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PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung von Colienterotoxin, dadurch gekennzeichnet, dass man enterotoxinbildende E.coli-Stämme kultiviert und das gebildete, im Zellfiltrat vorhandene Enterotoxin zur Reindarstellung der Isotachophorese unterwirft.
Coliinfektionen der Tiere, insbesondere der Jungtiere, wie Ferkel, Kälber und Lämmer, zählen zu den wichtigsten Krankheiten bei der Aufzucht von Haustieren. Die Coliinfektionen des Schweines treten hauptsächlich im Zusammenhang mit Störungen von seiten des Intestinaltraktes vor allem bei neugeborenen Ferkeln und bei Absetzferkeln auf.
Es kommt dabei zu einer massenhaften Vermehrung bestimmter Serotypen hämolysierender Colibakterien. Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass ein von bestimmten Colistämmen produziertes Enterotoxin, das Colienterotoxin, die Krankheitssymptome auslöst.
Coliinfektionen beim Menschen werden für die Säuglingsenteritis, für die meisten Formen der Reisekrankheit (Traveller's Disease) und für die akute tropische Diarrhoe verantwortlich gemacht.
Bisher wurden diese Coliinfektionen entweder mit Colivakzinen oder Antibiotika bzw. Chemotherapeutika bekämpft. Die Colivakzine sind prinzipiell gegen bestimmte Serotypen von E.coli, nicht aber gegen ihre Exotoxine gerichtet. Sie vermitteln also nur eine antibakterielle, nicht aber eine antitoxische Schutzwirkung. Ebenso wirken die zur Behandlung von Coliinfektionen empfohlenen Antibiotika bzw. Chemotherapeutika nur gegen die Keime, nicht gegen ihre Toxine. Ausserdem erschwert die fallweise auftretende Antibiotikaresistenz vieler pathogener E.coli-Keime die Behandlung. Eine wirksame Bekämpfung der Krankheiten ist daher bisher nicht möglich gewesen.
Die Fähigkeit, Colienterotoxin zu produzieren, wird durch ein Plasmid bestimmt, das von einem pathogenen E.coli-Stamm auf andere nicht pathogene durch Konjugation übertragen werden kann. Somit wird das beobachtete Auftreten von neuen enteropathogenen Serotypen verständlich. Offensichtlich sind jene E.coli Serotypen, die als neue enteropathogene Stämme erkannt wurden, gute Rezeptoren für Plasmide. Diese Meinung erklärt auch das Auftreten von vielfacher Antibiotikaresistenz unter den enteropathogenen E.coli-Stämmen, da R-Faktoren durch denselben Mechanismus übertragen werden wie Enterotoxinplasmide.
In Anbetracht der Übertragung durch Plasmide ist eine spezifische antibakterielle Immunprophylaxe wenig sinnvoll. Das gleiche gilt für eine chemotherapeutische Behandlung.
Die enteropathogenen E.coli-Stämme sind durch die
Fähigkeit charakterisiert, sich im Jejunum zu vermehren und eine Verschiebung von Wasser und Elektrolyte durch das intakte Darmepithelium in den Darmraum zu bewirken, wobei weder eine lokale noch systematische Invasion der
Bakterien eintritt.
Diesen Vorgang nennt man Enterosorption. Die Enterosorption ist auf ein von den Colistämmen produziertes Exotoxin, das Colienterotoxin, zurückzuführen.
In der Literatur wird die plasmidkontrollierte Synthese von 2 Formen des Enterotoxins, hitzelabiles (LT) und hitzestabiles (ST) Toxin beschrieben [Smith, H. W. und Gyles,
C. L.: J. Med. Microbiol. 3/387 (1970)]. Die zwei Entero toxine unterscheiden sich in ihrer Hitzestabilität, Säure labilität und im Molekulargewicht.
Nachstehende Tabelle gibt einen Überblick über die Eigenschaften: Eigenschaften LT ST Hitzelabilität (60"C, 10 min) + Säurelabilität (pH < 6) + Antigenität + Empfindlichkeit gegen Neutralisation mit Antiserum + + Dialysierbarkeit -- hohes Molekulargewicht + + Wirksamkeit in Kaninchen-Darmschlingen + + Wirksamkeit in Schweine-Darmschlingen + + Produktion, gesteuert durch ein Plasmid + + Fähigkeit, im Schwein Durchfälle zu induzieren + +
Es hat sich nun gezeigt, dass bei Verwendung des Colienterotoxins als Antigen im vakzinierten Tier Antikörper im Serum und im Kolostrum auftreten, die die Tiere vor der schädigenden Wirkung des Colienterotoxins schützen.
Da die Neugeborenen der landwirtschaftlichen Nutztiere Antikörper nur in den ersten Stunden bzw. Tagen nach der Geburt mit dem Kolostrum vom Muttertier aufnehmen können, ist es zu ihrem Schutz wichtig, dass dieses Kolostrum einen hohen Gehalt an spezifischen Antikörpern hat. Dies kann durch eine wiederholte Immunisierung des Muttertieres mit dem geeigneten Enterotoxin bestimmter Colistämme erreicht werden. Gerade innerhalb der ersten Lebenswochen wird dieser Schutz durch maternale Antikörper benötigt, da in dieser Zeit Infektionen der Jungtiere mit Enterotoxin-produzierenden Colistämmen sehr häufig auftreten und zum Tod der Tiere führen können.
Eine weitere Möglichkeit des Schutzes von Jungtieren ist die Verabreichung spezifischer heterologer Antikörper, z.B. in Form eines Serums, das aus mit Colienterotoxin immunisierten Tieren gewonnen werden kann.
In der Literatur wird zwar behauptet. dass die Verabreichung von Antiserum keine praktikable Vorbeugung gegen die Erkrankung der Ferkel darstellt. da der durch die Verabreichung von Antiseren erreichte Schutz von kurzer Dauer sei und überdies eine kontinuierliche Verabreichung erfordere [0. P. Miniats: Can. Vet. J. II/52 (1970)]. Diese Behauptung ist nur zutreffend für die Antiseren gegen das O- bzw. das 0- und K-Antigen(antibakterielle Antikörper), währenddessen ein monovalentes Antiserum gegen das Enterotoxin durchaus einen Schutz bewirken kann.
Ein Schutz von Säuglingen und Erwachsenen gegen die durch Colienterotoxin hervorgerufene Diarrhoe kann auf folgende Weise erreicht werden:
1. Maternale Vakzination gekoppelt mit einem Vakzine programm für den Säugling vor Beendigung des passiven
Schutzes oder 2. aktive Immunisierung mit Toxoid in allen anderen Fäl len.
Die Voraussetzung für die Anwendung des Colienterotoxins zur Immunisierung des Muttertieres und Schutz der Jungtiere durch Kolostrum sowie die passive Verabreichung von Antiserum, das in einer anderen Tierspezies gewonnen
wurde, ist der Nachweis, dass die von verschiedenen E.coli Stämmen gebildeten Enterotoxine immunologisch ident oder so weit verwandt sind, dass eine Kreuzimmunität besteht.
Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass alle E-coli-Stämme identisch sind, da die Fähigkeit zur Bildung von Colienterotoxin offenbar durch Plasmide übertragen wird. Eine weitere Voraussetzung ist die Entwicklung eines stabilen Toxoids.
Eine praktische Anwendung des Colienterotoxins (bzw.
Toxoids) als Bestandteil von Vakzinen sowie die Beantwortung der eben aufgeworfenen Fragen ist von der Darstellung eines reinen Colienterotoxins abhängig.
Die Erfindung besteht darin, dass man Colienterotoxin herstellt, indem man enterotoxinbildende E.coli-Stämme kultiviert und das gebildete, im Zellfiltrat vorhandene Ente rotoxin zur Reindarstellung der Isotachophorese unterwirft.
Das hitzelabile E.coli Enterotoxin hat mit dem V.cho lerae Enterotoxin eine Reihe von Charakteristika gemein sam, wobei besonders auf eine gewisse serologische Be ziehung zwischen den beiden Enterotoxinen hinzuweisen ist.
Das V.cholerae Enterotoxin konnte bereits in reiner Form dargestellt werden und eine umfassende physiko-chemische
Charakterisierung wurde vorgenommen. Das E.coli Entero toxin wurde bisher weder gereinigt noch liegen in der Lite ratur Angaben über molekulare Eigenschaften vor.
Es hat sich gezeigt, dass das gereinigte E.coli Entero toxin ebenfalls zur Immunprophylaxe gegen Cholera ange wendet werden kann. Die Voraussetzung für die Verwen dung einer aus E.coli Enterotoxin bzw. Toxoid gebildeten
Vakzine zur Immunprophylaxe gegen die Cholera ist der
Nachweis, dass eine serologische Verwandtschaft bzw.
K,reuzimmunität zwischen E.coli Enterotoxin und V.cholerae
Enterotoxin besteht.
Zum Nachweis dieser Bedingungen wurden folgende
Versuche durchgeführt.
Bakterienkulturen:
Es wurden drei schweinepathogene E. coli-Stämme
Stamm P 263 Serotype 08: K87, K88ab: 19
Stamm P 155 Serotype 0149: K91 : 88a,c
Stamm P 307 Serotype 08 : K87 K88ab zwei humanpatogene Stämme
Stamm H 10407 Serotype 078K :?
Stamm H 19 Serotype 026:K60:H11 sowie ein Ent- und ein Ent+ E.coli K12 Stamm, der das
Ent Plasmid vom humanpathogenen H19 übertragen erhal ten hatte, verwendet.
Die Mikroorganismen-Stämme sind unter den oben er wähnten offiziellen Bezeichnungen bekannt und der Öffent lichkeit frei zugänglich und wurden bezogen bei:
National Animal Disease Laboratory, Animal Disease and parasite Division, Agricultural Research Service, United
States Department of Agriculture, Ames, Iowa, USA bzw.
bei University of Washington, School of Medicine, Depart ment of Microbiology and Immunology, SC-42, Seattle,
Washington 98195, USA.
Medium:
Als Medium kann ein trypticase soy broth -Medium verwendet werden. Das Pepton-Wasser-Medium enthält pro
Liter 17 g Trypticasepepton, 3 g Phytonpepton, 5 g NaCI,
2,5 g Dextrose und 2,5 g K.HPO4 - 3H2O und besitzt ein pH von 7,3.
Man kann jedoch auch ein modifiziertes Medium einsetzen, dessen Zusammensetzung die gleiche wie oben beschrieben ist, wobei jedoch das Pepton vor seiner Verwendung einer Ultrafiltration durch Diaflo PM-10 Membranen (Amicon) unterworfen wird. Eine 30%ige (Gew./Vol.) Lösung eines trypticase soy broth -Mediums wird ultrafiltriert, der Rückstand verworfen und das Filtrat weiterverwendet. Es ist vorteilhaft, diese relativ kleinen Peptonmoleküle anstelle des rohen Produkts zu verwenden, da dadurch die spätere Abtrennung des Anteils unveränderten Mediums von den bakteriellen Produkten in den Rohkulturen von E.coli erleichtert wird.
Herstellung des Cohen terotoxins:
Ein gefriergetrockneter E.col Stamm, besonders der Stamm 263, Serotype 08 : K87, K88ab: H19 oder Hl9, Serotype 026 : K60 : Hl 1 wird in Wasser aufgenommen, auf Blutagarplatten ausgestrichen und 12 Stunden bei 37"C kultiviert. Dann werden mit einer Platinschleife Zellen aus der Oberfläche in einen 1 Liter Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml des oben beschriebenen modifizierten trypticase soy broth -Mediums enthält und der sich auf einem rotierenden Sc üttelapparat befindet. Die Bakterien werden 4 Stunden bei 7OC kultiviert.
Dann wird damit eine 2 Liter Kultur beimpft, die ihrerseits nach Erreichen der Mitte der logarithmischen Phase als Impfflüssigkeit für einen 20 Liter Fernmeter, in dem das Medium mit 500 /min gerührt und mit 10 Liter/min Luft belüftet wird, verwendet wird. Um ein Schäumen der Lösung zu verhindern, wird 1 ml eines 25%igen Antischaummittels (Gew./Vol) zugesetzt. Es wird 9 Stunden bei 37"C inkubiert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugieren in einer gekühlten Ultrazentrifuge bei 40C geerntet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch ein 0,45 pm Membranfilter filtriert und das Filtrat auf Sterilität geprüft (durch Bestreichen einer Blutagarplatte).
Das sterile Filtrat wird durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz entsalzt, lyophilisiert und bei 200 bis 700C für die weitere Verwendung gelagert.
Erfindungsgemässe Reinigung des Colienterotoxins durch Isotachophorese
Die erhaltene vorgereinigte Colienterotoxinpräparation wird der präparativen Isotachophorese unterworfen. Für die isotachophoretische Trennung wird eine senkrechte Säulenelektrophoreseapparatur mit 3,3% Polyacrylamidgel als Trägermaterial z.B. nach P.J. Svendsen und Carsten Rose (Science Tools, Vol. 17, No. 1, 1970, Seite 13) verwendet. Es wird nur eine gepufferte Gelsäule verwendet und die Ampholine carrier Ampholyte werden mit der Proteinprobe sowie dem Terminatorelektrolyten (Tris-±- -aminocaproat-Puffer, pH = 8,9) gemischt. Über das Gel wird der Terminatorelektrolyt geschichtet, der das System mit der oberen Elektrode (der Kathode) verbindet. In der Eluierungskammer im unteren Elektrodenteil (Anode) wird Tris-sulfat-Puffer (pH = 7,1) als Eluierungselektrolyt verwendet.
Die Pufferlösung ist an ein äusseres Reservoir angeschlossen und wird durch eine elektrische, isolierte Pumpe in Zirkulation gehalten. Die mit dem Tris-r-amino- caproat-Puffer vermischte Probe wird mit Hilfe einer Kapillare in die Säule eingebracht. indem man den die obere Schicht bildenden Tris-±-aminocaproat-Puffer durchstösst.
Um das Einbringen der Probe zu erleichtern, werden zur Erhöhung der Viskosität 3% Sucrose zugesetzt.
Das Gel wird von einer Vorratslösung nach der Methode von B.J. Davies [Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404 (1964)] unter Verwendung von Tris-phosphat, pH = 8,1 als Gelpuffer hergestellt, das nur durch Photopolymerisation polymerisiert wird.
Das aktive Material eluiert im Ampholine carrier Ampholyte System pH 6 - 8 knapp vor, bzw. mit dem Terminatorelektrolyten.
Das Eluat wird über einen UV-Absorptiometer zu einem Fraktionssammler geleitet, wodurch ein erster Wert für den Trenneffekt erhalten wird. Die endgültige Bestimmung der Fraktionierung wird mit Hilfe des in vitro Tests für Colienterotoxin (Adenylatcyclase-Test) durchgeführt.
Die Wirksamkeit des Colienterotoxins wird mit den beiden folgenden Testen nachgewiesen:
Kaninchen-Darmligatur-Test:
Die Aktivität von Colienterotoxinpräparationen kann mit dem Kaninchen-Darmligatur-Test geprüft werden, der bei Burrows W. und Musteikis G. H., J. Infect. Dis. 116/183
190 (1966) beschrieben wird. Zum Einsatz gelangen 1 bis 2 kg schwere weisse New Zealand Kaninchen, die 24 Stunden vor dem Test hungern. Sie werden mit Fluothane anästhesiert und die Bauchhöhle wird geöffnet. Der Dünndarm wird mit 20 ml Tyrode-Lösung ausgespült. Dann werden 6 zwischen 10 und 12 cm lange Segmente abgebunden. In den Hohlraum dieser Segmente werden 2 ml Tyrode Lösung (negative Kontrolle) oder 0,2 mg hitzelabiles Enterotoxin, besonders aus P-263 oder aus H19 (positive Kontrolle) injiziert. Die restlichen vier Darmschlingen werden für die Testmaterialien verwendet.
Nach der Injektion wird die Bauchhöhle geschlossen. 18 Std. später wird die Autopsie durchgeführt und ein Verhältnis von Volumen (ml) zur
Länge (cm) bestimmt.
In vitro Test mit Adenylatcyclase-Präparationen des
Katzenherzen
Die Herstellung der Adenylatcyclase-Präparationen wird nach der Methode von G.S. Levy [Levy G.S. und Epstein E., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33/990-995 (1968) und 38/86-92 (1970)] durchgeführt. Die Aktivierung der Adenylatcyclase durch Enterotoxin wird mit einem Radioisotopenverdünnungstest bestimmt [Gilman A.G., Proc.
Nat. Acad. Sci. 67/305-312 (1970)]. 5'-Adenylylimidodiphosphat (AMP-PNP) wird als Substrat eingesetzt und vor seiner Verwendung durch einen Durchgang durch eine Säule mit Dowex 50x2 in der Form gereinigt. Das Reaktionsmedium besteht aus 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH von 7,4,5 mM MgCl2, 10 mM Theophyllin, 0,1% Rinderserumalbumin und 2 mM AMP-PNP. Das Inkubationsvolumen beträgt insgesamt 0,1 ml und die Enzymkonzentration 0,15 mg Protein pro Prüfung. Die Inkubation wird durch Zugabe des Enzyms begonnen und 30 Minuten bei 370C durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktion werden 500 Ill 7,5Wo iger Trichloressigsäure zugesetzt und die Mischung 10 Minuten bei 4 C gehalten.
Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und das überstehende Material zu 5 ml mit Wasser gesättigtem Äthyläther gegeben.
Die Schichten werden durch Zentrifugieren getrennt und die Ätherphase wird entfernt. Nach insgesamt dreimaliger Ätherextraktion wird die wässrige Lösung bei 60-700C am Wasserbad mit einem Luftstrom zur Trockene gebracht. Der
Rückstand wird in 1 ml 0,2 M Acetatpuffer von pH = 4,0 gelöst. Die Menge gebildetes cyclisches AMP (Adenosinmonophosphat), ein direktes Mass für die Höhe der Akti vierung der Adenylatcyclase durch Colienterotoxin, wird mittels des eingangs beschriebenen Tests bestimmt.
Analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
Zum analytischen Studium der Proteine in verschiedenen
Stadien der Reinigung des Colienterotoxins wird entspre chend der Methode von L. Ornstein [Ann. N. Y. Acad. Sci.
121/321(1964)] und B.J. Davies [Ann. N. Y. Acad. Sci.
121/404 (1964)] Discgelelektrophorese angewendet. Für diese Elektrophorese werden vernetzte Polyacrylamidgele (5%) bei einem pH von 8,9 und Tris-glycin-Puffer eingesetzt. Der Puffer, der 50% Sucrose und 10- M 2-Mercapto äthanol enthält, wird über das Gel und darüber die Probe, die in 25% Sucrose und 10-3 M 2-Mercaptoäthanol enthaltenden Puffer gelöst ist, geschichtet. 2-Mercaptoäthanol ist auch in beiden (oberen und unteren) Puffern für die Elektrophorese enthalten. Als Farbstoff wird Bromphenolblau verwendet und die Elektrophorese wird 2?t Stunden bei Raumtemperatur und 1,5 ma per Gel durchgeführt. Nach der Elektrophorese werden die Proteine durch Inkubation der Gele 18 Stunden in 20% Sulfosalicylsäure ausgefällt.
Dann werden die Gele 4 Stunden in eine frisch bereitete Lösung von 0,02% Coomassie brillant Blau R 250 in 12,5%iger Trichloressigsäure getaucht, die Farblösung abdekantiert, 10%ige Trichloressigsäure zugesetzt und die Gele in dieser leicht bläulichen Lösung liegen gelassen, wodurch die Anfärbung intensiviert wird. Die angefärbten Gele werden fotografiert [A. Chrambach, R.A. Reisfeld, M. Wyckoff und J. Zaccari, Ann. Biochem. 20/150 (1967)].
Diese Gelelektrophorese kann auch in 8 M Harnstoff ausgeführt werden. Das Colienterotoxin wird mit 10 mM 2-Mercaptoäthanol, 10 mM Äthylendiamintetraacetat, 0,1 M Tris-chlorid-Puffer (pH = 9,0) und 8 M Harnstoff behandelt. Die Polyacrylamidgele werden in Gegenwart von 8 M Harnstoff hergestellt, sonst verfährt man analog wie oben beschrieben.
Polyacrylamid Gelelektrophorese in Natriumdodecyl- sulfat:
Polyacrylamid Gelelektrophorese in 0,1 % Natriumdodecylsulfat wird bei einem pH von 7,2 in 7,5% Acrylamid entsprechend der Methode von A.L. Shapiro, E. Vinuela, J. Maizel [Biochem. Biophys. Res. Commun. 28/215 (1967)] und K. Weber, M. Osborn [J.B.C. 244/4406 (1969)] ausgeführt.
Folgende Proteine werden als Standard verwendet: Trypsinogen aus Rinderpankreas (Molekulargewicht der Pols peptidkette = 2,4 104), Laktatdehydrogenase aus Rinderherzen (3,6 10) Rinderserumalbumin (6,8 Phosphorylase aus Kaninchenmuskeln (9,4 10) und E.coli -ss-Galaktosidase (1,3 -105).
Zunächst wird eine 1 %ige Lösung der Probe in Natriumdodecylphosphat und 2-Mercaptoäthanol 3 Minuten lang gekocht, um die Möglichkeit eines proteolytischen Abbaus zu verhindern. Die Proben werden gegen eine Lösung, bestehend aus 0,1 % Natriumdodecylphosphat und 2-Mercaptoäthanol, 0,01 M Natriumphosphat, pH = 7,1 dialysiert. Die Vergleichsproteine werden in gleicher Weise behandelt.
Molekulargewichtsbestimmung durch Gelfiltration:
Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Colienterotoxin, besonders aus Stamm P263, wird die Methode der Gelfiltration angewendet. Eine Sephadex G-150 Säule wird nach der Methode von P. Andrews [Biochem. J. 96/595 (1965)] unter Verwendung von Pferdeherzcytochrom C (MG 1,3 104), Rinderpankreaschymotrypsnogen A (2,4 104), Hühnereiweiss (4,5 104), Rinderserumalbumin (6,8 104), Kaninchenmuskelaldolase (1,47 10) und Rinderlebercatalase (2,2 10 dalton) als Vergleichsproteine kalibriert. Die Protein werden mittels ihrer Transmission bei 280 m messend erfasst.
Weiters wird zur Erstellung der Eichkurve tritiertes Wasser (1,11 104 dpm) messend erfasst durch Flüssigkeitsszintillation, sowie eine gesättigte Lösung von Blue Dextran, dessen optische Dichte bei 620 mp als Nachweis wird.
Die Sephadex-Säule ist mit 50 mM tris-chlorid, pH = 7,5, 100 mM KCI und 0,01 M 2-Mercaptoäthanol equilibriert. Alle oben genannten Substanzen werden in einem totalen Volumen von 0,7 ml auf die Säule aufgetragen und in 0,9 ml Fraktionen eluiert. Das Experiment wird bei 4 C durchgeführt.
Isoelektrische Fokussierung in einem Sucrosedichte gradienten:
Zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes für das gereinigte Enterotoxin wird zur isoelektrischen Fokussierung eine Glaskolonne (Typ 8100, 110 ml) nach der Methode von Versterberg 0. und Svensson H. [Chem. Scand.
20/820 (1966)] verwendet. Der Anodenelektrolyt (Phosphorsäure) befindet sich am Boden der Apparatur. Der Ampholine carrier Ampholyte umfasst einen pH-Bereich von 3 bis
10. Die optische Dichte wird bei 280 mm gemessen und zwar wird die Säule durch die Messzelle eines Uvicord II UV-Absorptiometers entleers. Der isoelektrische Punkt wird bei 4 C durch Messung des pH der eluierten Fraktionen mit einer kombinierten Mikroelektrode bestimmt.
Isoelektrische Fokussierung in Dünnschicht-Polyacryl- amidgel:
Enterotoxin wird an einer 5% Polyacrylamidgelplatte [entsprechend Z.L. Awdeh et al.: Nature (London) 219/66 (1968) modifiziert, nach J. Bours & van Doorenmaalen W.J.: Science Tools 17/36 (1970)] isofokussiert. Es wird ein Polyacrylamidgel von 26 X 12,5 cm und. 1 mm Dicke hergestellt mit einer Endkonzentration von 2% Ampholine carrier Ampholytes mit einem pH-Bereich von 3 - 5, 5 - 7 und 7 - 10 im Verhältnis 1 1:1:1. 1 zu 1 Das Gel wird 2 Stun- den mit Riboflavin als Fotokatalysator polymerisiert. 10 bis 25 1ll einer 0,1 %igen Lösung des Proteins in 2% Ampholine, pH 3 - 10, werden auf 10 X 5 mm Whatman 2 MM Papierstreifen, die auf das Gel gelegt werden, aufgebracht.
Die isoelektrische Fokussierung wird bei 10 C in einem Elektrophoreseapparat durchgeführt. Bevor die Gelplatten an den Elektroden befestigt werden, werden die Elektroden mit 0,5 x 25 cm Filterpapierstreifen, die mit 0,1% (Vol/ Vol.) Äthylendiaminlösung (Kathode) befeuchtet sind, bedeckt. Der Anfangstrom besitzt 50 mA (und wird auf 28 mA vermindert) während 2,5 Stunden bei 210 Volt (auf 1080 V steigend). Der pH-Gradient wird mit einer kombinierten Mikrooberflächenelektrode bestimmt. Nach der Isofokussierung werden die Proteine mit 14%iger Trichloressigsäure bei 60 C gefällt. Dann wird das Gel bei Zimmertemperatur mit 10%, 5% und 3%iger Trichloressigsäure 24 Stunden gewaschen, um den carrier Ampholyte zu entfernen.
Das Gel wird dann mit einer 0,05%igen Lösung von Coomassie brillant Blau R-250 (gelöst in Methanol/Essigsäure/Wasser = 45/9/46) 2 Stunden angefärbt und anschliessend mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen. Zum Quellen wird das Gel in ein Essigsäure-Wasser-Gemisch (9 : 91) gegeben und dann fotografiert.
Der Einfluss des pH-Wertes auf das Colienterotoxin:
Je 6 mg Mengen von Colienterotoxin werden in je 24 ml Tyrode Lösung in je 6 Teströhrchen abgefüllt. Der Inhalt der Röhrchen wird mit konzentrierter HCI oder 6 N NaOH auf pH 1, 3, 5, 6, 7 und 9 eingestellt. Die Teströhrchen werden 4 Stunden bei 4 C inkubiert und jedes Röhrchen nachher auf pH 7 eingestellt. Der Inhalt jedes Teströhrchens wird sowohl im Kaninchendarmschlingentest als auch im Schweinedarmschlingentest zu 2 ml (0,5 mg) per Darmschlinge untersucht.
Es zeigt sich, dass die enterotoxische Aktivität höchst säurelabil ist. Die Aktivität wird bereits ab pH 6 deutlich beeinflusst und ist ab pH vollständig zerstört.
Der Einfluss von Hitze auf das Colienterotoxin:
Mengen von je 5 mg des gereinigten Colienterotoxins, besonders aus Stamm P263 oder Stamm H19 werden mit je 20 mit Tyrodelösung aufgenommen und 30 Minuten lang auf 40, 50, 60, 65, 70 bzw. 100 C erhitzt. Die erhitzten Lösungen werden mit einer unbehandelten Lösung als Kontrolle sowohl im Kaninchendarmschlingentest als auch im Schweinedarmschlingentest untersucht. Es werden pro Darmschlinge 2 ml (0,5 mg) verabreicht.
Die biologische Aktivität des Colienterotoxins wird durch 30 Minuten langes Erhitzen auf 65 C vollständig zerstört. Die Hitzelabilität des Materials zeigt sich schon bei 500C, die vollständige Zerstörung der Aktivität tritt meist schon ab 60 C ein.
Physicochemische Eigenschaften:
Das Molekulargewicht des Colienterotoxins P263 kann mittels Sephadex-Gelfiltration [Andrews P.: Biochem. J. 96/ 595 (1965)] oder auch mittels NaDS-Gelelektrophorese [Weber K. und Osborn M.: J. Biol. Chem. 224/4406 (1969)] bestimmt werden. Es beträgt nach der ersten Methode 102 000 dalton, nach der zweiten 102 000 - 105 000.
S 20sw X 1013 (sec): 5,4
E 10/5 280 nm, 0,1 M (NH4)HCO3 pH 8,0: 11,6 PI: 6,95
Lipid < I %
Hexose < 1%
Biologische Aktivitäten von Colienterotoxin:
In den verschiedenen Testsystemen tritt bei folgenden Minimaldosen ein erkennbarer Effekt auf: Testsystem Minimaldosis Kaninchendarmschlingentest 0,5 ltg Schweinedarmschlingentest 0,5 ug Hauttest, erwachsene Kaninchen 0,05-0,1 g Fettzell-Lipasetest 0,2 g Adenylatcyclasetest aus Katzenherzengewebe 0,2 tjg
Beziehung zwischen hitzelabilem und hitzestabilem
Colienterotoxin:
:
Der Substanzpeak, der bei etwa 220 ml bei Verwendung einer Bio Gel-A-5 m-Säule (2,5 x 100 cm) eluiert, was einem Molekulargewichtsbereich von 106 dalton entspricht, enthält hitzestabile Aktivität. Dieses Material zeigt im Phenol-Schwefelsäure-Test [Dubois M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers und F. Smith: Anal. Chem. 28/350 (1961)] auf Karbohydrate, sowie im E-Toxate-Test (Limulus Amebocyte Lysate) auf Endotoxin [Levin I., Poore T.E., Zauber N.P. und Oser R.S.: New England Journ. of Med. 283/1313 (1970)] hoch positive Reaktion.
Zur Aufklärung der Natur dieser hitzestabilen Aktivität wird das lyophilisierte Material mit einer 0,1 M (NH4)HCO3- Lösung, pH = 8,0, 1% O/o Natriumdodecylsulfat, aufgenom- men und auf einer Bio-Gel A-5 m Säule (2,5 X 80 cm), die mit derselben Pufferlösung äquilibriert worden ist, aufgetrennt. Bei Verwendung dieser Säule mit einem Gesamtschichtvolumen vom 400 ml und dem Leervolumen von 155 ml eluieren 4 UV-positive Substanzpeaks und zwar bei 170 ml, 280 ml, 350 ml und 390 ml.
Das Material aus den 4 Substanzpeaks wird gesondert nachstehender Behandlung zur Entfernung von SDS und Renaturierung aus einer Harnstofflösung unterworfen [Weber K., D.J. Kuter: J. Biol. Chem. 246/4504 (1971)]:
Die Proteinlösungen werden durch Zugabe von festem Harnstoff auf 6 Molar in Harnstoff gebracht und 30 Minuten inkubiert, hierauf wird gegen Pufferlösung A (0,05 M Trisazetat pH 7,8, 6 M in Harnstoff) dialysiert. Das Natriumdodecylsulfat wird auf einer Säule aus Dowex 1 X 2, äquilibriert mit Puffer A, entfernt. Die Entwicklung der Säule erfolgt mit derselben Pufferlösung. Die Rekonstitution der Proteine aus der Harnstofflösung erfolgt bei Zimmertemperatur durch tropfenweise Verdünnung in einen 0,05 M Tris-Acetat-Puffer pH 7,8, so dass die Endverdünnung mindestens 10fach ist.
Die Lösung wird hierauf bei 4"C über Diaflo UM 10 Filter in einer Amicon-Zelle konzentriert und gegen den 0,05 m Tris-Acetat-Puffer pH 7,8 in der Kälte dialysiert, um Reste von Harnstoff zu entfernen. Die Proteinkonzentration wurde nach Lowry bestimmt.
Nach dieser Behandlung werden die Materialien aus den Substanzpeaks I - IV den üblichen Testen auf enterotoxische Aktivität, und dem E-Toxate-Test auf Endotoxin unter,vor- fen. Nur das Proteinmaterial aus Peak II zeigt enterotoxische Aktivität, das aber nun die typischen hitzelabilen Eigenschaften aufweist. Dieses Material ist frei von Endotoxin.
Der Substanzpeak I zeigt keine enterotoxische Aktivität und kann mittels des E-Toxate-Tests als stark endotoxinhältig erkannt werden. Peak III und IV zeigen keine wie immer geartete Aktivität und sind frei von Endotoxin. Wird das Material aus Peak II den bereits beschriebenen Reinigungsmethoden für die Darstellung des Colienterotoxins unterworfen, so wird daraus ein Material isoliert, das in seinen biologischen und physicochemischen Eigenschaften dem hitzelabilen Colienterotoxin gleich. Wird das renaturierte hitzelabile Material mit einem Überschuss des endotoxinhältigen Materials aus Substanzpeak I inkubiert, so weist dieses Material in allen Testsystemen auf Colienterotoxin wiederum die typischen hitzestabilen Merkmale auf.
Antiserum:
Monospezifisches E.coli Antitoxin von Ziegen wird gegen das reine E.coli Enterotoxin des schweinepathogenen Stammes P263 wie nachstehend beschrieben hergestellt:
2 Volumenteile einer 0,5% Lösung des Antigens in 0,5% Natriumbikarbonat werden mit Volumenteilen einer Aluminiumhydroxid-Suspension (Trockengewicht 15 mg/ml) vermischt und mindestens 1 Stunde bei 4"C gehalten. Die Suspension des adsorbierten Antigens wird mit 6 Volumenteilen kompletten Freund'schen Adjuvans unter tropfenweiser Zugabe und starkem Rühren emulgiert.
Den Ziegen werden beidseitig entlang der Wirbelsäule
10 mal je 0,1 ml der oben beschriebenen Emulsion pro Seite subkutan, in der Kniefalte der Vorder- und Hinter beine beidseitig an je 4 Stellen je 0,1 ml subkutan und in die Oberschenkelrückseite der Vorder- und Hinterbeine tief intramuskulär je 1 mal 1,25 ml injiziert. Nach 6 Wochen wird die gleiche Menge des Antigens in derselben Zusam mensetzung der Emulsion tief intramuskulär gespritzt, wäh rend die 2. Hälfte der Menge beidseitig in der Höhe der
Lymphknoten gespritzt wird. Nach weiteren 4 bis 6 Wochen wird das Blut zur Bestimmung der Antikörperkonzentration im Serum entnommen.
Passiver Hämagglutinations Mikrotest (PHA-Test):
Hühnerblut wird in steriler, 5 % iger Natriumcitratlösung aufgenommen und zentrifugiert. Die überstehende Flüssig keit wird entfernt und mit steriler modifizierter Alseverlösung ersetzt. Diese Präparation wird im Kühlschrank aufbewahrt. Die Zellen können bis zum Auftreten von Hämolyse verwendet werden. Vor Verwendung werden die Zellen viermal mit Difco HA-Puffer pH 7,2 gewaschen (35 ml Puffer/ml abgesetzter Zellen). Die Zellen werden wiederum suspendiert und auf eine Endkonzentration von 2,5% in oben genanntem Puffer aufgenommen. Hierauf wird mit einem gleichen Volumen von Gerbsäure (Verhältnis 1: 20 000) versetzt.
Nach einer Inkubation im Wasserbad bei 370C 10 Minuten, werden die Zellen zweimal mit 5 ml eines 0,15 M PBS-Puffer, pH 6,4, gewaschen und dann zu einer Endkonzentration von 2,5 % im selben Puffer resuspendiert.
Gereinigtes Colienterotoxin wird zu 10 pg/ml mit dem PBS-Puffer verdünnt, im selben Volumenverhältnis mit den mit Gerbsäure behandelten Zellen vermischt und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert. Hierauf wird zentrifugiert, der Überstand verworfen und die abgesetzten Zellen zweimal mit je 10 ml 1 %igen voradsorbiertem Ziegennormalserum in DIFCO HA pH 7,2-Puffer gewaschen. Die Zellen werden zu 0,5% im Ziegennormalserum resuspendiert und zur Verwendung bereitgestellt. Das Ziegennormalserum wird wie folgt zubereitet:
Das Ziegenserum wird 30 Minuten auf 560C erhitzt und hierauf mit Hühnererythrocyten zweimal adsorbiert (1 ml Serum + Zellen von 4 ml einer 2,5%igen Suspension, 10 Minuten bei Raumtemperatur). Hierauf wird durch Millipore-Filter (Millipore Corp., Bedford, Mass.
USA) filtriert und eingefroren aufbewahrt. Die 1 %ige Lösung des Ziegennormalserums wird am Tag der Verwendung zubereitet. Vor Einsatz in den Test werden die unbekannten Sera mit Ziegennormalserum 1: 5 verdünnt, bei 500C 30 Minuten inaktiviert und hierauf mit den abgesetzten Zellen aus 3 ml einer 2,5tigen Hühnererythrocyten-Suspension durch Inkubation unter Schütteln bei Zimmertemperatur über 30 Minuten adsorbiert. Für den Test werden Microtiter U Platten verwendet. 25 sul des Ziegennormalserums werden in die Vertiefungen 2 - 12 einpipettiert. 25 p1 einer 1: 5 Verdünnung des unbekannten Serums wird zu Vertiefung 1 und 2 gegeben und hierauf mit einer Microtiter-Verdünnungspipette serienmässig verdünnt.
Die vorsensitivierten Zellen, und zwar 25 111 einer 0,5 % igen Suspension werden dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die endgültige Ablesung wird nach Inkubation über Nacht vorgenommen. Die höchste Verdünnug des Serums, welche eine eindeutige Änderung des abgesetzten Knopfmusters der nicht agglutinierten Zellen hervorruft, wird als Endpunkt betrachtet.
Bentonit-Flokkulations Mikrotest (SBF-Test):
Die Bentonit-Vorratssuspension wird 0,5 g Bentonit (Wyoming Grade, Central Scientific So., Chicago, III), aufgenommen in 100 ml destilliertes Wasser wie nachstehend beschrieben zubereitet:
Die Suspension wird zweimal 10 Minuten in einem Waring Blender (Mixer) homogenisiert, hierauf in einem 500 ml mit Glasstopfen versehenen Zylinder abgefüllt und zum Absetzen stehengelassen. Der'Überstand wird abgeschüttet und bei 500 X g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der neuerliche Überstand wird nochmals bei 750 X g zentrifugiert, diesmal wird der Überstand verworfen. Das Sediment wird in 100 ml destilliertem Wasser resuspendiert und in einem Mixer 10 Minuten homogenisiert, unter Kühlung aufbewahrt und dient für weitere Versuche als Vorratslösung.
Die Suspension hat eine optische Dichte von 0,5 bei 250 nm. Für die Sensitivierung mit Colienterotoxin wird die Vorratslösung aufgeschüttelt, 5 ml der Vorratslösung bei 3 000 X g
10 Minuten lang zentrifugiert und die abgesetzten Partikeln in 1 ml 0,15 M PBS, pH 6,4-Puffer, resuspendiert. Hierauf wird dasselbe Volumen von 300 pg Antigen in PBS hinzugefügt. Die Mischung wird unter gelegentlichem Schütteln 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Sie wird hierauf bei 3 000 X g zentrifugiert, der Überstand wird verworfen und das Sediment wird in 10 ml einer 140igen Ziegennormalserum-Pufferlösung (DIFCO HA-Puffer pH 7,2) resuspendiert. Die Mischung wird nochmals zentrifugiert und das Sediment in 5 ml der 1 %igen Ziegennormalserum-Pufferlösung aufgenommen.
I ml einer 0,1 %igen Methylenblaulösung (aufgenommen in destilliertem Wasser) wird zu den Partikeln zwecks Anfärbung hinzugegeben. Hierauf wird zentrifugiert, zweimal mit 10 ml Ziegennormalserum-Pufferlösung gewaschen und in selbiger Lösung resuspendiert. Der Microtiter-test wird im wesentlichen ausgeführt wie im vorgehenden Abschnitt beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Testsera nicht präadsorbiert werden. Als Titer wird die höchste Verdünnung des Serums erkannt, welche das klare Auftreten einer Agglutination zeigt.
Nachweis der immunologischen Identität, bzw.
Kreuzimmunität
Der E.coli-Stamm P155, Serotype 0 149: K9l, K88a,c oder der gefriergetrocknete humanpathogene E.coli Stamm H10407 sowie der Ent E.coli Stamm K12 und Ent- E.coli Stamm Kl2 wird wie unter Herstellung des Colienterotoxins beschrieben, verwendet, um einen zellfreien Fermentationsüberstand zu gewinnen. Dieser Fermentationsüberstand dient jeweils als Probe mit unbekannter Zusammensetzung von Antigen Ag-X. Die Identifizierung und Quantifizierung wird mittels eines Referenzantigens, Ref-Ag (das reine E.coli Enterotoxin vom Stamm 263 bzw. vom Stamm H19), und eines Referenzantiserums, Ref-Ab (monovalentes Antiserum gegen das Enterotoxin H l 9) durchgeführt.
Die beiden Fragen, ob Ag-X ein Antigen enthält, das identisch mit Ref-Ag ist und, falls dies zutrifft, wie die Konzentration dieses Antigens verglichen mit der bekannten Konzentration des Antigens Ref-Ag ist, können mittels Crossed lmmunoelectrophoresis (Clarke H.G.M und Freeman T.: Clin. Sci. 35/403, 1968) und Tandem Crossed Immunoelectrophoresis [Kroll J.: A Manual of Quantitative lmmunoelectrophoresis edit. N.H. Axelsen, J. Kroll, B. Weecke, Universitetsforlaget, Oslo, S. 57 (1973), Suppl.
1/1973, Scandinavian Journal of Immunology] beantwortet werden.
Die Abb. 1 zeigt ein Crossed lmmunoelectrophoresis Bild des Ref-Ag. entwickelt gegen Ref-Ab. Es tritt nur ein Präzipitat auf.
In Abb. 2 wurde Ag-X anstatt Ref-Ag verwendet. Aufgrund der Position des Präzipitats in Abb. 2 kann angenommen werden, dass Ag-X ein Antigen enthält, das identisch ist mit Ref-Ag. Diese Annahme kann noch erhärtet werden durch die Reaktion der Identität mittels fusing precipi tates .
Dieses Experiment wird mit Hilfe der tandem crossed immunoelectrophoresis durchgeführt (Abb. 3).
Durch Vergleich der Abb. 3 mit Abb. 1 kann gezeigt werden, dass Ag-X das Ref-Ag enthält und dass die Konzentration dieses Antigens im Ag-X geringer ist als im Ref Ag. Die Quantifizierung des konfluierenden peaks erfolgt nach einer Standardmethode [J. Kroll: J. clin. Lab. Invest.
22/112(1968)].
Wird für Ag-X in dieser Versuchsanordnung der Kulturmedienüberstand des Ent- E.coli K12 Stammes verwendet, so tritt in Abb. 2 kein Präzipitat auf. Dieses Resultat bekräftigt die Aussage, dass das in Abb. 2 auftretende Präzipitat dem Enterotoxin pathogener E.coli Stämme zuzuordnen ist.
Dieselbe Versuchsanordnung wird vorgenommen, um die immunologische Identität bzw. Kreuzimmunität zwischen humanpathogenem und schweinepathogenem E.coli Enterotoxin festzustellen. In diesem Versuch dient als Ref-Ag das reine E.coli Enterotoxin vom schweinepathogenen E.coli Stamm P263, als Referenzantiserum Ref-Ab das monovalente Antiserum gegen das Enterotoxin P263. Das humanpathogene Enterotoxin H 19 dient als Probe mit unbekannter Zusammensetzung von Antigen Ag-X. Wie obenstehend bereits in Abb. 2 beschrieben, tritt auch hier im Bild einer Crossed Immunoelectrophoresis des Ag-X, entwickelt gegen Ref-Ab, nur ein Präzipitat an der identen Stelle wie in Abb. 1 auf. Aufgrund der Position des Präzipitats kann angenommen werden, dass Ag-X ein Antigen enthält, das identisch ist mit Ref-Ag.
Die Reaktion der Identität mittels fusing precipitates unter Anwendung der tandem crossed immunoelectrophoresis zeigt (Abb. 3), dass Ag-X und Ref-Ag serologisch ident sind. Somit ergibt sich die Möglichkeit, wahlweise das humanpathogene oder schweinepathogene Colienterotoxin als Antigen zur Immunisierung bzw. zur Präparation eines Toxoids zu verwenden.
Unter Beibehaltung der identen Versuchsanordnung wird untersucht, ob zwischen E.coli Enterotoxin und V.cholerae Enterotoxin eine vollständige bzw. partielle immunologische Identität besteht. Als Ref-Ag dient das reine E.coli Enterotoxin vom schweinepathogenen E.coli Stamm P263, als Ref-Ab wird das E.coli P263 Antitoxin verwendet und als Antigenprobe Ag-X wird reines V.cholerae Toxin eingesetzt.
Die Abb. 4 zeigt wieder ein Crossed Immunophoresis Bild des Ref-Ag, entwickelt gegen das Ref-Ab. Es tritt, wie bereits gezeigt, nur ein Präzipitat auf.
In Abb. 5 wird Ag-X anstatt Ref-Ag verwendet. Es tritt wieder eine Präzipitatlinie, aber in Position und Form verschieden mit dem Präzipitat aus Abb. 4 auf.
Wird nun die Technik der tandem crossed immunelectrophoresis durchgeführt, so wird das Präzipitationsbild der Abb. 6 erhalten, woraus auf eine deutliche partielle Identität der Antigene Ref-Ag (E.coli Enterotoxin) und Ag-X (V.cholerae Enterotoxin) geschlossen werden kann.
Aktive Immunisirrung:
Zuchtsauen werden künstlich besamt und ein Monat vor dem voraussichtlichen Wurftermin das erste Mal immunisiert: 0,95 mg gereinigtes Colienterotoxin werden zusammen mit 15 ml komplettem Freund'schen Adjuvans (7,5 ml Adjuvans + 7,5 ml NaC1-Puffer 0,05 M, 10 2 M 3-Mercaptoäthanol) i.m. gegeben. Nach 2 Wochen werden 0,35 mg Colienterotoxin in 5 ml 0,9% NaC1-Lösung i.v.
gegeben.
Da die serologische Identität zwischen humanpathogenem und schweinepathogenem Colienterotoxin gegeben ist, kann zur Immunisierung wahlweise H19 oder P263 Colienterotoxin verwendet werden.
Bestimmung von Kolostrum und Serumantikörpern in immunisierten Zuchtsauen:
Nach dem Abferkeln der wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben immunisierten Zuchtsauen wird 6, 12 und 24 Stunden später Kolostrum abgesaugt und gesammelt. 56 Stunden nach dem Wurftermin wird der Zuchtsau Blue zur Gewinnung von Serum entnommen.
Die Bestimmung der Antikörpertiter erfolgt mit dem Bentonit-Flokkulations-Mikrotest (SBF-Test) und ergibt folgende Resultate:
Zeit Titer
Kolostrum 6h 1: 512
12h 1:512
24h 1: 64
Serum 1: 64
Ein 1 : 2 verdünntes Schweineserum wird zu Neutralisationsstudien in den Kaninchendarmschlingentest eingesetzt.
Bei Einsatz einer Toxindosis von 0,25 mg/Darmschlinge (d.h. =3 Toxin Units) wird mehr als 60%ige Hemmung erreicht. Entsprechende Versuche mit Kolostrum (Abnahmezeitpunkt 616 post partem) zeigen im Kaninchenmodell eine vollständige Neutralisierung der Toxinwirkung.
Als 1 Toxin Unit wird die effektive Dosis 50 für Enterosorption in Darmschlingentest, oder die ED20 für Adenylatcyclasestimulierung im Adenylat-Cyclase-System definiert.
Präparation des Toxoids - Detoxifizierung mit GlutaraldeSlyd:
Um optimale Bedingungen für die Inaktivierung zu erzielen, wird bei Zugrundelegung eines Molekulargewichtes von 102 000 für das Toxinmolekül die Konzentration des Glutaraldehyds anfänglich zwischen 50 und 1000 Mole/Mol Toxin variiert. Die Reaktion wird in einem Konzentrationsbereich von 100 bis 1000 sug/ml Toxin, bei 30"C in einem 0,065 M PBS-Puffer pH 7,8 bei unterschiedlicher Inkubationszeit durchgeführt. Die Reaktionen werden durch zweimaliges Dialysieren gegen das 100fache Volumen PBS Puffer pH 7,8 abgestoppt. Bei Verwendung einer Toxinkonzentration von über 600 pg/ml beginnt das Reaktionsprodukt mit steigender Glutaraldehydkonzentration unlöslich zu werden.
Wird die Toxinkonzentration zwischen 100 und 600 Sg/ml gehalten und die Glutaraldehydkonzentration zwischen 50 und 400 Mole/Mol Toxin variiert, bleibt das Reaktionsprodukt in löslicher Form.
Der Adenylatcyclase-Test zeigt, dass optimale Detoxifizierung im pH-Bereich 7,8 bis 8,2 erfolgt. Wird die Toxinkonzentration zwischen 400 und 600 ,ng/ml gewählt, so nimmt die Resttoxizität (gemessen nach Inkubation über 72 Stunden bei 39"C) um das 1 0fach ab bei zweifachem Anstieg der Glutaraldehydkonzentration zwischen 50 und 200 Mole/Mol Toxin. Wird die Glutaraldehydkonzentration von 200 auf 400 Mole/Mol Toxin erhöht, so ist die Restaktivität auch mit den empfindlichsten Testmethoden (Adenylatcyclase-Test) nicht feststellbar.
Toxid Units:
Um Präparationen des inaktivierten Colienterotoxins (Toxoid) quantitativ zu erfassen, wurden Toxoid Units (TU) entsprechend der Methode nach Craig [Craig, J.P.: 1971, Cholera toxins p. 189-254 in S. Kadis, C. Montie und S.
Ajl (ed.) Microbial toxins, Vol. 2 Academic Press Inc., New York] bestimmt. Diese Bestimmung basiert auf der Fähigkeit des Toxins, mit dem Antitoxin in vitro zu reagieren. Der Test bestimmt die Abnahme des Neutralisationsvermögens einer bekannten Menge des Antitoxins, nachdem mit Toxoid inkubiert wird. Eine Reihe von Teströhrchen, die dasselbe Volumen des Antitoxins (2AU/ml) und eine entsprechende Verdünnung des Toxoids enthalten, werden bei 37"C 30 Minuten inkubiert. Eine andere Serie von Teströhrchen dient als Kontrolle, wobei zum selben Volumen des Antitoxins (2AU/ml) Puffer gegeben und unter denselben Bedingungen inkubiert wird.
Nach der Inkubation werden idente Volumina einer 0,15 log Serienverdünnung des Toxins zu den Teströhrchen gegeben und die Bestimmung wird mit dem Adenylatcyclase-Test ausgeführt, wie er zur Ermittlung der neutralisierenden Antikörper bereits beschrie ben wurde.
Die Verschiebung des 50%-Wertes in der Dosis-Wirkungskurve wird dazu benützt, um die Menge von freiem und gebundenem Antitoxin im Antitoxin-Toxoid-Gemisch zu bestimmen. 1 TU ist die Menge Toxoid, die 1 AU des Antitoxins bindet.
Titration des Antitoxintiters in immunen Ziegenseren:
Ziegen werden wie obenstehend beschrieben mit verschiedenen Präparationen von Toxoid immunisiert und der Antitoxintiter mit dem Adenylatcyclase-Test bestimmt.
In vitro Revertierwlgstest:
Proben des Toxoids (2 bis 5 ml) werden in 0,065 M PBS-Puffer pH 7,8 in Gegenwart von 0,01% Thiomerosal bei 37"C 2 Wochen lang inkubiert, ehe auf Toxinaktivität mit dem Adenylatcyclose-Test geprüft wird. Kontrollproben wurden bei 4"C gehalten und parallel getestet.
In vivo Revertierungstest:
Die eventuelle Entwicklung von Toxinaktivität wird mit dem Kaninchenhaut-Test nach Craig (Craig, J.P., Eidmer, E. R., Harnich, R.B., 1972 J. Infect. Dis. 125/213-215) über eine Zeitspanne von 2 Wochen verfolgt. Zweierschrittverdünnungen von Toxin als Kontrolle und Toxoid werden intracutan in den Rücken von New Zealand Albinokaninchen injiziert und der Durchmesser der Quaddelbildung täglich 2 Wochen lang verfolgt. Die Ergebnisse werden graphisch als Anstieg oder Abnahme der Quaddeldurchmesser mit der Zeit erfasst.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIM
Process for the preparation of coli terotoxin, characterized in that enterotoxin-forming E. coli strains are cultivated and the enterotoxin formed in the cell filtrate is subjected to pure presentation of the isotachophoresis.
Coli infections in animals, especially in young animals such as piglets, calves and lambs, are among the most important diseases in the rearing of pets. The coli infections in pigs mainly occur in connection with disorders on the part of the intestinal tract, especially in newborn piglets and weaners.
There is a mass increase in certain serotypes of hemolytic coli bacteria. Recent studies have shown that an enterotoxin produced by certain coli strains, the coli terotoxin, triggers the symptoms of the disease.
Human coli infections are thought to be responsible for infant enteritis, most forms of traveler's disease and acute tropical diarrhea.
So far, these coli infections have been combated either with colivacins or antibiotics or chemotherapy drugs. The colivacins are principally directed against certain serotypes of E. coli, but not against their exotoxins. So they only impart an antibacterial, but not an antitoxic protective effect. Likewise, the antibiotics or chemotherapeutics recommended for the treatment of coli infections only work against the germs, not against their toxins. In addition, the occasional antibiotic resistance of many pathogenic E. coli germs complicates the treatment. It has therefore not been possible to combat the diseases effectively.
The ability to produce colonic terotoxin is determined by a plasmid that can be transferred from one pathogenic E. coli strain to other non-pathogenic by conjugation. The observed occurrence of new enteropathogenic serotypes is thus understandable. Obviously, those E.coli serotypes recognized as new enteropathogenic strains are good receptors for plasmids. This opinion also explains the appearance of multiple antibiotic resistance among the enteropathogenic E. coli strains, since R factors are transmitted by the same mechanism as enterotoxin plasmids.
In view of the transmission by plasmids, specific antibacterial immunoprophylaxis makes little sense. The same applies to chemotherapy treatment.
The enteropathogenic E. coli strains are characterized by the
Ability to reproduce in the jejunum and cause water and electrolytes to move through the intact intestinal epithelium into the intestinal tract, with neither local nor systematic invasion of the
Bacteria occurs.
This process is called enterosorption. Enterosorption is due to an exotoxin, coli terotoxin, produced by the coli strains.
The plasmid-controlled synthesis of two forms of enterotoxin, heat-labile (LT) and heat-stable (ST) toxin is described in the literature [Smith, H. W. and Gyles,
C. L .: J. Med. Microbiol. 3/387 (1970)]. The two enterotoxins differ in their heat stability, acid stability and molecular weight.
The following table gives an overview of the properties: Properties LT ST heat instability (60 "C, 10 min) + acid instability (pH <6) + antigenicity + sensitivity to neutralization with antiserum + + dialyzability - high molecular weight + + effectiveness in rabbit intestinal loops + + Efficacy in pig intestinal loops + + production, controlled by a plasmid + + Ability to induce diarrhea in pigs + +
It has now been shown that when the colonic terotoxin is used as the antigen in the vaccinated animal, antibodies occur in the serum and colostrum which protect the animals from the damaging effect of the colonic terotoxin.
Because newborns of farm animals can only ingest antibodies with the colostrum from the mother animal in the first hours or days after birth, it is important for their protection that this colostrum has a high content of specific antibodies. This can be achieved by repeated immunization of the mother animal with the appropriate enterotoxin of certain coli strains. This protection by maternal antibodies is required especially within the first few weeks of life, since infections of the young animals with enterotoxin-producing coli strains occur very frequently during this period and can lead to the death of the animals.
Another way of protecting young animals is to administer specific heterologous antibodies, e.g. in the form of a serum which can be obtained from animals immunized with colienterotoxin.
It is claimed in the literature. that the administration of antiserum is not a practical preventive measure against piglet disease. since the protection achieved by the administration of antisera is short-lived and moreover requires continuous administration [0. P. Miniats: Can. Vet. J. II / 52 (1970)]. This claim is only valid for the antisera against the O or the 0 and K antigen (antibacterial antibodies), whereas a monovalent antiserum against the enterotoxin can certainly provide protection.
Protection of infants and adults against diarrhea caused by colienterotoxin can be achieved in the following ways:
1. Maternal vaccination coupled with a vaccine program for the infant before the end of the passive one
Protection or 2. active immunization with toxoid in all other cases.
The prerequisite for the use of colienterotoxin for the immunization of the mother animal and protection of the young animals by colostrum as well as the passive administration of antiserum, which is obtained in another animal species
is the proof that the enterotoxins produced by different E. coli strains are immunologically identical or so far related that there is cross-immunity.
However, it is very likely that all E-coli strains are identical, since the ability to form coli terotoxin is apparently transmitted by plasmids. Another requirement is the development of a stable toxoid.
A practical application of cole terotoxin (or
Toxoids) as a component of vaccines and the answers to the questions just raised depends on the presentation of a pure colonic terotoxin.
The invention consists in that coli terotoxin is produced by cultivating enterotoxin-forming E. coli strains and subjecting the duck rotoxin formed in the cell filtrate to the pure presentation of the isotachophoresis.
The heat-labile E.coli enterotoxin has a number of characteristics in common with the V.cho lerae enterotoxin, with particular reference to a certain serological relationship between the two enterotoxins.
The V.cholerae enterotoxin could already be represented in its pure form and a comprehensive physico-chemical
Characterization was undertaken. The E.coli enterotoxin has so far not been purified, nor is there any information on molecular properties in the literature.
It has been shown that the purified E.coli enterotoxin can also be used for immunoprophylaxis against cholera. The prerequisite for using an E.coli enterotoxin or toxoid
Vaccine for immunoprophylaxis against cholera is the
Evidence that a serological relationship or
K, re-immunity between E. coli enterotoxin and V.cholerae
Enterotoxin exists.
The following were used to demonstrate these conditions
Experiments carried out.
Bacterial cultures:
There were three porcine E. coli strains
Strain P 263 Serotype 08: K87, K88ab: 19
Strain P 155 Serotype 0149: K91: 88a, c
Strain P 307 Serotype 08: K87 K88ab two human-strains
Strain H 10407 Serotype 078K:?
Strain H 19 Serotype 026: K60: H11 as well as a Ent- and an Ent + E.coli K12 strain, which the
The plasmid transferred from human-pathogenic H19 had been used.
The microorganism strains are known under the official names mentioned above and are freely accessible to the public and were obtained from:
National Animal Disease Laboratory, Animal Disease and parasite Division, Agricultural Research Service, United
States Department of Agriculture, Ames, Iowa, USA and
at University of Washington, School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology, SC-42, Seattle,
Washington 98195, USA.
Medium:
A trypticase soy broth medium can be used as the medium. The peptone water medium contains pro
Liter 17 g trypticase peptone, 3 g phyton peptone, 5 g NaCI,
2.5 g dextrose and 2.5 g K.HPO4 - 3H2O and has a pH of 7.3.
However, a modified medium can also be used, the composition of which is the same as described above, but the peptone is subjected to ultrafiltration through Diaflo PM-10 membranes (Amicon) before it is used. A 30% (w / v) solution of trypticase soy broth medium is ultrafiltered, the residue is discarded and the filtrate is used again. It is advantageous to use these relatively small peptone molecules instead of the crude product, since this facilitates the subsequent separation of the portion of the unchanged medium from the bacterial products in the raw cultures of E. coli.
Production of the cohen terotoxin:
A freeze-dried E.col strain, particularly strain 263, Serotype 08: K87, K88ab: H19 or Hl9, Serotype 026: K60: Hl 1, is taken up in water, spread on blood agar plates and cultivated for 12 hours at 37 ° C. Then, with Transfer cells from the surface of a platinum loop into a 1 liter Erlenmeyer flask containing 200 ml of the modified trypticase soy broth medium described above, which is on a rotating shaker, and the bacteria are cultured at 7OC for 4 hours.
Then a 2 liter culture is inoculated with it, which in turn is used after the middle of the logarithmic phase as the inoculation liquid for a 20 liter remote meter in which the medium is stirred at 500 / min and aerated with 10 liters / min of air. To prevent the solution from foaming, 1 ml of a 25% antifoam (w / v) is added. It is incubated for 9 hours at 37 ° C. Then the cells are harvested by centrifugation in a cooled ultracentrifuge at 40 ° C. The supernatant liquid is filtered through a 0.45 μm membrane filter and the filtrate is checked for sterility (by brushing a blood agar plate).
The sterile filtrate is desalted by treatment with an ion exchange resin, lyophilized and stored at 200 to 700C for further use.
Purification of the colonic terotoxin according to the invention by isotachophoresis
The prepurified colienterotoxin preparation obtained is subjected to the preparative isotachophoresis. For isotachophoretic separation, a vertical column electrophoresis apparatus with 3.3% polyacrylamide gel as the carrier material is used, e.g. after P.J. Svendsen and Carsten Rose (Science Tools, Vol. 17, No. 1, 1970, page 13). Only a buffered gel column is used and the ampholine carrier ampholytes are mixed with the protein sample and the terminator electrolyte (tris ± - aminocaproate buffer, pH = 8.9). The terminator electrolyte, which connects the system to the upper electrode (the cathode), is layered over the gel. Tris-sulfate buffer (pH = 7.1) is used as the elution electrolyte in the elution chamber in the lower electrode part (anode).
The buffer solution is connected to an external reservoir and is kept in circulation by an electrical, insulated pump. The sample mixed with the Tris-r-amino-caproat buffer is introduced into the column using a capillary. by piercing the tris ± aminocaproate buffer forming the upper layer.
In order to facilitate the introduction of the sample, 3% sucrose is added to increase the viscosity.
The gel is made from a stock solution using the method of B.J. Davies [Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404 (1964)] using tris-phosphate, pH = 8.1 as gel buffer, which is polymerized only by photopolymerization.
The active material elutes in the Ampholine carrier Ampholyte System pH 6 - 8 just before, or with the terminator electrolyte.
The eluate is passed to a fraction collector via a UV absorptiometer, whereby a first value for the separation effect is obtained. The final determination of the fractionation is carried out using the in vitro test for colienterotoxin (adenylate cyclase test).
The effectiveness of the colonic terotoxin is demonstrated by the following two tests:
Rabbit intestinal ligation test:
The activity of colonic terotoxin preparations can be checked with the rabbit intestinal ligation test, which is described in Burrows W. and Musteikis G. H., J. Infect. Dis. 116/183
190 (1966). White New Zealand rabbits weighing 1 to 2 kg are used, which are starving 24 hours before the test. They are anesthetized with Fluothane and the abdominal cavity is opened. The small intestine is rinsed out with 20 ml of Tyrode solution. Then 6 segments between 10 and 12 cm long are tied off. 2 ml of Tyrode solution (negative control) or 0.2 mg of heat-labile enterotoxin, especially from P-263 or from H19 (positive control), are injected into the cavity of these segments. The remaining four bowel loops are used for the test materials.
After the injection, the abdominal cavity is closed. 18 hours later, the autopsy is performed and a ratio of volume (ml) to
Length (cm) determined.
In vitro test with adenylate cyclase preparations of the
Cat hearts
The preparation of the adenylate cyclase preparations is carried out according to the method of G.S. Levy [Levy G.S. and Epstein E., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33 / 990-995 (1968) and 38 / 86-92 (1970)]. The activation of adenylate cyclase by enterotoxin is determined using a radioisotope dilution test [Gilman A.G., Proc.
Nat. Acad. Sci. 67 / 305-312 (1970)]. 5'-Adenylylimidodiphosphate (AMP-PNP) is used as a substrate and is cleaned in the mold by a passage through a column with Dowex 50x2 prior to its use. The reaction medium consists of 50 mM Tris-HCl buffer with a pH of 7.4.5 mM MgCl2, 10 mM theophylline, 0.1% bovine serum albumin and 2 mM AMP-PNP. The total incubation volume is 0.1 ml and the enzyme concentration 0.15 mg protein per test. The incubation is started by adding the enzyme and carried out at 370C for 30 minutes. To terminate the reaction, 500 Ill of 7.5% trichloroacetic acid are added and the mixture is kept at 4 C for 10 minutes.
The precipitate is separated off by centrifugation and the supernatant is added to 5 ml of ethyl ether saturated with water.
The layers are separated by centrifugation and the ether phase is removed. After a total of three ether extractions, the aqueous solution is brought to dryness at 60-700C in a water bath with an air stream. Of the
The residue is dissolved in 1 ml of 0.2 M acetate buffer with pH = 4.0. The amount of cyclic AMP (adenosine monophosphate) formed, a direct measure of the level of activation of the adenylate cyclase by colienterotoxin, is determined using the test described at the beginning.
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis:
For the analytical study of proteins in different
Stages of purification of the colienterotoxin are according to the method of L. Ornstein [Ann. N. Y. Acad. Sci.
121/321 (1964)] and B.J. Davies [Ann. N. Y. Acad. Sci.
121/404 (1964)] disc gel electrophoresis. Cross-linked polyacrylamide gels (5%) at a pH of 8.9 and tris-glycine buffer are used for this electrophoresis. The buffer, which contains 50% sucrose and 10-M 2-mercaptoethanol, is layered over the gel and over it the sample, which is dissolved in 25% sucrose and 10-3M 2-mercaptoethanol-containing buffer. 2-Mercaptoethanol is also contained in both (upper and lower) buffers for electrophoresis. Bromophenol blue is used as the dye and the electrophoresis is carried out for 2 hours at room temperature and 1.5 ma by gel. After electrophoresis, the proteins are precipitated by incubating the gels in 20% sulfosalicylic acid for 18 hours.
Then the gels are immersed for 4 hours in a freshly prepared solution of 0.02% Coomassie brilliant Blue R 250 in 12.5% trichloroacetic acid, the color solution is decanted off, 10% trichloroacetic acid is added and the gels are left in this slightly bluish solution, which intensifies the staining. The stained gels are photographed [A. Chrambach, R.A. Reisfeld, M. Wyckoff and J. Zaccari, Ann. Biochem. 20/150 (1967)].
This gel electrophoresis can also be carried out in 8 M urea. The colonic terotoxin is treated with 10 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM ethylenediaminetetraacetate, 0.1 M Tris chloride buffer (pH = 9.0) and 8 M urea. The polyacrylamide gels are prepared in the presence of 8 M urea, otherwise the procedure is analogous to that described above.
Polyacrylamide gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate:
Polyacrylamide gel electrophoresis in 0.1% sodium dodecyl sulfate is carried out at pH 7.2 in 7.5% acrylamide according to the method of A.L. Shapiro, E. Vinuela, J. Maizel [Biochem. Biophys. Res. Commun. 28/215 (1967)] and K. Weber, M. Osborn [J.B.C. 244/4406 (1969)].
The following proteins are used as standard: trypsinogen from bovine pancreas (molecular weight of the polypeptide chain = 2.4 104), lactate dehydrogenase from bovine hearts (3.6 10) bovine serum albumin (6.8 phosphorylase from rabbit muscles (9.4 10) and E. coli - ss-galactosidase (1.3-105).
First, a 1% solution of the sample in sodium dodecyl phosphate and 2-mercaptoethanol is boiled for 3 minutes to prevent the possibility of proteolytic degradation. The samples are dialyzed against a solution consisting of 0.1% sodium dodecyl phosphate and 2-mercaptoethanol, 0.01 M sodium phosphate, pH = 7.1. The comparison proteins are treated in the same way.
Molecular weight determination by gel filtration:
The gel filtration method is used to determine the molecular weight of colienterotoxin, especially from strain P263. A Sephadex G-150 column is made according to the method of P. Andrews [Biochem. J. 96/595 (1965)] using horse heart cytochrome C (MG 1.3 104), bovine pancreachymotrypsnogen A (2.4 104), chicken egg white (4.5 104), bovine serum albumin (6.8 104), rabbit muscle aldolase (1 , 47 10) and beef liver catalase (2.2 10 dalton) calibrated as reference proteins. The proteins are measured by their transmission at 280 m.
Furthermore, titrated water (1.11 104 dpm) is measured by liquid scintillation to create the calibration curve, as well as a saturated solution of blue dextran, whose optical density at 620 mp is used as evidence.
The Sephadex column is equilibrated with 50 mM tris-chloride, pH = 7.5, 100 mM KCI and 0.01 M 2-mercaptoethanol. All of the above substances are applied to the column in a total volume of 0.7 ml and eluted in 0.9 ml fractions. The experiment is carried out at 4 C.
Isoelectric focusing in a sucrose density gradient:
To determine the isoelectric point for the purified enterotoxin, a glass column (type 8100, 110 ml) is used for the isoelectric focusing according to the method of Versterberg 0 and Svensson H. [Chem. Scand.
20/820 (1966)] was used. The anode electrolyte (phosphoric acid) is located on the bottom of the device. The Ampholine carrier Ampholyte has a pH range from 3 to
10. The optical density is measured at 280 mm and the column is emptied through the measuring cell of a Uvicord II UV absorptiometer. The isoelectric point is determined at 4 C by measuring the pH of the eluted fractions with a combined microelectrode.
Isoelectric focusing in thin-film polyacrylic amide gel:
Enterotoxin is on a 5% polyacrylamide gel plate [according to Z.L. Awdeh et al .: Nature (London) 219/66 (1968) modified, isofocused according to J. Bours & van Doorenmaalen W.J .: Science Tools 17/36 (1970)]. It is a polyacrylamide gel of 26 X 12.5 cm and. 1 mm thick manufactured with a final concentration of 2% Ampholine carrier Ampholytes with a pH range of 3 - 5, 5 - 7 and 7 - 10 in the ratio 1 1: 1: 1. 1 to 1 The gel is polymerized for 2 hours with riboflavin as a photocatalyst. 10 to 25 μl of a 0.1% solution of the protein in 2% ampholines, pH 3-10, are applied to 10 × 5 mm Whatman 2 MM paper strips which are placed on the gel.
Isoelectric focusing is carried out at 10 C in an electrophoresis apparatus. Before the gel plates are attached to the electrodes, the electrodes are covered with 0.5 x 25 cm filter paper strips, which are moistened with 0.1% (vol / vol.) Ethylene diamine solution (cathode). The initial current is 50 mA (and is reduced to 28 mA) for 2.5 hours at 210 volts (increasing to 1080 V). The pH gradient is determined with a combined micro surface electrode. After isofocusing, the proteins are precipitated with 14% trichloroacetic acid at 60 ° C. Then the gel is washed at room temperature with 10%, 5% and 3% trichloroacetic acid for 24 hours to remove the carrier ampholyte.
The gel is then stained with a 0.05% solution of Coomassie brilliant blue R-250 (dissolved in methanol / acetic acid / water = 45/9/46) for 2 hours and then washed with the same solvent. For swelling, the gel is placed in an acetic acid-water mixture (9:91) and then photographed.
The influence of pH on colonic terotoxin:
6 mg quantities of colienterotoxin are filled in 6 ml test tubes in 24 ml Tyrode solution. The contents of the tubes are adjusted to pH 1, 3, 5, 6, 7 and 9 with concentrated HCl or 6N NaOH. The test tubes are incubated at 4 C for 4 hours and each tube is subsequently adjusted to pH 7. The content of each test tube is examined both in the rabbit bowel loop test and in the pig bowel loop test at 2 ml (0.5 mg) per bowel loop.
It is shown that the enterotoxic activity is highly acid labile. The activity is clearly influenced from pH 6 and is completely destroyed from pH.
The influence of heat on colienterotoxin:
Amounts of 5 mg each of the purified colonic terotoxin, particularly from strain P263 or strain H19, are taken up with 20 each with Tyrode solution and heated to 40, 50, 60, 65, 70 or 100 C for 30 minutes. The heated solutions are examined with an untreated solution as a control in both the rabbit bowel loop test and the pig bowel loop test. 2 ml (0.5 mg) are administered per bowel loop.
The biological activity of colienterotoxin is completely destroyed by heating to 65 C for 30 minutes. The heat stability of the material is already evident at 500C, the complete destruction of the activity usually occurs at 60C.
Physicochemical properties:
The molecular weight of the colonic terotoxin P263 can be determined by Sephadex gel filtration [Andrews P .: Biochem. J. 96/595 (1965)] or also by means of NaDS gel electrophoresis [Weber K. and Osborn M .: J. Biol. Chem. 224/4406 (1969)]. It is 102,000 daltons by the first method and 102,000 - 105,000 by the second.
S 20sw X 1013 (sec): 5.4
E 10/5 280 nm, 0.1 M (NH4) HCO3 pH 8.0: 11.6 PI: 6.95
Lipid <I%
Hexose <1%
Biological activities of colienterotoxin:
A noticeable effect occurs in the different test systems at the following minimum doses: Test system Minimum dose of rabbit bowel loop test 0.5 ltg pig bowel loop test 0.5 µg skin test, adult rabbits 0.05-0.1 g fat cell lipase test 0.2 g adenylate cyclase test from cat heart tissue 0.2 tjg
Relationship between heat-stable and heat-stable
Colienterotoxin:
:
The substance peak, which elutes at approximately 220 ml using a Bio Gel A 5 m column (2.5 × 100 cm), which corresponds to a molecular weight range of 106 daltons, contains heat-stable activity. This material shows in the phenol-sulfuric acid test [Dubois M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers and F. Smith: Anal. Chem. 28/350 (1961)] for carbohydrates, and in the E-Toxate test (Limulus Amebocyte Lysate) for endotoxin [Levin I., Poore T.E., Zauber N.P. and Oser R.S .: New England Journ. of Med. 283/1313 (1970)] highly positive response.
To clarify the nature of this heat-stable activity, the lyophilized material is taken up with a 0.1 M (NH4) HCO3 solution, pH = 8.0, 1% O / o sodium dodecyl sulfate, and on a Bio-Gel A-5 m Column (2.5 X 80 cm), which has been equilibrated with the same buffer solution, separated. When using this column with a total layer volume of 400 ml and the empty volume of 155 ml, 4 UV-positive substance peaks elute at 170 ml, 280 ml, 350 ml and 390 ml.
The material from the 4 substance peaks is subjected to the separate treatment below for the removal of SDS and renaturation from a urea solution [Weber K., D.J. Kuter: J. Biol. Chem. 246/4504 (1971)]:
The protein solutions are brought to 6 molar in urea by adding solid urea and incubated for 30 minutes, after which dialysis is carried out against buffer solution A (0.05 M trisacetate pH 7.8, 6 M in urea). The sodium dodecyl sulfate is removed on a column of Dowex 1 X 2, equilibrated with buffer A. The column is developed with the same buffer solution. The proteins are reconstituted from the urea solution at room temperature by dropwise dilution in a 0.05 M Tris acetate buffer pH 7.8, so that the final dilution is at least 10 times.
The solution is then concentrated at 4 "C over Diaflo UM 10 filters in an Amicon cell and dialyzed against the 0.05 m Tris acetate buffer pH 7.8 in the cold to remove residues of urea. The protein concentration was determined according to Lowry.
After this treatment, the materials from substance peaks I - IV will undergo the usual tests for enterotoxic activity and the E-Toxate test for endotoxin below. Only the protein material from Peak II shows enterotoxic activity, which now has the typical heat-labile properties. This material is free of endotoxin.
Substance peak I shows no enterotoxic activity and can be identified as highly endotoxin-containing using the E-Toxate test. Peak III and IV show no activity whatsoever and are free of endotoxin. If the material from Peak II is subjected to the cleaning methods already described for the presentation of colienterotoxin, a material is isolated from it which has the same biological and physicochemical properties as the heat-labile colienterotoxin. If the renatured heat-labile material is incubated with an excess of the endotoxin-containing material from substance peak I, this material in turn has the typical heat-stable characteristics in all test systems for colienterotoxin.
Antiserum:
Goat monospecific E. coli antitoxin is produced against the pure E. coli enterotoxin of porcine P263 strain as described below:
2 parts by volume of a 0.5% solution of the antigen in 0.5% sodium bicarbonate are mixed with parts by volume of an aluminum hydroxide suspension (dry weight 15 mg / ml) and kept at 4 ° C. for at least 1 hour. The suspension of the adsorbed antigen is mixed with 6 parts by volume complete Freund's adjuvant emulsified with dropwise addition and vigorous stirring.
The goats are on both sides along the spine
10 times each 0.1 ml of the emulsion described above subcutaneously on each side, in the knee folds of the front and hind legs on both sides at 4 locations each 0.1 ml subcutaneously and deeply intramuscularly in the back of the thighs of the front and rear legs once 1 time , 25 ml injected. After 6 weeks, the same amount of the antigen in the same composition of the emulsion is injected deeply intramuscularly, while the second half of the amount on both sides in the amount of
Lymph node is injected. After a further 4 to 6 weeks, the blood is taken to determine the antibody concentration in the serum.
Passive hemagglutination microtest (PHA test):
Chicken blood is taken up in sterile, 5% sodium citrate solution and centrifuged. The supernatant liquid is removed and replaced with sterile modified Alseverlösung. This preparation is kept in the refrigerator. The cells can be used until hemolysis occurs. Before use, the cells are washed four times with Difco HA buffer pH 7.2 (35 ml buffer / ml settled cells). The cells are again suspended and taken up to a final concentration of 2.5% in the above-mentioned buffer. An equal volume of tannic acid (ratio 1: 20,000) is then added.
After incubation in a water bath at 370C for 10 minutes, the cells are washed twice with 5 ml of a 0.15 M PBS buffer, pH 6.4, and then resuspended to a final concentration of 2.5% in the same buffer.
Purified colonic terotoxin is diluted to 10 pg / ml with the PBS buffer, mixed in the same volume ratio with the cells treated with tannic acid and incubated at room temperature for 10 minutes. The mixture is centrifuged, the supernatant is discarded and the deposited cells are washed twice with 10 ml of 1% pre-adsorbed goat normal serum in DIFCO HA pH 7.2 buffer. The cells are resuspended at 0.5% in goat normal serum and made available for use. The normal goat serum is prepared as follows:
The goat serum is heated to 560C for 30 minutes and then adsorbed twice with chicken erythrocytes (1 ml serum + cells from 4 ml of a 2.5% suspension, 10 minutes at room temperature). This is followed by Millipore filters (Millipore Corp., Bedford, Mass.
USA) filtered and stored frozen. The 1% solution of normal goat serum is prepared on the day of use. Before use in the test, the unknown sera are diluted 1: 5 with normal goat serum, inactivated at 500C for 30 minutes and then adsorbed with the separated cells from 3 ml of a 2.5 ml chicken erythrocyte suspension by incubation with shaking at room temperature for 30 minutes. Microtiter U plates are used for the test. 25 sul of normal goat serum are pipetted into wells 2 - 12. 25 p1 of a 1: 5 dilution of the unknown serum is added to wells 1 and 2 and then diluted in series with a microtiter dilution pipette.
The presensitized cells, 25 111 of a 0.5% suspension, are then added to each well. The final reading is made after overnight incubation. The highest dilution of the serum, which causes a clear change in the button pattern of the non-agglutinated cells, is considered the end point.
Bentonite Flocculation Microtest (SBF Test):
The bentonite stock suspension is prepared 0.5 g bentonite (Wyoming Grade, Central Scientific So., Chicago, III), taken up in 100 ml distilled water as described below:
The suspension is homogenized twice in a Waring Blender (mixer) for 10 minutes, then poured into a 500 ml cylinder equipped with a glass stopper and left to settle. The supernatant is poured off and centrifuged at 500 X g for 15 minutes. The new supernatant is centrifuged again at 750 X g, this time the supernatant is discarded. The sediment is resuspended in 100 ml of distilled water and homogenized in a mixer for 10 minutes, stored under cooling and used as a stock solution for further experiments.
The suspension has an optical density of 0.5 at 250 nm. For the sensitization with colonic terotoxin, the stock solution is shaken, 5 ml of the stock solution at 3,000 X g
Centrifuged for 10 minutes and the settled particles resuspended in 1 ml 0.15 M PBS, pH 6.4 buffer. The same volume of 300 pg antigen in PBS is then added. The mixture is kept at room temperature for 1 hour with occasional shaking. It is then centrifuged at 3,000 X g, the supernatant is discarded and the sediment is resuspended in 10 ml of a 140% goat normal serum buffer solution (DIFCO HA buffer pH 7.2). The mixture is centrifuged again and the sediment is taken up in 5 ml of the 1% goat normal serum buffer solution.
I ml of a 0.1% methylene blue solution (taken up in distilled water) is added to the particles for staining. It is then centrifuged, washed twice with 10 ml of goat normal serum buffer solution and resuspended in the same solution. The microtiter test is performed essentially as described in the previous section, with the exception that the test sera are not pre-adsorbed. The highest dilution of the serum is recognized as the titer, which shows the clear occurrence of agglutination.
Proof of immunological identity or
Cross immunity
The E.coli strain P155, Serotype 0 149: K9l, K88a, c or the freeze-dried human-pathogenic E.coli strain H10407 as well as the Ent E.coli strain K12 and Ent-E.coli strain Kl2 are described as in the preparation of the colonic terotoxin, used to obtain a cell-free fermentation supernatant. This fermentation supernatant serves as a sample with an unknown composition of antigen Ag-X. Identification and quantification is carried out using a reference antigen, Ref-Ag (the pure E. coli enterotoxin from strain 263 or from strain H19), and a reference antiserum, Ref-Ab (monovalent antiserum against the enterotoxin H 19).
The two questions as to whether Ag-X contains an antigen that is identical to Ref-Ag and, if so, how the concentration of this antigen is compared to the known concentration of the antigen Ref-Ag, can be answered by Crossed Immunoelectrophoresis (Clarke HGM and Freeman T .: Clin. Sci. 35/403, 1968) and Tandem Crossed Immunoelectrophoresis [Kroll J .: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis edit. NH Axelsen, J. Kroll, B. Weecke, Universitetsforlaget, Oslo, p. 57 (1973), Suppl.
1/1973, Scandinavian Journal of Immunology].
Fig. 1 shows a crossed immunoelectrophoresis image of the Ref-Ag. developed against Ref-Ab. Only a precipitate occurs.
In Fig. 2, Ag-X was used instead of Ref-Ag. Due to the position of the precipitate in Fig. 2, it can be assumed that Ag-X contains an antigen that is identical to Ref-Ag. This assumption can be reinforced by the reaction of identity using fusing precipitates.
This experiment is carried out using tandem crossed immunoelectrophoresis (Fig. 3).
By comparing Fig. 3 with Fig. 1 it can be shown that Ag-X contains Ref-Ag and that the concentration of this antigen in Ag-X is lower than in Ref Ag. The confluent peak is quantified using a standard method [J. Kroll: J. clin. Lab. Invest.
22/112 (1968)].
If the culture media supernatant of the Ent E. coli K12 strain is used for Ag-X in this experimental arrangement, no precipitate occurs in FIG. 2. This result confirms the statement that the precipitate shown in Fig. 2 can be assigned to the enterotoxin of pathogenic E. coli strains.
The same experimental arrangement is carried out in order to determine the immunological identity or cross-immunity between human-pathogenic and porcine-pathogenic E. coli enterotoxin. In this experiment, the pure E. coli enterotoxin from the porcine pathogen E. coli strain P263 serves as Ref-Ag, and the monovalent antiserum against enterotoxin P263 as the reference antiserum Ref-Ab. The human pathogenic enterotoxin H 19 serves as a sample with an unknown composition of antigen Ag-X. As already described in Fig. 2 above, here too a picture of a crossed immunoelectrophoresis of Ag-X, developed against Ref-Ab, only shows a precipitate at the identical position as in Fig. 1. Due to the position of the precipitate, it can be assumed that Ag-X contains an antigen that is identical to Ref-Ag.
The reaction of identity using fusing precipitates using tandem crossed immunoelectrophoresis shows (Fig. 3) that Ag-X and Ref-Ag are serologically identical. This results in the possibility of using either human-pathogenic or pig-pathogenic colonic terotoxin as an antigen for immunization or for the preparation of a toxoid.
While maintaining the identical experimental set-up, it is investigated whether a complete or partial immunological identity exists between E. coli enterotoxin and V.cholerae enterotoxin. The pure E. coli enterotoxin from the porcine pathogenic E. coli strain P263 serves as Ref-Ag, the E. coli P263 antitoxin is used as Ref-Ab and pure V.cholerae toxin is used as the antigen sample Ag-X.
Fig. 4 again shows a crossed immunophoresis image of the Ref-Ag, developed against the Ref-Ab. As already shown, only a precipitate occurs.
In Fig. 5 Ag-X is used instead of Ref-Ag. A precipitate line appears again, but different in position and shape with the precipitate from Fig. 4.
If the technique of tandem crossed immunelectrophoresis is now carried out, the precipitation image of Fig. 6 is obtained, from which a clear partial identity of the antigens Ref-Ag (E. coli enterotoxin) and Ag-X (V.cholerae enterotoxin) can be concluded .
Active immunization:
Breeding sows are artificially inseminated and immunized for the first time one month before the expected litter date: 0.95 mg of purified colonic terotoxin are combined with 15 ml of Freund's complete adjuvant (7.5 ml of adjuvant + 7.5 ml of NaC1 buffer 0.05 M , 10 2 M 3-mercaptoethanol) im given. After 2 weeks, 0.35 mg coli terotoxin in 5 ml 0.9% NaC1 solution i.v.
given.
Since the serological identity between human pathogenic and porcine colonic terotoxin is given, either H19 or P263 colonic terotoxin can be used for immunization.
Determination of colostrum and serum antibodies in immunized breeding sows:
After farrowing the immunized breeding sows as described in the previous section, colostrum is aspirated and collected 6, 12 and 24 hours later. The breeding sow Blue is removed 56 hours after the date of casting, in order to obtain serum.
The antibody titer is determined using the bentonite flocculation microtest (SBF test) and gives the following results:
Time titer
Colostrum 6h 1: 512
12h 1: 512
24h 1:64
Serum 1:64
A 1: 2 diluted pig serum is used for neutralization studies in the rabbit bowel loop test.
When using a toxin dose of 0.25 mg / intestinal loop (i.e. = 3 toxin units), more than 60% inhibition is achieved. Corresponding experiments with colostrum (time of decrease 616 post partem) show a complete neutralization of the toxin effect in the rabbit model.
The effective dose 50 for enterosorption in the intestinal loop test or the ED20 for adenylate cyclase stimulation in the adenylate cyclase system is defined as 1 toxin unit.
Preparation of the toxoid - detoxification with GlutaraldeSlyd:
In order to achieve optimal conditions for the inactivation, the molecular weight of 102,000 for the toxin molecule is initially varied between 50 and 1000 moles / mole toxin based on the toxin molecule. The reaction is carried out in a concentration range from 100 to 1000 sug / ml toxin, at 30 ° C. in a 0.065 M PBS buffer pH 7.8 with different incubation times. The reactions are carried out by dialyzing twice against 100 times the volume of PBS buffer pH 7, 8. When a toxin concentration of over 600 pg / ml is used, the reaction product begins to become insoluble with increasing glutaraldehyde concentration.
If the toxin concentration is kept between 100 and 600 Sg / ml and the glutaraldehyde concentration is varied between 50 and 400 moles / mole toxin, the reaction product remains in soluble form.
The adenylate cyclase test shows that optimal detoxification takes place in the pH range 7.8 to 8.2. If the toxin concentration is chosen between 400 and 600, ng / ml, the residual toxicity (measured after incubation for 72 hours at 39 ° C) decreases by a factor of 1 with a double increase in the glutaraldehyde concentration between 50 and 200 moles / mole toxin If the glutaraldehyde concentration is increased from 200 to 400 moles / mole toxin, the residual activity cannot be determined even with the most sensitive test methods (adenylate cyclase test).
Toxid Units:
In order to quantitatively record preparations of the inactivated colonic terotoxin (toxoid), toxoid units (TU) were analyzed according to the Craig [Craig, J.P .: 1971, Cholera toxins p. 189-254 in S. Kadis, C. Montie and S.
Ajl (ed.) Microbial toxins, Vol. 2 Academic Press Inc., New York]. This determination is based on the toxin's ability to react with the antitoxin in vitro. The test determines the decrease in the ability to neutralize a known amount of the antitoxin after incubating with toxoid. A series of test tubes containing the same volume of the antitoxin (2AU / ml) and a corresponding dilution of the toxoid are incubated at 37 "C for 30 minutes. Another series of test tubes serves as a control, with the same volume of the antitoxin (2AU / ml) buffer is added and incubated under the same conditions.
After the incubation, identical volumes of a 0.15 log serial dilution of the toxin are added to the test tubes and the determination is carried out using the adenylate cyclase test as described for the determination of the neutralizing antibodies.
The 50% shift in the dose response curve is used to determine the amount of free and bound antitoxin in the antitoxin-toxoid mixture. 1 TU is the amount of toxoid that binds 1 AU of the antitoxin.
Titration of the antitoxin titer in immune goat sera:
Goats are immunized with various preparations of toxoid as described above and the antitoxin titer is determined using the adenylate cyclase test.
In vitro reversal test:
Samples of the toxoid (2 to 5 ml) are incubated in 0.065 M PBS buffer pH 7.8 in the presence of 0.01% thiomerosal at 37 "C for 2 weeks before testing for toxin activity with the adenylate cyclose test. Control samples were tested kept at 4 "C and tested in parallel.
In vivo reversal test:
The eventual development of toxin activity is monitored with the rabbit skin test according to Craig (Craig, J.P., Eidmer, E.R., Harnich, R.B., 1972 J. Infect. Dis. 125 / 213-215) over a period of 2 weeks. Two-step dilutions of toxin as a control and toxoid are injected intracutaneously into the back of New Zealand albino rabbits and the diameter of the wheal formation is monitored daily for 2 weeks. The results are recorded graphically as the increase or decrease in the wheal diameter over time.