NO341903B1 - Nyrekarsinmocellelinje og anvendelse derav - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører en nyrekarsinomcellelinje som er i stand til å aktivere immunsystemet på en antigenspesifikk måte. Ifølge et ytterligere aspekt inkluderer oppfinnelsen også derivater av cellelinjen som opprettholder nevnte aktiveringskapasitet. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for å målsøke og aktivere immunsystemceller mot celler fra klarcellenyrekarsinom. Nevnte fremgangsmåte omfatter den samtidige inkuberingen av isolerte immunsystemceller (dendrittceller, CD4*-, CD8*-lymfocytter, osv.) med celler fra RCC BA85#21-linjen i overensstemmelse med oppfinnelsen i et passende kulturmedium, i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå antigenspesifikke celler.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en tumorcellelinje til anvendelse i området for cellulær terapi og/eller profylakse.

Kjent teknikk

Klarcellenyrekarsinom (RCC) er den mest vanlige, maligne neoplasi i nyre, og står for omtrent 3 % av maligne neoplasier hos voksne med omtrent 30000 nye tilfeller diagnostisert hvert år i USA og 27000 i Europa, og 95000 dødsfall pr. år i verden (Bander NH et al., Cancer Res. 1989 1. des. 49(23):6774-80). I Italia rammer hvert år neoplasi 4000 mennesker og forårsaker 200 dødsfall. Det er den tredje mest vanlige typen for urologisk tumor etter prostatatumor og blæretumor, og ser ut til å ha en preferanse for hannkjønnet (forholdet menn/kvinner er 2:1) og med en forekomsttopp rundt det sjette til det syvende tiåret av livsløpet. Uheldigvis er ikke dens etiologi kjent.

RCC er en sykdom som kun er mulig å kurere i tidlig diagnostiserte tilfeller og mulig å behandle med radikal kirurgi. RCC presenterer en neoplastisk cellularitet som er svært resistent overfor tradisjonelle kjemoterapiregimer og relativt resistens overfor konvensjonell radioterapi. Opptil i dag har ikke kjemoterapi på pasienter med metastatisk RCC gitt tilfredsstillende resultater. Nyere data har vist at kun 5 % i 3000 tilfeller med pasienter på kjemoterapi har respondert på det terapeutiske regimet. Disse resultatene viser at RCC er svært resistent overfor et bredt utvalg kjemoterapeutiske midler administrert enten i kombinasjon eller ikke i kombinasjon, noe som tyder på et behov for nye midler og nye terapeutiske fremgangsmåter.

RCC er én av en liten gruppe med maligne neoplasier der antigenspesifikk og cellemediert antitumorimmunrespons har blitt vist. Dette faktumet tyder på at karsinomet uttrykker antigener som er gjenkjennelige for immunsystemet, spesielt ved cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og som kan muliggjøre utviklingen av en tumorfrastøtningstype immunrespons. Utvikling av strategier for CTL-type antitumorimmunisering er sekundær i forhold til å identifisere tumorantigener som er gjenkjent ved CTL’er i nyretumorcellelinjer, og celler som er i stand til effektivt å presentere antigenet overfor immunsystemet, slik dom dendrittceller.

Pr. i dag ligger de største vanskelighetene i å identifisere og selektere et svært immunogent antigenformat til anvendelse som en kilde for nye nyretumorantigener for å prime dendrittceller (DC) benyttet som en immunterapeutisk tilnærming, for å forsterke immunresponsen hos pasienter som er kompromittert med neoplastisk patologi.

Pr. i dag forblir isolering av stabile nyretumorcellelinjer en lite hyppig forekomst selv om nyretumorceller har blitt isolert og dyrket in vitro i flere laboratorier i de siste 30 årene (Bander NH et al. Cancer Res. 1989 1. des. 49(23):6774-80, Bear A et al. Cancer Res. 1987 15. juli, 47(14):3856-62, Blouin P. et al., Exp Pathol. 1989, 36(3):147-63). Immunogenisiteten til nyretumorlinjer er fremdeles et karakteristikum som ikke alltid foreligger, på tross av det faktum at for andre tumortyper med varierende histologi (melanom, pankreatisk karsinom, prostatakarsinom, mesoteliom, hepatokarsinom og nyrekarsinom) så blir laboratorieisolerte cellelinjer allerede benyttet for å fremstille vaksiner basert på anvendelsen av DC’er for å indusere en antigenspesifikk respons. Data som er fremskaffet fra disse undersøkelsene har vist seg å være lovende for fremtidig anvendelse av tumorceller for immunterapi på individer som er rammet av faste tumorer, på tross av at prosentvis respons overfor vaksinen er svært variabel.

Uansett forblir graden av immunogenisitet for de isolerte tumorlinjene en avgjørende parameter i formulering av en vaksine for å behandle faste neoplasier.

Oppsummering

Foreliggende oppfinnelse vedrører en cellelinje fra klarcellenyrekarsinom, betegnet RCC BA85#21 og som er deponert som nr. PD 04006 hos CBA i Genova (Italia). Cellelinjen er i stand til å aktivere immunsystemet på en antigenspesifikk måte. I overensstemmelse med et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen også lysat og/eller apoptotiske legemer av cellelinjen som opprettholder nevnte immunsystemaktiveringskapasitet. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for å aktivere celler i immunsystemet og spesifikt styre dem for å gjenkjenne nyrekarsinomceller, fortrinnsvis klarceller. Nevnte fremgangsmåte omfatter den samtidige inkuberingen av isolerte celler fra immunsystemet (dendrittceller, lymfocytter, CD4<+>, CD8<+>, osv.) med celler fra RCC BA85#21-linjen i et passende kulturmedium i en tidsperiode som er tilstrekkelig for å oppnå antigenspesifikke celler.

Detaljert beskrivelse av figurene

Fig. 1: Evaluering av genuttrykkingen av tumormarkørene: OFA (fig. 1a), CE (fig.

1b), hTert (fig. 1c), RUAS (fig. 1d) og interleukin-6 (fig. 1e) fra RCC BA85#21-klonen med sanntids-PCR.

Fig. 2: Mikrosatellittustabilitet (MSI) og tap av heterozygositet (LOH) i kontrollymfocytt (PBMC) og i RCC 85-klonen ved ulike passeringer (opphavslinje BA85 RCC1=1, opphavslinje BA85 RCC2=2, opphavslinje BA85 RCC3=3).

Testede lokus: BAT25 og BAT26, DS123 og DP1 (D5S346), D175250. LOH er tilstede kun i RCC 85#21-klonen på DP1-lokuset.

Fig. 3: Cytotoksisitetstest av CD8<+>-autologe T-lymfocytter mot RCC BA85#21-klonen (60 % lysis, E/T = 60:1). Ikke-spesifikk lysis av erytroidcellelinjen K562 er funnet å være mindre enn 20 %.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører isoleringen, karakteriseringen og anvendelsen av en human cellelinje som er avledet fra en klarcellenyretumor som har blitt fenotypisk og funksjonelt karakterisert i foreliggende oppfinnelse.

Den nye tumorcelleklonen blir isolert fra en primær lesjon fra klarcellenyrekarsinom og deponert hos CBA (Advanced Biotechnology Center) i Genova den 17. desember 2004 som deponeringsnummer PD04006. I foreliggende undersøkelse ble cellelinjene betegnet RCC B85#21.

Tilgjengeligheten av nevnte cellelinje, som er karakterisert (i prinsippet er karakteristika gitt i tabell 1) og som innehar høy immunogenisitet, muliggjør:

- identifiseringen av nye tumorantigener,

- standardiseringen av somatisk terapi basert på anvendelsen av autologe dendrittceller primet med det immunogene tumorcellelinjelysatet, med klasse-I- og klasse-II-peptider avledet fra de identifiserte tumorantigenene eller antigenet selv, som er i stand til å fremme aktiveringen og ekspanderingen av spesifikke T-celler mot nyretumorceller hos pasienter som er rammet av RCC.

RCC BA85#21-cellelinjene kan eventuelt bli transformert med heterologe nukleinsyrer. Transformeringen er implementert med fremgangsmåter som er kjent på fagområdet og kan bli gjennomført for å tilveiebringe cellene med antibiotikaresistens, et ytterligere antigenkarakteristikum eller et enkelt selekterbart karakteristikum.

Dermed faller celler som er mulig å fremskaffe fra den opprinnelige cellelinjen under transformasjon med heterologe nukleinsyrer innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Det samme gjelder klonale derivatceller, som etter behandling i kultur med RCC BA85#21 med ulike faktorer, slik som vekstfaktorer og/eller cytokiner, er vist å ha kapasiteten til å aktivere immunsystemet eller immunsystemceller eller å ha vekstkarakteristika som er spesielt passende for aktivitetene som er nødvendige for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det prinsipielle karakteristikum for nevnte celler er deres immunogenisitet, målt som deres kapasitet til å stimulere en antigenspesifikk respons i cellene i immunsystemet. En spesifikk respons betyr en respons (som er mulig å vise ved produksjon av signalmediatorer slik som cytokiner eller ved aktiveringen av andre celletyper, eller ved hjelp av flowcytometri) som er større enn en respons som er mulig å identifisere som kontroll.

Oppfinnelsen omfatter også produkter som er avledet fra RCC BA85#21-cellelinjen som er mulig å fremskaffe etter dyrkning av et passende antall celler, fortrinnsvis i RPMI 1640-medium ble tilsatt føtalt serum eller insulin (20 μg/ml), transferrin (10 μg/ml), natriumselenitt (25 nM), hydrokortison (50 nM), EGF (1 ng/ml), etanolamin (10 μM), fosforyletanolamin (10 μM), trijodtyronin (100 pM) bovint serumalbumin (2 mg/ml), HEPES-buffer (10 mM), glutamin (2 mM) og natriumpyruvat (0,5 mM), deretter konsentrere cellefraksjonen f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, eller ved fiksering (slik som behandling med dialdehyder) eller ved bestrålning med fortrinnsvis γ-stråler, lyofilisering og/eller frysing.

Derivater av nevnte cellelinjer er også mulig å fremskaffe fra RCC BA85#21-celleklonen f.eks. ved cellelysis og/eller fraksjonering og/eller lyofilisering og/eller fremstilling av apoptotiske legemer, osv. Nevnte derivater, som minst delvis inneholder proteinfraksjonene fra den opprinnelige klonen og dermed også de spesifikt uttrykte nyrekarsinomantigenene, opprettholder totalt eller delvis de immunogene kvalitetene til RCC-BA85#21-klonen og kan bli benyttet som en erstatning for denne.

Cellelinjen ifølge oppfinnelsen blir benyttet med det målet å indusere og/eller øke immunresponsene for terapeutiske og/eller profylaktiske formål ved å isolere genetisk transformerte celler, eller ved å fremstille lysater eller apoptotiske legemer.

Nevnte ekstrakter, fraksjoner og/eller cellepreparater og kombinasjoner derav kan i ulike proporsjoner hensiktsmessig bli blandet med eksipienser, fortynningsmidler og/eller stabilisatorer i farmasøytiske eller immunogene preparater.

Det er beskrevet preparater som omfatter ulikt behandlede RCC BA85#21-celler og/eller derivater derav, som er anvendelige for å indusere en spesifikk immunogen respons i immunsystemceller, fortrinnsvis lymfocytter og/eller dendrittceller.

Nevnte preparater blir benyttet til farmasøytiske formål og/eller vaksineringsformål i fremstillingen av medikamenter for profylakse og/eller terapi av nyrekarsinom.

Fremgangsmåter for å aktivere målsøkerimmunresponssektorer slik som celler i immunsystemet, spesielt T-lymfocytter og enhver foretrukket CD8<+>-celler, som er spesifikke for klarcellenyrekarsinomceller slik som cellene ifølge foreliggende oppfinnelse og/eller lysat og/eller apoptotiske legemer derav, omfatter den samtidige inkuberingen av immunsystemceller, fortrinnsvis lymfocytter eller dendrittceller, sammen med celler fra RCC BA85#21-linjen eller med dens derivater som tidligere definert. Nevnte samtidige inkubering blir fortrinnsvis utført i et passende kulturmedium slik som RPMI 1640 tilsatt humant AB+-serum og/eller vekstfaktorer og/eller aktiveringsfaktorer (f.eks. cytokiner) i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå antigenspesifikke celler. In vitro-fremgangsmåter for lymfocyttaktivering er kjent på fagområdet: dyrking av tumorceller, bestråling med γ-stråler, in vitro-lymfocyttstimulering, dvs. samtidig dyrking av tidligere inaktiverte tumorceller og lymfocytter, evaluering av lymfocyttinduksjon/-aktivering ved hjelp Elispot-analyse for IFN- γ, cytotoksisitetsanalyse, fenotypisk halvering av lymfocytter via flowcytometri, evaluering av lymfocyttproliferasjonene som respons på tumorantigen). I overensstemmelse med et foretrukket aspekt blir cellene ifølge oppfinnelsen benyttet til å prime dendrittceller, for å aktivere CD4<+>/CD8<+>-lymfocytter og naturlige dreperceller, og for å indusere en antigenspesifikk respons begrenset til HLA-A- og B/C-allelene og ikke HLA-begrenset.

Spesifisiteten til responsen indusert i lymfocyttceller ved cellene ifølge oppfinnelsen ble målt ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på området, slik som celleproliferasjon etter samtidig inkubering av de to celletypene, produksjon av cytokiner eller vekstfaktorer, fremkomst av spesielle overflateantigener slik som: OFA (onkoføtalantigen), karboksylesterase (CE), RUAS og hTERT (human telomerase revers transkriptase).

I overensstemmelse med en foretrukket utførelsesform blir derfor cellene og lysat og/eller apoptotiske legemer ifølge oppfinnelsen benyttet i in vitro-, ex vivo- og in vivo-immunterapiprotokoller der lymfocyttene eller immunsystemcellene fra en pasient som lider av nyretumor, fortrinnsvis klarcelle (RCC), blir stimulert in vitro med en cellekultur av RCC BA85#21-linjen eller med dens derivater ved passende betingelser, slik som de som er detaljert beskrevet i Oosterwijk-Wakka JC, J Immunother. 2002, 25(6):500-8 og i Holtl L. et al., Clin Cancer Res. 2002 8. nov. (11):3369-76 og også i Gitlitz BJ et al., J Immunother. 2003, 26(5):412-9, deretter reintrodusert inn i pasienten eventuelt etter at en seleksjonspassering også er gjennomført in vitro, f.eks. ved hjelp av immunokjemiske fremgangsmåter.

I overensstemmelse med et ytterligere aspekt omfatter dermed oppfinnelsen anvendelsen av RCC B85#21-cellelinjen for å fremstille en vaksine til behandlingen og/eller forebyggingen av nyreneoplasier, spesifikt klarcellenyreneoplasi, eller for å stimulere immunsystemceller in vitro, fortrinnsvis lymfocytter og/eller antigenspesifikke dendrittceller. RCC BA85#21-cellelinjen er også et essensielt instrument i seleksjonen og rensingen av spesifikke antigener som blir uttrykt i nyretumorer. I overensstemmelse med denne anvendelsen blir derfor cellelinjen dyrket og amplifisert, eventuelt ytterligere behandlet, f.eks. lysert, deretter undersøkt ved å benytte analytiske fremgangsmåter for karakterisering av overflateantigener eller cellulære antigener. Fremgangsmåter for å karakterisere spesifikke antigener er f.eks. elektroforese, fortrinnsvis todimensjonal elektroforese, elektrofokusering eller immunelektrofokusering, metabolsk markering etterfulgt av immunpresipitering osv. Oppfinnelsen omfatter dermed anvendelsen av RCC B85#21-cellelinjen for å selektere og rense, både i analytiske og preparative formål, antigener som er spesifikke for nyrekarsinomer, fortrinnsvis av klarcelletype.

I overensstemmelse med et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen en diagnostisk fremgangsmåte for nyrekarsinom som omfatter å sjekke tilstedeværelsen av et tumorantigenpanel inkludert blant mange andre de følgende antigenene: TP53TG3 (tumorprotein 53 målgen 3), trafikkproteinpartikkelkompleks 1 (TRAPPC1) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi), trafikkproteinpartikkelkompleks 2 (TRAPPC2/SEDLP) (som er involvert i skjelettutvikling, transkripsjon og regulering av DNA-avhengig transkripsjon, transport fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi), trafikkproteinpartikkelkompleks 2 (TRAPPC2) (som er involvert i spondyloepifyseal dysplasi, tarda), trafikkproteinpartikkelkompleks 3 (TRAPPC3) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi), trafikkproteinpartikkelkompleks 4 (TRAPPC4) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi, vesikkeltransport, dendrittmorfogenese, biosyntese av nevrotransmitterreseptorer), trafikkproteinpartikkelkompleks 5 (TRAPPC5), trafikkproteinpartikkelkompleks 6 (TRAPPC6). Denne undersøkelsen ble gjennomført med fremgangsmåter som viser tilstedeværelsen av proteinproduktet eller spesifikt RNA, og slik ved enten å benytte immunokjemiske fremgangsmåter ved å benytte antistoffer eller ved molekylære fremgangsmåter ved å benytte prober og molekylære frø, i overensstemmelse med et ytterligere aspekt vedrører oppfinnelsen et sett som omfatter RCC BA85#21-cellelinjen, fortrinnsvis i form av en sentrifugert pellet, eller i frossen og/eller lysert og/eller lyofilisert form, eller lysat og/eller apoptotiske legemer derav i kombinasjon med eller uten reagenser (slik som vekstmedium og/eller cytokiner) for fremstilling av vaksinepreparater eller immunogene preparater, som er nyttige for å implementere in vivo- og/eller ex vivo-immunterapiprotokoller, eller for å indusere en antigenspesifikk immunrespons i celler i immunsystemet.

EKSPERIMENTELL DEL

Eksempel 1. Isolering, dyrkning og morfologisk karakterisering av RCC BA85#21-klonen fra nyretumorceller

RCC BA85#21-nyrtumorcellelinjen (Elthem) ble isolert fra det primære tumorsetet i en pasient rammet av klarcellenyrekarsinom etter å ha fremskaffet tillatelse fra donoren. Den primære tumoren som RCC BA85#21-cellelinjen ble isolert fra var av histologisk grad 1 (ifølge Fuhrman som definert i Fuhrman SA et al. Am J Surg Pathol, 6(7): 655, 1982), ikke-aggressiv, og i dette tilfellet hadde den ikke invadert nyrearterien eller vena cava og hadde ikke metastasert seg i de nærliggende lymfeknutene. Tumorvevet i den primære lesjonen var sammensatt prinsipielt av klarceller med alveolær/tubulær arrangering.

Det utskårne tumorvevet ble skåret opp i tynne skiver for å oppnå fragmenter på 1-2 mm i lengde. Vevet som ble fremskaffet på denne måten ble overført til en steril flaske inneholdende 35 ml PBS ved pH 7,4, og til dette ble det tilsatt 5 ml hyaluronidase (0,1 %), 5 ml kollagenase-IV (1 %) og 5 ml DNase (0,02 %) i 20-30 min. ved romtemperatur. Cellesuspensjonen ble filtrert (100 μm Falcon 2350 strainer) og cellene ble vasket flere ganger i balansert fysiologisk saltløsning (HBSS). Supernatanten ble fjernet, pelleten ble resuspendert i kulturmedium og cellene plassert i en flaske på 25 cm<2>. Cellene ble i første omgang dyrket i ACL-4-medium tilsatt 20 % bovint serum (AR5). AR5-mediet var sammensatt av RPMI 1640-medium med tilsatt insulin (20 μg/ml), transferrin (10 μg/ml), natriumselenitt (25 nM), hydrokortison (50 nM), EGF 1 ng/ml), etanolamin (10 μM), fosforyletanolamin (10 μM), trijodyronin (100 pM), bovint serumalbumin (2 mg/ml), HEPES-buffer (10 mM), glutamin (2 mM) og natriumpyruvat (0,5 mM).

Cellene ble deretter dyrket i RPMI-medium tilsatt 20 % FCS, L-glutamin (216 mg/ml), penicillin (100 IU/ml), streptomycin (100 mg/ml) og HEPES (10 mM). Cellene ble frosset i 10 % DMSO i HSA (humant serumalbumin).

Cellene fra RCC85-linjen ble klonet ved hjelp av begrensningsfortynningsteknikken. Tumorceller ved passering P 39 ved 1 x 10<5>konsentrasjon ble fortynnet i RPMI 1640-medium med tilsatt 20 % FCS, 1 % L-glutamin, 1 % penicillin-streptomycin og platet på 96-brønners plater. 1 x 10<4>”materceller” (NIH 3T3) bestrålt ved 10000 rad ble tilsatt til kulturbrønnene i forholdene som er gitt nedenfor.

Celler/brønn VOLUM/ml MATER Tumorceller/brønn

96-brønners plater100 μl<4 x 104 3 x 103>

(U-bunnet)

48-brønners plater 1 ml 1 x 10<5>2,5 x 10<4>24-brønners plater 2 ml 2 x 10<5>5 x 10<4>

Det endelige resultatet var isoleringen av en stabilisert og immunogen klon av nyretumorceller, nemlig RCC BA85#21-klon, som fremstår som homogen i celleform (polygonal) og polynukleær med kjerner posisjonert sentralt i cytoplasma, og med tendens til alveolær klumpdannelse, og som også viser eosinofili med tydelig glykogendeponering og lipiddeponering når de blir farget med standard hematoksylin-eosin. De prinsipielle karakteristika for klonen er gitt i tabell 1.

Tabell 1

Eksempel 2. Immunhistokjemisk karakterisering av RCC BA85#21-klon Monolagscellepreparater ble fremskaffet ved å benytte ThinPrep-apparat (Cytyc Corp.). Celler ble farget i overensstemmelse med Papanicolaou og med immunhistokjemiske farginger gjennomført med Avidin-Biotin-Peroksidase (ABC)-teknikken i en automatisert immunfarger (Dakocytomation, Carpinteria, CA - USA) ved å benytte de følgende, primære antistoffene: CD 10 (Novocastra, Newcastle Upon Tyne - UK, klon: 56C6, 1/50 fortynning), cytokeratin AE1/AE3 (Dakocytomation, klon: AE1/AE/3, 1/5 fortynning), cytokeratin CAM 5.2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ - USA), klon: CAM 5.2, 1⁄2 fortynning), cytokeratin 19 (Dakocytomation, klon: BA17, 1/100 fortynning), epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R) (Dakocytomation, klon : H11, 1/50 fortynning), epitelmembranantigen (EMA) (Dakocytomation, klon: E29, 1/100 fortynning): Ki 67 (Dakocytomation, klon: MIB 1, 1/100 fortynning), mitokondrier (Dakocytomation, klon: 113-1, 1/75 fortynning), vimentina (Dakocytomation, klon: V9, 1⁄2 fortynning).

De histologiske preparatene ble inkubert med de primære antistoffene i 16 timer ved 4<o>C, deretter med biotinylerte, sekundære antistoffer og med avidin-peroksidase i 30 min. ved 37<o>C. Kromogen påvisning ble gjennomført med diaminobenzidin (DAB) i 20 min. ved 20<o>C og nukleærkontrast ble oppnådd ved nedsenking i 2 min. i Meyers hemalum. Seksjonene ble til slutt montert med glyserinert gelatin på passende dekkglass. Resultatene er vist i tabell 2.

Tabell 2. Positivitet for RCC BA85#21-cellelinjen overfor epitelmarkører

Resultatene som ble oppnådd bekreftet tumorfenotypen og epitelopphavet for klonen. Det bemerkes at den immunhistokjemiske analysen ble gjennomført på celler som ikke var behandlet med trypsin for ikke å endre membranantigener og dermed spesifikk binding til antistoffene benyttet til immunfarging. Markørene benyttet slik som cytokeratin CAM 5.2, mitokondriemarkør og vimentin viste seg å være sterkt positive (99 % av cellene viste positivitet), mens cytokeratin AE1/AE3, cytokeratin 19, EGF-R, EMA og Ki 67 var positive selv om dette foregikk ved lavere prosentandeler (positive verdier fra 4-40 %). Som en konklusjon ble RCC-cellelinjen funnet å være positiv for de karakteristiske markørene for neoplasi av epitelopphav slik som cytokeratin CAM 5.2, mitokondriemarkører, vimentin, cytokeratin AE1/AE3, cytokeratin 19, EGF-R, EMA og Ki 67, mens CD10 ble funnet å være negativ.

Eksempel 3. Fenotyping av RCC BA85#21-klon ved hjelp av flowcytometri og sanntids-PCR

RCC BA85#21-klonen ble fenotypet med et panel av monoklonale antistoffer (anti-MHC-I, anti-MHC-II, anti-CD40, anti-CD80, anti-CD54) i nærvær eller fravær av stimulering med IFN- γ (500 IU/ml). Cellene ble analysert med et Partecflowcytofluorometer (Muenster, Tyskland).

Klonen ble funnet å være positiv for klasse-I-, CD40- og CD54-molekyler. Klonen viste en lav prosentandel av positivitet for klasse-II-vevsforliggelighetsantigener og for det kostimulatoriske molekylet CD80, ved både baselinjebetingelser og etter stimulering med IFN- γ. Resultatene er oppsummert i tabell 3.

Tabell 3: Fenotypisk karakterisering av RCC BA85#21-klon ved flowcytometri.

MFI = Gjennomsnittelig fluorescensintensitet

Prosentverdiene indikerer antallet celler som er positive for reseptoren som er undersøkt, MFI er fluorescenssignalintensiteten som korrelerer med antallet reseptorer pr. celle.

Genuttrykking av noen tumorantigener og/eller cytokiner i RCC BA85#21-celler, spesielt OFA (onkoføtalantigen), karboksylesterase (CE) og RUAS, hTERT (human telomerase revers transkriptase) og IL-6 har blitt sjekket ved hjelp av sanntids-PCR ved å benytte dobbelt modifiserte oligonukleotider og spesifikke primere som f.eks. beskrevet i Su Z. et al. Cancer Res., 20031. mai. 63(9): 2127-33. Resultatene som er normalisert til uttrykkingen av et housekeeping-gen, beta-aktin, er vist i fig. 1a-1e. De absolutte verdiene ble funnet å være: OFA (2<- ΔCt>= 6,752E-01), hTERT (2<- ΔCt>= 4,282E-06), CED (2<- ΔCt>= 3,847E-02), RUAS (2<- ΔCt>= 3,590E-02) og IL-6 (2<- ΔCt>= 3,969E-01).

Eksempel 4. Karakterisering av genomisk stabilitet for RCC BA85#21-klon Genomstabilitet for RCC-klonen ble undersøkt ved analyse av mikrosatellittustabilitet (MSI) og tap av heterozygositet (LOH) ved å benytte PCR med primere for lokusene BAT25 og BAT26 og for D2S123, D5S346 og D17S250 som beskrevet i Rodriguez-Bigas MA et al. J Natl Cancer Inst 1997, 89, 1758-62 Boland CR. et al. Cancer Res 1998, 58:5248-57 og anbefalt av the National Cancer Institute Workshop. PCR-mønsteret, ved å følge vertikal elektroforese i polyakrylamid inneholdende urea med konsentrasjon på 8 M, ble sammenlignet med mønsteret for autologe lymfocytter (PBMC) og er vist i fig. 2 (RCC1, 2, 3).

PCR-resultatene viser at ikke noe MSI ble funnet i RCC BA85#21-klonen sammenlignet med kontrollen. I stedet ble LOH observert på lokus DP1 eller D5S346. Den minimale regionen ved delesjon på 5q som markerer for LOH er kartlagt til lokus 5q31.1 (interferonregulatorisk faktor-1, lokus IRF-1) i 23 % av RCC-tilfeller. Data som er rapportert i litteraturen tyder på at LOH på 5q spiller en viktig rolle i skapelsen av RCC, der denne genetiske hendelsen blir funnet i den innledende fasen for karsinogenese (stadium 2, 3, 4) (Ref. Sugimura J et al., Pathol Int. 1997, 47(2-3):79-83).

Eksempel 5. Karakterisering av RCC BA85#21-klon ved hjelp av microarray Microarray-analyse ferdigstilte det fenotypiske og funksjonelle rammeverket for RCC BA85#21-klon. cRNA-fragmentet ble hybridisert til en HG-U133Av2-oligonukleotid microarray-mikrobrikke (Affymetrix) inneholdende 22283 gensett, som representerer omtrent 12357 humane gener og omtrent 3820 EST-sekvenser med ukjent funksjon (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). For dataanalysen ble gensett som var involvert i de prinsipielle biologiske prosessene valgt: celleproliferasjon og cellesyklus, apoptose, celleangiogenese og signalisering, i overensstemmelse med the gene ontology database som er tilgjengelig hos NetAffx<TM>Analysis Center.

Blant andre ble de følgende markørene identifisert: TP53TG3, trafikkproteinpartikkelkompleks 1 (TRAPPC1) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi), trafikkproteinpartikkelkompleks 2 (TRAPPC2/SEDLP) (involvert i skjelettutvikling, transkripsjon og regulering av DNA-avhengig transkripsjon, transport fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi, trafikkproteinpartikkelkompleks 2 (TRAPPC2) (involvert i spondylopifyseal dysplasi, tarda), trafikkproteinpartikkelkompleks 2 (TRAPPC3) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi), trafikkproteinpartikkelkompleks 4 (TRAPPC4) (involvert i transporten fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi, vesikkeltransport, dendrittmorfogenese, biosyntese av neurotransmittreseptorer), trafikkproteinpartikkelkompleks 5 (TRAPPC5), trafikkproteinpartikkelkompleks 6 (TRAPPC6).

Eksempel 6. Funksjonell karakterisering av RCC BA85#21-klon ved microarray - immunogenisitet

Immunogenisiteten til RCC BA85#21-klonen ble undersøkt etter in vitrostimulering av autologe lymfocytter ved MLTC (blandede lymfocytttumorcellekulturer), ved hjelp av Elispot-teknikken for å måle IFN- γ-frigjøring fra antigenspesifikke CD8-lymfocytter, og ved cytotoksisitetstester, assosiert med<51>Crfrigjøring, ved hvilke evnen for nevnte, aktiverte lymfocytter i å lysere klonale tumorceller ble målt.

I første omgang ble PBMC’ene fra den samme pasienten som RCC BA85#21 aktivert ved samtidig inkubering med RCC-tumorcellene som tidligere var stimulert med IFN- γ (100 IU/ml) i 48 timer (autologt system). Cellene ble deretter sådd ut i 24-brønners plater i et ”responder/stimulator” (PBMC/RCC BA85#21)-forhold på 10:1 og opprettholdt i AIM-V (Invitrogen)-kulturmedium med tilsatt 5 % humant serum og IL-2 (250 IU/ml). Dette ble 1x10<6>PBMC (respondere) inkubert sammen med 1x10<5>RCC BA85#21-celler (stimulatorer) som tidligere var bestrålt med 10000 rad. En uke senere og deretter i to påfølgende uker ble lymfocyttene igjen stimulert med RCC BA85#21-celler i kulturmedium tilsatt IL-2 (250 IU/ml).

Tre uker etter starten på in vitro-stimulering (T21) ble CD8<+>-lymfocyttene isolert ved å benytte immunmagnetiske mikrokuler (Milteny Biotech). På den 35. dagen (T35) ble CD8<+>-T-celle”responderne” stimulert i ytterligere to uker med den tidligere bestrålte RCC BA85#21-klonen.

De antigenspesifikke cellene og graden av immunogenisitet ble testet mor RCC BA85#21 i både nærvær og fravær av monoklonale anti-HLA-I-antistoffer ved hjelp av Elispot-teknikken (Herr W et al. J Immunol Methods. 1997 25. apr.

203(2):141-52).

Elispot-analysen muliggjorde evaluering av omfanget av INF- γ-frigjøring ved CD8<+>-T-lymfocytter som 330 INF- γ<+>-celler av 10000 = 3,3 %. På immunologifeltet er denne verdien svært høy. INF- γ-frigjøring ble inhibert med 91 % av det monoklonale antistoffet rettet mot klasse-I-antigener, noe som bekrefter immunogenisiteten til RCC BA85#21-klonen og den antigenspesifikke responsen som er indusert av klonen selv.

Cytotoksisitetestesten og<51>Cr-frigjøringstesten ble gjennomført ved å følge standard metodikk (Dorrschuck A et al. Blood, 2004 15. okt. 104(8):2591-9). Kort fortalt ble 1 million celler tumorceller inkubert i 75 min. ved 37<o>C med<51>Cr (200 μCi/ml). Cellene merket på denne måten ble vasket tre ganger og resuspendert i RPMI 1640 med 10 % FCS. Lymfocyttene (responderne) ble fortynnet i duplikat i 96-brønners plater i mål-responder-forhold på 90:1, 30:1, 10:1, 3:1, 1:1. De merkede tumorcellene ble tilsatt til T-lymfocyttrespondere i en konsentrasjon på 1000 celler/brønn. Cellene som ble platet ut på denne måten ble inkubert i 5 timer ved 37<o>C. Ved slutten av inkuberingen ble platen sentrifugert ved 200 g i 5 min og 80 μl av supernatanten ble samlet inn for å bli talt i gammatelleren.

Resultatene er vist i fig. 3: de cytotoksiske CD8<+>-lymfocyttene (CTL) lyserte effektivt celler fra RCC BA85#21-klonen (60 %, E/T-forhold = 30:1), men ikke den erytroide linjen K565 som ble benyttet for å undersøke ikke-spesifikk cytotoksisitet (< 20 %, E/T-forhold, 60:1). De kombinerte fenotypiske og funksjonelle karakteriseringsdataene bekreftet tilstedeværelsen av integrin ICAM-1 (CD54), kostimularorisk CD40-molekyl og HLA-I-molekyler, som er i stand til å presentere tumorantigener. RCC-cellelinjen er derfor i stand til å indusere en klasse-I-respons og immunogen respons.

Dette faktumet ble bekreftet ut fra resultatene fra den samtidige dyrkningen av celleklonen med autologe T-lymfocytter. Spesielt bekreftet Elispot-analysen at RCC BA85#21-cellelinjen var i stand til å indusere INF- γ-frigjøring ved aktiverte CD8-lymfocytter med en klasse-I-respons (91 %) mens cytotoksisitetstesten bekreftet at nevnte, aktiverte lymfocytter var i stand til å spesifikt lysere RCC BA85#21-cellelinjen (60 %, E/T-forhold: 30:1) som ble benyttet til stimuleringen.

De kombinerte funksjonelle og fenotypiske dataene viser derfor den økte immunogenisiteten for RCC BA85#21-cellelinjen og dens nyttighet i terapi for behandlingen av pasienter som er rammet av klarcellenyrekarsinom.