NO753578L - - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte for fremstilling av toksiner".

Foreliggende oppfinnelse vedrører rensing av E. coli enterotoksin

i forbindelse med anvendelse av renset varme-labilt E. coli enterotoksin i vaksiner for aktiv immunisering og for fremstilling av sera for passiv beskyttelse mot E. coli infeksjoner, og for immunoprofylakse mot kolera.

E. coli enterotoksiner har lenge vært erkjent som betydningsfulle faktorer i E. coli infeksjoner, spesielt med hensyn til de store tap av vann og elektrolytter som opptrer ved diaretiske sykdommer bevirket av coli-bakterier. Muligheten for syntese av disse enterotoksiner er ikke stamme-spesifikke, men styres av et overførbart plasmid som kan overføres ved konjugasjon fra en patogen E. coli-stamme til ikke-patogene stammer. Tilsynekomsten av nye enteropatogene serotyper kan således forklares.

Coli-infeksjoner har hittil vært behandlet med coli-vaksiner

eller kjemoterapeutisk, spesielt med antibiotika. Bruken av coli-vaksiner er imidlertid generelt rettet mot spesielle serotyper av E. coli og ikke mot deres eksotoksiner, spesielt enterotoksiner.

Denne metode gir således en anti-bakteriell beskyttelse, men

ikke en anti-toksisk beskyttelse. Den plasmid-styrte mekanisme for syntesen forklarer også den hyppige tilsynekomst av anti-biotisk resistens blant enteropatogene E. coli-stammer, da R-faktorer overføres ved hjelp av den samme mekanisme som enterotoksin-plasmider.

Den plasmidstyrte syntese av to former av E. coli enterotoksin, nemlig varmelabilt (LT) enterotoksin og varmestabilt (ST) enterotoksin er beskrevet i litteraturen (f.eks. Smith, H.W. og Gyles, C.L., J. Med. Microbiol. 3, 387 (1970)). Disse former er forskjellige primært med hensyn til deres syrelabilitet, varmelabilitet og anti-genisitet, som f.eks. antydet i den følgende tabell, som også viser et antall kjente felles egenskaper :

Forsøk på ytterligere undersøkelse av eoli enterotoksiner og deres rolle i coli-infeksjoner har imidlertid hittil vært hindret ved manglende mulighet til oppnåelse av enterotoksinene med en tilstrekkelig høy renhetsgrad. En forutsetning for oppnåelse av den nødvendige renhet er et reproduserbart og nøyaktig utprøvingssystem for lokalisering og kvantifisering av enterotoksinaktivitet, f.eks. etter kromatografisk separasjon, men de hittil anvendte metoder, f.eks. de fordøyelseskanal-modeller som er nevnt ovenfor, har ikke vist seg tilstrekkelige i disse henseender, idet enterotoksiner som er identifisert ved disse metoder f.eks. er funnet å ha en bred fordeling av molekylvekter. Disse kjente forsøkssystemer er også tidkrevende og kan bare anvendes for undersøkelser i liten målestokk.

En mer nøyaktig og enklere utprøving av enterotoksin-aktiviteten anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse og er basert-på det forhold at stimuleringen av adenylat-cyklaseaktiviteten, som tilkjennegis ved en akkumulering av cyklisk 3',5'-adenosinmonofosfat (cAMP) i katte-myokardiale adenylat-cyklasepreparater er et nøyaktig mål på enterotoksin-aktivitet og konsentrasjon.

Denne metode for påvisning og/eller bestemmelse av E. coli enterotoksinaktivitet omfatter inkubasjon av et preparat av katte-myokardial adenylat-cyklase i et forut bestemt tidsrom i nærvær av et material som skal prøves på E. coli-enterotoksin-aktivitet, og måling av økningen i adenylat-cyklase aktivitet i det resulterende produkt i forhold til en kontrollprøve.

Mer spesielt kan inkubasjonen gjennomføres i nærvær av et substrat hvis omdannelse til syklisk 3'5<1->adenosin monofosfat katalyseres av adenylat cyklase, idet økningen i adenylatcyklaseaktivitet bestemmes ved å måle økningen i konsentrasjonen av cyklisk 3<1>,5'-adenosin monofosfat i det resulterende produkt i forhold til en kontrollprøve.

Katte-myokardial adenylat-cyklasepreparatet kan oppnås fra katte-myJcardialvev på kjent måte, som f.eks. som beskrevet av Levey et al. (G.S. Levey og E. Epstein, Biochem. Biophys. Res. Commun. 33, 990 - 995 (1968) og 38, 86 - 92 (1970)).

Preparatet kan være i partikkelform eller i oppløseliggjort form oppnådd ved behandling med et ikke-ionisk tensid, spesielt "Lubrol-PX" (ICI America Inc.) som beskrevet av Levey (supra)

og opptatt i f.eks. en sukrose-buffer. I tilfellet med oppløseliggjorte preparater er det imidlertid nødvendig å gjenopprette adenylat-cyklaseaktiviteten som øyensynlig ødelegges av tensidet. Dette kan greit oppnås ved tilsetning av fosfo-lipider, f.eks. fosfatidylserin.

Den adenylat-cyklase katalyserte omdannelse av substrater til cyklisk 3<1>,5<1->adenosin monofosfat er vel kjent. Egnede substrater omfatter adenosintrifosfat (ATP) eller foretrukket 5'-adenyl-imidodifosfat (AMP-PNP).. Inkubasjonen kan gjennomføres på konvensjonell måte, f.eks. som beskrevet i de ovennevnte Levey-henvisninger. Reaksjonsmediet omfatter fordelaktig magnesiumioner, f.eks. i form av magnesiumklorid, såvel som andre materialer som er kjent og fremme omdannelsen av ATP til CAMP og i den etterfølgende bestemmelse av cAMP, f.eks. bovin-serumalbumin og teofyllin-plus buffer, f.eks. Tris-HClbuffer, så vel som substratet, f.eks. AMP-PNP, enzym og forsøksmaterial eller kontrollprøve. Inkubasjonen initieres fordelaktig ved tilsetning av enzymet, i partikkelform eller oppløseliggjort form som beskrevet ovenfor, til det resterende reaksjonsmedium, og kan passende gjennomføres ved 37°C og i et tidsrom på 3 til 45 minutter, foretrukket 5 til 30 minutter. Omdannelsen kan så stanses på kjent måte, f.eks. ved tilsetning

av trikloreddiksyre og ved å opprettholde blandingen ved 4°C, f.eks. i 10 minutter eller mer. I det resulterende produkt

kan cAMP isoleres på konvensjonell måte. F.eks. kan bunnfallet fjernes ved sentrifugering og det overliggende væskelag ekstraheres flere ganger med dietyleter/vann og de vandige lag inndampes til tørrhet. Resten kan passende opptas i en buffer, f.eks. acetatbuffer pH 4 og prøveporsjoner kan så anvendes for etterfølgende cAMP-bestemme1se.

Før opparbeidelsen av cAMP tilsettes en kjent mengde tritiert

cAMP passende til blandingen (eller i det minste en prøve av denne) for å bestemme korreksjonen for ekstraksjons-gjenvinning ved bestemmelse av mengden av tritiert cAMP i det isolerte produkt.

Bestemmelsen av cAMP kan gjennomføres i samsvar med hvilke

som helst av de mange kjente metoder for dette, idet den foretrukne metode er radioisotop-fortynnings-testsystemet som beskrevet av Gllman A.G., Proe. Nat. Acad. Sei. 67, 305-312 (1970) og som modifisert som beskrevet ovenfor, idet dette system kan fås5,i handelen i form av et prøvetagningssett (Boehringer, Mannheim, Tyskland).

Denne testmetode muliggjør at fraksjoner av material hvorfra enterotoksin skal isoleres kan separeres og enkelt prøves på enterotoksin-aktivitet. Om nødvendig, for å oppnå større renhet, kan ytterligere separeringer deretter gjennomføres med de aktive fraksjoner, egnet etter sammenslåing av disse, og de aktive fraksjoner på nytt identifiseres. Trinnene med separering og identifisering kan således gjennomføres inntil et homogent eller et tilstrekkelig rent produkt oppnås.

Bruken av den enterotoksin-bestemmelse som er beskrevet har mer spesielt ført til utvikling av fremgangsmåter i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av E. coli enterotoksin med en høy grad av renhet. Spesielt er det funnet at E. coli enterotoksin kan isoleres og renses i høy grad ved isotachoforese eller affinitets-kromatografering.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for isolering og rensing av E. coli enterotoksin fra et urent eller forhåndsrenset cellefritt dyrkingsfiltrat fra en dyrkning i gjæringskar av en enteropatogen E. coli-

stamme hvor dyrkningsfiltratet underkastes isotachoforetisk eller affinitets-kromatografisk separering.

De resulterende separerte fraksjoner, eller i det minste dem

som inneholder protein, kan så festes på en protoksin-aktivitet, spesielt ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte, og underkastes slike ytterligere separeringstrinn som kan være nødvendige for å oppnå den nødvendige renhetsgrad. Det vil være klart at de aktive fraksjoner kan være bestemt på forhånd, f.eks. i foregående separeringer gjennomført under identiske betingelser, slik at testingstrinnet da ikke vil være nødvendig.

Det enterotoksinholdige cellefrie dyrkningsfiltrat kan oppnås

på kjent måte. F.eks. kan den enteropatogene E. colistamme hvis enterotoksin skal isoleres, dyrkes f.eks. i tre generasjoner ved 37°C i passende medium, f.eks. tryptikase-soyabuljong

(BBL, Lockeysville, Maryland, USA) eller fortrukket en

modifisert tryptikase-soyabuljong oppnådd ved ultrafiltrering av tryptikase-soyabuljongen, f.eks. en 30% (vekt/volum) oppløsning derav. Det første trinn ved dyrkingen gjennomføres passende i et relativt kort tidsrom, f.eks. 4 til 6 timer, det annet trinn f.eks. inntil'dyrkingen når midten av den logaritmiske fase, og slutt-trinnet i f.eks. 8 til 10 timer.

Cellene kan så høstes på konvensjonell måte, f.eks. ved sentrifugering, og det overliggende væskelag kan filtreres og undersøkes på sterilitet. Det rå sterile buljongfiltrat konsentreres deretter passende ved ultrafiltrering, f.eks.

gjennom "Diaflo PM-30"-membraner, av-saltes ved behandling med en ionevekslerharpiks i blandet lag, f.eks. "AG 501-X8",

frysetørres (lyofiliseres) og lagres for senere bruk, f.eks.

ved -20 til -70°C. Under denne første konsentreringsprosess beskyttes bakterieproduktene passende mot proteolyttisk nedbrytning ved tilsetning av en protease-inhibitor, f.eks. pentamidin-isotionat.

Det til å begynne med konsentrerte ly<filiserte sterile cellefiltrat kan passende for-renses ved hjelp av ett eller flere gelfiltreringstrinn før hoved-separeringstrinnet, spesielt når dette skal foregå ved hjelp av isotachoforese.

Gelfiltrerings-trinnet eller -trinnene kan gjennomføres

på konvensjonell måte, idet de passende geler og elueringsmidler bestemmes f.eks. i foregående forsøk med sikte på å etablere de tilnærmede molekylvekter hvormed enterotoksinaktiviteten er forbundet. I denne forbindelse er det funnet å være fordelaktig å gjennomføre en første gelfiltrerings-separering ved anvendelse av "Biogel A-5m" som bærer (separasjonsområde 5.000.000 - 80.000) og en ammonium-bikarbonatbuffer, pH 7.9 - 8.0, som elueringsmiddel. Etter bestemmelse av de enterotoksin-aktive fraksjoner, f.eks. ved den beskrevne testmetode,

kan de ønskede fraksjoner deretter slås sammen og en etterfølgende gelfiltrerings-separasjon gjennomføres, passende på en "Sephadex G-75"-kolonne (separasjonsområde 70.000 til 3.000) under anvendelse av den samme buffer eller en Tris-HCl buffer (pH 8.0). De aktive fraksjoner kan så på nytt bestemmes og slås sammen.

De sammenslåtte fraksjoner konsentreres deretter ønskelig videre ved dialyse, f.eks. mot 0.1 M Tris £ -amino-kaproatbuffer (pH 8.9) for å lette den foretrukne etterfølgende separering ved isotachoforese..

Den isotachoforetiske separering kan gjennomføres ved metoden til Svendson og Rose, Science Tools 17, 13 (1970) under anvendelse av polyakrylamidgel som bærende medium og "Ampholdne"-bæreramfolytter som buffer og avstans-substanser. Separeringen gjennomføres foretrukket i enkle buffrede gelkolonner, idet "Ampholine"-bæreramfolyttene blandes med prøven og oppførs- elektrolytten, som passende er Tris~£. -amino kaproat-buffer (pH 8.9). Opphørselektrolytten anordnes i et lag på toppen av gel- og Tris-sulfatbuffer (pH 7.1) anvendes fordelaktig som elueringselektrolytt. Separeringsprøven, spesielt det konsentrerte "Sephadex G-75"-gelfiltreringsprodukt blædes passende med sukrose for å øke dets viskositet, fortynnes med •\avslutning3-elektr0lytten og blandes med bæreramfolyttene, og innføres gjennom et kapilar-rør gjennom det øvre lag av avslutningselektrolytten for å danne et lag på toppen av gelen. Gelen fremstilles fordelaktig fra standardløsninger i henhold til Davis, Ann. N.Y. Acad. Sei. 121, 404 (1964.) under foretrukket

o anvendelse av tris-fosfat pH 8.1 som gelbuffer, polymerisert bare ved hjelp av fotopolymerisering.

De eluerte fraksjoner kan så testes på enterotoksin-aktivitet, f.eks. ved hjelp av den beskrevne metode, og de ønskede fraksjoner kan passende slås sammen og på nytt konsentreres ved dialyse mot tris- ^ -aminokaproat-buffer pH 8.9.

Om ønsket kan en ytterligere isotachoforetisk separering gjennomføres for oppnåelse av ennå størrelenhet, denne gang under anvendelse av et annet molforhold mellom lede-ion og mot-ion, eller foretrukket en annen elueringselektrolytt, f.eks. tris-2-(N-morfolino)etansulfonsyre pH 6.2.

Aktive fraksjoner kan på nytt slås sammen og konsentreres, passende ved dialyse som beskrevet ovenfor. Sluttproduktet underkastes deretter passende gelfiltrering på "Sephadex G-50" for å separere de lavmolekylære "Ampholine"-bæreramfolytter fra det isotachoforetisk fraksjonerte protein.

En alternativ metode for isolering av enterotoksinet fra til

å begynne med konsentrert sterilt cellefiltrat eller fra cellefiltrat for-renset ved gelfiltrering er ved hjelp av affinitets-kromatografering. Affinitetskromatografering er en kjent teknikk for separering av f.eks. proteiner, som utnytter den biologiske egenskap av disse -materialer til å binde gigander spesifikt og reversibelt. En oppløsning inneholdende det material som skal renses føres gjennom en kolonne som inneholder

en uoppløselig polymer eller gel hvortil en spesifikk inhibitor eller en annen ligand er blitt kovalent knyttet. Proteiner som ikke har noen særlig affinitet for liganden vil passere uhindret gjennom kolonnen mens derimot den som har affinitet til inhibitoren vil sinkes i forhold til deres affinitet. Det spesifikt absorberte protein kan deretter elueres ved å endre sammensetningen av.løsningsmidlet slik at dissosiering opptrer.

Separeringen i henhold til oppfinnelsen kan gjennomføres på

en måte som er konvensjonell for affinitets-kromatografisk separering, f.eks. som beskrevet av Cuatrecasas et al., Methods of Enzymology XXII, 345 (1971). For den foreliggende oppfinnelses formål omfatter egnede bindingsligander amfipatiske substanser, som f.eks. fosforlipider eller glykolipider med fri karboksylgrupper, spesielt gangliosider. Disse ligander kan være bundet til en uoppløselig grunnmasse, som passende er et agarose-derivat, som f.eks. et derivat fremstilt ved å tilknytte en aminokopolymer , f.eks. poly-L-lysyl-DL-alanin til cyanobromidaktivert agarose på kjent måte (f.eks. Cuatrecasas, P., J.

Biol. Chem. 245, 3059 (1970) og Sica V. et al., Nature (London), New Biology 244, 36 (1973)), eller albumin-agarose. Liganden kan knyttes til grunnmassen på konvensjonell måte. F.eks. i tilfellet med gangliosider kobles karboksylgruppen i den terminale sialinsyre til aminogruppene i de ovennevnte agarosederivater, i nærvær av et vannoppløselig karbodiimid-reaksjonsmiddel, f.eks. l-etyl-3-dimetyl-3(3-dimetylamino-propyl)karbodiimid eller dicykloheksylkarbodiimid. For koblingen anvendes gangliosidene passende i form av deres N-hydroksysuccinimid-estere eller deres aktiverte blandede anhydrider. Reaksjonen gjennomføres passende i et løsningsmiddel eller en løsningsmiddelblanding, f.eks. en cyklisk eter , f.eks.

dioksan eller en blanding av vann/dioksan.

Andre egnede ligand-grunnmassesystemer for bruk som affinitets-harpikser ved separeringen omfatter fettsyre-aminoalkylamino-anarosekomplekser. Disse kan fremstilles på konvensjonell måte, f.eks. som beskrevet i den første Cuatrecasas-henvisning nevnt ovenfor. Egnede alkylendiaminer for å danne aminoalkylamino- aggarosederivatene omfatter heksandiamin, dekandiamin og etylendiamin. Egnede fettsyrer omfatter palmitinsyre.

De ovenfor beskrevne affinitets-harpikser anbringes så på passende måte i en affinitetskolonne og det til å begynne med konsentrerte lyofiliserte sterile cellefiltrat opptas foretrukket i en buffer, f.eks. Krebs-Ringer bikarbonat-buffer pH 7.4, overføres, til kolonnen og fremkalles, passende under avkjøling ved 4°C. Elueringen av enterotoksinene kan f.eks. gjennomføres med natriumdodesylsulfat. Den etterfølgende fjernelse av natriumdodecylsulfatet og den nødvendige renaturering av det eluerte coli enterotoksin kan gjennomføres på kjent måte

(f.eks. K. Weber et al, J. Biol. Chem. 246, 4504 (1971)).

For fremstilling av enterotoksiner i henhold til oppfinnelsen

kan hvilke som helst enteropatogene E. coli-stammer, eller ikke-patogene stammer som er gjort patogene ved plasmid-overføring anvendes. Foretrukne stammer omfatter porsin-patogene E. colistammer P 263, serotype 08:K87, K88ab:Hl9,

P 155, serotype 0149:K91:88a,c, og P 307, serotype 08:K87,K88ab, human-patogene stammer H10407, serotype 078K og H19,

serotype 026:K60:H11, såvel som en Ent<+>og Ent" E. coli K12-stamme hvortil Ent plasmid fra humanstammen H 19 er blitt overført.

Ved isoleringsprosessen i henhold til oppfinnelsen er det

mulig å oppnå E. coli enterotoksin med en renhet på minst 99%. Fremgangsmåten muliggjør også at de spesielle former av enterotoksin, dvs. varmelabil (LT) form og varmestabil (ST)

form kan isoleres da disse former begge viser enterotoksigen aktivitet i den beskrevne prøve, selv om de er forskjellige med hensyn til fysikalske egenskaper, f.eks. molekylvekten, og således kommer tilsyne i forskjellige fraksjoner eller separeringstrinnet, f.eks. separeringene med gelfiltrering eller affinitets-kromatografering.

Oppfinnelsen tilveiebringer et varmelabilt (LT) E. coli enterotoksin med en molekylvekt på 102.000 + 3.000 som er blitt isolert ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen,

spesielt fra kulturer av E. coli-stammen P 263, og som tidligere

ikke er publisert.

E. coli-stammer er kjent å fremme diarre-sykdommer i mennesker

og dyr, spesielt i unge dyr som f.eks. føll, 3am og kalver. Coli-infeksjoner anses særlig å være ansvarlige for barne-enteritis, de fleste former av reisemagesyke og akutt tropisk diarre. I husdyr, spesielt i unge dyr som nevnt er coli-inf eks joner blant de mest betydningsfulle sykdommer. I griser opptrer coli-infeksjoner hovedsakelig i forbindelse med forstyrrelser i veggene i mage-tarmkanalen, spesielt i nyfødte smågriser og i av-yendte smågriser. Det opptrer da en massiv formering av visse serotyper av hemolyserende colibakterier.

De rensede varmelabile (LT) E. coli enterotoksiner som oppnås

ved oppfinnelsen, spesielt med en molekylvekt på 102.000

+ 3.000 er nyttige for beskyttelse mot E. coli-infeksjoner som påvist ved deres aktivitet i kanin- og svine-fordøyelseskanal-testen (W. Burrows, G.H. Musteikis, J. Infect. Dis. 116, 183

(1966) og H.W. Smith, CL. Gyles, J. Med. Microbiol 3, 403, (1970)), ved kaninhudtesten,(J.O. Craig, Proe. Cholera Res. Symp.

Honolulu 24, U.S. Government Printing Office (1965)) og i fettcelle-lipasetesten (P. Cuatrecasas, Biochem. 12, 3567/

(1973)) og ved den adenylat-cyklasestimulerende test som her

er beskrevet.

De rensede varmelabile (LT) enterotoksiner som fremstilles ved

den foreliggende oppfinnelse er også nyttige for beskyttelse mot colera som vist ved det forhold at det foreligger et nært serologisk forhold eller kryss-immunitet mellom E. coli

(LT) enterotoksin og koleraenterotoksin, som tidligere er blitt fremstilt i ren form og grundigkarakterisertmed hensyn til sine fysikalsk-kjemiske egenskaper.

Oppfinnelsen muliggjør således anvendelse av de rensede varmelabile (LT) E. coli enterotoksiner i vaksiner for aktiv beskyttelse og ved fremstilling av sera-' for passiv beskyttelse mot E. coli-infeksjoner og ved immunoprofylakse mot kolera,

i denne forbindelse er det funnet at enterotoksiner fra forskjellige E. coli-stammer er immunologisk identiske eller

så nær beslektet at det foreligger en kryss-immunitet, som er en forutsetning for noen immunologiske anvendelser, f.eks. for passiv oppnåelse av anti-sera, oppnådd i en annen dyreart.

For noen formål, spesielt for oral tilførsel og for fremstilling av et serum, er det nødvendig at det varmelabile (LT) E. coli enterotoksin foreligger i form av et stabilt toksoid, dvs. et preparat som bibeholder anti-genisiteten av enterotoksinet, men hvis giftighet nedsettes eller elimineres. Slike toksoider kan fremstilles på konvensjonell måte (f.eks. R.S. Rappaport et al, Inf. Imm. 9, 304 (1974)). F.eks. kan konvensjonelle kryssbindende midler, som f.eks. formaldehyd eller foretrukket glutaraldehyd tilsettes, idet det påsees at de immunologiske egenskaper bibeholdes under behandlingen. F.eks. kan det rensede varmelabile (LT) enterotoksin fremstilt ved oppfinnelsen inkuberes med formaldehyd ved en forhøyet temperatur, f.eks. 35 til 40°C over en langstrakt tidsperiode, f.eks. 2 til 6 uker, eller med glutaraldehyd ved romtemperatur til 40°C, under anvendelse av en glutaraldehydkonsentrasjon på 0.001 til 0.05 M.

Oppfinnelsen muliggjør videre fremstilling, av en vaksine omfattende en immunologisk effektiv mengde av et renset varmelabilt (LT)

E. coli enterotoksin eller et stabilt toksoid derav, for anvendelse for immunisering mot E. coli-infeksjoner eller kolera, hvor en immunologisk effektiv mengde av et renset varmelabilt (LT)

E. coli enterotoksin eller et stabilt toksoid derav tilføres.

Oppfinnelsen muliggjør også fremstilling av et serum omfattende anti-legemer indusert ved tilførsel av et renset varmelabilt (LT) E. coli-enterotoksin eller et stabilt toksoid derav, for anvendelse ved immunisering mot E. coli-infeksjoner eller kolera ved tilførsel av en immunologisk effektiv mengde av et slikt serum.

For anvendelse i vaksiner vil doseringen av det rensede varmelabile (LT) E. coli enterotoksin eller stabile toksoid derav selvfølgelig variere avhengig av tilførselsmåten, vert-individet og den ønskede behandling. Generelt oppnås imidlertid tilfredsstillende resultater med en dose på fra omtrent 0.015yug til lO^ug pr. kg av dyrets kroppsvekt. For større pattedyr er den totale daglige dose i området fra omtrent l^ug til 1 mg og doseringsformer egnet for oral tilførsel omfatter fra omtrent lOO^ug til 1 mg av det stabile toksoid. Toksinet eller toksoidet blir foretrukket frysetørret.

De mengder serum som tilføres for passiv immunisering vil selvfølgelig være ekvivalente med den effektive dose av toksin elle toksoid som antydet ovenfor og vil selvfølgelig avhengig av antilegeme-innholdet i serumet. Disse kan bestemmes ved måling av mengden av serum nødvendig for å nøytralisere de angjeldende mengder toksin, idet residual-aktiviteten bestemmes i fordøyelseskanal-testene som nevnt tidligere, videre ved den tidligere omtalte adenylat-cyklasestimulerende test, den passive hemaglytinasjons-mikrotest (S.V. Boyden, J. Exp. Med. 93, 107

(1951) ; og A.B. Stavitski, J. Immunol. 72, 368 (1954)) og Bentonite-flokkulasjons-mikrotesten (H.C. Goodman, J. Bozicevich, Immunochemical Methods, 1964 , 43) .

Vaksinene kan sammensettes på konvensjonell måte, f.eks. med eller uten tilsetningsmidler. Når det anvendes tilsetningsmidler omfatter disse imidlertid fordelaktig aluminiumforbindelser, f.eks. aluminiumhydroksyd eller fosfat eller "Alhydrogel" og vann-i-olje emulsjoner, som f.eks. "Adjuvant 65" (en vann i-olje emulsjon av antigen i jordnøttolje som er emulgert med manitol monooleat og stabilisert med aluminiumstearat) og for bruk for dyr, Freunds-tilsetningsmiddel.

Disse vaksiner og sera kan anvendes for beskyttelse av

E. coli-infeksjoner og kolera på konvensjonell måte. F.eks.

kan beskyttelse for barn og voksne mot coli-indusert diarre oppnås for barn ved maternal vaksinering forbundet med et vaksine-program for barna før enden av den passive beskyttelse, eller generelt ved aktiv immunisering ved toksoid.

Beskyttelse av dyr mot koliinfeksjoner er spesielt viktig i

unge dyr. På grunn av at de nyfødte landbruksviktige dyr kan ta antilegemer med morens colostrum bare i de første få timer eller dager etter fødselen, er det viktig for deres beskyttelse

at dette kolostrum har et høyt innhold av spesifikke anti-

legemer. Dette kan oppnås ved gjentatt immunisering av moren

med det passende enterotoksin. Umiddelbart i de første få leveuker er denne beskyttelse med maternale antilegemer nødvendig på grunn av at i denne tid kan infeksjoner i unge dyr med enterotoksinproduserende E. coli-stammer opptre meget hyppig og kan være dødelige. En ytterligere mulighet for beskyttelse av unge dyr er tilførsel av spesifikke heterologe antilegemer, f.eks.

i form av et serum oppnådd fra coli-enterotoksinimmuniserte dyr.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1: Fremstilling av coli enterotoksiner

a) _ Medium

"Trypticase soyabuljong" anvendes som medium. Pepton-vannmediet

inneholder pr. liter 17g trypticase pepton, 3 g fyton pepton,

5 g NaCl, 2.5 g dextrose og 2.5 g K2HP04.3H20 og har en pH på 7.3.

Alternativt kan en "modifisert trypticase soyabuljong", med

samme sammensetning som beskrevet ovenfor, men hvor peptonet tidligere er blitt ultrafiltrert gjennom "Diaflo PM-10"-membraner (Amicon) anvendes som medium. En 3 0% (vekt/volum) oppløsning av "trypticase soyabuljong" ultrafiltreres, resten kastes og filtratet anvendes videre. Det er fordelaktig å anvende disse relativt små peptonmolekyler istedet for det ubehandlede produkt, for å lette etterfølgende separering av uendret medium, fra bakterieproduktene i den urene overliggende væske av E. coli kulturene.

b) _ 2Y£lSiD2_

Den frysetørrede E. coli-stamme P. 263, Serotype 08:K87, K88ab:Hl9

tas opp i vann, utstrykes på blodagarplater og dyrkes ved 37°C i 12 timer. Celler fra overflateveksten overføres ved

hjelp av en platinatrådløkke til en liters Erlenmeyer-kolber inneholdende 200 ml av mediet (umodifisert eller modifisert trypticase-soyabuljong) på en roterende rysteinnretning. Bakteriene

dyrkes ved 37°C i 4 timer og anvendes for innokkulering av en 2 liters ryste-kultur. Når denne kultur når midten av den logaritmiske fase anvendes den for inokkulering av et 20 liters gjæringskar hvori mediet omrøres ved 500 omdreininger/minutt og luftes 10 l/minutt. For å unngå skumning tilsettes 1 ml av en 25% (vekt/volum) oppløsning av et anti-skummemiddel ("Glanapon 2000", Gross-Busetti, Wien). Gjæringskaret inkuberes ved 37°C i 9 timer og cellene høstes ved sentrifugering i en avkjølt ultrasentrifuge ved 4°C. Den overliggende væske filtreres gjennom 0.45yum membranfilter og kontrolleres på sterilitet (ved utstrykning på blodagarplater). Det sterile filtrat avsaltes ved behandling med en ionevekslerharpiks i blandet lag (f.eks. "AG-501-X8"),. lyofiLliseres og lagres for ytterligere anvendelse ved -20 til -70°C.

På analog måte som beskrevet ovenfor fremstilles de cellefrie dyrkingsfiltrater av andre E. colistammer, f.eks. svine-

patogene stammer P. 155, serotype<1>0149:K91:88a,c og P 307, serotype 08:K87 K88a,b såvel som de humanpatogene stammer H104 07, serotype 078K? og H19, serotype 026:K60:H11, og også en Ent<+>

og en Ent E. coli K12 stamme som har mottatt Ent-plasmidet fra den humanpatogene stamme H19.

EKSEMPEL 2: Rensing av coli enterotoksin ved gelfiltrering.

Det lyofilisat som ble oppnådd i eksempel 1 (fra hvilke som

helst av de nevnte stammer) opptas i 0.1 M NH4HC03~buffer (pH 7.9)

(elueringsmiddel) og den kromatografiske separering gjennomføres på en "Bio Gel A-5m"-kolonne (separeringsområde 5.000.000 - 80.000). Ved anvendelse av denne kolonne (2.5 x 100 cm) med et totalt volum på 50 0 ml og tilnærmet tomvolum på 19.0 ml elueres en substanstopp ved omtrent 220 ml tilsvarende en teoretisk molekylvekt på omtrent 10 dalton på basis av Ev/Eo =1.15. En ytterligere substanstopp med en tydelig skulder elueres ved 420 til,480 ml som på samme basis tilsvarer en molekylvekt på 4 5

omtrent 9 x 10 til 1.2 x 10 dalton. Den varmelabile aktivitet kan tydelig finnes, f.eks. ved hjelp av adenylat-syklasetesten,

i skulderen av denne topp.

De lyofiliserte aktive fraksjoner kan slås sammen og opptas

i 0.1 M NH4HC03-buffer (pH 7.9) og en ytterligere gelfiltrering gjennomføres ved å anvende en "Sephadex G-75"-kolonne (separasjonsområde 70.000 - 3.000). Det eluerte material

i tomvolumet skilles klart fra andre proteiner og viser biologisk aktivitet. De aktive fraksjoner (identifisert ved f.eks. adenylat-cyklasetesten) slås sammen og lyofiliseres.

EKSEMPEL 3; Rensing av coli enterotoksin ved isotachoforese

Cellefiltratet (fra eksempel 1) eller coli (LT) enterotoksin-preparatet oppnådd i eksempel 2 kan så underkastes preparativ isotachophorese. For isotachophoresesepareringen kan det anvendes et loddrett elektroforeseapparat med 3.3% polyakrylamidgel (f.eks. i samsvar med P.J. Svendson og Carsten Rose, Science Tools 17 (1), 13 (1970)) som bærermedium. En enkel;buffergel-kolonne anvendes fordelaktig idet "amfolin"-bæreramfolyttene blandes med proteinprøven såvel som den avsluttende elektrolytt (Tris-^-aminocaproatbuf f er pH 8.9). Den avsluttende

elektrolytt, som forbinder systemet med den øvre elektrode (katoden) anordnes i lag over gelen. I den nedre elektrode-avdeling i kolonnen (anode), anvendes tris-sulfatbuffer (pH 7.1) som elueringselektrolytt. Pufferoppløsningen inkluderes i et utvendig:.reservoar og opprettesholdes i sirkulasjon med en elektrisk differensialpumpe. Prøven, blandet med tris-aminocaproatbufferen innføres i kolonnen over gelen ved hjelp av et kapilarrør som stikker opp gjennom det øvre lag av tris- - aminocaproat-buffer. For å lette innføringen av prøven økes dennes viskositet ved tilsetning av 3% sukrose.

Gelen fremstilles fra en standardoppløsning i samsvar med metoden til B.J. Davies (Ann. N.Y. Acad. Sei. 121, 404 (1964)) under anvendelse av tris-fosfat (pH 8.1) som gelbuffer, og polymeriseres bare ved fotopolymerisering. Det aktive material elueres i "Amfolytt"-bæreramfolyttsystemet kort før eller sammen med avslutningselektrolytten.

Eluatet overføres via et UVabsorpsjonsmeter til en fraksjons-kollektor for å gi en første bedømmelse av separeringen

(proteinholdige fraksjoner). De aktive fraksjoner bestemmes tilslutt ved adeholytt-cyklasetesten.

EKSEMPEL 4; Rensing av coli enterotoksin ved affinitets-kromatograferirig.

Kolonnen (10 ml gel i en glasskolonne (1 x 20cm)) vaskes ved romtemperatur, først i to dager med 50% (volum/volum) metanol deretter i 6 timer med 200 ml 6 M guanidin hydroklorid og deretter i 3 timer med 100 ml Krebs-Ringer bikarbonatbuffer pH 7.4. 50 g lyofilisert dyrkingsfiltrat opptas i 150 ml Krebs-Ringer-bikarbonatbuffer og dialyseres grundig ved 4°C mot bufferen. Prøven tilføres kolonnen som utvikles med en strømningshastighet på 5 ml/time ved 4°C. Den vaskes med 500 ml 0.1 M NH4HC03buffer pH 8.0. Elueringen av den biologiske aktivitet gjennomføres ved romtemperatur med 0.1 M NH4HC03-buffer pH 8.0, 0.1% natriumdodecylsulfat (SDS). Det SDS-eluerte material underkastes separat den etterfølgende behandling, for separering av SDS og renaturering, med en urinstof f oppløsning (D. Weber, D.J. Kuter., J. Biol. Chem. 246 4504 (1971))..

Proteinoppløsningen bringes til 6 M urinstoff ved tilsetning

av fast urinstoff, inkuberes i 30 minutter, og dialyseres mot bufferløsningen A (0.05 M tris-acetat pH 7.8, 6 M urinstoff). SDS fjernes på en kolonne "Dowex" 1x2, ekvilibrert med buffer A. Fremkallingen av kolonnen gjennomføres med samme buffer. Gjenvinningen av proteinet fra urinstoffoppløsningen gjennomføres

.ved \ romtemperatur ved dråpevis fortynning i en 0.05 M tris — acetat buffer pH 7.8, slik at den endelige fortynning er minst 10 ganger. Oppløsningen konsentreres så over "Diaflo UM 10"-filter ved 4°C i en "Amicon"-celle og dialyseres ved 4°C

mot 0.05 M tris-acetatbuffer pH 7.8 for å fjerne resten av urinstoffet. Kolonnegelen kan fremstilles på følgende måte:4

Albumin-agarose (25 ml) vaskes med vann og oppslemmes i en

50% (volum/volum) vandig dioksanløsning. 50 mg av det ønskede gangliosid, f.eks. monosialosylgangliosid GM-, (GGNSLC) eller

^3(SGGNSSLC) tilsettes til denne suspensjon og blandingen

Gtet

omrystes i 15 minutter ved romtemperatur. Etter tilsetning av 100 mg l-etyl-3-dimetyl-3(3-dimetylamino-propyl)karbodiimid, omrystes suspensjonen i 6 timer ved romtemperatur, hvoretter ytterligere 100 mg karbodiimid tilsettes. Etter rysting i ytterligere 12 timer vaskes gelen med 500 ml vann, 500 ml 75% (volum/volum) vandig metanol, 250 ml 6 M guanidin hydroklorid og ytterligere 500 ml vann. Gangliosidrinnholdet, bestemt fra forskjellen mellom tilsatt ganglios.id og gjenvunnet, ureagert gangliosid, er omtrent 0.5 mg/ml gel.

Koblingen kan også gjennomføres ved å omsette 20 mg av gangliosidet og 5 mg dicykloheksylkarbodiimid i 10 ml dioksan i 30 minutter ved 15°C. Blandingen tilsettes så til 20 ml albuminaggarose suspendert i dioksan til et totalt volum på 40 ml.

Etter 15 timer ved romtemperatur vaskes gelen med 500 ml dioksan, 500 ml 90% (volum/volum) metanol og tilslutt med 250 ml 6M guanidin-hydroklorid.

o

B)_ IS2^1i!}2_§Y_^Z^Y^£23S§Y§H£2i2iSi^§§£er_av_gangliosi

20 mg av gangliosidet, f.eks. som under A) ovenfor, omsettes med 2.5 mg N-hydroksysuccinimid og 2.5 mg dicykloheksylkarbodiimid i 10 ml dioksan i 30 minutter ved romtemperatur. Oppløsningen tilsettes så til 20 ml albuminagarose suspendert i dioksan til et sluttvolum på 40 ml. Etter 15 timers rysting ved 4°C vaskes gelen med 500 ml dioksan, 500 ml 90% (volum/volum) metanol og med 250 ml 6M guanidin-hydroklorid.

G) ABY§5^§i§e._§Y_fei525i§£_§I}l}Y^Ei^_§Y_2aD2ii2§i^

lOO^ul av 0.1 M N-metylmorfolin i tetrahydrofuran tilsettes til

en oppløsning av 20 mg av gangliosidet, f.eks. som under A) ovenfor, i vannfritt tetrahydrofuran. Blandingen omrøres i 10 minutter ved 0°C og lOO^ul 0.1 M isobutylklorformat i tetrahydrofuran tilsettes. Blandingen holdes ved 0°C i 20 minutter og tilsettes så til 20 ml albuminaggarose suspendert i dioksan til et sluttvolum på 40 ml. Blandingen holdes så ved romtemperatur i 15 timer og den resulterende gel vaskes som beskrevet under A)

ovenfor.

På analog måte som eksemplene A, B og C ovenfor kan geler fremstilles ved å anvende en copolymer av poly-L-lysyl-DL-

alahin og syanobromi deaktivert agarose i stedet for albumin-agarose.

D)_ Fremst il lin2_ay_f ett sy £e-a22§£2§§I^f EiY§t3S2mEl§]S§

Aminoetylamino-, aminoheksylamino- og aminodecylaminoagarose-derivater kan fremstilles i samsvar med metoden til Cuatrecasas og Anfinsen Methods in Enzymology 22, 345 (1971) ved aktivering av "Sepharose 4B" med 200 mg CNBr/ml harpiks ved pH 11 - 11.5,

og omrøring ved pH 10 og 3°C i 15 timer med det tilsvarende diamin. Molforholdet mellom heksan- eller dekan-diamin til CNBr er 1, mens forholdet mellom etylendiamin og CNBr er 5. Aminoalkylaminoagarose-derivatet modnes i 5 dager og omsettes

med IM 2-aminoetanol ved romtemperatur for å mette eventuelle resterende aktiverte grupper av "Sepharose"-substansen. Det resulterende derivat inneholder omtrent 20 mol fri aminogruppe/

ml agarose. Den ønskede fettsyre, f.eks. palmeinsyre ,

kobles ved omrøring i 3 dager av en blanding av agarosederivater i 1.5 ganger dets volum av en 0.1 M oppløsning av natriumsåpen av fettsyren ved pH 10 og 37°C, i nærvær av 50 mg etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid pr. ml "Sepharose". 25%

etanol tilsettes for å bedre oppløseligheten av såpen. Produktet vaskes ved 37°C med 50% (volum/volum) etanol, etanol- 0.075 M natriumfosfat (1:1), pH 2.4, og med etanol 0.05 N NaOH.

Resterende ureagerte grupper mettes ved acetylering med eddiksyré-anhydrid.

EKSEMPEL 5: Molekylvektbestemmelse ved gelfiltrering

For bestemmelse av molekylvekten av E. coli P263 (LT) enterotoksin, kan metoden med gelfiltrering anvendes. Enokolonne med

"Sephadex G 150" kalibreres ved metoden til P. Andrews (Biochem. J. 96, 595 (1965)) under anvendelse av hestehjerte-cytokrom C (molekylvekt 1.3 x 10 4), bovin-pancreas-chymotrypsinogen A, (2.4 x 10 4 ), hønsealbumin (4.5 x 10 4), bovinserumalbumin

(6.8 x 10 4 ), kaninmuskel-addolase (1.47 x 10 5) og bovin-lever-katalase (2.2 x 10^) som sammenligningsproteiner (markører).

Proteinene overvåkes ved deres transmisjon ved 280 mH.

For fremstilling av standardkurven overvåkes videre trirtiert

vann (1.11 x 10 4 dpm) ved væske-syntilasjon og en mettet oppløsning av blå dekstran anvendes og dens optiske densitet ved 620 nyu anvendes for deteksjonen.

"Sephadex"-kolonnen ekvilibreres med 50 mM trisklorid og pH

7.5, 100 mM KC1 og 0.01 M 2-merkaptoetanol.. Elle disse materialer, med samlet volum 0.7 ml overføres til kolonnen og elueres i 0.9 ml fraksjoner. Forsøket gjennomføres ved 4°C. Molekylvekten av E. coli P263 (LT) enterotoksin bestemmes som 102.000

+ 3.000 (grensene for eksperimentell feil).

EKSEMPEL 6: Molekylvektbestemmelse ved polyakrylamid-gel

elektrophorese i natriumdodecylsulfat

Polyakrylamid-gelelektrophorese i 0.1% natriumdodecylsulfat gjennomføres ved pH 7.2 i 7.5% akrylamid ved fremgangsmåten i henhold til A.L. Shapiro, E. Vinuela, J. Maizel (Biochem.

Biophys. Res. Commun. 28, 215 (1967)) og J. Weber, M. Osborn (J.B.C. 244, 4006 (1969)). De følgende proteiner anvendes som standarder: -

Bovin-pancreas-trypsinogen (molekylvekt av polypeptidkjeder =

2.4 x 10 4 ), bovin-hjertelaktat dehydrogenase (3.6 x 10 4), bovin-serumalbumin (6.8 x 10 4) , kaninmuskelfo.sforylase

(9.4 x 10^) og E. coli @ -galactosidase (1.3 x 10^).

En 1% oppløsning av prøven (E. coli P 263 (LT) enterotoksin)

i natriumdodecylsulfat og 2-mercaptoetanol kokes i 3 minutter for å fjerne muligheten for proteolyttisk nedbryting. Prøven dialyseres så mot en oppløsning bestående av 0.1% i natrium-dodecylsulf at og 2-merkaptoetanol, 0.01 M natriumfosfat,

pH 7.1. Sammenligningsproteinene behandles på samme måte.

Molekylvekten av E. coli (LT) enterotoksin bestemmes ved denne metode såm 102.000 + 3.000 (grensene for eksperimentell feil).

EKSEMPEL 7: Bestemmelse av isoelektrisk punkt ved isoelektrisk

fokusering i sucrose- densitetsgradient

For å bestemme det isoelektriske punkt for renset enterotoksin gjennomføres isoelektrisk fokusering i en glasskolonne

(type 8100, 110 ml) i henhold til metoden til 0. Vesterberg og

H. Svensson (Chem. Scand..20, 820 (1966)). Anodeelektrolytten (fosforsyre) lokaliseres ved bunnen av apparatet. De "Ampholin"-bårede amfolytter dekker et pH område fra 3 til 10. Optisk densitet måles ved 280 yum ved å tømme kolonnen gjennom målecellen i et "Uvicord II"-UV-absorpti6nsmeter. Det isoelektriske punkt for proteinet bestemmes ved 4°C ved å måle pH i de eluerte fraksjoner med en kombinert mikroelektrode.

Det isoelektriske punkt for E. coli P263 (LT) enterotoksin bestemmes ved denne metode som 6.95.

EKSEMPEL 8; Bestemmelse av det isoelektriske punkt ved

isoelektrisk fokusering i tynnskikts- polyakrylamidgel.

Enterotoksin isofokuseres på en 5% polyakrylamidgel-plate i

henhold til Z.L. Awdeh et al. (Nature (London) 219, 66 1966))

som modifisert av J. Bours og W.J. van Doorenmaalen

(Science Tools 17, 36 (1970)). En polyakrylamidgel

26.x 12.5 cm og 1 mm tykkelse frembringes med en sluttkonsentras'jon på 2%. "Ampholin"-bæreramfolytter med et pH-område på 3 - 5 5 - 7 og 7 - 10 i forholdet 1:1:1. Gelen polymeriseres i 2 timer-med riboflavin som fotokatalysator. 10 til 25 ml av en 0.1% oppløsning av prøven i 2% "Ampholin", pH 3 - 10, anbringes på 10 x 5 mm Whatman 3 MM papirstrimler som legges i lag på gelen. Den isoelektriske fokusering gjennomføres ved 10°C i et elektroforeseapparat. Før gelplatene festes til elektrodene dekkes elektrodene med 0.5 x 25 cm filterpapirstrimler som fuktes med 0.1% (volum/volum) etylendiamin-oppløsning (katode) . Utgangsstyrken er 50 mA (og nacsettes til 28 mA) i 2.5 timer ved 210 volt (heves til 1080 volt). pH gradienten bestemmes ved hjelp av en kombinert mikrooverflate-elektrode. Etter isofukusering felles proteinene med 14% trikloreddiksyre ved 60°C. Gelen vaskes så ved romtemperatur med 10%, 5% og 3% trikloreddiksyre i 24 timer for å fjerne bæreramfolyttene.

Gelen farges så med en 0.05% oppløsningav "Coomassie Brilliant Blue R-250" (oppløst i metanol/eddiksyre/vann-45/9/46) i 2 timer, etterfulgt av vasking i det samme løsningsmiddel. For fornyet svelling anbringes gelen i eddiksyre/vann ^(9:91) og fotograferes deretter.

Det isoelektriske punkt av E. coli P263 (LT) enterotoksin ved denne metode er 6.95.

EKSEMPEL 9: Innvirkning av pH.■

6 mg porsjoner av coli enterotoksin (spesielt E. coli P263

(LT) enterotoksin) i 24 ml tyrode-oppløsning anbringes i 6 prøverør. Innholdet i rørene bringes til henhv. pH 1,3,5,6,7

og9 med konsentrert HC1 eller 6N NaOH. Prøverørene inkuberes ved 4°C og hvert rør bringes til pH 7. Innholdet i hvert rør prøves så i kanin- og svine-fordøyelseskanalforsøk ved 2 ml (0.5 mg) pr. intestinal-sløyfe.

Den enterotoksigeniske aktivitet av E. coli P263 (LT) enterotoksin er meget syrelabil. Aktiviteten ødelegges fullstendig ved pH4 eller mindre og påvirkes allerede ved pH6.

EKSEMPEL 10: Innvirkning av temperatur.

5 mg porsjoner av det rensede enterotoksin (spesielt P263 (LT) enterotoksin) opptas hver i 20 ml tyrodeoppløsning og oppvarmes ved henhv. 40, 50, 60, 65 og 70 og 100°C i 30 minutter. De oppvarmede oppløsninger prøves ved kanin- og svine-fordøyelses-kanalf orsøk med en ubehandlet oppløsning som kontroll. Det tilføres 2.0 ml (0.5 mg) pr. intestinal-sløyfe.

/Den biologiske aktivitet av enterotoksinet ødelegges fullstendig ved oppvarming i 3 0 minutter ved 65°C. Varmelabiliteten er allerede tydelig ved 50°C og dens fullstendige ødeleggelse av

aktiviteten foregår hovedsakelig allerede ved 60°C. -

EKSEMPEL 11; Påvisning av immunologisk identitet eller

kryss- immunitet.

Frysetørret E. coli-stamme P 155 serotype 0149:K01, K88a,

c eller human patogen E. coli-stamme H 10407, eller Ent E. coli-stamme K 12 og Ent E. coli-stamme K 12 anvendes

for å frembringe et cellefritt dyrkingsfiltrat som beskrevet ovenfor for stamme P 263. Cellefiltratet tjener som prøve med ukjent sammensetning av antigen Ag-sX*

Identifiseringen og kvantifiseringen gjennomføres under anvendelse av et referanseantigen, Ref-Ag (det rene coli enterotoksin fra stamme P 263 eller H 19) og et referanse-antiserum Ref-Ab (monovalent antiserum mot colienterotoksin).

De to spørsmål, hvorvidt Ag-rX .inneholder et antigen som er "identisk" med Ref-Ag, og i tilfelle hvorledes konsentrasjonen av dette antigen kan sammenlignes med den kjente konsentrasjon av antigen Ref-Ag, kan besvares ved "kryss-immunoelektroforese"

(H.G.M. Clarke og T. Freeman, Clin. Sei. 35, 403 (1968)) og "tandem krysselektroforese" (Kroll J., A manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, N.H. Axelsen et. al. Universitetsforlaget, Oslo , side 57 (1973), suppl. 1/1973, Scandinavian J. Immun).

Med henvisning til de vedføyde tegninger viser fig. 1 et "kryss-immunoelektroforese" bilde av Ref-Ag, utviklet mot Ref-Ag. Bare et bunnfall opptrer.

I fig. 2 anvendes Ag-vX,; istedet for Ref-Ag. På basis av posisjonen for bunnfallet i fig. 2 kan det sees at Ag-X inneholder et antigen som er identisk med Ref-Ag. Denne konklusjon forsterkes ved reaksjon av "identiteten" under anvendelse av "sammenførte bunnfall". Dette eksperiment kan gjennomføres ved hjelp av "tandem kryss-immunoelektrof orese" (fig. 3) .

Ved å sammenligne fig. 3 med fig. 1 kan det sees at Ag-X inneholder Ref-Ag og at konsentrasjonen av det siste i Ag-X er •

mindre enn i Ref-Ag. Kvantifiseringen av de sammenslåtte topper kan gjennomføres ved standard retoder (J. Kroll, J.Clin.

Lab. Invest 22, 112 (1968));

Hvis dyrkingsfiltratet Ent E. coli K 12-stammen anvendes i

dette forsøk istedet for Ag-X forekommer intet bunnfall i fig.

2. Dette bekrefter at det bunnfall som opptrer i fig. 2 er forbundet med enterotoksinene i patogene E. coli-stammer.

De samme forsøk kan gjennomføres for å påvise den immunologiske identitet eller kryss-immunitet av human-patogen og porfin-patogen E. coli enterotoksiner.

I denne prøve tjener rent E. Coli P 263 (LT) enterotoksin som Ref-Ag og det monovalente antiserum mot P 26 3 enterotoksin som Ref-Ag. Det humane patogene enterotoksin H 19 tjener som prøve med ukjent sammensetning av Agr)X\ Som beskrevet for fig.. 2

opptrer også et enkelt bunnfall i bildet for "kryss-immunoelektrof orese" av Ag-X utviklet mot Ref-Ag i samme posisjon som i fig. 1. På basis av posisjonen for bunnfallet kan det sluttes at Ag-X inneholder et antigen som er identisk med Ref-Ag. Reaksjonen med "identitet" under anvendelse av sammenførte bunnfall i "tandem-kryss-immunoelektroforese" viser (som i fig. 3) at Ag-X og Ref-Ag er serologisk identiske.

På bakgrunn av dette kan humane patogene eller svine-patogene

coli enterotoksiner anvendes som antigener for immunisering eller for fremstilling av toksoider.

Ved å anvende samme eksperiment kan spørsmålet om hvorvidt

der mellom E. coli enterotoksin og V. cholerae enterotoksin foreligger en delvis eller fullstendig immunologisk identitet undersøkes. Det rene E. coli P 263 (LT) enterotoksin tjener som Ref-Ag mens E. coli P 263 antitoksin anvendes som Ref-Ab og

det rene V. cholerae toksin tjener som antigen-prøve Ag-X.

Resultatene er vist i fig. 4, 5 og 6. I. fig. 4 opptrer det

som tidligere et eneste bunnfall. I fig. 5 opptrer på nytt et enkel bunnfall, men i en annen stilling og med en forskjellig form

fra den i fig. 4.

Fra fig..6 ("tandem-kryss-immunoelektroforese") er det klart

at der er en distinkt og i det minste partiell identitet mellom Ref-Ag og Ag-X (E. coli enterotoksin og V. cholera-enterotoksin).

" EKSEMPEL 12: Aktiv immunisering.

Avlspurker insemineres kunstig og immuniseres, for den første gang en måned før antatt fødsels-tidspunkt: 0.95 mg renset E. coli enterotoksin (spesielt P 263 (LT) enterotoksin) sammen med 15 ml komplett Freunds tilsetningsmiddel (7.5 ml tilsetningsmiddel + 7.5 ml NaCl-buffer 0.05 M, 10~<2>M ^-merkaptoetanol) tilføres i.m. Etter 2 uker tilføres ytterligere 0.35 mg enterotoksin i 5 ml 0.9% NaCl oppløsning.Lv.

På grunn av den serologiske identitet mellom svine- og human-patogene coli-enterotoksiner kan det rensede (LT) enterotoksin av stammen H 19 f.eks. anvendes alternativt.

6, 12 og 24 timer etter at avlspurkene har født grisungene avsuges colostrum og oppsamles. 56 timer etter fødselen tas blodprøve for serumprøve.

Bestemmelsen av anti-legeme-innholdet kan gjennomføres ved bentonit-flokkuleringsmikrotest (SBF-test). De følgende resultater oppnås:

Et fortynnet (1:2) svineserum kan anvendes ved nøytraliserings-studier ved kanin-fordøyelseskanalsløyfeprøven. Etter bruk av en toksindose på 0.25 mg/sløyfe (dvs. 3 toksinenheter) oppnås mer enn 60% inhibering. Tilsvarende forsøk med colostrum

(6 timer post partem) viser i kaninmodellen en fullstendig nøytralisering av toksinaktiviteten.

(1 toksinenhet defineres som ED^q i fordøyelseskanal-sløyfe-testen eller i adenylat-cyclasesystemet).

EKSEMPEL 13: Fremstilling av et toksoid.

For å oppnå optimale betingelser for inaktiveringen, på basis

av en molekylvekt på 102.000 for toksinmolekylet, varieres konsentrasjonene av glutaraldehyd til å begynne med fra 50 til 1000 mol/mol toksin. Reaksjonen gjennomføres under anvendelse av et toksin-konsentrasjonsområde på 100 til 1000^ug/ml, ved 30°C i en 0.065 M PBS-buffer pH 7.8 og for forskjellige inkubasjonstider. Reaksjonene stanses ved dialyse mot 100 ganger så store volumer av PBS-buffer pH 7.8. Ved en toksin-konsentras jon på over 600^ug/ml begynner reaksjonsproduktet med økende konsentrasjon av glutaraldehyd og bli uoppløselig. Hvis tdksinkonseritrasjonen holdes mellom 100 og 600^ug/ml og glutaraldehydkonsentrasjonen varieres mellom 50 og 400 mol/mol toksin forblir reaksjonsproduktet i oppløselig form.

Adenylat-cyklasetesten viser at den optimale detoksifisering oppnås i pH området 7.8 til 8.2. Hvis en toksinkonsentrasjon på 400 til 600 mg/ml velges nedsettes rest-toksisiteten

(målt etter inkubering i 72 timer ved 30°C) til tiendeparten

ved to gangers økning i glutaraldehyd-konsentrasjonen mellom 50 og 200 mol/mol toksin. Hvis glutaraldehydkonsentrasjonen heves fra 200 til 400 mol/mol toksin kan ikke restaktiviteten påvises selv med de mest følsomme metoder (adenylat-cyklasetesten) .

For å bestemme preparater av inaktivert coli enterotoksin (toksoid) kvantitativt bestemmes toksinenheter med metoden til Craig (J.P. Craig 1971, Cholera toxins, sidene 189 - 254 i S. Kadis et. al., Microbial Toxins 2, Academic Press Inc.,

New York).

Denne bestemmelse er basert på toksinenes evne til å reagere

in vitro med antitoksinet. Prøven bestemmer nedsettelsen i nøytralisasjonsevne for en kjent mengde antitoksin, etter inkubasjon med toksoid. En serie testrør, hver inneholdende den samme mengde antitoksin (2 AU/ml) og en tilsvarende fortynning av toksoid inkuberes hver ved 37°C i 30 minutter.

En ytterligere serie forsøksrør tjener som kontroll, idet

hvert rør inneholder den samme mengde antitoksin (2 AU/ml) hvortil buffer er tilsatt og som inkuberes under de samme betingelser. Etter inkubasjonen tilsettes identiske volum med en 0.15 log serie fortynning av toksin til forsøksrørene og bestemmelsen gjennomføres ved hjelp av adenylat-cyklasetesten.

Forskyvningen av 50%-verdiene ved dose-aktivitetskurven anvendes så for å bestemme mengden av fri og bundne antitoksiner i antitoksin-toksoidblandingen. En TU er den mengde toksoid som binder en AU av antitoksinet (AU = antitoksinenhet).

EKSEMPEL 14: Adenylat- cyclasétesten.

Fremstilling av adenylat-cyklasepreparatet i partikkelform gjennomføres ved fremgangsmåten til Levey (G.S. Levey og E. Epstein, Biochem. Biophys. Res. Commun. 33, 990 - 995 (1968) og 38, 86 - 92 (1970)) under anvendelse av katte-myocordial-vev. Aktiveringen av adenylatcyklase ved coli enterotoksinet bestemmes ved radioisotop-fortynningstesten (A.G. Gilman, Proe. Nat. Acad. Sic. 67, 305 - 312 (1970)) under anvendelse av 5-adenylimido-difosfat (AMP-PNP) som substrat i stedet for ATP. AMP-PNP renses før bruken ved å føres gjennom en kolonne.med "Dowex"

50 x 2 i H+<->form.

Reaksjonsmediet omfatter 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4),

5mM MgCl2, 10- mM teofyllin, 0.1% bovin-serumalbumin og 2mM AMP-PNP. Inkubasjonsvolumet oppgår til 0.1 ml totalt og enzymkonsentrasjonen er 0.15 mg protein pr. test. Inkubasjonen settes i gang ved tilsetning av enzymet og gjennomføres i 30 minutter ved 37°C. For å avslutte reaksjonen tilsettes 500 ml 7.5% trikloreddiksyre og blandingen holdes ved 4°C i

10 minutter. Bunnfallet separeres ved sentrifugering og over liggende væskelag tilsettes til 5 ml dietyleter mettet med vann. Lagene separeres ved sentrifugering og eterfasen fjernes. Etter totalt tre eterekstraksjoner inndampes den vandige

løsning til tørrhet ved 60 til 70°C på et vannbad med en luftstrøm. Resten oppløses i 1 ml 0.2 M acetatbuffer (pH 4.0). Mengden av dannet vcAMP, som er et direkte mål på graden av aktivering av adenylat-cyklase ved coli enterotoksin, bestemmes ved' hjelp av den tidligere nevnte test (kan fås som et forsøks-sett fra Boehringer Mannheim, vest-Tyskland.

EKSEMPEL 15: Fremstilling av en vaksine.

En enterotoksoid oppløsning (spesielt E. coli P 263 (LT) enterotoksoid) (lmg/ml) dialyseres grundig mot en oppløsning ay,

NaHP04(0.07 M) og filtreres på et Seitz-steriliseringsfilter.

Det samme volum av en steril 0.07 M CaC^ oppløsning tilsettes

så for å frembringe en vaksine absorbert på kalsiumfosfat med en pH 6.8 til 7. For inokkulering fortynnes vaksinen og tilføres i doser på f.eks. 1 til lOO^ug.

EKSEMPEL 16: Oral tilførselsform.

Frysetørret mengder av enterotoksoid (spesielt P 263(LT) enterotoksoid) (f.eks. lOOyug-l mg) presses inn i en dragé-.kjerne med et passende filter (som også kan tjene som et tilsetningsmiddel) og belagt med en anionisk polymer fra metakrylsyre og metakrylsyreestere (f.eks. "Eudragit L og S") hvortil det er tilsatt et mykningsmiddel. Belegg av denne type beskytter mot innvirkning av magesafter på grunn av at de er uoppløselige i det.sure pH området og vann-ugjennom-trengelige. De er således motstandsdyktige overfor magesaftene. Etter passering gjennom magen vil beleggene oppløses.

"Eudragit C"-filmer vil f.eks. oppløses i det nøytrale pH-området fra pH 6 (duodenal-saftene), mens "Eudragit-S"-filmer først oppløses i de nedre tynntarmområder (fra pH 7).

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for isolering og rensing av E. coli enterotoksin fra et urent eller forurenset cellefritt dyrkingsfiltrat av en enteropatogen E. coli-stamme fra dyrking i et gjæringskar, karakterisert ved at dyrkingsfiltratet underkastes isotachoforetisk separasjon.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at dyrkingsfiltratet underkastes isotachoforetisk separasjon under anvendelse av polyakrylamidgel som bæremedium og "amfolin"-bæreramfolytter som buffer og avstands-substanser.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at avslutningselektrolytten er tris-£-aminokaproatbuffer pH 8.9 og elueringselektrolytten er tris-sulfatbuffer pH 7.1.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 3, karakterisert ved at de resulterende separerte- fraksjoner prøves på E. coli enterotoksin-aktivitet, idet en eller flere fraksjoner med den ønskede aktivitet underkastes en ytterligere isotachoforetisk separering.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den videre isotachoforetiske separering gjennomføres under anvendelse av polyakrylamidgel som bærermedium ,:"Ampholine" bæreramfolytter som buffer- og avstands-substanser, tris-^-aminokaproatbuffer pH 8.9 som avsluttende elektrolytt og tris-2-(N-morfolino)etan-sulfonsyre pH 6.2 som elueringselektrolytt.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 - 5, karakterisert ved at resulterende E. coli enterotoksin-holdige fraksjoner gelfiltreres for å fjerne amfolin-bæreramfolytter.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at fraksjonen gelfiltreres over "Sephadex G-50".

8. Fremgangsmåte for isolering og rensing av E. coli enterotoksin fra et urent eller forrenset cellefritt dyrkingsfiltrat av en enteropatogen E. coli-stamme fra en dyrking i gjæringskar, karakt e>risert ved at dyrkingsf iltratet underkastes affinitets-kromatografisk separering.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at affinitetsliganden er et fosfolipid eller glycolipid med fri karboksylgrupper.

10. Fremgangsmåte som:angitt i krav 9, karakterisert ved at affinitetsliganden er et gangliosid. •

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at gangliosidet er gangliosid GM^ (GGNSLC) eller GQt t 3 (SGGNSSLC).

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 8-11, karakterisert ved at den uoppløselige grunnmasse hvortil affinitetsgiganden er bundet for å danne af f initetsharpiksen er albuminag^ arose eller et aggarose-derivat fremstilt ved å knytte et poly-L-lysyl-DL-alanin til cyanobromidaktivert aggarose..

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at affinitetsharpiksen er fettsyreaminoalkylaminoaggarosekompleks.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at affinitetsharpiksen er et kompleks av palmitinsyre og et aminoalkylaminoaggarose-derivat dannet fra sefarose og etylendiaminheksandiamin eller dekandiamin.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 8-14, karakterisert ved at elueringen gjennomføres med natriumdodecylsulfat idet det resulterende eluerte enterotoksin deretter renatureres.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 8-15, karakterisert ved at det urene cellefrie dyrkingsfiltrat forrenses ved gelfiltrering.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at det urene cellefrie filtrat forrenses ved gelfiltrering og'Biogel A-5m".

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at gelfiltreringen over "Biogel A-5m" gjennomføres under anvendelse av en alkalisk buffer.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at bufferen er ammonium-bikarbonatbuffer pH 7.9 til 8.0.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 17 til 19, karakterisert ved , at de resulterende fraksjoner testes for enterotoksinaktivitet, idet en eller flere fraksjoner med den ønskede aktivitet deretter underkastes en ytterligere forrensing ved gelfiltrering.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 20, karakterisert ved at den ytterligere forrensing ved hjelp av gelfiltrering gjennomføres over "Sephadex G-75" under anvendelse av en alkalisk buffer.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21, karakterisert ved at den alkaliske buffer er Tris-HCl buffer pH 8.0.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 22, karakterisert ved - at det enterotoksinholdige cellefrie dyrkingsfiltrat oppnås ved dyrking i 3 generasjoner av enteropatogen E. coli-stamme i en trypticase-soyabuljong eller en ultrafiltrert trypticase-soyabuljong som medium..

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at det første trinn i dyrkingen gjennomføres i 4 til 6 timer, det annet trinn inntil dyrkingen når midten av den logaritmiske fase og det tredje trinn i 8 til 10 timer.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 23 eller 24, karakterisert ved at det rå buljongfiltrat ultrafiltreres i nærvær av pentamidin-isotionat og deretter avsaltes.

26. Fremgangsmåte som ..angitt i krav 1 til 25, karakterisert ved at de separerte fraksjoner tettes med hensyn til E. coli enterotoksinaktivitet ved ihkubering av et preparat av kattemyokardialadenylat-cyklase i et forut bestemt tidsrom i nærvær av den prøve som skal testes, og økningen i adenylatcyklaseaktivitet i det resulterende produkt måles i forhold til en kontrollprøve.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 26, karakterisert ved at inkuberingen gjennomføres i nærvær av et substrat hvis omdannelse til cyklisk -3'-5'-adenosinmonofosfat katalyseres "ved adenylateyklase, idet økningen i adenylatcyklase-aktivitet;-bestemmes ved måling av økningen i mengden av cyklisk 2'-5'-adenosinmonofosfat i det resulterende produkt, i forhold til en kontroll.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 27, karakterisert ved at substratet er adenosin trifosfat eller 5 <1-> adenylimidodifosfat.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 27 eller 28, karakterisert ved at inkubasjonen gjennomføres i et reaksjonsmedium omfattende Tris-HClbuffer pH 7.4, magnesiumklorid, bovin-serumalbumin og teofyllin.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 26 til 29, karakterisert ved at inkubasjonen gjennom-føres ved 37°C i 5 til 30 minutter.

31. Fremgangsmåte som angitt i krav 26 til 30, karakterisert ved at fremstillingen av katte-myocardial adenylatcyklase oppnås i partikkelform fra katte-myocardial-vev.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 31, karakterisert ved at den enteropatogene E. colistamme er P 263, P 155, P 307, H 10407, H 19 eller Ent <+> eller Ent K12., idet Ent-plåsmidet er overført fra H19.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-32, karakterisert ved at den enteropatogene E. colistamme er P 263.