NO770463L - Fremgangsm}te for fremstilling av en ph-indikator - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en redusert anilinblått pH indikator for anvendelse ved påvisning av nærvær av mikroorganismer i kulturmedier.

I henhold til teknikkens stilling er det utviklet meka-nismer og apparater som er egnet til å analysere prøver med hen-syn på spesifikke mikroorganismer ved anvendelse av et trau eller en form av plast som inneholder en serie av tørkede kulturmedier som inneholdes i separate men forbundne celler, idet hvert av mediene er spesifikt for en enkelt organisme. Når prøven blir nedsenket i formen, blandet med mediene i fordypningene og inku-bert i maskinen, blir det en gjensidig innvirkning mellom organismen (eller organismene) som er tilstede i prøven og det kulturme-dium som er spesifikt for den organisme, og dette frembringer en forandring i mediet som blir avlest med maskinen for å vise nærværet av den organisme.Forandringen i mediet innebærer en forandring i lysgjennomgangsegenskapene til mediet, dvs. en farveforandring eller forandring av uklarhet. Forandringen kan forårsakes av metabolsk aktivitet til organismene, hvilken for eksempel kan forårsake dannelse av syre og en forandring av pH, og dette forårsaker- en farveforandring i en pH følsom indikator i mediet. Forandringen av lysgjennomgangsegenskapene til mediet kan også forårsakes av en utfelning som dannes i mediet på grunn av metabolsk aktivitet til organismen, eller den kan forårsakes av vekst av organismen.

De spesifikke medier som er beregnet for anvendelse i

de forannevnte former, er alle beregnet til å begunstige vekst av én mikroorganisme og inhibere vekst av andre organismer, og de er i stand til å frysetørkes og kan virke ved det lave C^-miljø i fordypningene i formen.

I medier for påvisning av E. coli, gjær og sopp, og for opptelling, påvises nærværet av hver av disse mikroorganismer ved metabolsk aktivitet.til organismen, hvilket forårsaker dannelse av syre og forandring av pH. Det er følgelig en gjenstand ved denne oppfinnelse at pH indikatoren som er innlemmet i mediet, forandrer farve ved den minste forandring i retning av sur pH slik at lysgjennomgangsegenskapene til mediet vil forandres raskt, og således gis det anledning til en hurtig påvisning av den mikroorganisme som søkes identifisert ved den ovenfor omtal-te mekanisme for å analysere prøver.

Vi har nå oppdaget en fremgangsmåte for å redusere far-vestoff et anilinblått slik at det vil forandre farve ved forandring av pH i retning mot sur.pH, og således forandre lysgjennom-sgangsegenskapene til hvilket som helst medium som det er innlemmet i. Den forandring i pH som vi har referert til , blir forårsa-ket ved dannelse av syre. Farven på det reduserte, anilinblått er lysebrun eller farveløs ved en pH på 7,0. Ved dannelse av syre med ukjente mikroorganismer vil det reduserte anilinblått forandres til blått. Denne forandring vil foregå i løpet av 12 til 18 timer, slik at det blir anledning til en hurtig påvisning av mikroorganismer i kliniske prøver ved en analysemekanisme som påviser blått.

Reduksjonsmidlet ved foreliggende oppfinnelse er natriumtioglykollat. Dette reduksjonsmiddel er nyttig ved denne oppfinnelse på grunn av at det ikke vil inhibere vekst av mikroorganismer, slik som andre egnede kjemiske reduksjonsmidler gjør.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for

å redusere anilinblått slik at det reduserte anilinblått kan virke som en meget følsom pH indikator i kulturmedier som er beregnet for anvendelse i formene og fordypningene ved en analyserende mekanisme.

Reduksjonsmidlet i henhold til denne oppfinnelse er natriumtioglykollat. Dette reduksjonsmiddel er viktig siden det ikke inhiberer vekst av de mikroorganismer som søkes påvist med mekanis-men ved de tidligere siterte anvendelser.

Den reduserte anilinblått-indikator påviser ganske hurtig dannelse av syre. Indikatoren er også resistent mot feil forårsa-ket av nærvær av protein i kulturmedier.

Anilinblått-indikatoren i henhold til denne oppfinnelse

blir fremstilt ved å redusere anilinblått med natriumtioglykollat.

Det anvendte anilinblått er vannløselig, fortrinnsvis fra Nutritional Biochemical Cd. < For å fremstille en stammeløs-ning av anilinblått, bør det anvendes ca. 4,0 til ca. 6,0 g anilinblått pr. 500 ml med stammeløsning, fortrinnsvis 5,0 g pr.

500 ml.

Vanligvis er ikke anilinblått noen spesiell verdifull

pH indikator, på grunn av at det reagerer ganske sakte på pH forandring ved omsetninger. Det er dessuten sterkt utsatt for å gi feil i nærvær av protein.

Ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse har anilinblått blitt forandret ved reduksjon og fjerning av minst en, og muligens to amingrupper. Denne reduksjon har øket sterkt den hastighet hvormed anilinblått kan påvise forandringer i pH. Anilinblått gir dessuten pålitelige resultater i nærvær av protein.

Fremgangsmåten for å redusere anilinblått blir utført ved å koke anilinblått i nærvær av natriumtioglykollat, fortrinnsvis fra NutritionalBiochemical company.

Anilinblått kan reduseres med andre reduksjonsmidler.

Det reduserte anilinblått dannet ved en reduksjonsprosess hvorved det anvendes andre reduksjonsmidler enn natriumtioglykollat, er imidlertid tilbøyelig til å inhibere veksten av mikroorganismer som søkes påvist.

Det er ønskelig at 100% av det anilinblått som skal anvendes, blir redusert. Dersom mindre enn 100 % blir redusert, vil indikatoren bli ustabil, dvs. den vil lett oksyderes ved henstand.

Ved en pH på 7,0 har det reduserte anilinblått i henhold til foreliggende oppfinnelse en farve som er lysebrun til klar. Under sure forhold forandres redusert anilinblått fra lysebrunt eller klart til.blått. Denne forandring blir iakttatt og regist-rert ved analyseringsmekanismen.

Fremgangsmåte, for å redusere anilinblått slik at det blir egnet for anvendelse som en indikator for E. coli, i en opptellings-buljong, og for Candida gjær og andre sopper, bødvendiggjør i bunn og grunn de følgende trinn: (1) Å oppløse 5 g vannløselig anilinblått i en blanding omfattende 100 ml 1 N natriumhydroksyd og 400 ml destillert vann ved hjelp av røring sammen med svak oppvarming. (2) Å tilsette 7,5 g natriumtioglykollat til blandin gen fra trinn 1, og koke den resulterende blanding i ca. 45 minutter mens det opprettholdes et v lum på 500 ml. (3) Å gjenta trinn 2 med mindre mengder natriumtioglykollat og kortere koketider inntil .100 % av anilinblått er redusert.

(4) Å avkjøle den reduserte anilinblått-blanding.

(5) Å justere den fremstilte løsning til 500 deler ved tilsetning av destillert vann.

Det er ikke skadelig for fremgangsmåten å anvende over-skudd av natriumtioglykollat. Hovedkravet er at 100 % med anilinblått blir redusert.

Den foregående behandling forårsaker utvikling av ammoni-akk fra anilinblått-molekylene, og resulterer i en blanding av far-vestoffer som er sterkt pH følsomme. Den reduserte anilinblått-indikator begynner å forandre farve i nærvær av syre. Ved pH

7,0 er redusert anilinblått lysebrunt eller farveløst. Ved sure forhold er redusert anilinblått blått.Anilinblått forandrer full-stendig farve ved pH på 6,4 til 6,6.

I et 1000 ml's måle-begerglass anbringes 5,0 g anilinblått, 100 ml 1 N natriumhydroksyd og 400 ml destillert vann. Blandingen blir rørt for å oppløse anilinblått.Løsningen blir så svakt oppvarmet. 7,5 g natriumtioglykollat blir satt til løsningen. Deretter blir løsningen oppvarmet til koking og den blir holdt ved dette tem-peraturnivå i 45 minutter. 2,5 g natriumtioglykollat blir satt til løsningen, og løsningen blir kokt i 10 minutter. så blir det satt 2,0 g natriumtioglykollat til løsningen, og løsningen blir kokt i 3 minutter. Løsningen blir hensatt til avkjøling. Destillert vann blir tilsatt inntil volumet når 500 ml. Det siste trinn bør utfø-res i en målesylinder.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for å redusere anilinblått, .karakterisert vedat den omfatter trinnene: å oppløse anilinblått i en alkalisk løsning og å koke løsningen: i nærvær av natriumtioglykollat inntil anilinblått er redusert.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1,karakterisert vedat det anvendes ca. 8 til ca. 12 g/l med anilinblått.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller 2,karakterisert vedat NaOH blir anvendt for den alkaliske løsning.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, 2 eller 3,karakterisert vedat det anvendes ca. 10 til ca.

18 g/l med natriumtioglykollat.

5. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat koketrinnet b lir gjentatt ved anvendelse av progressivt mindre mengder av natriumtioglykollat og progressivt kortere tidsperioder inntil alt anilinblått er redusert, og deretter avkjøles den reduserte anilinblåttløsning.