NO781684L - Fremgangsmaate til fremstilling av sitronsyre - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte til fremstilling av sitronsyre"

Myse har i lengre tid vært anvendt til foringsformål.

Bl.a. som følge av utvikling av fremgangsmåter til ultrafiltrering av myse har man i den senere tid separert protein fra myse, noe som har medført at det fås store mengder mysepermeat. Dette permeat har et meget lavt proteininnhold, mens konsentrasjonene av laktose og salter er hovedsakelig de samme som i myse. Mysepermeat med

sitt lave proteininnhold betraktes idag som avfall, og da det har et stort biologisk oksygenforbruk (BOD^), er det et avfall som er kost-bart å behandle. Det har nå overraskende vist seg at det høye innhold av laktose i mysepermeat kan utnyttes ved en fremgangsmåte til fremstilling av sitronsyre. Sitronsyre har stor anvendelse i næringsmiddelindustrien som smaksstoff, og det anvendes også i en viss grad innenfor den farmasøytiske og kjemiske tekniske industri. Sitronsyre kan f.eks. anvendes som kompleksdanner i rengjøringsmidler og ved rensing av røkgass.

De fremgangsmåter som for tiden anvendes til fremstilling av sitronsyre, er svært gamle, og den vanligste fremgangsmåte er stadig den hvor Aspergillus niger overflategjæres i åpne trau under anvendelse av melasse, fortrinnsvis fra sukkerroer, som karbonkilde. Der finnes idag også moderne neddykkede metoder med eller uten kontinuerlig dyrking, men disse har bare kommet i kommersiell bruk i et fåtall tilfeller. ■

Samtlige kommersielle fremgangsmåter er idag basert på anvendelse av sakkarose som karbonkilde, vanligvis i form av melasse. I mindre skala har man også anvendt hydrolysat og stivelse som karbonkilde. Videre er det i US-PS 3 317 54 9 foreslått en fremgangsmåte til fremstilling av sitronsyre hvor en gjærstamme gjæres under aerobe betingelser, idet der som egnet karbonkilde er angitt stivelse, melasse, sakkarose, glykose, maltose, dekstrin, fruktose eller galaktose.

Laktose er en sukkerart som hovedsakelig forekommer i melk.

Dessuten er det bare et fåtall mikroorganismer som kan utnytte laktose som karbonkilde. Disse mikroorganismer forekommer vanligvis i melk, og de har evne til å danne 3-galaktosidase. Det ville således medføre store økonomiske fordeler om man ved fremstilling av sitronsyre kunne anvende laktose i myse eller mysepermeat som karbonkilde istedenfor andre sukkerarter eller hydrolysater av cellulose eller stivelse som karbonkilde.

Det har nå overraskende vist seg at man ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fremstille sitronsyre i en totrinnsprosess under dyrking av egnede mikroorganismer og under utnyttelse av laktose som karbonkilde. For at laktosen skal kunne utnyttes som karbonkilde, må den omdannes til pyrodruesyre, som så kan omdannes til sitronsyre. Problemet er å få pyrodruesyre til å anrikes i kulturoppløsningen på en slik måte at den ved innvirkning av mikroorganismer kan overføres til sitronsyre. I denne forbindelse må man således unngå omdannelse av pyrodruesyren til C02, og dette skjer hensiktsmessig gjennom en påvirkning av mikroorganismenes aerobe metabolisme. En slik påvirkning kan f.eks. bevirkes ved tilsetning av cyanider for å forgifte mikro-organismens ånding, ved en reduksjon av oksygentilførselen eller ved tilsetning av aneromycin.

Den foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte til fremstilling av sitronsyre,karakterisert vedat E. Coli KG 93, F i et første trinn i 15-24 timer ved en temperatur på 20-37°C

og en pH-verdi på 5,0-7,5 dyrkes på et substrat som utgjøres av mysepermeat som har fått tilsatt fosfater i en mengde på 0,8-1,6 g/l og nitrater i en mengde på 0,8-1,2 g/l eller en tilsvarende mengde urea, og at H. Wickerhamii CBS 4308 i et annet trinn i 20-26 timer ved en temperatur på 15-35°C og en pH-verdi på 4,5-6,5 dyrkes på dyrkningsvæsken fra det første trinn, hvoretter sitronsyre utvinnes fra dyrkningsoppløsningen på i og for seg kjent måte.

Et hensiktsmessig substrat som kan anvendes ved dyrkningen, er i første rekke et mysepermeat som har følgende gjennomsnittlige sammensetning:

Da der foreligger et underskudd av først og fremst nitrogen-holdige forbindelser, må substratet kompletteres med nitrat eller urea. Herunder kan der anvendes et eneste nitrat eller en blanding av to eller flere nitrater. Etegnet nitrat er f.eks. kaliumnitrat. Dessuten må fosfor tilsettes substratet, og dette finner hensiktsmessig sted i form av fosfat, f.eks. KH2P04, K2HP04 eller NaNH^HPO^. Også andre fosfater og fosforforbindelser kan anvendes. Substratet kompletteres slik at fosforinnholdet blir 0,8-1,6 g/l, passende 1,2 g/l, og nitratinnholdet blir 0,8-1,2 g/l, passende 1,0 g/l. Istedenfor nitrat kan en tilsvarende mengde urea tilsettes.

Den mikroorganismestamme (Escherichia Coli KG 93, F ) som anvendes i det første trinn, er valgt med henblikk på sin evne til å danne pyrodruesyre, mens den mikroorganismestamme (Hansenula Wickerhamii CBS 4308) som anvendes i det annet trinn, er valgt med henblikk på sin evne til å danne sitronsyre.

Hvert trinn i dyrkningen utføres hensiktsmessig kontinuerlig. Ved overføring av dyrkningsvæsken fra det første til det annet trinn er det vanligvis ikke nødvendig først å drepe E. Coli. Der foreligger nemlig som regel en forskjell i temperatur og pH-verdi mellom de to trinn, noe som medfører at overførte celler av E. Coli ikke kommer til å konkurrere med H. Wickerhamii. Om det ønskes, kan imidlertid E. Coli drepes etter første trinn.

Det er særlig bekvemt å utføre dyrkningen i det første trinn ved en temperatur på ca. 37°C og en pH-verdi på ca. 7. Dyrkningen i det første trinn utføres til å begynne med fortrinnsvis under luft-tilførsel, som avbrytes etter ca. 2/3 av dyrkningstiden. Det første trinn er vanligvis avsluttet etter ca. 18 timer.

Det annet trinn utføres med fordel ved en temperatur på ca. 30°C og en pH-verdi på ca. 5.

Substratets pH-verdi i de to trinn kan innstilles på forskjellige måter. For eksempel kan der anvendes gassformet ammoniakk.

Dyrkningen i det annet trinn skjer ofte under tilsetning av cyamid i en mengde på 0,1-0,5 g/l, f.eks. i form av ferrocyanid eller cyanoeddiksyre. Istedenfor cyanid kan man også anvende anero-myc in.

Som angitt ovenfor skjer utvinningen av sitronsyre fra det annet trinn på i og for seg kjent måte. Man kan f.eks. anvende en utfelling med kalsiumkarbonat eller kalsiumhydroksyd og fra-filtrering.

Oppfinnelsen vil bli nærmere forklart ved hjelp av de neden-stående utførelseseksempler.

Eksempel 1

Et mysepermeat med følgende sammensetning benyttes:

Den ovennevnte saltmengde var fordelt som følger:

Permeatet ble komplettert med fosfater og nitrater i en mengde på henholdsvis 1,2 og 1,0 g/l.

Det kompletterte mysepermeat ble pumpet inn i et kontinuerlig<.>'gjæringskar ("Chemap") som var forsynt med en turbinrører. Det hele ble podet med E. Coli KG 93, F~. Dyrkningen fant sted ved en temperatur på 37°C og en pH-verdi på ca. 7. pH-verdien ble holdt stabil ved hjelp av ammoniakk i gassform. Luft ble tilført ved hjelp av en kompressor. Etter ca. 12 timers dyrkning ble lufttilførselen helt avbrutt for oppnåelse av en anrikning av pyrodruesyre. Etter ytterligere ca. 6 timers dyrkning uten lufttilførsel ble gjærings-væsken kontinuerlig pumpet videre til et annet gjæringskar av samme type og her podet med H. Wickerhamii CBS 4308. Dette annet dyrkningstrinn ble utført ved en temperatur på 30°C og en pH-verdi på ca. 5. Dyrkningen i det annet trinn pågikk i ca. 24 timer. Også i det

annet trinn ble pH-verdien holdt stabil ved hjelp av ammoniakk i gassform. Ved dyrkningen i det annet trinn ble der tilsatt ferrocyanid i en mengde på 0,3 g/l. Utbyttet av pyrodruesyre i trinn 1 var 32 g/l. Utbyttet av sitronsyre etter gjennomføringen av hele fremgangsmåten var 43 g/l.

Eksempel 2

Fremgangsmåten i eksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at det første dyrkningstrinn (med E. Coli KG 93, F~) ble utført ved en temperatur på 32°C og en pH-verdi på 6,5. Dyrkningen ble utført med lufttilførsel i 16 timer og uten lufttilførsel i 8 timer. Det annet dyrkningstrinn (med H.Wickerhamii CBS 4308) ble utført i ca. 23 timer med en temperatur på ca. 25°C og en pH-verdi på 5,5. Utbyttet av sitronsyre ble 32 g/l.

Eksempel 3

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt, men det første dyrkningstrinn ble utført ved en temperatur på 37°C og en pH-verdi på 7,5. Dyrkningen ble utført med lufttilførsel i 14 timer og uten lufttilførsel i 7 timer. Videre ble det annet dyrkningstrinn utført i 2 2 timer ved en temperatur på 30°C og en pH-verdi på 5,5. Noen tilsetning av ferrocyanid ble ikke utført. Utbyttet av sitronsyre ble 42 g/l.

Eksempel 4

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt, men det første dyrkningstrinn ble utført ved en temperatur på 37°C og en pH-verdi på 6,5. Dyrkningen ble utført med lufttilførsel i 16 timer og uten lufttilførsel i 8 timer. Videre ble det annet dyrkningstrinn gjennom-ført på ca. 24 timer ved en temperatur på 25°C og en pH-verdi på 5,0. Utbyttet av sitronsyre ble 50 g/l.

Eksempel 5

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble gjentatt, men det første dyrkningstrinn ble utført ved en temperatur på 3 2°C og en pH-verdi på 6,5. Dyrkningen ble utført med lufttilførsel i 16 timer og uten lufttilførsel i 8 timer. Videre ble det annet dyrkningstrinn utført-:, på ca. 24 timer ved en- temperatur på-25°C og én pH-verdi på 6,0 .i . ~ Utbyttet av sitronsyre ble 1,6 g/l.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til de viste utførelsesformer som kan modifiseres på forskjellige måter innenfor rammen av oppfinnelsen.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av sitronsyre, karakterisert ved at E. Coli KG 93, F~ i et første trinn i 15-24 timer ved en temperatur på 20 -37 °C og en pH-verdi på 5,0-7,5 dyrkes på et substrat som utgjøres av mysepermeat som har fått tilsatt fosfater i en mengde på 0,8-1,6 g/l og nitrater i en mengde på 0,8-1,2 g/l eller en tilsvarende mengde urea, og at H. Wickerhamii CBS 4308 i et annet trinn i 20-26 timer ved en temperatur på 15-35°C og en pH-verdi på 4,5-6,5 dyrkes på dyrkningsvæsken fra det første trinn, hvoretter sitronsyre utvinnes fra dyrkningsoppløsningen på i og for seg kjent måte.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at dyrkningen i det første trinn til å begynne med utføres under lufttilførsel som avbrytes etter ca. 2/3 av dyrkningstiden.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at dyrkningen i det første trinn utføres ved en temperatur på ca. 37°C og en pH-verdi på ca. 7.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at dyrkningen i det første trinn utføres i ca. 18 timer.

5. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at dyrkningen- i det annet trinn utføres ved en temperatur på ca. 30°C og en pH-verdi på ca. 5.

6. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at pH-verdien innstilles ved hjelp av ammoniakk i gassform.

7. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-6, karakterisert ved at dyrkningen i det annet trinn utføres med en tilsetning av cyanid på 0,1-0,5 g/l.

8. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-6, karakterisert ved at dyrkningen i det annet trinn utføres med tilsetning av aneromycin.