FI77046C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara peptider. - Google Patents

Description

1 77046

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I

Gly-B-Thr-A* -Thr-A" -D-Ser-Lys-X-Y (I)

R

jossa kaavassa A' on Gly, D-Ala tai D-Leu, A" on Gly tai D-Ala, B on Pro tai Thz, D on Glu tai Gin, R on vety tai alem-10 pi alkyyli, joka korvaa yhden lysyylitähteen £-aminoryh-män vetyatomeista, X on Cys, Ala, ABU ( Qi#-aminovoihappo) tai Cys(Me), ja Y on hydroksi, -Nf^» Pro-Leu tai Pro-Leu-Met, ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

15 Erikseen määriteltyinä valmistettavat peptidit ovat dekapeptideja, joilla on kaava:

Gly-B-Thr-A' -Thr-A " -D-Ser-Lys-X; (11Q)

R

undekapeptidejä, jolla on kaava 20 Gly-B-Thr-A'-Thr-A"-D-Ser-Lys-X-Pro; (I11)

R

dodekapeptidejä, jolla on kaava

Gly-B-Thr-A'-Thr-A"-D-Ser-Lys-X-Pro-Leu; (L-) 25 ja tridekapeptidejä, joilla on kaava

Gly-B-Thr-A’-Thr-A"-D-Ser-Lys-X-Pro-Leu-Met (I13)

R

joissa kaavoissa ^A', A", B, D, R ja X merkitsevät samaa kuin edellä.

30 Nämä peptidit ovat käyttökelpoisia nisäkkään immu nologisen vastustuskyvyn parantamiseksi.

Ennestään tunnettuja ovat monet aineet, joiden avulla voidaan kohottaa nisäkkäiden, erityisesti ihmisten elimistön immuunisysteemin kykyä vastustaa tauteja. Tällaisia 35 aineita ovat esimerkiksi mykobakteerien raakauutteet, gly-kopeptidit ja niistä johdetut glykopeptidimodifikaatiot 2 77046 sekä "tymosiinit", kateenkorvan erittämä hormoniryhmä. Äskettäin on osoitettu, että eräällä veren fraktiolla, erityisesti ihmisen seerumiprealbumiinilla on myös tällaista aktiviteettia (US-patenttijulkaisu 4 046 877).

5 Ihmisen seerumiprealbumiinin rakenne on nyt selvi tetty. Se on tetrameeri, joka muodostuu aliyksiköistä, joista jokainen sisältää samassa tunnetussa järjestyksessä 127 aminohappoa (Kanda, Y. et ai., J. Biol. Chem., 249, 6976 (1974)) ; myös sen kolmiulotteinen konfiguraatio on 10 määritetty (Blake, C.L.F. et ai., J. Mol. Biol., 121(3), 339 (1978)). Esillä olevan keksinnön kannalta merkitystä on lähinnä sekvenssin N-terminaalilla, jonka on osoitettu olevan seuraava: 15 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu-Met 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Osana aikaisemmista yrityksistä prealbumiinin rakenteen määrittämiseksi (Conzales, G. et ai., Biochem. J., 125; 20 309 (1971)) valmistettiin kunkin aliyksikön N-terminaalin päästä alkavaa sekvenssiä vastaava nonapeptidifragmentti.

Nyt on yllättäen keksitty, että ihmisen seerumin prealbumiinin aliyksiköiden N-terminaalisarjaa vastaavat deka-, undeka- ja tridekapeptidit ovat erittäin tehokkaita 25 nisäkkäiden immunologisen vastustuskyvyn lisääjiä. Lisäksi modifioimalla näiden peptidien aminohapposekvenssiä siten, että niissä on yhdessä tai useammassa asemassa normaalista poikkeava aminohappotähde, saadaan peptidejä, joiden aktiviteetti on samankaltainen tai parempi.

30 Eri aminohapoista käytetään mukavuussyistä, kuten jo edellä käytettiin, yleisesti peptidikemiassa hyväksyttyjä tavanomaisia lyhenteitä, joita on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11: 1726 (1972); nämä lyhenteet tarkoittavat L-aminohappo- 35 ja, jollei muuta mainita paitsi kun kyseessä on aminohappo, jossa ei ole kiraliteettikeskusta, kuten glysiini tai muu akiraalinen aminohappo. Kaikki tässä mainitut peptidisek- 3 77046 venssit on kirjoitettu yleisesti hyväksytyn käytännön mukaisesti, jolloin N-terminaalinen aminohappo on vasemmalla ja C-terminaalinen aminohappo oikealla.

Keksinnössä käytetään lisäksi seuraavia aminohappo-5 tähteiden lyhenteitä:

Aminohappotähde Lyhenne

Tiatsolidiini-2-karboksyylihappo Thz S-metyyli-L-kysteiini Cys(Me)

10 Ct-aminovoihappo ABU

Samoin kuin edellä myös nämä aminohappotähteiden lyhenteet tarkoittavat kaikki L-enantiomeeria, jollei muuta ilmoiteta.

15 Tässä käytettynä ilmaisulla "alempi alkyyli" tar koitetaan suoraa tai haarautunutta tyydyttynyttä hiilive-tyryhmää, jossa on 1 - 4 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopropyyliä, n-butyyliä, isobutyyliä, sek-butyyliä ja tert-butyyliä.

20 Niissä tapauksissä, joissa peptidiketjun karbok- syyliryhmä on amidin muodossa, NH2 on liitetty aminohappotähteen lyhenteeseen tähän asemaan; esimerkiksi peptidiä Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, jossa alaniinin C-terminaali on amidin muodossa, edustaa kaa-25 va NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-AlaNH2·

Kun N-terminaalin aminohappotähteen edessä ei ole mitään merkintää, se tarkoittaa, että typen vapaaseen va-lenssiin on liittynyt vety; kun aminohappotähteen C-termi- 4 77046 naalin perässä ei ole mitään merkintää, se tarkoittaa, että päätekarbonyyliryhmään on liittynyt -OH. Esimerkiksi

Gly-Gly-Gly tarkoittaa siten yhdistettä 0 0 0

Il II II

5 H2N-CH2C-NHCH2C-NH-CH2C-OH. Jos C-terminaalin ryhmässä tapahtuu muutos ja tarkoituksena on vain osoittaa tätä, niin se esitetään. Siten esimerkiksi peptidin C-termi-naalissa oleva Ala on CH^ CH-.

, J v -3 1Q -HNCHCOOH; Ala-tähde on -NH-CH-C0-.

Tässä käytettynä ilmaisulla "farmaseuttisesti hyväksyttävä suola" tarkoitetaan suolaa, jossa vastaavan ei suolamuodossa olevan yhdisteen biologinen aktiivisuus on säilynyt ja joka ei aiheuta ei-toivottuja myrkkyvaikutuk- 15 siä. Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat a) epäorgaanisten happojen kanssa muodostetut happoadditiosuolat, esimerkiksi kloorivedyn, bromivedyn, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon ym. suolat; orgaanisten happojen kanssa muodostetut suolat, esimerkiksi etikka- 2Q hapon, oksaalihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiini-hapon, fumaarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omena-hapon, askorbiinihapon, bentsoehapon, pamoiinihapon, algii-nihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenisulfonihapon, nafta-leenidisulfonihapon, polygalakturonihapon ym. suolat; 25 b) polyvalenssisten kationien suolat, kuten sink ki-, kalsium-, vismutti-, magnesium-, aluminium-, kupari-, koboltti-, nikkeli-, kadmiumsuolat ym., tai orgaanisen kationin, kuten N,N'-dibentsyylietyleenidiamiinin tai etylee-nidiamiinin suolat tai 3Q c) (a):n ja (b):n yhdistelmät, kuten sinkkitannaat- tisuola.

5 77046

Keksinnön mukaisessa menetelmässä edellä kuvattujen peptidien valmistamiseksi suojatusta peptidistä poistetaan suojaryhmät ja mahdollisesti kovalenttisesti sidottu kiinteä tukiaine, jolloin saadaan edellä kuvattu dekapeptidi, 5 undekapeptidi, dodekapeptidi tai tridekapeptidi tai tällaisen peptidin suola, ja haluttaessa vapaa dekapeptidi, undekapeptidi, dodekapeptidi tai tridekapeptidi muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai dekapeptidin, undekapeptidin, 10 dodekapeptidin tai tridekapeptidin suola muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai dekapeptidin, undekapeptidin, dodekapeptidin tai tridekapeptidin suola hajotetaan, jolloin saadaan vastaava vapaa peptidi. Synteesimenetelmä 15 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mukais ten peptidien ja niiden suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista, että i) poistetaan suojaryhmät yhdisteestä, jolla on kaava: 20 (P1) -Gly-B-Thr—A' -Thr—A"-D-Ser—Lys-X-(Y') (S)

a 12 12 «3 12 ' 15 f 9T

(P2)b (P2)b (P1)C(P >b R <P >e (P )d (II) jossa A', A", B, D, R ja X merkitsevät samaa kuin edellä, Y' on hydroksi, NH2# Pro, Pro-Leu, Pro-Leu-Met, Pro-tähde, 25 Pro-Leu-tähde tai Pro-Leu-Met-tähde, P1, P2, P1, P2 ja P3 ovat sivuketjujen suojaryhmiä, joista P1 on sopiva Qt-amino- 2 ryhmän suojaryhmä, jokainen ryhmistä P on toisistaan riip- pumatta sopiva sivuketjuhydroksyylm suojaryhma, P on so- 2 piva sivuketjun karboksyyliryhmän suojaryhmä, P on sopiva 30 sivuketjun £-aminoryhmän suojaryhmä, P^ on sopiva sivu-ketjun sulfhydryyliryhmän suojaryhmä, S on joko sopiva karboksyylin suojaryhmä tai kiinteä polymeeritukiaine, a, b, c, d, e, f ja g ovat kukin kokonaislukuja 0 tai 1, edellyttäen, etteivät kaikki a-e ja g voi olla 0, tai 35 ii) kun g on 1, ja S on kiinteä polymeeritukiainen 3 kaavan II mukaista yhdistettä käsitellään kiinteän tukiaineen lohkaisevalla aineella, minkä jälkeen prosessi i) 6 77046 tai /B) kaavan II mukaista yhdistettä käsitellään kiinteän tukiaineen lohkaisevalla aineella, samanaikaisesti kuin suoritetaan prosessi i) tai Zc) käsitellään prosessin i) tuotetta kiinteän tukiaineen lohkaisevalla aineella; tai 5 iii) kaavan I mukainen yhdiste muutetaan farmaseut tisesti hyväksyttäväksi suolaksi käsittelemällä se orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla; tai iv) kaavan I mukaisen yhdisteen suola muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi kä- 10 sittelemällä se erilaisella orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla; tai v) kaavan I mukaisen yhdisteen suola hajotetaan vapaaksi kaavan I mukaiseksi polypeptidiksi käsittelemällä se epäorgaanisella emäksellä.

15 Peptidejä voidaan siis syntetisoida millä tahansa alalla hyvin tunnetulla menetelmällä. Sopivia menetelmiä on yhteenvetona esimerkiksi teoksissa J.M. Stewart ja J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, ja J. Meienhofer, Hormonal 20 Proteins and Peptides, vol. 2, s. 46, Academic Press (New York) 1973, joissa käsitellään kiinteäfaasipeptidisyntee-siä; ja K. Lubke, The Peptides, voi. 1, Academic Press (New York) 1965, jossa käsitellään klassista liuossyntee-siä.

25 Näissä menetelmissä suoritetaan yleensä peräkkäin yhden tai useamman aminohapon tai suojatun aminohapon lisäys kasvavaan peptidiketjuun. Normaalisti ensimmäisen aminohapon amino- tai karboksyyliryhmä suojataan sopivalla suoja-ryhmällä. Suojattu aminohappo tai aminohappojohdannainen 30 voidaan sitten joko liittää inerttiin kiinteään tukiaineeseen, tai se voidaan liittää liuoksessa sarjan seuraavaan aminohappoon, jossa on sopivasti suojattu komplementtiryhmä (amino- tai karboksyyliryhmä), olosuhteissa, jotka sopivat amidisidoksen muodostumiseen. Lisätystä aminohappotähteestä 35 poistetaan sitten suojaryhmä, ja seuraava aminohappo (joka on sopivasti suojattu) lisätään jne. Kun kaikki aminohapot 77046 7 on liitetty oikeassa järjestyksessä niin jäljellä olevat suojaryhmät (ja mahdollinen tukiaine) poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti, jolloin saadaan lopullinen polypeptidi. Yksinkertaisin muunnoksin voidaan tätä yleistä menetelmää 5 käyttäen lisätä kerrallaan useampi kuin yksi aminohappo kasvavaan ketjuun, esimerkiksi liittämällä (olosuhteissa, joissa kiraliteettikeskukset eivät rasemisoidu) suojattu tri-peptidi sopivasti suojattuun dipeptidiin, jolloin suoja-ryhmien poistamisen jälkeen saadaan pentapeptidi.

10

Erityisen edullisesti keksinnön mukaisia yhdisteitä valmistetaan kiinteäfaasipeptidisynteesillä.

Tässä menetelmässä aminohappojen Ok-aminoryhmä suojataan happo- tai emäsherkällä ryhmällä. Tällaisten ryhmien 15 tulisi olla pysyviä olosuhteissa, joissa muodostetaan pep-tidisidokset, mutta helposti poistettavia ilman, että pep-tidiketju hajoaa tai rasemisoituu jonkin kiraliteettikes-kuksensa suhteen. Sopivia aminohappojen suojaryhmiä ovat yleisesti tert-butyylioksikarbonyyli (Boc), bentsyylioksi-2o karbonyyli (Cbz), bifenyyli-isopropyylioksikarbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc), tert-amyyli-oksikarbonyyli, isobornyylioksikarbonyyli , <y,o(.-dimetyy-li-3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli, o-nitrofenyyli-sulfenyyli, 2-syaani-tert-butyylioksikarbonyyli ym, var-25 sinkin tert-butyylioksikarbonyyli (Boc).

Seuraavat ovat sopivia sivuketjujen funktionaalisten ryhmien suojaryhmiä: - lysiinin £, -aminoryhmälle: Cbz ja Boc; - seriinin ja treoniinin hydroksyyliryhmille: 30 bentsyyli (Bz) ja tetrahydropyranyyli (muodostavat eette- reitä); - kysteiinin SH-ryhmälle: p-metoksibentsyyli, bentsyyli tai trityyli (muodostavat tioeettereitä), alkyylidisulfidit tai karbamoyyliryhmät, kuten etyylikarbamoyyli, tai aset- 25 amidometyyli; - glutamiinihapon karboksyyliryhmille: bentsyyli-2,4,6-trimetyylibentsyyli tai tert-butyyli (muodostavat estereitä).

77046 8 C-terminaalinen aminohappo liitetään sopivaan kiinteään tukiaineeseen. Sopivia tukiaineita tähän synteesiin ovat sellaiset, jotka ovat inerttejä reagenssien suhteen ja inerttejä vaiheittaisissa kondensaatio-suojaryhmänpoisto-5 reaktioiden reaktio-olosuhteissa sekä liukenemattomia käytettyihin reaktioväliaineisiin. Sopivia kiinteitä tukiaineita ovat bentshydryyliamino-polystyreeni-divinyyli-bentseenipolymeeri, kloorimetyylipolystyreeni-divinyyli-bentseenipolymeeri, hydroksimetyylipolystyreeni-divinyy-10 libentseenipolystyreeni jne., varsinkin kloorimetyylipoly-styreeni-(1%)-divinyylibentseenipolymeeri. Siinä erityistapauksessa, että yhdisteen C-terminaali on amidi, on varsinkin bentshydryyliamino-polystyreeni-divinyylibentsee-nipolymeeri käyttökelpoinen tukiaine (P. Rivaille et ai., 15 Helv. Chim. Acta., 54, 2772 (1971)).

Kiinnittäminen kloorimetyylipolystyreeni-divinyyli-bentseenityyppiseen hartsiin suoritetaan reaktiossa N -suojatun aminohapon, erityisesti Boc-aminohapon kanssa sen cesiumsuolan, tetrametyyliammonium-, trietyyliammo-20 nium-1,5-diatsabisyklo/B.4.Q/undek-5-eenisuolan tms. suo lan muodossa etanolissa, asetonitriilissä, N,N-dimetyyli-formamidissa (DMF) tms. Erityisesti käytetään cesiumsuolaa DMF:ssä kloorimetyylihartsin kanssa korotetussa lämpötilassa, esimerkiksi noin 40-60°C:ssa, edullisesti noin 50°C: 25 ssa, noin 12-48 tuntia, edullisesti noin 24 tuntia. N°^-Boc-aminohappo kiinnitetään bentshydryyliamiinihartsiin käyttäen kytkentäaineena N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC)/1-hydroksibentsotriatsolia (HBT) noin 2- noin 24 tunnin aikana, edullisesti noin 12 tunnin aikana, noin 30 10-50°C:ssa, edullisesti noin 25°C:ssa, liuottimessa, ku ten dikloorimetaanissa tai DMF:ssä, edullisesti dikloori-metaanissa. Suojattujen aminohappojen kytkeminen voidaan suorittaa peräkkäin alalla hyvin tunnetussa automaattisessa polypeptidisyntetisaattorissa. -suojaryhmien pois-35 taminen voidaan suorittaa esimerkiksi trifluorietikkaha-pon metyleenikloridiliuoksella, kloorivedyn dioksaaniliu-oksella, kloorivedyn etikkahappoliuoksella tai muulla vah- 9 V7046 van hapon liuoksella, edullisesti 50-%:11a trifluorietik-kahapon dikloorimetaaniliuoksella huoneen lämpötilassa.

Kutakin suojattua aminohappoa käytetään edullisesti noin 2,5-kertainen mooliylimäärä, ja kytkeminen voidaan suo-5 rittaa dikloorimetaanissa, dikloorimetaani/DMF-seoksessa, DMF: ssä tms., varsinkin metyleenikloridissa noin huoneen lämpötilassa. Kytkentäaineena on yleensä DCC dikloorimetaanissa, mutta myös N,N’-di-isopropyylikarbodi-imidiä tai muita karbodi-imidejä joko yksin tai yhdessä HBT:n, N-10 hydroksisukkinimidin tai muiden N-hydroksi-imidien tai ok-siimien kanssa voidaan käyttää. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suojattujen aminohappojen aktiivisia estereitä (esim. p-nitrofenyyli-, pentafluorifenyyliesteri ym) tai symmetrisiä anhydridejä.

15 Kiinteäfaasisynteesin lopussa täysin suojattu polypeptidi poistetaan hartsista. Kun sidos hartsituki-aineeseen on bentsyyliesterityyppiä, pilkkominen sellaisen peptidin muodostamiseksi, jossa on C-terminaalissa happoamidi, suoritetaan käsittelemällä ammoniakki/alkoholi-20 liuoksella (esim. metanoli- tai etanoliliuos) noin 10-50°C: ssa, edullisesti 25°C:ssa 12-24 tuntia, edullisesti 18 tuntia. (Yllä oleva tuote saadaan vaihtoehtoisesti muodostamalla pilkkomalla C-terminaaliin esteri ja sen jälkeen suorittamalla aminolyysi).

25 Vapaa peptidi lohkaistaan hartsista samanaikaises ti poistamalla suojaryhmä käsittelemällä nestemäisellä fluo-rivedyllä ja anisolilla noin -10 - +10°C:ssa noin 15-60 minuuttia, edullisesti noin 30 minuuttia.

Sivuketjujen suojaryhmät voidaan poistaa käsittele-30 mällä esimerkiksi vedettömällä nestemäisellä fluorivedyllä anisolin tai muun karboniumsitojan läsnäollessa kuten edellä kuvattiin, käsittelemällä fluorivety/pyridiinikompleksilla, käsittelemällä tris(trifluoriasetyyli)boorilla ja trifluo-rietikkahapolla, pelkistämällä vedyllä ja Pd/C-katalysaat-35 torilla tai polyvinyylipyrrolidonilla tai pelkistämällä natriumilla nestemäisessä ammoniakissa. Erityistapauksessa, kun peptidi on sidottu bentshydryyliaminohartsiin ja halu- 10 77046 taan saada C-terminaalinen amidi, suojaryhmän poistaminen ja peptidin poistaminen hartsista voidaan suorittaa samoin kuin edellä samanaikaisesti käsittelemällä nestemäisellä fluorivedyllä ja anisolilla.

5 Polypeptidi, josta suojaryhmät on täysin poistettu, puhdistetaan sitten käyttäen erilaisia kromatografiamenetelmiä, kuten joitakin tai kaikkia seuraavia tyyppejä: ioninvaihto heikosti emäksisellä hartsilla (asetaattimuoto); hydrofobinen adsorptiokromatografia ei-derivatoidulla po-10 lystyreenidivinyylibentseenillä (esimerkiksi Amberlite XAD); silikageeli-adsorptiokromatografia; ioninvaihtokromatografia karboksimetyyliselluloosalla; jakaantumiskromatografia esim. Sephadex G-25:llä tai vastavirtajakautumalla; suuren suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC), erityisesti käänteis-15 faasi-HPLC-oktyyli- tai oktadekyylisilyyli-silikasidotulla faasikolonnipakkauksella.

(Sellaisissa tapauksissa, joissa peptidiin on liitettävä yksi tai useampi D-aminohappo, on usein edullisempaa käyttää synteesiin D- ja L-muotojen raseemista seosta 20 kuin kalliimpaa resolvoitua D-enantiomeeriä. Tätä seosta käytettäessä saadaan tulokseksi peptidien diastereomee-rinen seos. Diastereomeerit voidaan erottaa alalla tunne-: tuin menetelmin ja eristää esimerkiksi edellä kuvatuilla kromatografiamenetelmillä. Koska diastereomeerien lukumäärä 25 kuitenkin kasvaa kertoimella 2 jokaista lisättyä D/L-enan-tiomeeriparia kohti, tämä erotus ja eristäminen tulisi suorittaa ennen seuraavan parin lisäämistä jossakin välivaiheessa, jossa on käytetty vain yhtä D/L-seosta. Kun on käytetty vain yhtä D/L-seosta, voidaan erottaminen siten suo-30 rittaa lopputuotteessa, mutta käytettäessä peräkkäin useampia D/L-seoksia, ovat myös välierotuksen välttämättömiä).

Immunologisen vastustuskyvyn paraneminen voidaan osoittaa erilaisilla biologisilla kokoilla, joita immunologiassa suoritetaan sekä in vitro että in vivo käyttäen 35 pieniä koe-eläimiä. Esimerkkeinä voidaan mainita seuraa-vat kokeet: 11 77046 - herkkyys atsatiopriinille rosettikokeessa in vitro tai in vivo, - vasta-ainesynteesi in vivo tai in vitro, - imukudoksen tuottaminen, 5 - seka-lymfosyyttireaktio, - blastogeneesi konkanaväliini A:n kanssa, - in vitro spontaani rosettikoe, - sytotoksisten lymfosyyttien tuottaminen, - lymfosyyttien itsestäänherkistyminen in vitro tai in vivo.

10 Edellä mainitut kokeet liittyvät yhteen tai useam paan yleistä kliinistä merkitystä omaavaan seikkaan, jossa immunologisen kompetenssin uskotaan olevan osatekijänä; näitä ovat: - vasta-ainesynteesin edistäminen, 15 - korvaus- ja toipumisterapia, - autoimmuunitaudit.

Nopeaan ja tarkkaan immunologisen kompetenssin aktiviteetin kohoamisen osoittamiseen käytetään edullisesti hyvin tunnettua edellä mainittua rosettikoetta /Bach, J.P., 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68: 2734 (197DJ7. Tässä kokeessa mitataan pernan rosetteja muodostavien solujen herkkyys atsatiopriinille /6-(l-metyyli-4-nitro-5-imidatsolyyli)mer-kaptopuriini/.

Tämän kokeen merkitystä immunologisen aktiivisuuden 25 osoittajana tukee runsas koemateriaali (vrt. Bach, J.F., "The Mode of Action of Immunosuppressive Agents", North Holland/American Elsevier Publishing Co., Amsterdam/New York, 1975). Kaavan I mukaisilla peptideillä on tässä kokeessa aktiviteettia määrinä, jotka ovat nanogramma- ja pi-30 kogrammasuuruusluokkaa.

Nämä peptididt ovat siten kliinisesti käyttökelpoisia ihmisten käsittelyyn tapauksissa, joissa immunologisen kompetenssin uskotaan olevan tärkeä tekijä, esimerkiksi autoimmuunitaudeissa (esim. lupus erythematosus, 35 haavainen paksunsuolentulehdus, autoimmuuni-hemolyyttinen anemia, kilpirauhasmyrkytys, nivelreuma, maksakirroosi), 12 77046 kateenkorvan vajaakehityksessä ja kasvuhäiriöissä, immuniteetin saavuttamisessa infektiotaudeissa (esim. bakteerien, virusten tai sienien aiheuttamat taudit), Hodgkin'in taudissa, gammaglobuliinin puutoksesta johtuvassa oireyhty-5 mässä, kateenkorvahormonin erittymisen väliaikaisesta vähenemisestä johtuvassa immunologisen vastustuskyvyn alenemisessa, poikkeavissa soluntuottamistapauksissa, tilanteissa, joissa kemiallisesti tai radiologisesti on aiheutettu immuuni vaimennettu tila.

10 Peptidit voidaan valmistaa tavanomaisten farmaseut tisten tai lääkevalmisteiden muotoon sekoittamalla ne farmaseuttisesti hyväksyttävien, myrkyttömien laimennusaineiden kanssa. Ne voidaan sekoittaa esimerkiksi orgaanisten tai epäorgaanisten, parenteraaliseen lääkeantoon sopivien kantaja-15 aineiden kanssa, kuten lihaksensisäiseen, ihonalaiseen tai suonensisäiseen lääkeantoon sopivien kantaja-aineiden kanssa; nämä valmisteet voivat olla nestemäisinä liuoksina tai suspensioina joko yksikköannoksina tai useampia annosyksik-köjä sisältävinä valmisteina. Sopivia kantaja-aineita ovat 2Q esimerkiksi tavallisesti käytetyt steriili vesi tai suolaliuos, polyalkyleeniglykolit, kuten polyetyleeniglykoli, kasviöljyt, hydratut naftaleenit ym.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä sisältäville farmaseuttisille valmisteille voidaan suorittaa tavanomaisia farma-25 seuttisia toimenpiteitä, kuten sterilointi (esim. millipore-suodatus) ja ne voivat sisältää tavanomaisia farmaseuttisia lisäaineita, kuten säilöntäaineita, stabilointiaineita, emul-gointiaineita, turpoavia sideaineita, suoloja osmoottisen paineen säätämiseen tai puskureita. Koostumukset voivat si-3Q sältää myös muita terapeuttisesti vaikuttavia aineita tai aineita, jotka saavat aikaan vaikutusajan pidentymisen. Tällaisten annosmuotojen valmistus on sinänsä tunnettu ja alan asiantuntijalle ilmeinen. Tällaisten koostumusten valmistusta on laajalti kuvattu esimerkiksi teoksessa E.W. Martin: 35 "Remington's Pharmaceutical Sciences”. Edullisessa valmiste-muodossa peptidi on steriloituna ja lyofilisoituna joko yksi- i3 7 70 4 6 nään tai muiden kiinteiden lisäaineiden kanssa steriilissä lääkepullossa. Välittömästi ennen käyttöä siihen lisätään tarvittava määrä liuotinta, esim. vettä, säilöntäainetta sisältävää vettä tai muita lisäaineita sisältävää 5 vettä peptidin liuottamiseksi.

Joka tapauksessa lääkkeenä käytettävän farmaseuttisen koostumuksen tulee sisältää sellainen määrä peptidiä, joka on terapeuttisesti vaikuttava kulloinkin käsitellyssä tautitapauksessa.

10 Annostus voi tapahtua antaen yksikköannoksia tai jaettuja annoksia, ja annostus riippuu aina käsiteltävän potilaan tarpeesta ja häntä hoitavan lääkärin arviosta. Useimpiin tapauksiin voidaan ohjeena antaa seuraavat an-nostusalueet: noin 10 ng - noin 20 mg/kg vuorokaudessa, 15 edullisesti noin 100 ng - noin 5 mg/kg vuorokaudessa. Aikuisella ihmisellä (70 kg) tämä annostus tarkoittaa määriä 700 ng/vrk - 1,4 g/vrk, edullisesti 7 - 350 mg/vrk.

Edullisia kaavan I mukaisia dekapeptidejä, undeka-peptidejä, dodekapeptidejä ja tridekapeptidejä ovat sel-20 laiset, joissa A' on Gly, D-Leu tai D-Ala ja A" on Gly tai D-Ala, B on Pro; R on vety; D on Glu tai Gin, ja X on Ala, Cys tai Cys(Me).

Erityisen edullisia näistä ovat yhdisteet, joissa A' ja A" ovat toisistaan riippumatta Gly tai D-Ala, D 25 on Glu tai Gin ja X on Ala tai Cys.

Eräässä toisessa edullisten yhdisteiden ryhmässä Y on -OH, -NH2 tai Pro.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden aktiivisuus määritettiin in vitro rosettikokeella. Koe suoritettiin olen-30 naisesti kirjallisuusviitteessä Bach, J.F. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 68, s. 2734 (1974), kuvatulla tavalla. Koesuoritus oli yksityiskohtaisesti seuraava: i4 77046 A. Atsatiopriinin natriumsuolan perusliuoksen valmistus 277 mg vapaana happona olevaa atsatiopriinia (Imuran, Burroughs Wellcome) liuotettiin mittapullossa 25 ml:aan vet-5 tä. Liuokseen lisättiin kaiken aineksen liuottamiseksi ti-poittain sekoittaen noin 1 ml 1-n NaOH-liuosta. Lopuksi liuos laimennettiin 1:100 Hank'in tasapainotetulla suolaliuoksella (pH 7,2, valmistettu jauhemaisesta tuotteesta; Difco Labs. Detroit Mich.), jolloin saatiin liuos, joka 10 sisälsi 0,106 mg/ml atsatiopriinin natriumsuolaa, pH 8,2.

Tämä liuos steriloitiin suodattamalla millipore-suotimella. Valmista liuosta säilytettiin valolta suojattuna jääkaapissa. Sen pysyvyys tarkistettiin mittaamalla optinen tiheys aallonpituuksilla 280 ja 330 nm.

15 B. Itse kokeeseen käytettiin sellaisten 6-8 viikon ikäisten urospuolisten C57B1/6 Simonsen hiirten pernasoluja, joilta hiiriltä oli 7-30 vrk ennen tappamista poistettu kateenkorva. Jokainen perna homogenoitiin erikseen ja pestiin Hank'in tasapainotetulla suolaliuoksella. Solut koot-20 tiin pelletiksi linkoamalla (200 x g) 10 minuuttia jäähdytetyssä lingossa. Lopullinen yhdistetty suspensio sisälsi g 40-60 x 60 tumallista solua/ml.

Kontrollisarja: Sellaisten hiirien pernasolujen herkkyys, joilta kateenkorva oli poistettu, atsatiopriinin 25 natriumsuolan suhteen määritettiin titraamalla atsatiopriinin Na-suola määrinä 25-1,56 ^ug/putki käyttäen perusliuoksen (kohta A) 0,25 ml:n kaksinkertaisia sarja-laimennuksia edellä valmistetussa Hank'in pernasolususpen-siossa (0,1 ml), jota lisättiin jokaiseen laimennukseen 30 (4,6 x 10^ solua/putki).

Koesarja: Peptidien koefraktiota (0,125 ml määrät) laimennettiin sarjassa Hank1 in liuokseen kaksinkertaisiksi laimennuksiksi. Lisättiin 2,5 yUg atsatiopriinin Na-suolaa 0,125 35 ml:ssa Hank'in liuosta (samoin kuin edellä), ja 0,1 ml per-nasolususpensiota lisättiin jokaiseen koefraktion laimennukseen .

15 77046

Sekä kontrollisarjän että koesarjan näytteitä inku-boitiin vesihauteessa 37°C:ssa 60 minuuttia. 0,2 ml 2 vrk aikaisemmin valmistettua 50-%:ista lampaan punasolususpen-siota (SRBC) Alsever-liuoksessa (Grand Island Biological 5 Co., "Gibco", Grand Island N.Y.) laimennettiin 15 ml:aan

Hank'in liuosta. Kummankin sarjan putkiin lisättiin kuhunkin 0,125 ml tätä SRBC-suspensiota, ja solut koottiin pelletiksi linkoamalla (200 x g) jäähdytetyssä lingossa 5 minuuttia. Pelletoituja soluja jäähdytettiin 4°C:ssa 90 mi-10 nuuttia, sitten ne suspendoitiin varovasti sekoittamalla 5 minuutin ajan rotaattorissa, ja rosetit laskettiin Males-sez-hemosytometrillä.

Aktiivisuus saatiin määrittämällä pienin koe-fraktioiden sisältämä peptidimäärä, joka esti rosentinmuo-15 dostuksen vähintään 50 %:isesti atsatiopriinin Na-suolan (2,5 yUg/putki) läsnäollessa. Suoja-aineeksi lisättiin joissakin tapauksissa ditiotreitolia (DTT).

Koeyhdiste _Aktiivisuus +

Erittäin puhdas prealbumiini 7r5 - 31r2 20 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CySH(+DTT) 6,25

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CySH(-DDT) 25 - 50 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CyS(Me) 125

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CySH-Pro 7,8 (+DTT) : ’ 25 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CySH-Pro 15,6 (-DTT)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala 97

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro 125 - 250 ·;·: Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-rLys-Ala 31,2 30 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala 125 - 250

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro 1,95 +) määrä ngroina, joka saa aikaan rosettien lukumäärän 50 % risen vähenemisen.

35 Seuraavat esimerkit esitetään, jotta alan asiantun tija voisi paremmin ymmärtää keksintöä ja soveltaa sitä käytäntöön. Niitä voidaan pitää keksintöä valaisevina edustavina esimerkkeinä.

i6 77046

Valmistus A

Hartsiin sidotun C-terminaali-aminohapon valmistus

Boc-Ala-OH:n (3,4 g) liuos etanolin (26 ml) ja veden (26 ml) seoksessa säädettiin pH-arvoon 7 lisäämällä 5 cesiumkarbonaatin (noin 2,9 g) liuos noin 10 ml:ssa vettä. Liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa, ja jäännös suspendoitiin vedettömään etanoliin. Liuotin poistettiin jälleen alennetussa paineessa, ja jäännöstä kuivattiin suur-vakuumissa 24 tuntia.

10 Kuiva jäännös suspendoitiin 94 ml:aan vedetöntä di- metyyliformamidia (DMF), ja suspensioon lisättiin 14,29 g kloorimetyylipolystyreeni-1 %-divinyylibentseeni-hartsia (1,05 mmol Cl/g hartsia) Merrifield-hartsi - Lab Systems Inc). Suspensiota ravisteltiin 24 tuntia 50°C:ssa, sitten 15 se suodatettiin Biichner-lasisuppilolla. Hartsi pestiin suo-timella vuoronperään DMF/H20-seoksella (9:1) ja EtOH:lla. Vähintään 3 kummallakin liuottimella suoritetun pesun jälkeen hartsi pestiin 3 annoksella CH2CI2 ja kuivattiin va-kuumissa, jolloin saatiin 17,05 g Boc-Ala-hartsia.

20 Esimerkki 1 A. Beckman 990 Peptidi-syntetisaattorin reaktioas-tiaan pantiin 9,524 g (8,38 mmol) edellä valmistuksessa A saatua Boc-L-Ala-hartsia. Aminohappoja lisättiin peräkkäin tähän hartsiin seuraavan synteesiohjelman mukaisesti: 25

Vaihe 1 CH2CI2— pesu kerran 1,5 min 2 50 % CF^CC^H/C^C^— kerran 1,5 min suojaryhmänpoisto 3 50 % CF3C02H/CH2C12— kerran 30 min 30 suojaryhmänpoisto 4 CH2Cl2-pesu 3 kertaa 1,5 min 5 10 % trietyyliamiini/ 2 kertaa 1,5 min CH2C12 17 77046

Vaihe 6 Cl^Ci^-pesu 3 kertaa 1,5 min 7 -Boc-aminohappoliuos kerran lisäys 8 Ν,Ν'-disykloheksyylikarbo- kerran lisäys di-imidiliuos 5 9 CH2Cl2“huuhtelu ja kerran kytkentä- kytkentäreaktio reaktio 2 h 10 C^C^-huuhtelulisäys kerran 1,5 min 11 CHjC^-pesu 3 kertaa 1,5 min 12 etanolipesu 3 kertaa 1,5 min 10 13 CE^C^-pesu 3 kertaa 1,5 min

Vaiheet 1-13 edustavat yhtä täydellistä sykliä yhden aminohapon kytkemiseksi, reaktio todetaan täydelliseksi ninhydriinimenetelmällä (E. Kaiser et ai., Anal.

15 Biochera., 34, 595 (1970)).

Hartsi kytkettiin peräkkäin käyttäen 2-3 kertaista mooliylimäärää kutakin suojattua aminohappoa ja DCC:tä. Hartsia käsiteltiin tällä tavoin peräkkäisissä kytkentä-sykleissä käyttäen seuraavia aminohappoja: 20 9,51 g Boc-Lys(Cbz)-OH, 5,13 g Boc-Ser(Bz)-OH, 8.43 g Boc-Glu (OBz)-OH, 4.38 g Boc-Gly-OH, 8.43 g Boc-Thr (Bz)-OH plus 20 % uusintakytkentään ____; 4,38 g Boc-Gly-OH, • - 8,43 g Boc-Thr (frz-) -OH>- 5.38 g Boc-Pro-OH, 4.38 g Boc-Gly-OH.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin C^C^Jlla ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 17,294 g suojattua polypeptidihartsia.

35 Polypeptidituote poistettiin hartsista samanai kaisesti kuin kaikki suojaryhmät käsittelemällä vedettö- χβ 77046 mällä nestemäisellä HF:llä. Suojatun polypeptidihartsin (10,0 g) ja anisolin (10 ml) seosta Kel-F-reaktioastiassa käsiteltiin noin 90 ml:11a uudelleentislattua (CoF^ista) vedetöntä HF:ää 0°C:ssa 45 minuuttia. HF haihdutettiin 5 vakuumissa, ja HF-suolan muodossa oleva peptidi pestiin dietyylieetterillä (3 x 100 ml). Jäännös liuotettiin jää-etikkaan ja lyofilisoitiin valkeaksi jauheeksi.

Epäpuhdas polypeptidi liuotettiin veteen, ja liuos johdettiin ioninvaihtokolonnin lävitse, joka sisälsi 1Q Ag3X4A:ta (heikosti emäksinen) asetaattimuodossa. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 3,71 g raakatuotetta asetaattimuodossa.

Peptidin lopullinen puhdistus suoritettiin suuren suorituskyvyn nestekromatografialla, jossa kolonnin (5 x 15 100 cm) pakkauksena oli Lichroprep RP18 (käänteisfaasi).

Näyte lisättiin kolonniin ja aluoitiin vesi/asetonitriili-seoksella (97:3, liuoksen NH^OAc-pitoisuus oli 0,03-m, pH 4,5) 19 ml/min.

Eluenttia tutkittiin UV-absorptiolla aallonpituudella 2Q 212 nm, ja kaikkein puhtaimmat fraktiot koottiin. Suurin alussa eluoitu piikki yhdistettiin ja lyofilisoitiin vedestä 3 kertaa, jolloin saatiin puhdas Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, sp. 184°C (hajoaa); /«C7p5 -70,3° (Cl, HOAc).

Aminohappoanalyysi: 25 Thr + Ser 2,5 (3); Gly 1,0 (1); Pro 1,0 (1);

Gly 2,8 (3); Ala 1,1 (1); Lys 1,3 (1).

B. Sellaisten peptidien syntetisoimiseksi, joiden C-terminaalissa on amidi, käytetään bentshydryyliamino-poly-styreeni-divinyylibentseenihartsia. Ensimmäinen aminohappo 3Q liitetään hartsiin reaktioastiassa samoin kuin valmistuksessa A käyttäen normaalia neutralointi- ja liittämissarjaa ja lisäten reaktioseokseen 1 ekv. hydroksibentsotriatsolia. Liittämisreaktio saa jatkua 18 tuntia ennen reaktion täydellisyyden toteamista. Muu osa synteesistä suoritetaan samoin 35 kuin tämän esimerkin osassa A.

19 77046

Esimerkki 2

Vaihtoehtoisesti kaavan I mukainen yhdiste voidaan valmistaa klassisella liuossynteesillä, jota esitetään kaavamaisesti seuraavasti: 5 (A) Boc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-OMe (Bz) (Bz) 10

Boc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-N3_ (Bz) (Bz)

Boc-DAla-Glu-Ser_Lys_Cys 15 (Bz) (Cbz) (Bz) — (B) D-Ala-Glu-Ser-Lys-Cys- (Bz) (CBz) (Bz) 20 ’

Boc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser—Lys—Cys (BZ) (Bz) (Bz) (Cbz) (Bz)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Cys, Sp. 200°C.

— 25 V Yhdisteet A ja B valmistetaan erillisistä aminohapoista peräkkäisillä suojaus-, liittämis- ja suojaryhmän poista-mistoimenpiteillä, joita on kuvattu teoksessa E. Schroder 30 ja K. Lukkey The Peptides, voi. 1, Acad.Press, (New York) 1965. A ja B liitetään sitten asyyliatsidimenetelmällä (J. Honzel et ai., Coll. Czech Chem. Conn; 26, 2333 (1971)) käyttäen DCC/HBT-kytkentäainetta tai muulla vapaafragmentti-kytkentätekniikalla, ja saadun peptidin suojaryhmät poiste-35 taan hydraamalla.

77046 20

Samalla tavalla voidaan yhdisteen muita fragmentteja kytkeä yhteen, ja saadusta yhdisteestä poistaa suoja-ryhmät, esimerkiksi 7 aminohappoyksikköä sisältävä N-ter-minaalifragmentti voidaan kytkeä 4 aminohappoyksikköä si-5 sältävään C-terminaalifragmenttiin, jolloin saadaan 11 yksikön peptidi, esimerkiksi:

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro.

Esimerkki 3

Analogisesti esimerkeissä 1 tai 2 kuvatun menetel-10 män kanssa valmistettiin tai voidaan valmistaa seuraavat peptidit:

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys; sp. 200°C (hajoaa); aminohappoanalyysi: Thr + .Ser 2,6 (3); Glu, 1,1 (1); Pro, 1,0 (1); Cys + Cystine 1,0 15 (1); Gly 2,7 (3); Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala; sp. 205°C (hajoaa); [a]^ -51° (Cl, HOAc); aminohappoanalyysi: Thr + Ser, 3,2 (3); Glu, 1,0 (1); 20 Pro 1,1 (1), Gly 2,0 (2), Ala 2,0 (2), Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala; sp. 225°C (hajoaa); aminohappoanalyysi: Thr + Ser 2>6 (3)'* Glur IjO (1); Pro, 1,0 (1); Gly, 1,9 (2); Ala, 25 1,9 (2); Lys 1,1 (1).

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro; sp 187°C rOLJ^5 -70,1° (0,9,HOAC) 30 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me),

Sp. 140°C (hajoaa); . [a]^5 -49,4° (Cl, HOAc); : aminohappoanalyysi: Thr + Ser, 2,5 (3); Glu, 1,1 (1);

Pro 1,5 (1), Gly 2,9 (3), Lys 1,0 (1), Cys(Me) 1,3 (1).

35 21 77046 NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala, NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2, 5 NAc-Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-AlaNH2, NAc-Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro, 10 sp 192°C foil^5 -75,6° (0,8,HOAC) NAc-D-Ala-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu, 15 NAc-D-Ala-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu-Met,

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala-Pro-Leu-MetNH2, 20 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro, sp 187°C, I'CCJ^5 “70,9° (0,9,HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala, sp 187°C “5°/lC) (0,9,HOAC) 25

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2, fCpl5 "42,4° (0,75, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu, 30 fCU/l5 -75,6° (0,9, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu, sp 182°C -76,7° (0,9, HOAC) 35 Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, sp 153°C CQiJq5 -40,4° (1,0, HOAC) 22 7 70 4 6

Gly-Pro-Thr-D-Leu-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, sp 162°C, -36,7° (0,4, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-CysNH2, 5

Gly-Thz-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, sp 133 - 140°C, -48,7° (0,9, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu-Met, 10 sp 178°C, föjl5 -77,0° (0,8, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu-Met, sp 170 - 173°C, fCtfl5 -77,0° (0,8, HOAC) 15 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro, sp 187°C, CQt,]*5 -70,9° (0,9, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro, sp 187°C, -70,1° (0,9, HOAC) 20

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys(Me)-Cys, sp 187°C, -42,4° (1,0, HOAC)

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Abu, 25 Sp 180°C, -47,7° (0,7, HOAC)

Esimerkki 4

Suolan muuttaminen farmaseuttisesti hyväksyttä-30 vaksi tai muuksi suolaksi A. Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala (katso - esimerkin 1 puhdistusmenetelmää) liuotetaan 50 ml:aan vet tä, ja liuos johdetaan kolonniin, joka sisältää 50 g Dowex 3 anioninvaihtohartsia, joka oli etukäteen tasapai-35 notettu etikkahapolla ja pesty deponoidulla vedellä. Ko- lonni eluoidaan deponoidulla vedellä ja effluentti lyofili-soidaan, jolloin saadaan vastaava etikkahapon suola.

23 770 4 6

Toistamalla edellä esitetty menettely käyttäen etik-kahapon sijasta hartsin tasapainottamiseen muita happoja voidaan valmistaa esimerkiksi kloorivetyhapon, bromivetyha-pon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon, bentsoehapon 5 tms. suolat.

Samoin voidaan valmistaa muiden kaavan I mukaisten yhdisteiden, kuten esimerkissä 2 lueteltujen yhdisteiden happoadditiosuolat.

B. Suolan ollessa niukkaliukoinen veteen se voidaan 10 valmistaa saostamalla vedestä käyttäen haluttua happoa.

Esimerkiksi sinkkitannaattisuola valmistetaan liuottamalla 10 mg Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala:n asetaat-tisuolaa 0,1 ml:aan vettä, ja lisäämällä liuokseen 8 mg parkkihappoa 0,08 mltssa 0,25-m NaOH-liuosta. Peptidin liu-15 okseen lisätään sitten välittömästi 5 mg ZnSO^-heptahyd- raattia 0,1 ml:ssa vettä. Saatu suspensio laimennetaan 1 ml: 11a vettä ja sakka lingotaan. Supernatantti dekantoidaan, ja jäännös pestään 2 kertaa 1 ml:n annoksilla vettä välillä lingoten ja dekantoiden. Sakka kuivataan vakuumissa, jol-20 loin saadaan noin 15 mg edellä olevan peptidin sekasinkki-tannaattia.

Pamoaattisuolan valmistus: Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Ser-Lys-Ala:n asetaattisuolan (10 mg) liuokseen etanolin (1,6 ml) ja 0,25-m NaOH-liuoksen (0,1 ml) seoksessa lisä-25 tään 11 mg pamoiinihappoa 0,3 mlrssa 0,25-m NaOH-liuosta. Liuottimet haihdutetaan alennetussa paineessa, ja jäännös suspendoidaan veteen (2 ml), suspensio lingotaan ja supernatantti dekantoidaan. Sakka pestään vedellä (1,5 ml), lingotaan ja supernatantti dekantoidaan. Sakka kuivataan va-30 kuumissa, jolloin saadaan noin 10 mg mainitun peptidin pa-. . moaattisuolaa.

; - Samalla tavalla voidaan valmistaa muita niukkaliu- koisia suoloja.

C. Suolan valmistus metallikationin kanssa, esim.

35 sinkkisuolan valmistus. Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala:n asetaattisuolan (50 mg) liuokseen 0,25-m NaOH-liuoksen (0,4 ml), veden (0,3 ml) ja etanolin (1 ml) seoksessa ,Λ 77046 24 lisätään ZnS04-heptahydraatin (15 mg) liuos 0,2 ml:ssa vettä. Sakka lingotaan, ja supernatantti dekantoidaan.

Sakka pestään 1 ml:11a vettä, lingotaan ja supernatantti dekantoidaan. Sakka kuivataan vakuumissa, jolloin saadaan 5 50 mg edellä mainitun peptidin sinkkisuolaa.

Samankaltaisella menetelmällä valmistetaan muiden monivalenssisten kationien suoloja, esim. kalsiumin, vismu-tin, bariumin, magnesiumin, aluminiumin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ym. suolat.

10 Esimerkki 5

Happoadditiosuolan valmistus vapaasta peptidistä

Vapaan emäksen Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala:n (50 mg) liuokseen lisätään 30 ml 1-n etikkahappoa. Saatu liuos lyofilisoidaan, jolloin saadaan noin 50 mg tä-15 män peptidin etikkahapposuolaa.

Samalla tavalla käyttämällä etikkahapon sijasta muita happoja (stökiometrisina määrinä peptidin suhteen) saadaan muita happoadditiosuoloja, esimerkiksi kloorivety-hapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpiha-20 pon suolat.

Esimerkki 6

Suolan muuttaminen vapaaksi peptidiksi

Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala:n asetaatti-suolan (50 mg) liuos 25 ml:ssa vettä johdetaan kolonnin 25 lävitse, joka sisältää 50 g Dowex 1 hartsia (vahvasti emäksinen kvaternäärinen ammonium-anioninvaihtohartsi), joka oli tasapainotettu NaOH-liuoksella vastaionihydroksidin saamiseksi. Kolonni eluoidaan 150 ml :11a vettä, ja eluent-ti lyofilisoidaan, jolloin saadaan noin 50 mg vastaavaa 30 polypeptidiä vapaana emäksenä.

Vastaavalla tavalla voidaan muut kaavan I . mukaisten peptidien happoadditiosuolat, esimerkiksi esimerkissä 3 mainitut suolat, muuttaa vastaaviksi emäksiksi.

Claims (8)

1. 25 77046
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 Gly-B-Thr-A'-Thr-A"-D-Ser-Lys-X-Y (I) V R jossa kaavassa A' on Gly, D-Ala tai D-leu, A" on 10 Gly tai D-Ala, B on Pro tai Thz, D on Glu tai Gin, R on vety tai alempi alkyyli, joka korvaa yhden lysyyli-tähteen £-aminoryhmän vetyatomeista, X on Cys, Ala, ABU (O^-aminovoihappo) tai Cys(Me), ja Y on hydroksi, -NH2, Pro, Pro-Leu tai Pro-Leu-Met, ja niiden farmaseutti-15 sesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että i) poistetaan suojaryhmät yhdisteestä, jolla on kaava: 20 (P1)—Gly—B-Thr—A' —Thr—A"— D-Ser-iys X_ (Y') f _(S) _ (P2)b (P2)b (P3)c (t2)b k (t5)e <P4)d <H) jossa A', A", B, D, R ja X merkitsevät samaa kuin edellä,
3. 25 Y' on hydroksit -NH2, Pro, Pro-Leu, Pro-Leu-Met, Pro-tähde, Pro-Leu-tähde tai Pro-Leu-Met-tähde, pi, P2, P3, P4 ja P5 ovat sivuketjujen suojaryhmiä, joista P3· on sopiva r^-amino-ryhmän suojaryhmä, jokainen ryhmistä P^ on toisistaan riippumatta sopiva sivuketjuhydroksyylin suojaryhmä, P3 on so-30 piva sivuketjun karboksyyliryhmän suojaryhmä, P4 on sopiva sivuketjun £-aminoryhmän suojaryhmä, P3 on sopiva sivu-ketjun sulfhydryyliryhmän suojaryhmä, S on joko sopiva karboksyylin suojaryhmä tai kiinteä polymeeritukiaine, a, b, c, d, e, f ja g ovat kukin kokonaislukuja 0 tai 35 1, edellyttäen, etteivät kaikki a-e ja g voi olla 0, tai 26 7 7 0 4 6 ii) kun g on 1, ja S on kiinteä polymeeritukiaine /A) kaavan II mukaista yhdistettä käsitellään kiinteän tukiaineen lohkaisevalla aineella, minkä jälkeen prosessi i) tai ZB) kaavan II mukaista yhdistettä käsitellään kiinteän 5 tukiaineen lohkaisevalla aineella, samanaikaisesti kuin suoritetaan prosessi i) tai ZC) käsitellään prosessin i) tuotetta kiinteän tukiaineen lohkaisevalla aineella; tai iii) kaavan I mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi käsittelemällä se orgaa- 10 nisella tai epäorgaanisella hapolla; tai iv) kaavan I mukaisen yhdisteen suola muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi happoadditiosuolaksi käsittelemällä se erilaisella orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla; tai 15 v) kaavan I mukaisen yhdisteen suola hajotetaan vapaaksi kaavan I mukaiseksi polypeptidiksi käsittelemällä se epäorgaanisella emäksellä.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mu- 20 kainen peptidi, jossa A' on Gly, D-Ala tai D-Leu, A” on Gly tai D-Ala, B on Pro tai Thz, D on Glu tai Gin, R on vety ja X on Ala, Cys tai Cys(Me).
5. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan
6. 25 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me), Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-D-Ala-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro,
7. 30 Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-Ala, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Gln-Ser-Lys-AlaNH2, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu,
8. 35 Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu, Gly-Pro-Thr-D-Ala-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, 27 77046 Gly-Pro-Thr-D-Leu-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Thz-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys-Pro-Leu-Met, Gly-Pro-Thr-Gly-Thr-Gly-Glu-Ser-Lys-Cys(Me)-Pro-Leu-Met. 28 7 7 0 4 6