NO814384L

NO814384L - Deca-, undeca-, dodeca- og tridecapeptider med tymisk aktivitet

Info

Publication number: NO814384L
Application number: NO814384A
Authority: NO
Inventors: Abraham White; John Joseph Nestor; Gordon Henry Jones; Pamela Miram Burton
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1980-12-22
Filing date: 1981-12-21
Publication date: 1982-06-23
Also published as: IE53004B1; YU42752B; CA1187869A; FI77046C; NZ199335A; DK568281A; JPS57128666A; FI77046B; EP0055113B1; AU546769B2; IL64610A; EP0055113A2; YU303581A; IE813004L; KR830007522A; IL64610A0; FI814112L; HU189550B; AU7870581A; EP0055113A3

Description

Oppfinnelsen vedrører peptider med kort kjedelengde (10, 11,

12 eller 13 aminosyrer) somøker dens immunologiske kompe-

tansen hos pattedyr, særlig hos mennesker.

Det er kjent flere stoffer som, når de administreres til pattedyr, forøker evnen hos organismens immunsystem til å

bekjempe sykdom. Blant disse stoffene er råekstrakter fra mycobakterier, glykopeptider og modifikasjoner av glykopep-

tider avledet fra disse, og "tymosiner11, en type hormoner som utskilles fra brisselen. Det er nylig blitt påvist at en blodfraksjon, nærmere bestemt prealbumin fra menneskeblod,

også besitter en slik aktivitet (US patentskrift nr. 4.046.877).

Strukturen til prealbumin fra menneskeblod er nå med sikker-

het fastslått. Det er en tetramer av underenheter som hver inneholder 127 aminosyrer i en og samme kjente rekkefølge (Kanda, Y., et al, J. Biol. Chem., 249: 6976 (1974)), og til og med den tredimensjonale konfigurasjonen er blitt fastslått (Blake, CL.F., et al, J. Mol. Biol., 121 (3): 339 (1978). Sekvensen med den nærmeste tilknytning til foreliggende oppfinnelse er sekvensen ved N-enden som er fastslått å være:

Et nonapeptidfragment som svarer til sekvensen som starter

ved N-enden i hver underenhet, ble rapportert i 1971 som del av tidligere forsøk på å fastslå prealbuminstrukturen.

(Gonzalez, G. et al, Biochem. J., 125: 309 (1971)).

Det er nå overraskende funnet at deca-, undeca-, dodeca- og tridecapeptidene som utgjør N-endesekvensen i prealbumin-underenheter fra menneskeblod, har en svært stor evne til å øke immunologisk ; kompetanse hos pattedyr. Videre gir endring av aminosyresekvensen på et eller flere, steder i disse peptidene ved å sette inn en annen amino-acylrest i stedet for den som normalt er tilstede, en gruppe peptider

med lik eller forøket aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører peptider med formelen:

hvor:

A, A, og A" uavhengig av hverandre er Gly, D-Ala, D-Leu eller D-Trp, hvor A om ønsket kan være N-alkylert

eller N-acylert,

B er Pro, A 3-Pro, Thz eller diMeThz,

C og C uavhengig av hverandre er Thr, Ser, Val eller

alloThr,

D er Glu, Gin, Asp eller Asn,

R er hydrogen eller laverealkyl eller lavereacyl, substituert for et av hydrogenatomene på e-aminogruppen i lysylresten,

X er Cys, Ala, ABU eller Cys(Me) og

Y er valgt fra gruppen som består av hydroksy, Pro, Pro-Leu, og Pro-Leu-Met, -NH2, ProNH2, Pro-LeuNH2 og Pro-leu-MetNH2, og farmasøytisk akseptable salter derav.

Nærmere bestemt er disse peptidene decapeptider med formelen:

undecapeptider med formelen: dodecapeptider med formelen: og tridecapeptider med formelen

hvor A, A', A", B, C og C<1>, D, R og X er som definert ovenfor .

Disse peptidene er nyttige for å øke immunologisk kompetanse hos pattedyr, og et annet aspekt ved oppfinnelsen angår derfor en fremgangsmåte for økning av nevnte kompetanse, og et ytterligere angår farmasøytiske preparater bestemt for bruk ved en slik fremgangsmåte, som den aktive bestanddel, inneholder et peptid som beskrevet ovenfor.

Et ytterligere aspekt vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som nevnt ovenfor og som en hjelp ved beskrivelsen av denne oppfinnelsen, benyttes de vanlige forkortelsene for de forskjellige vanlige aminosyrene slik de er generelt akseptert i peptidteknikken ifølge anbefaling fra IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11: 1726 (1972) og angir L-aminosyrer med mindre annet er angitt, med unntak av den achirale aminosyren glycin eller andre achirale aminosyrer. Alle peptidsekvenser som her er nevnt, er skrevet i henhold til den generelt aksepterte konvensjonen etter hvilken aminosyren ved N-enden er til venstre og aminosyren ved C-enden er til høyre.

Videre er det benyttet følgende forkortelser for aminoacylrester med tilknytning til oppfinnelsen:

Som nevnt ovenfor, angir alle forkortelser aminoacylrester L-enantiomeren, med mindre annet er angitt.

Uttrykket "laverealkyl" refererer slik det her er brukt til en rett eller forgrenet, mettet hydrokarbongruppekjede med fra 1-4 karbonatomer slik som f.eks. metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl og tert-butyl.

"Lavereacyl" henviser til

hvor R' er laverealkyl som

definert ovenfor.

"N-acylert" henviser til en aminogruppe i amidbinding med lavereacyl.

"N-alkylert" henviser til en aminogruppe hvori et hydrogen-atom er blitt erstattet med laverealkyl.

"N-acylert" er forkortet til NAc og "n-acylerte" aminosyre-rester har NAc i begynnelsen av sine navn eller forkortelser. "N-alkylert" er forkortet til NR<1>og N-alkylerte aminosyre-rester har NR<1>i begynnelsen av sine navn eller forkortelser. Dersom den bestemte alkylgruppe er angitt, brukes de vanlige betegnelsene, f.eks. NMe, NEt, etc. i stedet for NR'. Således forkortes f.eks. en acylert glycylrest med NAc-Gly,

et alkylert glycyl forkortes med NR'-Gly og en glycylrest som har en metylgruppe substituert ved a-amino, forkortes NMe-Gly.

I tilfeller hvor karboksylgruppen i peptidkjeden foreligger

i form av amidet, tilføres NH2til forkortelsen for amino-acylresten i denne posisjonen, f.eks. peptidet Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala hvor alaninet ved C-enden er i form av amidet, angis som NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-AlaNH2.

Når det ikke er anført noe før aminosyreresten i N-enden, betyr det at H- er knyttet til den frie bindingen hos nitro-genatomet, når ingen anførsel er gjort etter aminosyreresten i C-enden, betyr dette at -0H er knyttet til karbonylet i enden. F.eks. betyr Gly-Gly-Gly således ^N-CH^-NH-CH^C-OH. Dersom et unntak skal gjøres med hensyn til C-endegruppen,

og anførselen er ment kun å indikere en rest, vil dette være anført slik. Følgelig er f.eks. Ala ved C-enden hos et pep-

Uttrykket "farmasøytisk akseptable salter" henviser slik det her er brukt til salter som beholder denønskede biologiske

aktivitet til opphavsforbindelsen og som ikke gir noen uønskede toksikologiske virkninger. Eksempler på slike salter er (a) syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, bromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre og lignende, og salter dannet med organiske syrer slik som f.eks. eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, malein-syre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbin-syre, benzosyre, garvesyre, embonsyre, alginsyre, polyglutam-syre, naftalensulfonsyrer, naftalendisulfonsyrer, polygala-turonsyre, (b) salter med polyvalente metallkationer slik som sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kopper, kobolt, nikkel, kadmium og lignende, eller med et organisk kation dannet fra N,N'-dibenzyletylendiamin eller etylen-diamin, eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt og lignende.

Økningen av immunologisk kompetanse kan demonstreres ved hjelp av forskjellige indisier, hvorved det benyttes både in vitro og in vivo biologiske prøver på små dyr som er velkjent i immunologisk teknikk. F.eks. kan de følgende prøver nevnes:

- azatioprin-sensitiv rosettprøve in vitro eller in vivo,

- antistoff-syntese in vivo eller in vitro,

- dyrking av lymfoide vev,

- blandet lymfocyttreaksjon,

- blastogenese med konkanavalin A,

- in vitro spontan rosettprøve,

- fremstilling av cytotoksiske lymfocytter,

- lymfocytt selv-sensitivisering in vitro eller in vivo.

De ovenfor nevnte prøver har tilknytning til en eller flere av de generelle klassene av klinisk betydning for hvilke immunologisk kompetanse er antatt å være en faktor:

- stimulering av antistoff-syntese,

- erstatnings- og gjenoppbygningsterapi,

- autoimmune sykdommer.

Prøven som ble valgt for en hurtig og nøyaktig påvisning av virkning med hensyn til økning av immunologisk kompetanse,

er den ovenfor nevnte, velkjente in vitro rosettprøve som beskrevet av Bach, J.P., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 68: 2734 (1971), ved hvilken følsomheten hos rosettdannende celler fra milt mot azatioprin, [6-(l-metyl-4-nitro-5-imidazolyl)-merkaptopurin], måles.

En stor mengde dokumentasjon:tunderstøtter betydningen av denne prøven for å fastslå immunologisk status (kfr.

Bach, J.F., "The Mode of Action of Immunosuppressive Agents", North Holland/American Elsevier Publishing Co., Amsterdam/ New York, 1975). Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser virkning i denne prøven på nanogram eller picogram-nivåer.

Disse peptidene kan følgelig være klinisk nyttige for behandling av mennesker i situasjoner hvor immunologisk kompetanse antas å være en nyttig faktor, f.eks. autoimmune sykdommer, (f.eks. lupus erytematosus, uleerøs kolitt, autoimmun hemo-lytisk anemi, tyrotoksikosis, leddreumatisme, skrumplever), tymisk aplasia og dysplasia, immunitetsøkning ved infeksjo-ner (f.eks. bakterielle, virale og fungale), Hodgkins sykdom, hypogammaglobulinemisk syndrom, avvikende celledelingsfor-hold, avtagende immunologisk kompetanse på grunn av midler-tidig svikt i brisselens hormonproduksjon, i kjemisk eller strålingsinduserte immun-undertrykte tilstander, osv.

Peptidene kan tilberedes i form av konvensjonelle farmasøy-tiske eller medisinske preparater ved sammenblanding med farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske hjelpestoffer. F.eks. kan materialet blandes med organiske eller uorganiske, inerte farmasøytiske bærere egnet for parenteral administrering, f.eks. intramuskulært, subkutant eller intravenøst i form av f.eks. væskeoppløsninger, suspensjoner og lignende, i hele eller oppdelte doser. Egnede bærere kan inneholde f.eks. slike vanlige hjelpestoffer som sterilt vann eller saltvann, polyalkylenglykoler slik som polyetylenglykol, oljer av vegetabilsk opprinnelsem hydrogenerte naftalener og lignende.

De farmasøytiske preparatene som inneholder det foreliggende materialet, kan utsettes for konvensjonelle farmasøytiske midler slik som sterilisering (f.eks. ved millipore-filtrer-ing) og kan inneholde konvensjonelle farmasøytiske hjelpestoffer slik som preserveringsmldler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, bindingsmidler, salter for justering av osmotisk trykk eller buffere. Preparatene kan også inneholde andre terapeutiske nyttige materialer, eller materialer som forlenger varigheten av virkningen av den foreliggende forbindelse. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av slike doseringsformer er kjente og vil være åpenbare for fagmannen. En bred oversikt over slike teknikker for fremstilling av preparater kan finnes f.eks. i "Remington's Pharmaceutical Sciences" av E.W. Martin.- Et foretrukket preparat er et

slikt hvor peptidet er sterilisert og lyofilisert enten alene i eller sammen med andre faste hjelpestoffer, og lagret i et sterilt glass inntil bruk. Umiddelbart før administrering, tilsettes den ønskede mengde oppløsningsmiddel, f.eks. vann, vannholdige preserveringsmidler eller en oppløsning av forskjellige hjelpestoffer i vann, for å oppløse peptidet.

i

I alle tilfelle vil farmasøytiske preparater som skal administreres inneholde peptidet i en terapeutisk effektiv mengde for behandling av det bestemte aktuelle forhold.

Den foreskrevne dose kan bestå av en enhet eller oppdelte doser, men vil i alle tilfeller nødvendigvis være avhengig av behovene til vedkommende som behandles og legens bedøm-melse. Som en grov veiledning for de fleste tilfeller, vil imidlertid peptidene bli administrert i området fra ca.

10 ng/kg/dag til ca. 20 mg/kg/dag, fortrinnsvis fra ca.

100 ng/kg/dag til ca. 5 mg/kg/dag. Uttrykt på en annen måte vil dette for et gjennomsnittlig (70 kg) voksent menne-ske være fra 700 ng/dag til 1,4 g/dag, fortrinnsvis fra 7 mg/dag til 350 mg/kg.

Foretrukne decapeptider, undecapeptider, dodecapeptider og tridecapeptider ifølge oppfinnelsen er slike hvor A, A<1>og A" uavhengig av hverandre er Gly, D-Leu, D-Trp eller D-Ala, idet A eventuelt kan være alkylert eller acylert ved a-aminogruppen, B er Pro, C og C' er Thr, R er hydrogen, D er Glu, Gin, Asp eller Asn, og X er Ala, Cys eller Cys(Me).

Særlig foretrukket blant disse er slike hvor A, A' og A" uavhengig av hverandre er Gly eller D-ala og hvor A eventuelt kan være alkylert eller acylert ved a-aminogruppen,

D er Glu eller Gin og X er Ala eller Cys.

Andre foretrukne forbindelser er de hvor Y er -OH, -Nr^,

Pro eller ProNH2.

Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan syntetiseres ved en hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent for fagmannen innen peptidteknikken. Et utmerket sammendrag av de mange teknikkene som således er tilgjengelige, finnes i J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis,

W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, s. 46, Academic Press (New York) 1973 for peptidsynteser i fast fase, og E. Schroder og K- Lubke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York) 1965 for klassisk syntese i oppløsning.

Disse fremgangsmåtene omfatter generelt den trinnvise til-føyelsen av en eller flere aminosyrer eller passende beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede. Vanligvis er enten amino- eller karboksylgruppen i den første aminosyren beskyttet med en egnet beskyttelsesgruppe. Den beskyttede eller avledede aminosyren kan deretter enten knyttes til en inert fast bærer eller anvendes i oppløsning ved å tilsette den neste aminosyren i sekvensen med den kompiimentære (amino eller karboksyl) gruppen passende beskyttet under egnede forhold for dannelse av amidbindingen. Den beskyttende gruppen fjernes deretter fra den tilknyttede aminosyreresten og den neste aminosyren (passende beskyttet) tilsettes, osv. Etter at alle deønskede aminosyrene er blitt knyttet sammen i den bestemte sekvensen, fjernes eventuelle gjenværende beskyttende grupper (og eventuelle faste bærere) hver for seg eller samtidig, hvorved det endelige polypeptidet frembringes. Ved en enkel modifikasjon av denne generelle fremgangsmåten, er det mulig å tilsette mer enn en aminosyre av gangen til en voksende kjede, f.eks. ved å kople (under forhold som ikke racemiserer chirale sentre)

et beskyttet tripeptid med et passende beskyttet dipeptid, hvorved man får et pentapeptid etter å ha fjernet beskyttelsesgruppen.

En særlig foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter peptid-syntese i fast fase.

Ved denne fremgangsmåten beskyttes a-aminogruppen i aminosyrene ved hjelp av en syre- eller base-følsom gruppe. Slike beskyttelsesgrupper bør ha egenskaper som gjør dem stabile under forholdene ved dannelse av peptidbindinger, mens de bør være lette å fjerne uten at den voksende peptidkjeden ødelegges eller at noen av de chirale sentrene i kjeden racemiseres. Egnede beskyttelsesgrupper- for aminosyrer generelt er t-butyloksykarbonyl (Boe), benzyloksy-karbonyl (Cbz), bifenylisopropyloksykarbonyl, 9-fluorenyl- metyloksykarbonyl (Fmoc), t-amyloksykarbonyl, isobornyloksy-karbonyl, a,a-dimetyl-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, o-nitrofenylsulfenyl, 2-cyano-t-butyloksykarbonyl og lignende, spesielt t-butyloksykarbonyl (Boe).

De følgende er egnede beskyttelsesgrupper for funksjonelle grupper i sidekjede:

- for e-aminogruppen i lysin: Cbz og Boe,

- for hydroksylgruppene i serin, treonin og allo-treonin:

benzyl (Bz) og tetrahydropyranyl (som danner etere),

- for SH i cystein: p-metoksybenzyl, benzyl eller trityl

(som danner tioetere), alkyldisulfider eller karbamoyl-grupper slik som etylkarbamoyl eller acetamidometyl,

- for karboksylgruppen i glutamin- eller asparaginsyrer: benzyl-2,4,6-trimetylbenzyl eller t-butyl som danner estere.

Aminosyren ved C-enden knyttes til en egnet, fast bærer. Faste bærere som egner- seg for ovenfor nevnte syntese, er slike materialer som er inerte overfor reagensene og reak-sjonsforholdene ved de trinnvise reaksjonene med kondensa-sjon og fjerning av beskyttelsesgrupper, og som også er uoppløselige i de anvendte media. Egnede faste bærere er benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenpolymer og lignende, særlig klormetylpolystyren-1% divinylbenzenpolymer. For det spesielle tilfelle hvor C-enden i forbindelsen er et amid, er benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenpolymeren beskrevet av P. Rivaille, et al, Heiv. Chim. Acta., 54,

2772 (1971) en særlig nyttig bærer.

Bindingen til klorometylpolystyrendivinylbenzen-harpikstypen utføres ved hjelp av reaksjonen mellom den Na<->beskyttede aminosyresærlig Boc-aminosyren, i form av dens cesium, tetrametylammonium, trietylammonium, 1,5-diazabicyklo[5.4.0]-undec-5-en eller lignende salter i etanol, acetonitril, N,N-dimetylformamid (DMF) og lignende, særlig cesiumsaltet

i DMF, og klormetylharpiksen ved en forhøyet temperatur,

f.eks. mellom ca. 40 og 60°C, fortrinnsvis ca. 50°C, i fra ca. 12 til 48 timer, fortrinnsvis ca. 24 timer. Na<->Boc-aminosyren knyttes til benzhydrylaminharpiksen ved hjelp av en N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCC)/1-hydroksybenzotriazol (HBT) bevirket kopling ifra ca. 2 til ca. 24 timer, fortrinns-, vis ca. 12 timer ved en temperatur på mellom ca. 10 og 50°C, fortrinnsvis 25°C i et oppløsningsmiddel slik som diklormetan eller DMF, fortrinnsvis diklormetan. Den suksessive sammenkoplingen av beskyttede aminosyrer kan utføres i en automatisk polypeptidsyntetiserer som er velkjent innen teknikken. Fjerningen av de Na<->beskyttede gruppene kan ut-føres i nærvær av f.eks. en oppløsning av trifluoreddiksyre i metylenklorid, hydrogenklorid i dioksan, hydrogenklorid i eddiksyre eller andre sterke syreoppløsninger, fortrinnsvis 50% trifluoreddiksyre i diklormetan omtrent ved omgivelses-temperaturer. Hver enkelt beskyttet aminosyre innføres foretrukket i et overskudd på omtrent 2,5 molar og sammenkoplingen kan utføres i diklormetan, diklormetan/DMF-blandinger, DMF og lignende, særlig i metylenklorid omtrent ved omgivel-sestemperatur. Sammenkoplingsmidlet er vanligvis DCC i diklormetan, men kan være N,N'-di-iso-propylkarbodiimid eller andre karbodiimider enten alene eller i nærvær av HBT, N-hydroksysuccinimid, andre N-hydroksyimider eller oksimer. Alternativt kan det anvendes estere som er aktive mot beskyttede aminosyrer (f.eks. p-nitrofenyl, pentafluor-fenyl og lignende) eller symmetriske anhydrider.

Ved slutten av syntesen i fast fase fjernes det fullstendige beskyttede polypeptid fra polymeren. Når bindingen til polymerbæreren er av benzylestertypen, gjennomføres oppdel-lingen som gir et peptid med et syreamid i sin C-ende, ved å behandle med ammoniakk/alkohol (f.eks. metanol eller etanol)-oppløsninger ved en temperatur på ca. 10-50°C, fortrinnsvis 25°C, i 12-24 timer, fortrinnsvis 18 timer. (Oppdeling som gir en ester ved C-enden fulgt av aminolyse- er en alternativ fremgangsmåte hvorved man frembringer det ovenfor nevnte produktet).

Det frie peptid løsnes fra polymeren med samtidig fjerning

av beskyttelsesgruppen ved behandling med væskeformig hydrogenfluorid og anisol ved en temperatur mellom ca. -10

og +10°C, i mellom ca. 15 minutter og 1 time, fortrinnsvis ca. 3 0 minutter.

Beskyttelsesgrupper. for sidekjeder kan fjernes ved å behandle med f.eks. vannfritt væskeformig hydrogenfluorid i nærvær av . anisol eller andre karbonium-fjernere som beskrevet ovenfor, behandling med hydrogenfluorid/pyridin-kompleks, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddiksyre, ved reduksjon med hydrogen og palladium på karbon eller polyvinyl-pyrrolidon, eller ved reduksjon med natrium i væskeformig ammoniakk. I det spesielle tilfellet med peptider bundet til benzhydryl-amino-polymerer, hvor amidet ved C-enden er ønsket, kan fjerning av beskyttelsesgrupper og fjerning av peptidet fra polymeren utføres samtidig ved å behandle med flytende hydrogenf luorid og anisol. som ovenfor. beskrevet.

Polypeptidet som er fullstendig befridd for beskyttelsesgrupper, renses deretter ved en sekvens av kromatografiske trinn hvor en hvilken som helst eller alle av de følgende typer anvendes: ionebytting på en svakt basisk polymer i acetatform, hydrofob adsorpsjonskromatografi på ikke-avledet polystyrendivinylbenzen (f.eks. Amberlite XAD), adsorpsjonskromatografi på silikagel, ionebytterkromatografi på karboksy-metylcellulose, adskillingskromatografi, f.eks. på Sephadex G-25, eller motstrømsfordeling, "high performance"-væskekromatografi (HPLC), særlig omvendt fase HPLC på oktyl- eller oktadecylsilyl-silika-bundet fasekolonnepakking.

(I de tilfellene hvor en eller flere D-aminosyrer skal inn-føres i peptidet, er det ofte mer fordelaktig å anvende en racemisk blanding av D- og L-formene enn den mer kostbare isolerte D-enantiomer i syntesen. Etter innføring i den nevnte blanding, vil det oppnås en diastereomer blanding av peptider. Diastereomerene kan separeres ved hjelp av teknik-

ker som er kjent, og isoleres f.eks. ved hjelp av det kromatografiske fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Ettersom antallet av diastereomerer imidlertid vil øke med en faktor på 2 hver gang et D/L-enantiomerpar innføres, bør denne separering og isolering utføres ved en hvilken som helst mellomtilstand hvor bare en D/L-blanding har vært brukt,

før innføringen av den neste. Adskillelsen kan derfor utføres på sluttproduktet under når bare en D/L-blanding er anvendt, men når det er brukt mer enn en i sekvensen,

vil det også være nødvendig med separeringer på mellomtrinn.)

Det aspektet ved oppfinnelsen som har tilknytning til en fremgangsmåte for fremstilling av peptidene nevnt ovenfor, vedrører følgelig en fremgangsmåte som er kjennetegnet ved: å fjerne beskyttelsesgrupper og, om ønsket, faste bærere som er kovalente bundet fra et beskyttet peptid for derved å frembringe et decapeptid, undecapeptid, dodecapeptid eller tridecapeptid som beskrevet ovenfor, eller et salt derav, og (a) om ønsket, omdanne det frie decapeptid, undecapeptid,

dodecapeptid eller tridecapeptid til et farmasøytisk

akseptabelt salt, eller

(b) omdanne et salt av decapeptidet, undecapeptidet, dodecapeptidet eller tridecapeptidet til et farmasøytisk akseptabelt salt, eller (c) dekomponere et salt av decapeptidet, undecapeptidet,

dodecapeptidet eller tridecapeptidet til det tilsvarende frie peptid.

Fremgangsmåten er spesielt kjennetegnet ved:

(i) å fjerne beskyttelsesgrupper fra en forbindelse med formelen:

hvor A, A<1>, A", B, C, C, D, R og X er som definert ovenfor og hvor Y<1>er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, -NH2, Pro, Pro-Leu, Pro-Leu-Met, Pro-NH2, Pro-Leu-NH2 og Pro-Leu-MetNH2, en Pro-rest, en Pro-Leu-rest og en Pro-Leu-Met-rest,

p\ P^, P"^, P^ og P^ er sidebeskyttelsesgrupper for sidekjede hvor

P"*" er en beskyttelsesgruppe som passer for a-amino,

hver P 2 er uavhengig av hverandre en beskyttelsesgruppe som passer for hydroksylgruppe i en sidekjede,

P 3er en beskyttelsesgruppe som passer for en karboksylgruppe i en sidekjede,

P 4er en beskyttelsesgruppe som passer for en e-aminogruppe

i en sidekjede,

P 5er en beskyttelsesgruppe som passer for en sulfhydryl-gruppe i en sidekjede,

S er enten en beskyttelsesgruppe som passer for en karboksylgruppe, eller en fast polymerbærer,

hver av a, b, c, d, e, f og g er et helt tall lik 0 eller 1, eller

(ii) når g er lik 1 og S er en fast polymerbærer,

A) å behandle forbindelsen med formel II med et avspaltingsmiddel for fast bærer, fulgt av fremgangsmåten ifølge (i), eller B) behandle forbindelsen med formel II med et avspaltingsmiddel for fast bærer, samtidig med fremgangsmåten ifølge (i), eller C) behandle det erholdte produkt fra fremgangsmåten ifølge (i) med et avspaltingsmiddel for fast bærer, eller (iii) omdanne en forbindelse med formel I til et farmasøytisk akseptabelt salt ved å behandle med en organisk eller uorganisk syre eller (iv) omdanne et salt av forbindelsen med formel I til et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt ved å behandle

med en forskjellig organisk eller uorganisk syre,

eller

(v) dekomponere et salt av en forbindelse med formel I til et fritt polypeptid med formel I ved å behandle med en uorganisk base.

De følgende eksempler er gitt for å gjøre det mulig for fagmannen i større grad å forstå og praktisere foreliggende oppfinnelse. De må ikke bli betraktet som en begrensning av be-skyttelsesomfanget for oppfinnelsen, men heller som illu-strerende og representative for dem.

Fremstilling A

( Fremstilling av polymerbundet aminosyre ved C- enden)

En oppløsning av 3,4 g Boc-Ala-OH i en blanding av 26 ml etanol (EtOH) og 26 ml H20 ble bragt til pH 7 ved tilsats av en oppløsning med ca. 2,9 g cesiumkarbonat i ca. 10 ml vann. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved redusert trykk og resten resuspendert i tørr EtOH. Oppløsningsmidlet ble på nytt fjernet ved redusert trykk og resten tørket i 24 timer under høyvakuum.

Den tørre resten ble suspendert i 94 ml tørr dimetylformamid

(DMF) og 14,29 g klormetylpolystyren-l%-divinylbenzen-polymer (1,05 mmol Cl/g polymer) ble tilsatt. Suspensjonen ble rystet i 24 timer ved 50°C og deretter filtrert på en Buchner-glass-trakt. Polymeren ble vasket på filteret skiftesvis med DMF/H20 (9:1) og EtOH. Etter i det minste tre vaskinger

med hvert oppløsningsmiddel, ble polymeren vasket med tre porsjoner CH2C12 og tørket under vakuum hvorved det ble opp-nådd 17,05 g Boc-Ala-polymer.

Eksempel 1

A. I reaksjonskaret på et Beckman 990 peptid—apparat ble plassert 9,524 g (8,38 mmol) Boc-L-Ala-polymer, fremstilt som beskrevet ovenfor i fremstilling A. Aminosyrer ble tilsatt trinnsvis til denne polymeren ved hjelp av følgende syntese-program:

Trinnene 1-13 fullstendiggjør en sammenkoplingssyklus for en aminosyre og reaksjonens fullendelse kontrolleres ved hjelp av ninhydrinmetoden til E. Kaiser, et al, Anal. Biochem., 34, 595 (1970) .

Polymeren ble i rekkefølge sammenkoplet med et 2-3 molart overskudd av hver beskyttet aminosyre og DCC. Polymeren ble følgelig behandlet med etter hverandre følgende sammenkop-lingssykluser med

9,51 g Boc-Lys(Cbz)-OH,

5,13 g Boc-Ser(Bz)-OH,

8,43 g Boc-Glu(OBz)-OH,

4,38 g Boc-Gly-OH,

8,43 g Boc-Thr(Bz)-OH pluss 20% ved gjentatt behandling 4,38 g Boc-Gly-OH,

8,43 g Boc-Thr(Bz)-OH,

5,38 g Boc-Pro-OH,

4,38 g Boc-Gly-OH.

Polymeren ble fjernet fra reaksjonskaret, vasket med CH2CI2

og tørket under vakuum hvorved man fikk 17,294 g med beskyttet polypeptidpolymer.

Polypeptidproduktet ble frigjort fra polymeren samtidig med

at beskyttelsesgruppen ble fullstendig fjernet fra produktet ved behandling med vannfritt flytende HF. En blanding av 10,0 g beskyttet polypeptid-polymer og 10 ml anisol i et "kel-F"-reaksjonskar ble behandlet med ca. 90 ml vannfritt, flytende HF som var destillert på nytt (fra CoF^), ved 0°C

i 4 5 minutter. HF ble fordampet under vakuum og peptidresten i form av dens HF-salt, ble vasket med 3 x 100 ml porsjoner dietyleter. Resten ble deretter oppløst i iseddik og lyofilisert, hvorved man fikk et hvitt pulver.

Det rå polypeptid ble oppløst i vann og sendt gjennom en ionebytterkolonne med Ag3x4A (svakt basisk) i acetatformen. Fraksjonene som inneholdt produkt, ble skylt ut og lyofilisert, hvorved man fikk råproduktet i acetatformen, 3,71 g.

Sluttrensing av peptidet ble utført ved hjelp av avansert væskekromatografi på en 5x100 cm kolonne med "Lichroprep RP18"-bærer. Prøven ble tilsatt og kolonnen eluert med 97% H20/3% acetonitril (0,03 molar oppløsning i NH^OAc, pH 4,5)

i en mengde på 19 ml/min.

Kolonne-eluatet ble målt ved hjelp av UV-absorpsjon ved 212 nm og fraksjoner ble kuttet ut for å gi størst mulig renhet.

Mesteparten av tidlige eluerte toppen ble slått sammen og lyofilisert fra vann tre ganger hvorved man fikk ren Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, med smeltepunkt 184°C (dekomponering), [a]^<5>-70,3° (Cl, HOAc),

Aminosyreanalyse: Thr + Ser, 2,5 (3), Gly, 1,0 (1),

Pro 1,0 (1), Gly 2,8 (3), Ala 1,1 (1), Lys 1,3 (1).

B. For syntesen av peptider med et amid i C-enden benyttes en benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzen-polymer. Den første aminosyren knyttes til polymeren i et reaksjonskar ved hjelp av en normal nøytraliserings- og koplingssekvens som beskrevet i fremstilling A med tilsats av en ekvivalent hydroksybenzotriazol til reaksjonsblandingen. Sammenkoplingen får fortsette i 18 timer før fullstendigheten av den kontrolleres. Det gjenværende av syntesen foregår som i del A i dette eksemplet.

Eksempel 2

Forbindelser med formel (I) kan alternativ fremstilles ved en klassisk oppløsningssyntese etter følgende skjema:

Forbindelse A og B fremstilles fra de enkelte aminosyrer ved i rekkefølge å beskytte, sammenkople og fjerne beskyt telsesgrupper slik som beskrevet i E. Schroder og K. Lukke, The Peptides, vol. 1, Acad. Press, (New York) 1965. A og B knyttes deretter sammen ved hjelp av acylazid-metoden til J. Honzel, et al, Coll. Czech. Chem. Conn.: 26, 2333 (1971), med DCC/HBT-sammenkopling eller andre sammenkoplingsteknikker for frie fragmenter, og beskyttelsesgrupper fjernes fra det oppnådde peptidet ved hjelp av hydrolyse.

På samme måte kan andre fragmenter i produktforbindelsen kombineres og beskyttelsesgrupper fjernes fra kombinasjonen, f.eks. kan et N-endefragment med syv aminosyrer kombineres med et C-endefragment med fire aminosyrer, hvorved man får et peptid med eleve enheter, f.eks.

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro..

Eksempel 3

På en analog måte med den beskrevet i eksemplene 1 og 2 er andre peptider ifølge foreliggende oppfinnelse blitt fremstilt, f.eks.

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys,

smeltepunkt 200°C (dekomponering), aminosyreanalyse: Thr + Ser 2,6 (3), Glu 1,1 (1), Pro 1,0 (1), Cys + Cystin 1,0 (1), Gly 2,7 (3), Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala,

smeltepunkt 205°C (dekomponering), [a]^<5>-51° (Cl, HOAc), Aminosyreanalyse: Thr + Ser 3,2 (3), Glu 1,0 (1),

Pro 1,1 (1), Gly 2,0 (2), Ala 2,0 (2)/Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala,

smeltepunkt 225°C (dekomponering)

Aminosyreanalyse: Thr + Ser 2,6 (3), Glu 1,0 (1),

Pro 1,0 (1), Gly 1,9 (2), Ala 1,9 (2), Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro

(ingen data, for liten prøve).

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me),

smeltepunkt 140°C (dekomponering), [a]^<5>-49,4° (Cl, HOAc), Aminosyreanalyse: Thr + Ser 2,5 (3), Glu 1,1 (1),

Pro 1,5 (1), Gly 2,9 (3), Lys 1,0 (1), Cys(Me) 1,3 (1).

NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala, NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2, NAc-Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-AlaNH2, NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro, NAc-D-Ala-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu, NAc-D-Ala-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu-Met, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu-MetNH2, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys,

Gly-Pro-Thr-D-Leu-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CysNH2,

Gly-Thz-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu-Met, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu-Met.

Eksempel 4

Omdannelse av et salt til et farmasøytisk akseptabelt salt eller et annet salt.

A. En 0,1 g stor oppløsning av hydrogenfluoridsaltet av Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala (se rensingsfrem-gangsmåten i eksempel 1) oppløses i 50 ml vann og sendes gjennom en kolonne med 50 g "Dowex 3"-anionbytterharpiks som på forhånd var blitt ekvilibrert med eddiksyre og vasket med deionisert vann. Kolonne elueres med deionisert vann og eluatet lyofiliseres, hvorved man får det korresponderende eddiksyresaltet.

Ved å gjenta det ovenfor anførte, men erstatte eddiksyren med andre syrer under ekvilibreringen av harpiksen, kan det oppnås de korresponderende saltene med f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, benzosyre og lignende.

På samme måte kan det fremstilles syreaddisjonssalter av andre forbindelser ifølge oppfinnelsen, f.eks. de som er spesielt nevnt i eksempel 2.

B. Salter med lav oppløselighet i vann kan fremstilles ved utskilling fra vann ved hjelp av den ønskede syre. F.eks.: sinktannatsalt - en oppløsning av 10 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-eddiksyresalt i 0,1 ml vann behandles med en oppløsning av 8 mg garvesyre i 0,08 ml av 0,25 molar NaOH. En oppløsning av 5 mg ZnSO^-heptahydrat i 0,1 ml vann tilsettesøyeblikkelig til peptidoppløsningen.

Den erholdte suspensjonen fortynnes med 1 ml vann og bunnfallet sentrifugeres. Supernatanten dekanteres og resten vaskes to ganger med 1 ml porsjoner vann ved sentrifugering av bunnfallet og dekantering av supernatanten. Bunnfallet tørket under vakuum hvorved man får ca. 15 mg av det blan-dede sinktannatsaltet av det ovenfor nevnte peptidet.

Pamoatsalt - til en oppløsning av 10 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-eddiksyresalt i en blanding av 1,6 ml etanol og 0,1 ml 0,25 molar NaOH ble tilsatt oppløsning av 11 mg embonsyre i 0,3 ml 0,25 molar NaOH. Oppløsningsmidlene ble fjernet ved redusert trykk og resten suspendert i 2 ml vann, sentrifugert og supernatanten ble dekantert. Bunnfallet vaskes med 1,5 ml 1^0, sentrifugeres og supernatanten dekanteres. Bunnfallet tørkes under vakuum hvorved man får ca. 10 mg av pamoatsaltet av det ovenfor nevnte peptidet.

På lignende måte kan andre salter med lav oppløselighet i vann fremstilles.

C. Fremstilling av salt med metallkationer, f.eks.

sinksalt -

Til en oppløsning av 50 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-eddiksyresalt i en blanding av 0,4 ml 0,25 molar NaOH, 0,3 ml vann og 1 ml etanol tilsettes en oppløsning av 15 mg ZnS04~heptahydrat i 0,2 ml vann. Bunnfallet sentrifugeres

og supernatanten dekanteres. Bunnfallet vaskes med 1 ml vann ved sentrifugering og dekantering av supernatanten. Bunnfallet tørkes under vakuum hvorved man får ca. 50 mg

av sinksaltet av det ovenfor nevnte peptidet.

På en lignende måte kan det fremstilles salter med andre multivalente kationer, f.eks. kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kopper, kobolt, nikkel, kadmium og lignende.

Eksempel 5

Fremstilling av syreaddisjonssaltet fra fritt peptid.

Til en oppløsning av 50 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala i form av den frie base tilsettes 30 ml IN eddiksyre. Den erholdte oppløsning lyofiliseres, hvorved man får ca. 50 mg eddiksyresalt av det ovenfor nevnte peptid.

På samme måte ble det, ved å erstatte eddiksyre med andre syrer (i støkiometrisk ekvivalente mengder i forhold til peptidet), fremstilt andre syreaddisjonssalter av peptider, f.eks. saltene av saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre.

Eksempel 6

Omdannelse av saltet til fritt peptid

En oppløsning av 50 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-eddiksyresalt i 25 ml vann sendes gjennom en 50 g kolonne med "Dowex 1" (sterkt basisk, kvaternær ammoniumanionbytter-harpiks) som var ekvilibrert med NaOH-oppløsning for å frem-stille det motsatte hydroksydionét. Kolonnen elueres med 150 ml vann og eluatet lyofiliseres hvor man får ca. 50 mg av det korresponderende polypeptidet i form av den frie base.

På samme måte kan andre syreaddisjonssalter av peptider ifølge oppfinnelsen, f.eks. de nevnt i eksempel 3, omdannes til de korresponderende frie baser.

Eksempel 7

Farmasøytiske preparater

I preparatene omtalt nedenfor er Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNf^ brukt som den aktive bestanddel. Imidlertid kan selvfølgelig også andre peptider ifølge oppfinnelsen brukes.

Alle de faste bestanddelene oppløses i vann og lyofiliseres i et sterilt glass. Før administrering tilsettes vann for å oppløse de faste stoffene. I tilfeller med glass som skal brukes til flere doser, er det foretrukket å bruke vann som inneholder et preserveringsmiddel, f.eks. 1,2 mg metyl-parab^n/ml og 0,12 mg propylparaben/ml. Rekonstituerte preparater kan lagres ved 4°C i opptil to uker.

Eksempel 8

In vitro- rosettprøve

Prøven ble utført i hovedsak som beskrevet av Bach, J.F.

et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., vol. 68, s. 2734 (1974). Den nøyaktige prosedyren var følgende: A. Fremstilling av forrådsoppløsning av natriumsaltet av

azatrioprin.

277 mg av den frie syre av azatioprin ble oppløst i 25 ml vann i et volumetrisk flaske. Ca. 1 ml IN NaOH ble tilsatt dråpevis under omrøring for å oppløse alt pulveret. Den erholdte oppløsningen ble fortynnet 1:100 i Hank's likevekts-oppløsning av salter, pH 7,2, fremstilt fra pulverformet medium, hvorved man fikk en oppløsning inneholdende 0,106 mg/ml azatioprin-natriumsalt, pH 8,2. Denne oppløsningen ble filtrert gjennom et milliporefilter for å gi sterilisering. Den erholdte oppløsningen ble lagret mørkt i et kjøleskap. Stabiliteten ble kontrollert ved å måle optisk densitet ved 280 og 330 nm.

B. Til selve prøven ble det brukt miltceller fra 6-8 uker gamle "C57B1/6 Simonsen" hannmus, hvor brisselen var fjernet 7-30 dager før miltcellene ble tatt ut. De enkelte miltene ble homogenisert og vasket i kald Hank's likevekts-saltopp-løsning. Cellene ble pelletert ved 200 x g i 10 minutter i en avkjølt sentrifuge. Det ble til slutt fremstilt en sammenslått suspensjon av 40-60 x 10^ celler pr. ml.

Kontrollserier

For å bestemme sensitiviteten av miltceller fra. dyr hvor brisselen er fjernet mot natriumsaltet av azatioprin, ble natriumsaltet av azatioprin titrert i området fra 25 yg/rør til 1,56 yg/rør ved hjelp av to ganger seriefortynninger på 0,25 ml av forrådsoppløsningen (del A) i Hank's miltcelle-suspensjon fremstilt som beskrevet ovenfor (0,1 ml) som ble tilsatt til hver fortynning (4,6 x 10 celler/rør).

Prøveserier

Prøvefraksjoner av peptidene (0,125 ml prøver) ble fortynnet, to ganger i serier med Hank's. Til hver fortynning av prøve-fraksjonen ble det tilsatt 2,5 ug natriumsaltet av azatioprin i 0,125 ml Hank<1>s (se ovenfor) og 0,1 ml miltcelle-suspensjon.

Både kontroll og prøveserier ble inkubert ved 37°C i vannbad i 60 minutter. 0,2 ml 50% erytrocytter fra sau (SRBC) i Alsever-oppløsning som var fremstilt to dager tidligere,

ble fortynnet i 15 ml Hank<1>s. 0,125 ml av denne SRBC-suspensjonen ble tilsatt til hvert rør i begge seriene, og cellene ble pelletert i en avkjølt sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter. Pelleterte celler ble avkjølt ved 4°C i 90 minutter, forsiktig resuspendert i en omrører i 5 minutter og rosettene ble telt i et Malessez-apparat for bestemmelse av relativt antall celler i blodet.

Aktiviteten ble bestemt som den minste mengde peptid i prøve-fraksjonene som inhiberte rosettdannelse med 50% eller mer i nærvær av 2,5 yg/rør natriumsalt av azatioprin. (DTT (ditiotreitol) tilsettes som et beskyttelsesmiddel, når dette er angitt.)

3e

(Nanogram som kreves for å bevirke en 50% reduksjon i antall rosetter)

Claims

1. Peptid, karakterisert ved at det har formelen:

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor: A, A <1> og A" uavhengig av hverandre er Gly, D-Ala, D-Leu eller D-Trp, hvor A eventuelt kan være N-alkylert eller N-acylert, B er Pro, A 3-Pro, Thz eller diMeThz, C og C uavhengig av hverandre er Thr, Ser, Val eller alloThr, D er Glu, Gin, Asp eller Asn, R er hydrogen eller laverealkyl eller lavereacyl, substituert for et av hydrogenatomene på e-aminogruppen i lysylresten, X er Cys, Ala, ABU eller Cys(Me) og Y er valgt fra gruppen som består av hydroksy, Pro, Pro-Leu og Pro-Leu-Met, -NH2~ ProNH2 , Pro-LeuNH2 og Pro-Leu-Met-NH2 .

2. Peptid ifølge krav 1 og farmasøytisk akseptable salter derav, karakterisert ved at: A, A' og A" uavhengig av hverandre er Gly, D-Ala, D-Leu eller D-Trp, hvori A eventuelt kan være N-acylert eller N-alkylert, B er Pro eller Thz, C og C er Thr, D er Glu eller Gin, R er hydrogen og X er Ala, Cys eller Cys(Me).

3. Peptid ifølge krav 2 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen som består av: Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me), Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro, Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2 , Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-D-Leu-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CysNH2 , Gly-Thz-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu-Met, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu-Met.

4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den skal anvendes for å øke immunologisk kompetanse hos pattedyr.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 i blanding med en farmasø y-tisk akseptabel, ikke-toksisk bærer.

6. Fremgangsmåte for å øke immunologisk kompetanse hos pattedyr, karakterisert ved å admini-strere til et individ med behov for slik behandling, en terapeutisk effektiv mengde av, eller et farmasøytisk preparat som inneholder en effektiv mengde av, en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid med formel:

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor: A, A" og A" uavhengig av hverandre er Gly, D-Ala, D-Leu eller D-Trp, idet A eventuelt kan være N-alkylert eller N-acylert, B er Pro, A 3-Pro, Thz eller diMeThz, C og C uavhengig av hverandre er Thr, Ser, Val eller alloThr, D er Glu, Gin, Asp eller Asn, R er hydrogen eller laverealkyl eller lavereacyl, som er substituert for et av hydrogenatomene i e-aminogruppen til lysylresten, X er Cys, Ala, ABU eller Cys(Me) og Y er valgt fra gruppen som består av hydroksy, Pro, Pro-Leu og Pro-Leu-Met, -NH2 , ProNH2 , Pro-LeuNH2 og Pro-Leu-MetNH2 . karakterisert ved åi) fjerne beskyttelsesgrupper fra en forbindelse med

hvor A, A', A", B, C, C, D, R og X er som definert ovenfor og hvor Y' er valgt fra gruppen bestående av hydroksy, -NH2 , Pro, Pro-Leu, Pro-Leu-Met, Pro-NH2 , Pro-Leu NH2 og Pro-Leu-MetNH2 , en Pro-rest, en Pro-Leu-rest og en Pro-Leu-Met-rest, P , P^, P"^, P^ og P^ er beskyttelsesgrupper for sidekjeder hvor P^ er en beskyttelsesgruppe egnet for a-amino, hver P 2 uavhengig av hverandre er en beskyttelsesgruppe egnet for et sidekjedehydroksyl, P 3 er en beskyttelsesgruppe egnet for en sidekjede- hydroksylgruppe, P 4 er en beskyttelsesgruppe egnet for en sidekjede-e-aminogruppe, P 5 er en beskyttelsesgruppe egnet for en sidekjede-sulf-hydrylgruppe, S er enten en beskyttelsesgruppe egnet for en karboksylgruppe eller en fast polymerbærer, hver av a, b, c, d, e, f, og g er et helt tall lik 0 eller 1, eller ii) når g er 1 og S er en fast polymerbærer, A) behandle forbindelsen med formel (II) med et avspaltingsmiddel for den faste bærer, fulgt av fremgangsmåten ifølge (i), eller B) behandle forbindelsen med formel (II) med et avspaltingsmiddel for fast bærer, samtidig med fremgangsmåten ifølge (i), eller C) behandle det erholdte produktet frå fremgangsmåten ifølge (i) med et avspaltingsmiddel for en fast bærer, eller iii) omdanne en forbindelse med formel (I) til et farmasøy-tisk akseptabelt salt ved å behandle med en organisk eller uorganisk syre, eller iv) omdanne et salt av forbindelsen med formel (I) til et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt ved å behandle med en annen organisk eller uorganisk syre, eller v) dekomponere et salt av en forbindelse med formel (I) til et fritt polypeptid med formel (I) ved å behandle med en uorganisk base.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat som inneholder 1-99 vektdeler av et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff og 99-1 vektdeler av en forbindelse fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 7, karakter i- sert ved å blande 1-99 vektdeler av nevnte farma-søytisk akseptable hjelpestoff med 99-1 vektdeler av nevnte forbindelse eller av et salt derav for å frembringe nevnte farmasøytiske preparat.