-måte prepolymer

_ knneholder en diol med mer enn 80 vekt-% oksyetylengrupper..

'såsom "Carbowax" 1000, trimetylolpropan (TMOP) som kryssbindingsmiddel og som isocyanat "Isonat" 143L, som er et metylen-bis(fenylisocyanat), heretter MDI, basert isocyanatprodukt fra Upjohn Polymer Chemicals med en funksjonalitet på ca. 2,1.

I den foretrukne formulering for høy-MDI-måte prepolymert Carbowax brukes et poly(oksyetylen)diolprodukt fra Union Carbid for å tilføre vannabsorberende egenskaper og gi skum-produktet styrke gjennom sin virkning som kryssbindingsmiddel. Det er viktig å holde molarforholdet av diolet (såsom Carbowax) til det monomere polyolkryssbindingsmiddel (slik som TMOP) omtrent i området fra 4:1 til 8:1 og fortrinnsvis ca. 6:1. På lignende måte bør forholdet av isocyanatekvivalenter til hydroksylekvivalenter i prepolymeren ligge i området ca. 3-4:1 og helst i området 3,3-3,7:1.

Det isocyanatholdige produkt bør utgjøre mer enn 50 vekt-%

av hele prepolymeren og bør ha en funksjonalitet større enn —2,0. Dette ville utelukke rent MDI som har en funksjonalitet på bare 2,0 som eneste isocyanat. Bruken av Isonat 143L som foretrukket isocyanatkilde er ønsket fordi det inneholder dimer, trimer og karbodiimidkomponenter som øker funksjonaliteten til et høyere nivå enn 2,0 og som antas å bidra til lagringsstabiliteten av prepolymeren og til styrken og dimensjonsstabiliteten til skummet.

Prepolymerene i lav-MDI-formen kan være fremstilt i to ut-førelsesformer. En utførelsesform, heretter utførelsesform ~A, anvender et monomert polyolkryssbindingsmiddel, mens den annen utførelsesform, heretter utførelsesform B, anvender et polymert polyolkryssbindingsmiddel. I utførelsesform A er de resulterende skum laget av en prepolymer med minst én poly(oksy C2_^alkylen)diol med en molekylvekt på minst ca. 1.100 og med minst 50 vekt-% oksyetylengrupper såsom en Carbowax laget av Union Carbide, et monomert polyolkryssbindingsmiddel med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol såsom trioltrimetylolpropan og et metylen-bis(fenylisocya-Aat), heretter MDI, basert isocyanatprodukt med en funksjon- '_alitet større enn 2,0 såsom Isonat 14 3-L laget av Upjohn Polymer Chemicals som har en funksjonalitet på ca. 2,1 og som er laget av en blanding av MDI og isocyanatholdige derivater av MDI. Disse prepolymerer er videre beskrevet i US ansøkning nr. 314,554 av 26.10.1981.

I utførelsesform B av^lav-MDI-formen er skummene laget fra en prepolymer med minst én poly(oksy C2_4ålkylen)holdig diol med en relativt lav molekylvekt på mindre enn 2.000 og med minst 50 vekt-% oksyetylengrupper og fortrinnsvis minst 80 vekt-% såsom en Carbowax 1.000 laget av Union Carbide; et polymert poly(oksy C2_^alkylen)polyolkryssbindingsmiddel med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol med en relativt høy molekylvekt av størrelsesorden minst 500 såsom triolet TEP 990, et poly(oksyetylen)triol med molekylvekt ca. 900

fra Union Carbide eller POLY G76-120, et oksyetylendekket

—poly(oksypropylen)triol med molekylvekt ca. 1.400 fra Olin; <p>g et metylen-bis (fenylisocyanat), heretter MDI, basert isocyanatprodukt med en funksjonalitet større enn 2,0 laget —fra en blanding av MDI og isocyanatholdig derivat fra MDI såsom Isonat 143-L laget av Upjohn Polymer Chemicals som har en funksjonalitet på ca. 2,1. Disse prepolymerer er videre beskrevet i US patentansøkning nr. 314,555 av 26.10.1981.

Ett av nøkkeltrekkene ved disse prepolymerformuleringer i lav-MDI-formen er begrensningen av mengden av isocyanatet såsom Isonat 143-L, slik at det utgjør mindre enn 50 % og gjerne 38-46 vekt-% av prepolymeren i utførelsesform A og

37-48 vekt-% av prepolymeren i utførelsesform B. Behovet for isocyanatkomponenten reduseres i utførelsesform A ved å øke den gjennomsnittlige molekylvekten til en diolkompo-nent slik at den er større enn 1.100. Ved å bruke trimetyl-propan som monomert kryssbindingsmiddel, er de foretrukne diolmolekylvektsnivåer på 1.200-1.400 og diolen inneholder minst 80 vekt-% oksyetylengrupper. Diolen som brukes i en

foretrukket utførelsesform er en blanding av to dioler med

I forskjellige molekylvekter. F.eks. kan en diol ha en mole-i kylvekt på 1.000 mens den andre diol har en molekylvekt! på_ 1.450. I utførelsesform B reduseres behovet for isocyanatkomponenten ved å øke den gjennomsnittlige moelkylvekten til den polymere polyolkryssbindingskomponent, slik at den er større enn 500. Ved å bruke Carbowax 1.000 som diol, hvilken har en molekylvekt på ca. 1.000, er det foretrukne polymere polyolkryssbindingsmiddel Poly G176-120 som er en triol med en molekylvekt på ca. 1.400.

Det faktiske innholdet av fritt MDI kan justeres opp eller ned i dette isocyanathoIdige produkt så lenge funksjonaliteten forblir større enn 2,0. F.eks. kunne ytterligere rent MDI tilsettes.

Aspartaseproduserende mikroorganismer som immobiliseres ved de foreliggende MDI-baserte polyuretaner er beskrevet i US patentansøkning nr. 187,938 av 17.9.1980.

Diolen som brukes i fremstillingen av høy-MDI-mol prepolymer som brukes heri er en poly(oksy C2_^alkylen)diol med minst 50 vekt-% oksyetylengrupper og fortrinnsvis minst 50 vekt-% oksyetylengrupper og fortrinnsvis minst 80 vekt-% oksyetylengrupper. Når således diolen inneholder oksypropylen eller oksybutylen eller blandinger derav, må altså denne minimale mengde av oksyetylen være tilstede. Det foretrukne diol har minst 80 vekt-% oksyetylengrupper og er en hydrofil poly(oksyetylen)diol laget av Union Carbide under produktnavnet Carbowax. Når Isonat 143L brukes som eneste isocyanatkilde, foretrekker man å bruke Carbowax med en molekylvekt på ca. 1.000. Andre Carbowaxformuleringer med en molekylvekt fra 600 til 1.100 kan brukes, men den mest foretrukne form har en molekylvekt fra 950 til 1.050. Det er produktområdet som fremstilles når man lager en handels-vare Carbowax 1.000. Hvis en lavere molekylvektform enn ca. 600 brukes, vil den resulterende svamp, laget fra prepolymeren tape sine hydrofile egenskaper, fordi enhver svamp-formulering da ville kreve en større mengde av relativt

hydrofobt Isonat. Hvis på lignende måte en høyere moléky.l-vektsform av Carbowax enn 1.100 brukes, vil den resulterende svamp tape sin kryssbinding, densitet og meget av sin d'im-._

ensjonsstabilitet og stivhet.

For å gi kryssbindingsstyrke til det ferdige skumprodukt som skal lages fra høy-MDI-form prepolymer, tilsettes et relativt kort, lavmolekylvektsmonomert polyol med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol. Eksempler er trimetyloletan, trimety lolpropan., glycerol, trietanolamin, pentaerytritol eller blandinger derav. Det foretrukne polyol er trimetylolpropan, TMOP, som har formelen

Ved fremstilling av høy-MDI-form prepolymer er det også ønskelig å kontrollere forholdet av diol såsom Carbowax"til det kortere kryssbindende polyol. I allminnelighet bør molarforholdet ligge i området ca. 4:1 til 8:1 med foretrukket forhold ca. 6:1.Hvis forholdet er for lavt, slik at"det er for meget polyol, vil den resulterende svamp dannet av prepolymeren tape sin hydrofile karakter og skummet vil også ha en dårligere skumstruktur. Hvis, på den annen side, forholdet økes slik at det er mindre polyol såsom TMOP, får man svake, utflytende skum som erkarakterisert vedfine celler og delvis lukkede celler. De molare forhold som er uttrykt for disse to materialer angir de relative tall av hydroksylekvivalenter tilstede for hvert materiale. Således bidrar ved et forhold på 6 mol av den foretrukne diol Carbowax til 1 mol av den foretrukne polyol TMOP, Carbowaxen med 12 ekvivalenter hydroksyl mot 3 ekvivalenter av TMOP.

Carbowax 1.000 har en ekvivalent vekt på 500 pr. hydroksylgruppe, mens TMOP med en molekylvekt på 134 har en ekvivalent vekt på 45 pr. hydroksylgruppe, fordi Isonat 143L brukes for å kombinere med hydroksylgruppene, og mengden nødvendig Isonat vil være meget avhengig av en mengde TMOP og derfor kontrolleres mengden TMOP temmelig omhyggelig.

I • I

1 Forholdet isocyanat til hydroksylgrupper i reaktanene bør ligge i området 3-4 eller helst fra ca. 3,3 til 3,7. Når høy-MDI-form prepolymer fremstilles, reagerer en isocyanatgruppe i polyisocyanatkomponenten med én hydroksylgruppe som levner den gjenværende isocyanatgruppe ureagert. Disse fri isocyanatgrupper på prepolymeren reagerer så med vann

og danner polyureabindinger med samtidig økning i molekylvekt og frigjøring av C02, hvilket hjelper til å danne det skummede produkt.

Det isocyanatholdige produkt bør omfatte mer enn 50 vekt-% prepolymer for å gi det skummede produkt den nødvendige stivhet.

Når komponentene omsettes under dannelse av høy-MDI-form

prepolymer, har det vært nyttig å måle isocyanatmengden

—ved titrering etter at reaksjonen har funnet sted i ca.

en time. Fra denne avlesning og etterfølgende titreringer

kan man avgjøre den ytterligere reaksjonstid som er nød-—vendig for å redusere isocyanatmengden ned til ca. den mengde som er det teoretiske punkt, ved hvilke alle hydroksylgrupper vil ha reagert med isocyanatet. Hvis reaksjonen får fortsette for langt slik at isocyanatmengden reduseres ytterligere, øker prepolymerviskositeten, hvilket gjør det van-skelig å deretter blande prepolymeren med vann. Overrea-gering av prepolymerkomponentene vil også bevirke at skum-densiteten øker samt den vannabsorberende egenskapen til det resulterende skum avtar.

"For lav-MDI-formen kan isocyanatkomponenten med fordel reduseres i utførelsesform A, hvor MDI-systemet inneholder en poly(oksy C2_4alkylen)diol og TMOP,f.eks. som det monomere kryssbindingsmiddel ved å øke den gjennomsnittlige molekylvekten til poly(oksy C2_4alkylen)diolkomponenten til en molekylvekt større enn 1.100. Disse dioler har fortrinnsvis minst 80 vekt-% etylenoksygrupper. De resulterende elastiske skum bibeholder sine fysikalske egenskaper, selv om de utsettes for damp i en autoklav ved 120°C i 5 timer, og skummene sveller betydelig mindre enn TDI-skum. TDI-baserte

_hydrofile skura sveller mer enn 100 volum-% i våt tilstand,

mens foreliggende skum sveller bare 30-60 % ved væting i utførelsesform A.

For lav-MDI-formen i utførelsesform B kan isocyanatkomponenten med fordel reduseres, hvor MDI-systemer anvender

dioler med relativt lav molekylvekt med en molekylvekt mindre enn 2.000 ved å øke molekylvekten til polyolkryssbindingsmiddelet. I stedet for å bruke TMOP med en molekylvekt på 134, anvendes poly (oksy C^^alkylen) trioler eller tetroler med høyere molekylvekt, hvilke har molekylvekter av størrelsesorden 500-2.000. Et foretrukket eksempel er Poly G176-120 som er et triol med en molekylvekt på ca. 1.400. De resulterende elastiske skum bibeholder sine fysikalske egenskaper selv om de utsettes for damp i en

autoklav ved 120°C i 5 timer, og skummene har en betydelig"""redusert svelle-evne sammenlignet med TDI-skum. TDI-baserte hydrofile skum sveller mer enn 100 volum-% ved væting, mens

foreliggende skum bare sveller fra ca. 30-75 % ved væting i utførelsesform B.

Den reduserte andel av isocyanatet såsom Isonat 143-L i både utførelsesform A og B gjør de resulterende skum elastiske og spenstige sammenlignet med skum med et Isonat 143-L-innhold større enn 50 % som er halv-stiv og ikke spenstig. Økning i molekylvekten av diolet muliggjør en reduksjon av nødvendig mengde Isonat 14 3-L i en slik grad at forholdet av isocyanatfunksjonelle grupper til hydroksylfunksjonelle

grupper (kjent som isocyanatindex) kan reduseres fra 3,5/1 til ca. 3/1, en forandring som bidrar til skumproduktets elastisitet. Selv om fleksibilitet best karakteriseres ved fleksural modulus, er den lettere tilgjengelige strekk modulus på 1 % forlengelse brukt som omtrentlig klassi-fisering av disse skum i myke og elastiske (modulus under 0,136 atm.),faste men elastiske (modulus mellom 0,136 og 0,272 atm.), og halvstive eller stive (modulus over 0,272 atm.).

'Det foretrukne isocyanatholdige produkt med en funksjonalitet større enn 2,0 for alle prepolymerblandingene er en blanding av difenylmetandiisocyanat, forkortet MDI, og isocyanatholdige derivater av MDI. Et handelsprodukt som til-fredsstiller dette krav er Isonat 143L som dannes ved å omsette MDI til et karbodiimid, og dette materiale reagerer så igjen under dannelse av et trifunksjonelt cykloaddukt. Denne blanding av MDI, karbodiimid og cykloaddukt er i like-velet. Blandingen inneholder en hovedbestanddel av rent difenylmetandiisocyanat og mindre mengder karbodiimider og trifunksjonelle cykloaddukter av difenylmetan og diiso-cyanat. En blanding av A og B komponentene nedenfor utgjør 14 3L-systernet.

Slik det her brukes betyr uttrykket derivater av difén.yl-metandiisocyanat produkter som er laget fra MDI som utgangs-materiale. Det vil inbefatte addukter, dimere og trimere. Det vil ikke inbefatte materialer såsom polymetylen, poly-fenylisocyanater som ikke er laget fra MDI.

Prepolymerteknologien for fremstilling av skum krever blanding med omtrent samme volum vann. Dette krever at prepolymeren er hydrofil og det er grunnen til at minst noe poly-|(oksyetylen) holdig diol må brukes ved fremstilling av pre polymer laget ut fra Isonat 14 3-L. Den ønskede viskositet for god blanding og skumming med vann er i området ca. 10.000 - 35.000 cp ved 25°C, og fortrinnsvis ca. 20.000 cp. Både viskositeten og hydrofilisiteten til prepolymerene konstrueres ved riktig valg av polyoltype og molekylvekt. Prepolymerene må ikke fortykkes nevneverdig under lagring.

Det er funnet at det yål være tilstrekkelig lagringstabili-_tet hvis viskositeten ikke stiger over 100.000 cp (målt ved 45°C) etter akselerert lagringsprøving i to uker ved 80°C.

For at et elastisk skum skal være anvendelig for de fleste formål, bør det ha en strekkfasthet på minst 0,136 atm, en skumdensitet på ca. 32-96 kg/m 3 og en forlengelse ved brudd på minst 100 % høyere enn foretrukket. I et eksempel på ut-førelsesf orm A er en forlengelse ved brudd på 200 % oppnådd,""mens i et eksempel i utf ørelsesf orm B er en forlengelse ved

brudd på 250 % oppnådd.

" Diolet som brukes i lav-MDI-form prepolymerene er et poly-(oksy C2_4alkylen)diol inneholdende minst 50 vekt-% oksyetylengrupper. Når således diolet inneholder oksypropylen eller oksybutylen eller blandinger derav, må alltid denne minimumsmengde oksyetylen være tilstede. De foretrukne dioler i utførelsesform A har minst 80 vekt-% oksyetylengrupper.

I en av de foretrukne utførelsesformer av utførelsesform A, har man funnet det tilfredsstillende å som diol bruke en blanding av Carbowax 1.000 ogCarbowax 1.450 fremstilt av Union Carbide, selv om det ligger utenfor rammen av denne utførelsesform å bruke enhver kombinasjon av de mer foretrukne poly(oksyetylen)dioler med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1.000-2.000, men fortrinnsvis i området 1.200-1.400. I disse tilfeller vil den gjennomsnittlige molekylvekten' til alle diolene være ca. minst 1.100. Ved å bruke

en blanding av disse to dioler i omtrentlig ekvi-molare mengder har de resulterende skum fordelaktig lav volum-

L svelling og lav densitet...J

I Selv om det ligger innenfor rammen av utførelsesform A å bruke enhver monomer polyol som kryssbindingsmiddel, er de mer foretrukne polyolkryssbindingsmidler med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol. Disse inbefatter trimetyol-propan, trimetyloletan, glycerol, trietanolamin, pentaerytritol, eller blandinger av disse polyoler. Den mest foretrukne er trimetylolpropan, TMOP som har formelen

For utførelsesform B er det funnet tilfredsstillende i den foretrukne utførelsesform og som dioler bruke Carbowax 1.000 eller Carbowax 1.450 fremstilt av Union Carbide, selv om det ligger innenfor rammen av utførelsesformen å bruke en-"hver poly(oksyetylen)diol med en gjennomsnittsmolekylvekt

på 1.000-2.000, men fortrinnsvis i området 1.000-1.500.

"Selv om det ligger innenfor rammen av utførelsesform B å bruke enhver polymerpolyol som kryssbindingsmiddel, er de sterkere foretrukne polymere poly(oksy C2_^alkylen)polyolkryssbindingsmiddel med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol og med en gjennomsnittlig molekylvekt på minst 500 eller blandinger av disse polymere polyoler. Den mest foretrukne er Poly G76-120 som er en oksyetylendekket poly-(oksypropylen)triol med molekylvekt ca. 1.400. Oksyetylen-resten antas her å inneholde blokker av oksyetylenenheter bundet til en sentral polyoksypropylenkjerne. Det forventes at polyolkryssbindingsmiddelet også kunne bestå av en sta-tistisk kopolymer av disse enheter.

Densiteten og de fysikalske egenskapene til skummene i ut-førelsesform A og B synes å være avhengig av polyolinnholdet. Hvis det ønskes å ha et skum med lavere densitet, men som er fast og mindre gummiaktig, økes mengden av polyol. Hvis

det ønskes å ha høyere densitet og mer elastisitet, så reduseres mengden av polyol. Den anvendelige mengde polyol.kryss-_bindingsmiddel med en hydroksyfunksjonalitet på 3 ellerJ4

er slik at 2 - 35 % av hydroksylinnholdet til diolen og polyolblandingen kommer fra polyolen. Det foretrukne området for et godt elastisk skum er 10-30 % hydroksyl fra polyolen. I utførelsesform B er polyolen en polymer polyol og i allminnelighet brukes en relativt liten mengde av den polymere polyol for å holde prepolymeren flytende. Når

mengden polyolkryssbindingsmiddel uttrykkes i forhold til mengden tilstedeværende diol, er diolen og polyolkryssbindingsmidlene tilstede i utførelsesform A i et molforhold på ca. 4:1 til 8:1 og i utførelsesform B når mengden av polymer polyolkryssbindingsmiddelet uttrykkes i forhold til den rikeligere mengde tilstedeværende diol, foreligger diolen og polyolkryssbindingsmidlene i et molforhold pa ca. 30:1 til 8:1.

I utførelsesform A har Carbowax 1.000 en ekvivalentvekt ~ på 50 0 pr. hydroksylgruppe, mens TMOP med en molekylvekt på 134 har en ekvivalentvekt på 45 pr. hydroksylgruppe. Da Isonat 143L brukes for å kombinere med hydroksylgruppene, vil den nødvendige mengde isocyanat være meget avhengig av mengden TMOP og derfor blir mengden TMOP kontrollert relativt omhyggelig.

Hvis polyolets molekylvekt er for høy i utførelsesform B, er hydroksylkonsentrasjonen så lav at det tar for lang tid å reagere for utgangsmaterialene. Hvis på den annen side molekylvekten er for lav og lav-molekylvektsdioler anvendes, kreves større mengder isocyanat og stive skum dannes.

I utførelsesform B har Carbowax 1.000 en ekvivalentvekt på 500 pr. hydroksylgruppe, mens Poly G76-120 med en molekylvekt på 1.400 har en ekvivalentvekt på 46 7 pr. hydroksylgruppe. Da Isonat 143L brukes for å kombinere med hydroksylgruppene, vil mengden av det nødvendige isocyanat være meget avhengig av mengden Poly G76-120 og derfor kontrolleres mengden av Poly G76-12 0 temmelig omhyggelig.

Den praktiske mengde Isonat 14 3-L i både utførelsesform A<!>og B er slik at isocyanatindeksen er 2,5 - 3,5, men fqrj- trinnsvis 2,8 - 3,2 og med meget gode resultater ved 3,1.

Høyere forhold tillater lavere polymerviskositet, lavere skumdensitet og mindre svelling, med de øker også omkost-ningene og reduserer mykhet og forlengelse. Reaksjonsmek-anismen og behovet for å måle isocyanatmengden ved titrering når prepolymer dannes er de samme som omtalt tidligere i forbindelse med^høy-MDI-formen.

Man velger overflateaktive midler som gir et skum med et godt utseende og korrekt cellestørrelse, form og uten sammenbrudd eller spalter. Overflateaktive midler som er kjent for å være anvendelig polyuretanskum kan anvendes her. Eksempler på foretrukne overflateaktive midler er blokk kopolymerene av oksyetylen og oksypropylen såsom pluronpolyoloverflateaktive midler fremstilt av BASF

Wyandotte Corp. i Wyandotte, Michigan. Et foretrukket ""overflateaktivt middel er Pluronic L-62.

Under fremstilling av polyuretanskummet er den foretrukne ""metode å tilsette ca. en lik mengde vandig suspensjon til prepolymerblandingen og deretter blande de to sammen. Sammensetningen av den vandige suspensjon kan også uttrykkes på basis av 100 deler prepolymerharpiks. Således skrives 100 deler vann pr. 100 deler harpiks 100 phr vann. Forholdet av mengden prepolymerblanding til den vandige suspensjon kan variere over et vidt område. Hvis, imidlertid mengden av den vandige suspensjon er for stor, faller styrken til det resulterende skum. Hvis, på den annen side,

mengden av den vandige suspensjon reduseres for meget, vil det ikke være mulig å tilsette nok.celler, hvilke tilføres gjennom den vandige suspensjon.

Den foretrukne metode for skumming av prepolymeren er å oppvarme den vandige suspensjon, f.eks. en 2 % løsning av Pluronic L-62-overflateaktivt middel samt prepolymeren til en temperatur på ca. 35°C. Disse helles eller pumpes sammen i et forhold på ca. 100 vektdeler vandig suspensjon til ca. 80 vektdeler prepolymer og røres umiddelbart i opp-

til 30 sekunder med en mekanisk rører såsom et blad fesjtet l " - i

_ på en røremotor. Så lang tid muliggjør fullstendig blanding, men tillater ikke noen nevneverdig grad av kjemisk reaksjon. Denne blandingen helles umiddelbart i en form, hvor heving og herding av skummet finner sted.

Fremgangsmåten for fremstilling av L-aspartinsyre innbefatter kontakt av et substrat omfattende fumaration med et _ MDI-holdig skum ifølge foreliggende oppfinnelse.- Substratet har fortrinnsvis en pH fra 8 til 10 og temperaturen til substratet er fortrinnsvis fra 15 til 60°C. Substratet inneholder fortrinnsvis ammoniumfumarat og kan også inneholde ytterligere magnesiumioner. L-aspartinsyrefremstillings-prosessen kan utføres kontinuerlig eller satsvis.

P røvemetoder

~~ Clorox- prøven

Denne prøven er en forenklet metode for å prøve bestandig-~~heten til skum mot hydrolytisk nedbryting i et sterkt alkalisk medium. Forsøksmetoden innbefatter dannelse av et skum uten mikroorganismer ved å blande like mengder av en flytende polymer og en 2 % vandig løsning av Pluronic L-62 ved 35°C. Så skjæres en liten skumterning (ca. 150 mg) som løst passer inn i et 20 ml glass med skrulokk. En kon-sentrert vandig natriumhypokloritløsning som selges under handelsnavnet "Clorox" tilsettes glasset. Glass som inneholder skumterningen og Cloroxløsningen ristes frem og tilbake ved romtemperatur på en glassrister på en slik måte at innholdet beveger seg frem og tilbake ca. 20 ganger/minutt. Tiden det tar for skummet å løse seg eller brytes opp i små stykker måles.

Svelle- prøven

Denne prøven er et mål for dimensjonsstabiliteten til

skummet. Den måler graden av svelling fra tørr tilstand

I til våt tilstand. Prøvemetoden innbefatter dannelse av e1tskum uten mikroorganismer ved å -blande like volumer av Jen >

flytende polymer og en 2 % vandig løsning av Pluronic L-62 ved 35°C.

Skummet skjæres til en rektangulær blokk med ca. 7,5 x 12,5 x 2,5 cm og sluttdimensjonene måles nøyaktig. Skummet neddykkes i vann inntil det er fullstendig mettet. Vann-overskuddet presses ut av skummet som måles på nytt. Vol-umet beregnes vått og tørt. Resultatene er angitt som pro-sent økning i svelling fra det opprinnelige tørre volum.

En lav svellingsgrad er i allminnelighet ønskelig.

Autoklav- prøven

Denne prøven er oqså et mål for skummets hydrolysestabili-tet. Prøvemetodikken innbefatter dannelse av et skum uten mikroorganismer ved å blande like volumer av en flytende "polymer og en 2 % vandig løsning av Pluronic L-62 ved 35°C. Skumprøven plasseres i en dampautoklav ved 120°C i 5 timer. Hvis tapet av den kompresjonsbestemte verdi er mindre enn ""30 %, har skummet overlevet og får en "ok" gradering.

Etter at de grunnleggende aspekter ved oppfinnelsen er beskrevet, skal de følgende eksempler illustrere spesifike utførelsesformer av denne.

Fremstillingseksempel 1 ( sammenligning)

I dette eksempel lages en TDI-holdig prepolymer for sammenligning.

En prepolymer ble fremstilt ved å blande 2 molekvivalenter

Carbowax 1.000, polyet;ylenglycol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1.000 laget av Union Carbide og 1 molekviva-lent trimetylolpropan (TMOP). Blandingen ble tørket ved 100-110°C under et trykk på 5-15 Torr for å fjerne vann. Den resulterende tørkede blanding ble langsomt tilsatt over et tidsrom på ca. 1 time til en kjele inneholdende 6,65 molekvivalenter toluendiisocyanat (TDI) under røring av TDI og polyolblandingen. Temperaturen ble holdt på 60°C. Blandingen ble holdt på 60°C under røring i 3 ytterligere timer. Den

endelige reaksjonsblanding inneholdt et 5 mol-% underskudd """av TDI.

Fremstillingseksempel 2

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av en prepolymer for bruk ifølge foreliggende oppfinnelse -i høy-MDI-f ormen.

En blanding av Carbowax 1.000 (412 g, 0,4 mol) og trimetylolpropan (9,05 g, 0,0675 mol) ble tørket ved oppvarming i to timer ved 70°C under et redusert trykk på 2 Torr. Til den tørkede polyolblanding satte man 507,5 g (3,55 ekvivalenter isocyanat) av "Isonat" 143-L, et MDI-basert isocyanatprodukt fra Upjohn Company med en funksjonalitet på ca. 2,1. Temperaturen ble holdt ved 70°C i 2,5 timer, etter hvilken tid isocyanatinnholdet i produktprepolymeren ble funnet å være 2,72 milliekvivalenter/g.

Fremstillingseksempel 3

Dette eksempel viser fremstilling av en lav-MDI-form prepolymer av utførelsesform A ved bruk av en kombinasjon av to forskjellige poly(oksyetylen)dioler som gir en prepoly-... mer som vil gi en mykere, finere og tettere skumstruktur enn skummet som lages fra prepolymeren i Fremstillingseksempel 2.

Fremgangsmåten fra Fremstillingseksempel 2 ble fulgt ved bruk av 348 g (0,35 mol) Carbowax 1.000, 498 g (0,35 mol) Carbowax 1.450, 12,2 (0,09 mol) trimetylolpropan og 729 g (5,10 ekvivalenter isocyanat) Isonat 143-L. Produktprepolymeren hadde et isocyanatinnhold på 2,18 milliekvival-enter/g og viskositet på 23.000 centipois.

Fremstillingseksempel 4

Dette eksempel viser dannelsen av en lav-MDI-form prepolymer av utførelsesform A ved bruken av en forskjellig kombinasjon av dioler. Ved å bruke en meget liten mengde triol

i kombinasjon med en diol med lavmolekylvekt (600) oppnås""en prepolymer som gir et sterkt skum med relativt lav densitet og høy porøsitet, hvilket vil lette gjennomstrømning av reagenser i det resulterende skum.

Fremgangsmåten fra Fremstillingseksempel 2 ble fulgt ved

bruk av 122 g (0,20 mol) Carbowax 600, 263 g (0,18 mol) Carbowax 1.450, 3,7 g (0,03 mol) trimetylolpropan, og 409 g (2,86 ekvivalenter isocyanat) av Isonat 143-L. Produktprepolymeren hadde et isocyanatinnhold på 2,48 milliekvival-enter/g og viskositet på 15.100 cp.

Fremstillingseksempel 5

Dette eksempel viser hvordan prepolymersammensetningen i Fremstillingseksempel 4 kan justeres med mindre Carbowax 600 og mere trimetylolpropan. Den erholdte prepolymer vil føre til et mykere og finere skum.

Fremgangsmåten i Fremstillingseksempel 2 ble fulgt ved å bruke bare 63 g (0,01 mol) Carbowax 600, 355 g (0,24 mol)

Carbowax 1.450, 7,8 g (0,06 mol) trimetylolpropan og 374 g (2,62 ekvivalenter isocyanat) av Isonat 143-L. Produktpoly-[neren hadde et isocyanatinnhold på 2,04 milliekvivalent!er/_g og en viskositet på 36.500 cp.

Fremstillingseksempel. 6

Dette viser bruken av en annen triol i prepolymerblandingen for å lage en lav-MDI-form prepolymer av utførelsesform B.

Fremgangsmåten i Fremstillingseksempel 2 ble fulgt ved å bruke 438 g (0,3 mol) Carbowax 1.450, 34,5 g (0,025 mol) Poly G 76-120 og 370 g (2,59 ekvivalenter isocyanat) Isonat 143-L. Produktet hadde et isocyanatinnhold på 2,07 milli-ekvivalenter/g og viskositet på 11.200 cp.

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av et skum med "bundede mikroorganismer ifølge foreliggende oppfinnelse.

Prepolymeren fra Fremstillingseksempel 2 blandes opp med en vandig del som inneholdt mikroorganismer med aspartaseaktivitet på en lignende måte som den fremgangsmåte som er beskrevet i artikkelen "Immobilization of Escherichia coli Cells Containing Aspartase Activity with Polyurethane and Its Application for L-Aspartic Acid Production" av M.C. Fusee et al i Applied and Environmental Microbiology, bind 42, nr. 4 (oktober 1981) sidene 672-676. Således ble E. coli stamme ATCC 1130 3 dyrket under aerobe betingelser ved 37°C i et medium inneholdende ammoniumfumarat (1,6 %), MgSO^7H20 (0,05 %) , KH2P04(0,2 %), maisstøpvæske (2,0 %) og gjærekstrakt (2,0 %) (pH justert til 7,0). Etter en 24 timers vekstperiode ble cellene samlet ved sentrifugering (5.000

x g, 30 min), og den våte cellepasta (80 % vann) ble blan-det med polyuretanprepolymer ved romtemperatur (1 del cellepasta pluss 1 del prepolymer). Vannet og andre isocyanat-reaktive grupper som befinner seg på celleoverflatene såsom aminer, reagerte med den isocyanatdekkede prepolymer. Denne

reaksjonen forårsaket dannelsen av en polyuretanpolymer som inneholdt fangede og presumtivt kovalént bundede E. coli-... celler inneholdende aspartaseaktivitet. Det resulterende

E. coli-"skum" ble malt til en gjennomsnittlig partikkel-størrelse på 0,5 cm i en Cumberland-mølle før aspartase-aktiviteten ble målt..

Målingen av aspartaseaktivitet er også beskrevet i Fusee et al's publikasjon. For Immobiliserte celler ble en vekt av skumpartikler inneholdende 1 g celler bestemt ved å inku-bere partiklene i en omrørt 100 ml løsning av 1,0 M ammonium-fumaratløsning (pH 9,0) inneholdende 1 mM Mg2+ ved 37°C i 60 minutter. Prøver ble fjernet ved 15, 30 og 60 minutters intervaller. Prøvene ble analysert for tap av fumarsyre og økning av L-malinsyre. Forskjellen mellom den reduserte konsentrasjon av fumarsyre og konsentrasjonen av L-malin-syren som dannes utgjør L-aspartinsyrekonsentrasjonen.

Aspartaseaktivitet ble definert i enheter/g (våtvekt) av ."celler, hvor 1 U er definert som den mengde enzym som gir 1/umol L-aspartinsyre/time ved 37°C under målebetingelsene. Med andre ord er en aktivitetsenhet definert som migrogram fumarsyre tapt fra en standardprøveløsning på en time ved 37°C. Det resulterende elastiske skum ble funnet å ha en aspartaseaktivitet på 64.655 enheter/g våt cellepasta. Dette viser at skummet var virkningsfullt som et immobili-seringsmiddel.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer stabiliteten av skum med bundede mikroorganismer i en alkalisk løsning av ammoniumfumarat.

Et TDI-holdig kontrollskum ble fremstilt ved å blande sammen forskjellige vekter av TDI-holdig prepolymer fra Fremstillingseksempel 1 og hele cellemassen av Escherichia coli-holdig aspartaseaktivitet som beskrevet i artikkelen "Immobilization of Escherichia coli Cells Containing Aspartase Activity with Polyurethane and Its Application for L-Aspartic Acid Production" av M.C. Fusee et al i Applied

and Environmental Microbiology , bind 42, nr. 4 (oktober

.1981), sidene 672-676 . I _|

Et skum ifølge foreliggende oppfinnelse ble fremstilt ved å

blande sammen like vektdeler prepolymer fra Fremstillingseksempel 2 og den samme hele cellemasse av E. coli som oven-for beskrevet.

Begge skum ble skåret opp og så malt til små partikler. En masse av begge disse skumpartikler fikk stå i en 1,5 % løs-ning av ammoniumfumarat ved pH 9. Det TDI-holdige kontrollskum ble mykt og fikk løsningen til å bli uklar og gul i løpet av få dager hvilket viste at det ble brutt ned. Skummet ifølge oppfinnelsen ble ikke mykt og løsningen forble klar og fargeløs etter to uker.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer stabiliteten av skummet under "~ reaks jonsbetingelsene.

Skumpartikler laget ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet ~i Eksempel 1 ble brukt som båret katalysator i en kontinuerlig benkeskalareaktor. Reaktoren var en 200 mm glasskolonne med kappe og med en innvendig diameter på 16 mm.

Den kontinuerlige resirkulasjonsreaktoren ble drevet fra et reservoar av løsning med et totalsystemvolum på 100 cc. Substratet som ble brukt var fumarsyre justert til pH 9,0 med ammoniumhydroksyd. Mengden av katalysatorpartikler var 7,5 g basert på de våte E. coli-celler. Katalysatorpartiklene ble først dyppet i 100 ml substrat ved romtemperatur i 1 time. Væsken fikk renne av og de våte katalysatropartikler ble pakket i kolonnen. Katalysatorpartiklene ble så vasket med 100 ml friskt substrat som var ført gjennom ved 6 ml/min ved 37°C og kastet. Så ble et IM substrat tilført reaktoren. For å måle aktiviteten ble 100 ml av det friske substrat

så øyeblikkelig resirkulert gjennom kolonnen ved 6 ml/min og 100 ul prøver ble fjernet på forskjellig tidspunkter for å bestemme reduksjonen i fumarsyrekonsentrasjonen.

Reaktoren ble kjørt i 20 dager, og i løpet av denne tiden ble reaktoren drevet i nærvær enten av substrat eller piro- dukt eller en blanding av de to ved en total kombinert konsentrasjon på IM substrat pluss produkt. Under forsøks-perioden ble et friskt substrat tilsatt 4 ganger. Etter 20 dagers drift viste systemet fortsatt aktivitet uten synlig mykning eller nedbrytning av skummet, og uten mis-fargning av de reaktive løsninger som inngikk i prosessen.

Eksempel 4

Dette eksempel illustrerer den hydrolytiske aktiviteten

til skummene og deres bestandighet mot hydrolytisk nedbrytning.

Prepolymerene fra Fremstillingseksemplene 1-6 ble laget til skum etter den fremgangsmåte som er angitt i Clorox-prøven. Skummene ble så målt med Clorox-prøven, Svelle-~~prøven og Autoklavprøven. Resultatene er oppført i tabell

1 nedenunder sammen med skummenes densitet.

Det TDI-holdige skum ble lett brutt ned i den hydrolytiske Clorox-stabilitetsprøven, dets volum svellet nesten 150 %, det tålte ikke autoklav-prøven og hadde en meget høy densitet. Alle skummene som var laget fra de MDI-holdige prepolymerer hadde bemerkelsesverdige bedre egenskaper.

Den foregående detaljerte beskrivelse er kun gitt som illustrasjon og det er åpenbart at mange variasjoner kan gjøres innenfor rammen av denne oppfinnelse.

Claims (10)

1. Vannløselig, hydrolysebestandig, hydrofil polyeter-polyurea-polyuretanskum med aspartaseproduserende mikroorganismer bundet til skummet,karakterisertved at det fremspilles ved under skummende betingelser å omsette en vandig blanding inneholdende en kultur av aspartaseproduserende mikroorganismer og en hydrofil , polyeter-polyuretan-prepolymer, hvilket skum har et vektforhold mellom polyurea-polyuretan-polymer og mikroorganismer i skummet fra ca. 2 til ca. 4, et vektforhold av prepolymer til vann fra ca. 2 til ca. 0,5, og prepolymeren har en isocyanatfunksjonalitet utover 2 men . ikké større enn 8 idet minst 50 mol-% av alkylenoksyd-enheten i polyetersegmentene av polyuretanene er etylen-"~oksyd, og er fremstilt ved å omsette en polyalkylen- polyol, et difenylmetandiisocyanatholdig isocyanatprodukt med en funksjonalitet større enn 2,0 omfattende en bland-ning av difenylmetandiisocyanat og isocyanatholdige deri vater av difenylmetandiisocyanat og, helst, et polyolkryssbindingsmiddel med 3-4 hydroksylekvivalenter pr. mol, hvori isosyanatproduktet omfatter en blanding av en hovedmengde av rent difenylmetandiisocyanat og mindre mengder karbodiimider og trifunksjonelle cykloaddukter av difenylmetandiisocyanat.

2. Skum ifølge krav 1,karakterisertved at prepolymeren er enten A. en prepolymer utledet av (a) en poly(oksy-C2_4alkylen)diol med minst ca. 50 vekt-% oksyetylengrupper og en gjennomsnitts molekylvekt på ca. minst 1.100, hvilken diol har nominelt to hydroksylekvivalenter pr. mol, (b) et difenylmetandiisocyanatholdig isocyanatpro-L_ dukt med en funksjonalitet større enn 2,0 om-_| fattende en blanding av difenylmetandiisocyanat og isocyanat inneholdende derivater av difenylmetandiisocyanat, og (c) et monomert polyolkryssbindingsmiddel med 3-4 hydroksylekvivalenter pr. mol, hvilket isocyanatholdige produkt omfatter mindre enn 50 vekt-% av prepolymeren, idet diolen og polyolkryssbindingsmiddelet foreligger i et molforhold i området ca. 4:1 til 8:1, og forholdet av isocyanatekvivalenten til de totale hydroksylekvivalenter ligger i området ca. 2,5:1 ti1 3,5:1; B. en prepolymer dannet fra (a) en poly(oksy-C0_4alkylen)diol med minst ca. 50 vekt-% oksyetylengru<p>per og en gjennomsnittsmolekylvekt mindre enn ca. 2.000, hvilken diol nominelt har to hydroksylekvivalenter pr. mol, (b) et difenylmetandiisocyanatholdig isocyanatprodukt med en funksjonalitet større enn 2,0 omfattende en blanding av difenylmetandiisocyanat og isocyanatholdig derivater av difenylmetandiisocyanat, og . (c) et polymert poly(oksy-C2_4alkylen)polylkryss-bindingsmiddel med 3-4 hydroksylekvivalenter pr. mol, og har en gjennomsnittlig molekylvekt på minst 500, det isocyanatholdige produkt omfatter mindre enn 50 vekt-% av prepolymeren, det polymere polyolkryssbindingsmiddel foreligger slik at hydroksyekvivalentene utgjør 5 til 35 mol-% av de samlede hydroksyekvivalenter i diolet og polyolet, og forholdet av isocyanatekvivalenter til de totale hydroksylekvivalenter er i området ca. 2,5:1 til13,5:1; eller I C. en prepolymer dannet fra (a) en poly(oksy-C2_4alkylen)diol med minst ca. 50 vekt-% oksyetylengrupper og en gjénnomsnitts-molekylvekt på ca. maksimalt 1.100, hvilket diol har to hydroksylekvivalenter pr. mol, (b) et difenylmetandiisocyanatholdig isocyanatprodukt med en funksjonalitet større enn 2,0 omfattende en blanding av difenylmetandiisocyanat og isocyanatholdige derivater av difenylmetandiisocyanat, og (c) et monomert polyolkryssbindingsmiddel med 3 eller 4 hydroksylekvivalenter pr. mol, "hvilket isocyanatprodukt omfatter mer enn 50 vekt-% av prepolymeren, diolen og polyolkryssbindingsmiddelet foreligger i et molforhold i området fra 4:1 til 8:1, og for-eholdet av isocyanatekvivalenter til de totale hydroksyl ekvivalenter ligger i området fra 3:1 til 4:1.

3. Skum ifølge krav 2,karakterisertved at gjennomsnittsmolekylvekten for poly(oksy-C2_4_ alkylen)diolen i del (A) er mellom 1.100 og 2.000 og diolen har minst 80 vekt-% oksyetylengrupper og at den gjennomsnittlige molekylvekten for poly(oksy-C2_4alkylen)-diolen i del B er 600-2.000 og diolen har fortrinnsvis minst 80 vekt-% oksyetylengrupper og, helst at den gjennomsnittlige molekylvekten til poly(oksy-C2_4alkylen)- diolen i del (A) er mellom 1.200 og 1.500 og at gjennomsnittsmolekylvekten til poly(oksy-C2_4alkylen)diolen i del (B) er mellom 950 og 1.500.

4. Skum ifølge krav 2,karakterisertved at poly(oksy-C2_4alkylen)diolen i del (A) omfatter en blanding av minst to dioler som begge har en forskjellig gjennomsnittlig molekylvekt og, helst hvor poly(oksy-C2_4alkylen)diolen i del (A) omfatter en blandinc av en diol med en molekylvekt på ca. 1.000 og en diol med en molekylvekt på ca. 1.450.

5. Skum ifølge krav 2,karakterisertved at polyolkryssbindingsmiddelet i del (A) og i del (C) velges fra gruppen_trimetylolpropan, trimetyloletan, glycerol, trietanolamin, pentaerytritol og blandinger derav og hvor det polymere polyolkryssbindingsmiddel i del (B) velges fra gruppen bestående av en poly(oksy-ety len) triol med en molekylvekt på ca. 900, og en oksy-ety len avs luttet poly (oksypropylen)triol med en molekylvekt på ca. 1.400 og blandinger derav.

6. Skum ifølge krav 5,karakterisert vedat det polymere polyolkryssbindingsmiddel i del (B) inne^holder blokker av oksyetylen og oksypropylenenheter.

7. Skum ifølge krav 2,karakterisert vedat gjennomsnittsmolekylvekten til<p>oly(oksy-C2_4alkylen)-diolen i del (C) er mellom 600 og 1.100 og diolen har minst 30 vekt-% oksyetylengrupper og at isocyanatproduktet omfatter en blanding av en hovedmengde ren difenylmetandiisocyanat og mindre mengder karbodiimider og trifunksjonelle cykloaddukter av difenylmetandiisocyanat.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av L-aspartinsyre,karakterisert vedat et substrat omfattende fumaration bringes i kontakt med skum ifølge krav 1 og 2.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at substratet har en pH fra 8 til 10 og substratets temperatur er fra 15°C til 60°C.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at substratet omfatter ammoniumfumarat eller mag-nesiumion. i ' i