NO820610L - Fremgangsmaate for aa oeke produksjonen av protein i vertsorganismer og dna-plasmid for utoevelse av fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører molekylær-biologi og

rrier spesielt en teknikk for å øke ekspresjons-nivåene for protein-produkter som det er kodet for, av heterolog DNA

i klonende vektorer.

Genetiske endringer kan foregå tilfeldig som et resultat

av mutasjoner som viser seg i et gen. Som et resultat av en endring i genet, kan en tilsvarende endring opptre i dét'■ protein som det koder for, slik at de resulterende egenskaper av organismen endres. Med utviklingen av re-kombinant DNA-teknikk kan slike genetiske endringer gjøres med hensikt ved innføring av en kjent nukleotidsekvens fra en stamme eller art inn i en annen. Den kjente nukleotidsekvens kan velges for å bibringe en ønsket egenskap til den stamme eller art hvori den innføres. Når den modifiserte stamme eller art fortsetter med den normale replikasjonsprosess vil den også duplisere den innførte sekvens.

En vanlig anvendt rekombinant DNA-teknikk innbefatter å

bryte den dobbelt-trådede DNA i den klonende vektor i et plasmid på et passende sted hvor fremmed DNA skal innføres.

For å oppnå dette anvendes typisk spesielle typer av proteiner, benevnt restriksjonsenzymer. Visse restriksjonsenzymer vil åpne DNA ved spesielle nukleotidsekvenser. Hvis tb for-skjellige typer av DNA kuttes på en lignende måte, vil de åpne ender derfor være komplementære og vil under passende be-tingelser slutte..seg sammen med de komplementære ender liggende ved siden av hverandre. De kan så knyttes sammen enzymatisk (med ligase). Dette gjør det mulig å innføre eller "spleise" et fremmed DNA-segment fra en hvilken som helst kilde inn i det ønskede sted i plasmidets klonende vektor.

All DNA, uansett om det er fra mikrober eller fra kompliserte planter eller dyr, består av det samme identiske sett av nukleotider. Når således et DNA-fragment avledet fra en fremmed kilde spleiseslinn i et plasmid, og plasmidet inn-føres i en passende vert-mikroorganisme reproduserer replika-sjonssystemet i verten det innførte segment sammen med DNA

fra den opprinnelige vert.

Når den først er i verten blir den fremmede eller heterologe DNA ikke bare replikert fra generasjon til generasjon, men vil også produsere protein som det er kodet for.

Dette forutsetter at den riktige leseramme og promotorer foreligger. Mengen av protein fremstilt av heterolog DNA som et resultat av re-kombinasjon avhenger selvfølgelig av størrelsesgraden og virkningsgraden av den prosess som anvendes for å utnytte proteinproduksjonen og replikasjonen av den modifiserte vert-bakterie. En annen faktor som er involvert i mengden av fremstilt protein er mengden eller virkningsgraden av proteinfremstilling i hver bakterie. Mengdeandelen av materialer fremstilt av heterolog DNA i forhold til vertens egen DNA er typisk det samme fra celle til celle og fra generasjon til generasjon.

De fleste plasmider eksisterer i bare en kopi for hver bakteriecelle. Noen plasmider forekommer imidlertid i høyere kopinummer enn 1. F.eks. eksisterer plasmidet COlEl typisk i 10 til 20 plasmidkopier pr. kromosom i E.coli.

Med visse plasmider er det mulig å øke den relative mengde-andel av plasmid DNA i cellen ved å tilsette en protein-synteseinhibitor som f.eks. kloramfenikol eller spectinomycin. Denne teknikk hjelper selvfølgelig ikke med til akkumu-leringen av protein hvis det er dette som ønskes. På grunn av nærværet av inhibitor vil bare utbyttet av DNA bli høyere.

Protéinfremstilling kan fremmes ved bruk av såkalte super-promotorer som tilveiebringer ytterst høye nivåer for protein-ekspresjon ved økende mivåer av messenger RNA. En slik teknikk har imidlertid begrensninger i det maksimale takt som cellemaskineriet kan arbeide i. Arbeider ved University of California har lykkes i å isolere mutanter av plasmider hvori kopitallet er mye større enn normalt. F.eks. er COlEl mutanter isolert hvori plasmid-kopitallet overstiger 10 til 20 kopier pr. kromosom. Bruken av slike mutanter for fremstilling av protein fra eksogen DNA kan imidlertid ofte resultere i svikt på grunn av forekomsten av tallrike delesjoner i viktige regioner i plasmidene.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret klonende vektor for rekombinant DNA-fremstilling av protein, og å tilveiebringe et forbedret plasmid som er istand til å eksistere i høyt kopinummer og gi korrekt ekspresjon av protein, samt å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for oppnåelse av proteinfremstilling på høyt nivå fra heterolog DNA innført i klonevektorer i plasmidet.

Andre formål for oppfinnelsen vil fremgå for den fagkyndige fra det etterfølgende beskrivelse sett i forbindelse med de vedføyde tegninger hvori: Fig. 1 er et skjematisk diagram av et plasmid pBGP120; Fig. 2 illustrerer et kopitall-mutant plasmid avledet fra plasmidet i fig. 1 hvori en delesjon har forekommet; Fig. 3 er et skjematisk diagram av plasmidet bygget opp i samsvar med oppfinnelsen.

Meget generelt omfatter plasmidet i samsvar med oppfinnelsen en sekvens av DNA inneholdende et sted 11 for begynnende replikasjon, et sted 12 for dannelse av replikasjons-primertråden, et:.sted 13 for initiering av gjennomlesningsekspresjon, og en seksjon 15 av heterolog DNA nedstrøms fra og under kontroll av ekspresjons- initieringsstedet og kodet for å gi riktig leseramme for fremstilling av et ønsket protein. Sekvensen har videre en forhindrende konfigurasjon som forhindrer gjennomlesnings-transkripsjon inn i replikasjons-primerstrandgenet. Resultatet er et plasmid med høy kopitall-evne som er stabil ved at delesjoner hovedsakelig unngås.

Ved oppbygning av plasmidet i samsvar med oppfinnelsen selekteres et plasmid som er nyttig som en klonende vektor.

Et slikt plasmid er vist og beskrevet av 0''Farre 1,

P.H. Polisky, B., og Gelfand, D.H. i J. Bacteriology 134 (2):645 - 654 (1978). Dette plasmid inneholder en funksjonell del av lac-promotoren og lac-operonet nativt for vert bakterien, endende i et EcoRl restriksjons-enzymsted 14 i beta-galaktosidasegenet i lac-operonet. Denne del kan være forbundet ved restriksjonsstedet 14

til et heterologt gen orientert i den samme orientering og med samme leseramme slik at gjennomlesningen kan foregå fra lac-operonet inn i det heterologe gen i den samme leseramme.

Dette plasmid (pBGP120) eksisterer i høye kopitall-nivåer, omtrent 10 til 20 plasmider pr. celle-kromosom. Plasmider som er istand til å eksistere i ennå høyere.kopitall selekteres ved typisk tidligere kjent teknikk. Slik teknikk inkluderer bestemmelsen av nivåene.for et klonet produkt fremstilt fra plasmidet DNA.

Det er blitt konkludert at det typisk er en repressor fremstilt av repressorgenet 16 i selve plasmidet som holder kopitallet nede, snarere enn noen positiv kontroll som tilveiebringer en stimulus som opprettholder et høyt kopitall. Den foreliggende oppfinnelse anvendes foretrukket for et plasmid hvor et negativt kontrollsystem av denne type er tilstede..1 denne forbindelse vises det til arbeidet med PSC 101 chimerer av Caballo, F. Timmis, K. og Cohen, S.N. i Nature 259:285-290 (1976). Typisk kan flere suksess-ive seleksjonsprosesser kreves for seleksjon av mutantene med høyt kopitall. Med andre ord er det for oppfinnelsen viktig at egenskapen med høyt kopitall er nativt for selve plasmidet, og ikke er resultatet av .noen funksjon særskilt innehatt av den spesielle vert-bakterie. I alle fall har det selekterte plasmid et endret repressorgen 16x (fig. 2) som fører til høyt kopitall, dvs. mer enn 10 til.20 pr. kromosom.

Det er oppdaget at plasmider selektert på denne måte,

selv om de eksisterer i høyt kopitall, nesten uten unntagelse undergår uønskede delesjoner av vesentlige deler av plasmidet (dvs. de er ustabile). Tap av kritiske deler av plasmidet, som f.eks. promotoren som fremmer translasjon av det innskutte heterologe DNA, resulterer av og til i at plasmidet svikter med hensyn til fremstilling av det ønskede protein. Den deleterte form av det høye kopitall-plasmid er vist i fig. 2. Det kan ses at med lac-promotor og mye av lac-operon borte kan DNA-innskutt ved EcoRl stedet 14 kan replikeres, men transkripsjon kan ikke lenger kontrolleres fra lac-promotoren.

Replikasjon begynner ikke spontant fra begynnelsen for plasmid-replikasjon 11 vist i fig. 1. For å begynne replikasjon er det snarere nødvendig at en replikasjons-primer-RNA-tråd genereres. Transkripsjon av denne RNA primer-tråd begynner ved begynnelsen 18 av replikasjons-primertråden som befinner seg mellom EcoRl-stedet 14 og repressoren 16. Den transkriberes i retning mot urviseren på den,ytre DNA-tråd 12 og stopper i den vanlige situasjon ved begynnelsen av plasmid-replikasjonsstedet 11. I rea-liteten fremstilles imidlertid et stort antall RNA-primertråder som strekker seg forbi begynnelsesstedet 11. For at replikasjon skal finne sted må disse RNA-primertråder være behandlet for å trimme trådene og deletere utenom-liggende material.

Senere tids arbeider har vist at repressoren 16 er et

segment av RNA som forhindrer behandlingen av RNA replikasjons-primertrådene for å trimme overskudd av RNA fra trådene. Følgelig er replikasjonen ikke i stand til å begynne ved begynnelsesstedet 11. Denne repressor RNA fremstilles fra den indre tråd som sett i fig. 1 i retning med urviseres,

vist ved pilen 20. I tilfellet med den høye kopitall— mutant, har denne korte RNA repressor en enkel basis-mutasjon

som hypotetisk kan forhindre folding av repressor RNA på

en slik måte at behandlingen av de for lange primertråder blokkeres.

I slike høye kopitall-mutanter, er det postulert at

delesjoner i plasmidene foregår som er resultat av gjennomlesnings-transkripsjon initiert fra lac-promotoren (under cykli.sk AMP-kontroll) i retning mot urviseren som det fremgår av fig. 1, i og gjennom replikasjons-primertråden. Cellen enten mister plasmidet ved ikke å replikere dette,

eller cellen eliminerer lac-promotoren ved passende dele-, sjoner. Transkripsjonsretningen av lac-promotoren er vist i figurene 1 og 3, ved pilen 19. Transkripsjonen av primertråden er i den samme retning som lac og er vist ved pilen 22. Kopitallet alene er ikke nok for å frembringe ustabili-teten, pga. at mutanten er helt stabil (dvs. full størrelse)

i celler hvor lave nivåer for lac-transkripsjon opptrer.

Med den ovennevnte modell i minne kan således en ny for-

bedret metode utnyttes for å generere stabile mutanter i full størrelse. Den nye metode involverer terminering av gjennomlesnings-transkripsjon fra de regulerende og heterologe gen-sekvenser ved anbringelse av et passende transkrip-sjonelt "stopp" signal etter det innskutte heterologe gen. Dette kan gjøres ved å anvende kjent teknikk med passende restriksjonsenzymer og ligase, se generelt Gentz, R., Langner, A., Chang, A, Cohen, S., og Bujard, H. Proe. Nat'l. Acad.

Sei. USA 78:4936-4940 (1981).

Passende transkripsjonene "stopp" signaler inkluderer hoved-terminatoren av bakteriofag fd genpm. Nukleotidsekvensen i bakteriofag fd DNA er kjent, se Beck, E., Sommer, R., Auerswald, E.A., Kurz, Ch., Zink, B., Osterburg, G. og Schaller, H., Nucleic Acids Res. 5 (12):4496-4503 (1978).

Fig. 3 illustrerer anbringelse av et.passende transkrip-sjonelt "stopp" signal når lac- operonet anvendes.for å tilveiebringe reguleringsmekanismen for den innskutte heterologe del.

Det er nyttig å ha temperatur-sensitive (Ts) kopitall-mutanter. Dette er pga. at produksjon i høyt nivå av enkelte proteinprodukter av heterolog DNA kan ha en skadelig virkning på vert-cellene. I temperatur-sensitive kopitall-mutanter er der en opprettholdelse av lavt kopitall når vert-cellene dyrkes ved en "tillatelig" temperatur (vanligvis forholdsvis lav).

Når produktet av heterolog DNA ønskes i større mengder endres temperaturen (økes vanligvis). Ved denne ikke-tillatelige eller restriktive temperatur manifestrerer mutasjonen seg og plasmid-kopitallet øker, og resulterer i øket protein-produksjon fra plasmidene.

Slike Ts-mutanter er sjeldne, men kan finnes for nesten enhver type mutant ved passende seleksjon. Først bestemmes stedet for kopitall-mutanten ved fin-kartlegging med genetisk re-kombinasjon. Når først stedet er kjent, blir stedet spesifikt mutagenisert. Dette kan gjøres ved nukleotid-endring eller ved å kutte ut området med restriksjonsenzymer, sterk mutagenisering av fragmentet med midler som bisulfitt, hydroksylamin eller ultrafiolett-bestråling, og innføring av fragmentet på nytt. De resulterende plasmider transformeres til celler som overproduserer lac-repressor. Disse legges .så over Xgal ved tillatelige temperaturer. "Blå" områder fjernes fra kulturen. Deretter samles ved forhøyede temperaturer nye "blå" arealer som viser seg og som er temperatur-sensitive mutanter.

Disse mutasjoner er generelt "recessive i trans". Dette betyr at når en mutant og et normalt plasmid settes inn i den samme celle maskeres den endrede eller "høy kopitall fenotype".

Den deleterte form av kopitall-mutanten kan eksistere i den samme celle som det normale kopitall-parentaltype-plasmidet (dette er ikke tilfellet for ikke-mutanten pga.iinkompa-tibilitets-egenskapen. Til tross for den tilsvarende replikasjonsmåte, er denne egenskap ikke manifestert i den deleterte form). Når de anbringes i samme celle, faller kopitallet for begge typer av plasmider til det normale

(10 til 15). Det kan således konkluderes at et diffuser-bart produkt - repressoren - normalt opprettholder det lave kopitall men er fraværende eller inaktivt i mutant-formen.

Det er imidlertid nyttig å ha en kopitall-mutant som er dominant i trans.. Dette tillater en mer generalisert metode ved at ikke-kopitall mutant-plasmider med tilsvarende replika-sjonsmåter kan dyrkes til et høyt kopinivå i verter som bærer en slik trans-dominant mutasjon.

Det sees derfor, at oppfinnelsen tilveiebringer et forbedret plasmid som kan eksistere og replikere med høyt kopitall og til å gi korrekt ekspresjon av protein. Med høyt kopitall menes typisk i overskudd av 50 plasmider pr. kromosom og foretrukket i området 100-500 eller mer. Plasmidet muliggjør således at man kan oppnå meget høyt produksjons-nivå, for protein fra heterolog DNA.

Claims (13)

1. Forbedret DNA-plasmid med et sted for begynnende replikasjon, et gen for dannelse av en replikasjons-primerstrand, et sted for initieringen av gjennomlesningsekspresjon, en seksjon av heterolog DNA nestrøms fra det nevnte ekspresjons-initieringssted kodet for og i riktig leseramme for å fremstille et ønsket protein, og et endret repressorgen som fører til høy kopitall-replikasjon, karakterisert ved at plasmidet omfatter et passende transkripsjonalt stopp-signal, lokalisert etter den nevnte heterologe DNA til å forhindre gjennomlesnings-transkripsjon inn i det nevnte gen for den nevnte replika-sj ons-primertråd.

2. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at repressorgenet endres slik at det fremstiller defekt repressor.

3. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at repressorgenet endres slik at det ikke fremstilles noen repressor.

4. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at ekspresjons-initieringsstedet omfatter et sted for initiering av translasjonen og i det minste en vesentlig del av et gen som er nativt for vert-arten av bakterier hvorved gjennomlesning kan foregå fra den nevnte native gen-del inn i den heterologe DNA.

5. Plasmid som angitt i krav 1, karakterisert ved at det har et høyt kopitall mutant-repressorgen som er temperatursensitivt og transdominant.

6. Fremgangsmåte for å øke fremstillingen av protein ved hjelp av heterolog DNA i klonende vektorer i plasmid, karakterisert ved at det selekteres :.; mutanter av plasmidet med endrede repressorgener som fører til høyt kopitall-replikasjon, den heterologe DNA settes inn i de klonende vektorer under kontroll av en promotor, og gjennomlesnings-transkripsjon fra promotoren inn i replikasjons-primertrådgenet av den klonende vektor i plasmidet hindres ved innsetting av en passende transkrip-sjonal stopp-sekvens mellom den heterologe DNA og det nevnte replikasjons-primertrådgen.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at kopitallmutantene er temperatursensitive kopitall-mutanter.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at kopitallmutantene selekteres på en slik måte at slike mutanter er dominante i trans.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av protein i en vert-mikroorganisme, idet dette protein kodes for av heterolog DNA, karakterisert ved at det anvendes en vert-mikroorganisme inneholdende plasmider i et høyere kopitall enn normalt, idet hvert av plasmidene omfatter: et sted for begynnende replikasjon, et sted for dannelse av en replikasjons-primertråd, et sted for initiering av gjennomlesnings-ekspresjon, en seksjon av heterolog DNA nedstrøms fra det nevnte ekspresjons-initieringssted kodet for og i riktig leseramme til å gi et ønsket protein, og et endre repressorgen som fører -til høyt kopitall-replikasjon, idet plasmidet videre har et passende transkripsjonalt stoppsignal lokalisert etter den nevnte heterologe DNA for å forhindre gjennomlesnings-transkripsjon inn i det nevnte sted for replikasjons-primertråden.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, k æ-.r akterisert ved at repressorgenet endres slik at det frembringes defekt repressor.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at repressorgenet endres slik at det ikke fremstilles noen repressor.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at ekspresjons-initieringsstedet omfatter et sted for initiering av translasjon og i det minste en vesentlig del av et gen som er nativt for vert-arten av bakterier hvorved gjennomlesning kan foregå fra den nevnte native gendel inn i den nevnte heterologe DNA.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved et i.høyt kopitall-mutant repressorgen som er temperatursensitivt og transdominant.