NO340246B1 - Fremgangsmåter for brønnbehandling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn, spesielt anbringelse nede i borehullet av bakterier som er i stand til å produsere brønnbehandlingskjemikalier eller forløpere eller generatorer derav, samt partikler, blandinger og strukturer som inneholder disse bakteriene.

Under drift av en hydrokarbonbrønn (dvs. en gass- eller oljebrønn) oppstår det forskjellige problemer nede i borehullet så som korrosjon av metallarmatur, avsetninger som hemmer hydrokarbonstrømmen (av f.eks. belegg, gassklatrater, metallsulfider, vokser, gelpolymerer, mikrobielt avfall, etc), generering av toksisk hydrogensulfid på grunn av av sulfatreduserende bakterier, øket vannstrømning inn i det produserende borehullet, etc.

Der hvor f.eks. sjøvann injiseres gjennom et injeksjonsborehull inn i et oljebærende stratum for å drive olje gjennom formasjonen (dvs. bergarten) og inn i det produserende brønnhullet, så kan således forskjeller i det som er oppløst i injeksjonsvannet og vannet som allerede er nærværende i formasjonen føre til at metallsalter felles ut som belegg, noe som fører til gradvis økende tilstopping av det produserende brønnhullet.

Dette håndteres typisk ved å anvende en "pressing" ("squeezing") av belegginhibitorkjemikalier, dvs. kjemikalier som bryter ned belegget og øker olje-eller gass-strømning. Dette omfatter vanligvis opphør av hydrokarbonstrømning, idet en vandig løsning av belegginhibitoren tvinges ned i det produserende borehullet under trykk for å presse inhibitorløsningen inn i formasjonen, og så startes produksjonen på nytt. Slik behandling tillater generelt ytterligere seks måneder eller så med hydrokarbonstrømning før det er nødvendig med en ytterligere pressing, idet hver pressing fører til noe skade på formasjonen som omgir det produserende borehullet og gir som et resultat en øket strømning av formasjonsfragmenter (dvs. bergartkorn etc.) inn i borehullet.

Det produserende borehullet i en oljebrønn er generelt foret i det hydrokarbonbærende stratum med "gruspakker", sandholdige filterelementer, som tjener til å fange opp formasjonsfragmenter, og det er blitt foreslått å inkludere i slike gruspakker keramiske partikler belagt med eller impregnert med brønnbehandlings-kjemikalier så som belegginhibitorer (se EP-A-656459 og WO 96/27070) eller bakterier (se WO 99/36667). På samme måte er behandling av formasjonen som omgir det produserende brønnborehullet med brønnbehandlingskjemikalier før hydrokarbonproduksjon begynner, også blitt foreslått, f.eks. i GB-A-2290096 og WO 99/54592.

US 5,297,625 omhandler en fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn der fremgangsmåten går ut på å innføre termofile mikroorganismer som er i stand til å generere en brønnbehandlingskjemikalie, inn i en brønn.

Forskjellige polymere, oligomere, uorganiske og andre partikkelformede bærere for brønnbehandlingskjemikalier er også kjent, f.eks. ionebytterharpiks-partikler (se US-A-4 787 455), akrylamidpolymerpartikler (se EP-A-193 369), gela-tinkapsler (se US-3 676 363), oligomere matrikser og kapsler (se US-A-4 986 353 og US-A^ 986 354), keramiske partikler (se WO 99/54592, WO 96/27070 og EP-A-656 459), samt partikler av selve brønnbehandlingskjemikaliet (se WO 97/ 45625).

Partikler som er belagt med eller som inneholder brønnbehandlingskjemi-kalier vil imidlertid uunngåelig bare gi beskyttelse i en begrenset tidsperiode. Det eksisterer derfor fremdeles et behov for midler for brønnbehandling som gir beskyttelse over en lengre tidsperiode, f.eks. mot belegg eller andre problemer, så som korrosjonsproblemer eller problemer i forbindelse med hemming av hydrokar-bonstrømning.

I tillegg er én kjent belegginhibitor polyasparginsyre (polyAsp). Det er imidlertid åpenbart at der er vanskelig å produsere poly(asparginsyre) i en skala som er akseptabelt for industrien. Den kjemiske syntesen av polyAsp finner sted ved hjelp av f.eks. termisk polymerisasjon av maleinsyreanhydrid og en fosforsyre-katalysert metode. Kjemisk syntese fører til a, p-formen av polymeren i stedet for a-formen som finnes i de naturlige omgivelsene. Kjemisk syntese produserer også biprodukter. Foreliggende oppfinnelse forsøker derfor å tilveiebringe en ny måte å generere og anvende polyAsp på i miljøet nede i borehullet.

I foreliggende oppfinnelse foreslås det å gjennomføre brønnbehandling ved at det ned i brønnen føres termofile/Arcfrea-bakterier eller andre termofile bakterier eller organismer som er i stand til å generere brønnbehandlingskjemikalier.

Archea er ett av jordens tre organismesystemer, idet de andre to er eubakterier og eukaryoter (se Howland (red.) The Surprising Archaea, Oxford University Press, 2000). Archea kan deles i tre grupper: a) anaerobe metanogener; b) anaerobe og aerobe svovelmetaboliserende bakterier (f.eks. Sulfolobales og Termo-proteales) ; og c) moderat termofile Termoplasmales. Bare enkelte av gruppe a), men de fleste av gruppe b) er termofile, idet de er i stand til å overleve ved tempe raturer helt opptil 90-150°C. Den siste utgaven av Bergeys lærebok eller Howland (red.) (se over) kan konsulteres for en hensiktsmessig definisjon og klassifisering av Archea. Generelt kan Archea identifiseres utfra celleveggen derav som mangler et peptidoglykan-skjelett og utfra deres cytoplasmiske membran som inneholder glyceroletere med C20(fytanyl) og C40(bifytanyl) alkylisoprenoider i stedet for fettsyreglycerolesterne. I tillegg er de DNA-avhengige RNA-piolymerasene av Archea forskjellig fra de av eubakterier ved at de består av mer enn fire under-enheter og er motstandsdyktige mot antibiotikaene rifampicin og streptolycligin.

Ett aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn, en fremgangsmåte som omfatter at det ned i et produserende borehull føres termofile/Arcfrea-bakererier eller andre termofile bakterier eller mikroorganismer som er modifisert genetisk for å producere et brønnbehandlingskjemikalie. Egnede mikroorganismer vil være halofile og anaerobe samt termofile, f.eks. enkelte svovelreduserende bakterier så som Desulfovibrio-, Desulfobulbus-, Desulfobacter, Desulfococcus- stammer etc, forskjellige Bacillus-arter, Clostridium- arter, Termoanaerobacter, Termoanaerobium, Termobacteroides, Termodesulfobacterium, enkelte Pseudomonas etc. Enkelte svovelreduserende bakterier kan også benytte andre metabolske veier gjennom laktat eller acetat. Disse Archea eller andre termofile organismer kan være naturlig forekommende, men typisk vil de måtte modifiseres genetisk for å produsere brønnbehandlingskjemikalier. Archea, spesielt genetisk modifisert Archea, er foretrukket for anvendelse i fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen. I en spesielt foretrukken utførelse vil brønnbehandlingskjemikaliene være midler som hemmer belegg.

Termofile bakterier har generelt vært ansett som et problem i oljebrønner ettersom de vanligvis er svovelmetaboliserende og genererer toksisk hydrogensulfid.

Som angitt i det ovenstående, foreslås det i samsvar med foreliggende oppfinnelse å føre mikroorganismer ned i et produserende borehull, og det er i henhold til oppfinnelsen således ikke tenkt at mikroorganismer skal føres ned gjennom et injeksjonshull. Betingelsene i de to hullene er svært forskjellig, både når det gjelder de fysikalske omgivelsene og de boreproblemene som oppstår. En effektiv behandlingsmetode i ett hull ville således sannsynligvis ikke være egnet for det andre. På samme måte vil mikroorganismer som kunne trives i omgivelsene i det ene hullet ikke nødvendigvis overleve i det andre .

Den anvendte mikroorganismen er fortrinnsvis en mikroorganisme som er hjemmehørende på hydrokarbonfeltet hvor brønnen som skal behandles er lokalisert. Det beskrives her metoder for å ta prøver av og identifisere egnede mikroorganismer som allerede finnes på feltet, og som kan anvendes i fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen. Det kan imidlertid anvendes andre typer av Archea, så som de som er deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) og British Collection of Industrial and Marine Bacteria (CIMB).

Eksempler på egnede arter omfatter: Desulfotomaculum, Archaeoglobus (f.eks. A. fulgidis), Termodesulforabdus, Petrofaga (f.eks. P. mobilis), Methanoc-ocous (f.eks. M. termolithotrophus), Termodesulfotobakterier, Sulfolobales, Ter-moprotealis, Termoplasmales. Medlemmer av alle de allerede nevnte gruppene av Archea kan anvendes i fremgangsmåtene i henhold til foreliggende oppfinnelse, forutsatt at de oppviser den nødvendige termofile karakter.

Archea og andre bakterier eller mikroorganismer som kan overleve ved temperaturer på over 50°C (mer foretrukket over 70°C) er å anse som "termofile". De mikroorganismene, spesielt Archea, som kan trives ved temperaturer over 90°C, er spesielt foretrukket.

Archea og andre bakterier eller mikroorganismer kan etter behov være fakultativt anaerob/strengt anaerob, og ha svært enkle ernæringskrav. Dette er spesielt viktig ettersom det kan være nødvendig å innføre bakteriene og næringsmidlene for samme ned i hullomgivelsene, f.eks. i en porøs matriks. Archea og de andre bakteriene eller mikroorganismene kan på enkel måte anvende kortkjede-hydrokarbon eller acetat i sin energimetabolisme. De ønskede næringsmidlene kan på enkel måte innføres i den porøse matriksen eller injiseres sammen med bakteriene eller de andre mikroorganismene i porøse partikler.

Archea og de andre bakteriene eller mikroorganismene kan modifiseres genetisk ved hjelp av standard teknikker for å innføre operative nukleinsyresekvenser som koder for proteiner som er

brønnbehandlingskjemikalier eller som medvirker i produksjonen av kjemikalier som er egnet for anvendelse i brønnbehandlingskjemikalier. Bakteriene kan således produsere brønnbehandlingskjemikaliene direkte, eller de kan produsere forløpere til eller generatorer for brønnbehandlingskjemikalier. Det er mulig at i samsvar med den genetiske modifiseringen er det en reguleringsanordning

(regulatory) i stedet for en kodingssekvens som føres inn i vertsorganismen og er ansvarlig for å slå på eller forsterke ekspresjon av en relevant kodingssekvens.

Følgende referanser og andre fra den tredje internasjonale kongress om extremophiles, 3.-7. september, 2000, Technical University Hamburg-Harburg, kan konsulteres mht. omvandling av Archea: - L27: "Phylogenetic Patterns of Posttranscriptional Modification in Ribosomal RNA of Termophiles", Crain, P.F.; Noon, K.R.; Stetter, K.O. og McCloskey, J.A. fra The University of Utah; - P132: "Overexpression in Escherichia coli of the Gene Coding for Glucose Dehydrogenase from Haloferax mediterranei", Esclapez, J.; Pire, C; Ferrer, J. og Bonete, M.J. fra The University of Alicante; - P122: "Molecular Cloning of an Extremely Termostable Esterase Gene from the Hypertermofilic Archaeon Sulfolobus solfataricus by Expression in Escherichia coli", Morana, A.; Aurilia, V.; Di Prizito, N. og Cannio, R. fra Instituto di Scienze deH'Alimentazione, Consiglio Nazionale deile Ricerche (CNR); - L52: "A Genetic System for the Hypertermofilic Archaeon Pyrococcus abyssi: Spheroplasts Transformation and Construction of a Shuttle Vector", Lucas, S.; Toffin, L; Zivanovic, Y.; Forterre, P.; Charlier, D.R.; Prieur, D. og Erauso, G. fra University Paris-Sud.

Referanser i det følgende til " Archea" gjelder mutatis mutandis til andre termofile bakterier eller mikroorganismer som kan føres ned i hullet i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

For ekspresjon av eksogene gener i Archea er en rekke vektorer blitt beskrevet og anvendt i tidligere teknikk. For eksempel beskriver Cannio et al.

(1998, J. Bacteriol. 180(12): 3237-40) en vektor som er spesielt effektiv i Sulfolobus solfataricus. Cannio et al. beskriver videre metoder og vektorer for omdannelse av Archae i journalen "Extremophiles" 2001 5(3): 153-9. Skyttel-vektorer som er egnet for anvendelse i E. Coli og Sulfolobus er også blitt laget (Cannio et al, første vedrørende 'Extremophiles as cell Factories', Athen, 19-21 April 1997). Disse avhandlingene er inkorporert heri som referanse. Modifiseringer av disse vektorene som kan være ønskelig for anvendelse med andre arter av mikroorganismer er kjent innenfor fagområdet og er innenfor den kompetansen som en som arbeider på dette området har.

En fremgangsmåte for omdannelse av en Archea som omfatter at det inn i nevnte Archea føres et nukleinsyremolekyl, hvis ekspresjon direkte eller indirekte resulterer i produksjon, typisk ved hjelp av Archea selv, av et brønnbehandlings-kjemikalie, omfatter et ytterligere aspekt av oppfinnelsen.

Archea som er blitt genetisk modifisert til å produsere brønnbehandlings-kjemikalier, omfatter et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse. Behand-lingskjemikaliet som produseres ved hjelp av Archea vil være nyttig i omgivelsene til et produserende hull og Archea som er i stand til å overleve i disse omgivelsene.

Gener som koder for anvendbare brønnbehandlingskjemikalier eller enzymer eller andre faktorer som er involvert i produksjonen av aktive brønnbehand-lingskjemikalier fra en organisme, kan således under anvendelse av egnede omvandlingsteknikker som er velkjente innenfor fagområdet, føres inn i verts-Archea. Generelle retningslinjer når det gjelder kloningsteknikker er å finne f.eks. i Molecular Cloning Laboratory-læreboken av Maniatis et al., publisert av Cold Spring Harbour Laboratory Press. Nærmere bestemt viser referanse L52 hvordan transformasjon for eksempel kan oppnås i den hypertermofile Archea Pyrococcus abyssi.

Gener som er egnet for å tilveiebringe organismer kan være andre bakterier eller mikroorganismer eller høyere eukaryoter inkludert planter og pattedyr. Ekspresjonsproduktet bør være stabilt i ved betingelsene nede i hullet, og kan således typisk være termostabilt. Målorganismer for tilveiebringelse av genet av interesse kan således selv eksistere i ganske ekstreme omgivelser. Genet som føres inn i Archea kan ha blitt modifisert for å forbedre termostabiliteten til ekspresjonsproduktet. Videre kan proteiner som uttrykkes ved organismer som selv ikke kunne overleve nede i borehullet være tilstrekkelig stabile til å overleve i aktiv form når de uttrykkes ved den termofile Archea. Proteinet kan også inneholde ytterligere modifisering, så som tilsetning av tags, f.eks. his tags eller mye tags, som forbedrer isoleringen av proteinet fra systemet, dersom dette er nødvendig.

For enkelte av de enklere brønnbehandlingskjemikaliene, f.eks. poly-aminosyrer så som polyaspartat, kan nukleinsyren som koder for genet syntetiseres de novo (dvs. ikke tatt fra en annen organisme) og innført i Archea på vanlig måte.

Transformasjon vil typisk omfatte en plasmidvektor som også vil inneholde et gen for å muliggjøre identifikasjon av Archea som er transformert med godt resultat, f.eks. et gen for antibiotisk motstand så som kloramfenikol-acetyltrans-ferase. Når mikroorganismen føres ned i brønnhullet, kan antibiotikaen også innføres, f.eks. kan organismen, næringsmidlene og antibiotikaen koinjiseres i porøse partikler. På denne måten kan endogene bakterier slås ut, noe som gir en konkurransemessig vekstfordel for den modifiserte organismen. Andre metoder for utvelging av transformanter er kjente for fagpersonen, og omfatter anvendelse av en lyssensitiv vektor, et lux-gen, som får positive kolonier til å lyse opp i mør-ket. Andre egnede bærere for omvandling av bakteriene inkluderer kosmider og bakteriofage molekyler.

Som godt forstått på fagområdet, må genet som føres inn i Archea være operativt forbundet med kontrollsekvenser som er kompatible med normal gen-ekspresjon i >Arc/7ea/-verten. Kontrollsekvenser induserer akseleratorer og eventuelt regulerende sekvenser som fører til at et gen slås på eller av som respons på et kjemikalie eller fysisk stimulus. Genet kan settes inn i/Arc/7ea/-kromosomet og kan reguleres ved endogene kontrollsekvenser eller dersom vektoren ikke sette inn (insert), så vil genet av interesse ko-transfekteres med egnede regule-rings- og akselereringssekvenser.

Det kan være nødvendig å tilføre til/Arcfrea-aminosyrene ko-faktorer etc. som er nødvendige i produksjonen av brønnbehandlingskjemikaliene.

Eksempler på enkle ikke-naturlige brønnbehandlingskjemikalier som kan produseres på denne måten inkluderer aspartatrike eller aspartatgjentagende polypeptider og oligopeptider og asparginsyrepolymerer og -oligomerer som kan fungere som belegginhibitorer.

En spesielt foretrukken gruppe av belegginhibitorer er molekyler som er rike på aminosyrer med ladede sidekjeder, spesielt anioniske aminosyrer så som asparginsyre eller glutaminsyre, men også inkludert kationiske aminosyrer så som lysin, arginin eller histidin. Slike molekyler som opptar ikke-genetisk kodede ladede aminosyrer kan syntetiseres in situ ved hjelp av Archea, selv om molekyler som kan være generert ved hjelp av omsetting og således omfatte bare de 20 genetisk kodede aminosyrene, er foretrukket.

Brønnbehandlingskjemikaliet kan således være et peptid (det skilles her ikke mellom 'peptid' og 'polypeptid') som er rikt på ladede, spesielt sure, aminosyrer. Et slikt peptid kan bestå utelukkende av ladede aminosyrer eller en effektiv andel av ladede aminosyrer; f.eks. over lengden eller en del derav vil mellom 30, fortrinnsvis mellom 50 og 100% av alle aminosyrene være ladet, f.eks. vil 60, 70, 80 eller 90% av alle aminosyrene være ladet. Dersom peptidet har en ladet del, så vil denne delen omfatte minst 10 aminosyrerester, fortrinnsvis 15 eller flere rester med en andel av ladede, fortrinnsvis sure, rester som drøftet i det foregående. Absolutt uttrykt vil brønnbehandlingspeptidet fortrinnsvis ha minst 3, fortrinnsvis 4 eller flere, mer foretrukket 6 eller flere, f.eks. 8 til 14 ladede rester eller 15 til 25 ladede rester, spesielt 20 til 25 ladede rester. Ladede rester kan være konsekutive eller adskilte av andre ikke-ladede rester, men generelt vil peptidet eller et/en område/del derav ha en tydelig ladet natur.

Polymeren kan være en kopolymer f.eks. av asparginsyre og histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin. Det er påvist at kopolymerer av asparginsyre og prolin eller histidin kan være en mer effektive belegginhiberende polymerer enn polymerer av asparginsyre alene. De ikke-ladede restene er fortrinnsvis prolin. Selv om nærvær av metionin på N-enden av peptidet også kan fore-komme.

Det ladede polypeptidet er mest foretrukket polyAsp. Referanser som her er gjort til "polyAsp" inkluderer kopolymerer som drøftet i det foregående, men i hvert tilfelle er minst 30% fortrinnsvis minst 50%, f.eks. minst 70%, av restene i det endelige peptidproduktet asparginsyre. Igangsetting av omsetting vil kreve nok en rest i den første posisjonen (avledet fra start-codon) av det opprinnelig uttrykte peptidet, typisk vil denne være Met selv om bakterier også kan anvende andre rester i den første posisjonen. Det endelige polyAsp-produktet som anvendes i brønnbehandlingen kan bibeholde den opprinnelige resten eller denne kan være spaltet, spesielt der hvor polyAsp-genet inkorporerer et oppstrøms signal eller en annen sekvens. PolyAsp-produktet (unntatt hvilke som helst signal- eller merke-sekvenser) vil typisk ha en lengde på 15 - 75 aminosyrer, en lengde på f.eks. 20 - 45 aminosyrer, og vil fortrinnsvis inkorporere 1 - 8, f.eks. 2-4 prolin-rester.

Produksjonen av polyAsp fra en naturlig fornybar kilde så som Archea eller bakterier enten in situ i brønnen eller i en bioreaktor, tilveiebringer et effektivt middel for å produsere store mengder av polyAsp. Anvendelse av Archea eller bakterier for å produsere polyAsp er således også mer miljøvennlig enn hvilken som helst av dagens metoder. Produksjonen av polyAsp kan enten finne sted in situ, som beskrevet et annet sted i søknaden, via ekspresjonen derav i genetisk modifisert termofil Archea, eller kan alternativt finne sted i en bioreaktor.

Brønnbehandlingskjemikaliet kan omfatte et proteinmolekyl, f.eks. et nor-malt uttrykt >Arc/7ea/-protein som er blitt modifisert for å øke antall ladede rester i samme, enten ved å øke antall ladede, fortrinnsvis sure rester som finnes i hele molekylet, men mer foretrukket ved å tilsette et ladet område til molekylet. Det uttrykte proteinet kan således uten problemer ha et ladet område som ikke finnes i det naturlige molekylet. Det ladede området vil fortrinnsvis være på utsiden av proteinmolekylet slik at det er tilgjengelig og i stand til å utøve sine belegginhiberende egenskaper.

Proteinet eller polypeptidet kan utskilles ved hjelp av Archea eller forbli festet til den bakterielle celleoverflaten. Større proteiner kan gå gjennom celleveggen, idet de har sine ladede områder på utsiden av Archea. Det er mulig å modifisere utsondringen av et peptid ved å tilsette eller fjerne signalpeptider som styrer peptidet til å bli utsondret. Signalpeptider for utsondring eller membran-lokalisering er velkjent innenfor fagområdet. Signalpeptidene kan spaltes under eller etter utsondringsprosessen eller de kan forbli festet til peptidmolekylet. Når en signalsekvens spaltes på denne måten, er det mulig på enkel måte å fjerne den igangsettende Met-resten. Referanse her til "polyAsp"-molekyler innbefatter referanse til molekyler som inkorporerer slike signalsekvenser, så som APR (alkalisk protease) -signalsekvensen.

Mange egnede peptidbelegginhibitormolekyler vil være nye, og disse mole-kylene utgjør et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse. Nukleinsyremolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som koder for eller er komplementær til en sekvens som koder for disse peptid-belegginhibitormolekylene utgjør et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse. En genetisk konstruksjon som omfatter slike nukleinsyremolekyler som er operativt forbundet med en promotersekvens er enda et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse.

Et eksempel på en nukleinsyre som koder for et brønnbehandlingskjemika-lie er 5'-CATGGATGACGATGATGACCCGGATGATGACGACGATGACGATGAC GATCCGGACGATGACGACGATGATGACGATGATCCTAGGCATCACCATCAC CATCATTAAG-3'. Nukleinsyremolekyler som omfatter denne sekvensen og polypeptidene som inkorporerer aminosyresekvensen som koder for samme, MDDDDDPDDDDDDDDDPDDDDDDDDDPRHHHHHH, omfatter ytterligere aspekter av oppfinnelsen, og det gjør også vektoren pET11d-Asp som beskrevet i eksempel 2. Varianter og fragmenter av disse sekvensene som på tilsvarende måte er rike på Asp-rester (eller triplettene som koder for samme, etter behov) er ytterligere aspekter av oppfinnelsen. Det kan være foretrukket å utvikle polyAsp-genet slik at de forskjellige tripletter som koder for Asp er inkorporert for å unngå selvsammenkopling selv om dette problemet kan unngås ved anvendelse av dsDNA.

Spesielle varianter av interesse er de som mangler C-ende-His-restene (og det forbindende Arg). Dersom polyAsp smeltes til en signalsekvens, så vil det typisk mangle sitt eget initierings-codon og derfor ikke inkorporere de fire 5'-basis-CATG.

Andre anvendbare brønnbehandlingskjemikalier som kan produseres ved hjelp av Archea, omfatter alkoholer og glyceroler, proteinholdige og ikke-proteinholdige anti-frysemolekyler og bio-overflateaktive midler.

Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av naturlig forekommende organismer, dvs. organismer som ikke er blitt genetisk modifisert og som fortrinnsvis hører hjemme i oljereservoaret eller borehullet. Slike organismer har utviklet seg til spesifikt å behandle betingelsene som er å finne på disse stedene, og kan produsere produkter som er anvendbare i oppfinnelsen. Slike produkter omfatter organiske syrer som beskytter mot karbonat, cryoprotein som virker mot hydrater (f.eks. gasshydrat som er et krystallinsk faststoff som utgjøres av et gassmolekyl som rundt seg har en ramme av vannmolekyler) og enzymer som bryter S-S-broer til lavere viskositet. Eksempler på slike organismer omfatter Archea som er eks-tremofile, dvs. ekstreme termofiler.

Archea kan avgis til stedet nede i hullet i eller på partikler, f.eks. porøse uorganiske partikler (f.eks. silika, alumina, etc.) eller polymerpartikler eller i kapsler, f.eks. kolloider, etc. Disse bærerpartiklene kan også transportere bakterielle næringsstoffer.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer partikler impregnert med termofil Archea som er genetisk modifisert for å produsere

brønnbehandlingskjemikalier.

Et annet aspekt av oppfinnelsen omfatter fremstilling av sammensetning for hydrokarbonbrønnbehandlinger av termofil Archea som er genetisk modifisert for å produsere brønnbehandlingskjemikalier.

Enda et ytterligere aspekt av oppfinnelsen omfatter en hydrokarbonsam-mensetning for brønnbehandling omfattende en bærervæske som inneholder termofile Archea som er genetisk modifisert for å produsere

brønnbehandlingskjemikalier.

Et videre aspekt av oppfinnelsen omfatter et rørformet filter for anbringelse nede i hullet inneholdende termofile Archea som er genetisk modifisert for å produsere brønnbehandlingskjemikalier.

I fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan bakteriene anbringes nede i hullet før og/eller etter at hydrokarbonproduksjon (dvs. ekstraksjon av olje eller gass fra brønnen) har begynt. Fortrinnsvis anbringes bakteriene nede i hullet før produksjon har begynt, spesielt i kompletteringsfasen av brønnkonstruksjon.

Bakteriene kan anbringes i borehullet (f.eks. i de hydrokarbonbærende strata eller i "rottehull") eller i den omgivende formasjonen (f.eks. i sprekkdannel-ser eller i selve bergarten). I det førstnevnte tilfellet impregneres bakteriene uten problemer inn i partikler som befinner seg i et rørformet filter, f.eks. en gruspakke eller en filterstruktur som beskrevet i EP-A-656 459 eller WO 96/27070; i det sist-nevnte tilfelle posisjoneres bakteriene (eventuelt impregnert inn i partikler) fortrinnsvis ved å presse en flytende blanding som inneholder bakteriene ned i borehullet. Bakteriene anbringes, fortrinnsvis før produksjon begynner, både i borehullet i et filter og i den omgivende formasjonen. Bakteriene inokuleres alternativt inn i partiklene.

Når bakteriene (typisk impregnert inn i partikler) anbringes i den omgivende formasjonen, så bør det anvendte trykket være tilstrekkelig til gjøre at bakteriene trenger inn minst 1 m, mer foretrukket minst 1,5 m, enda mer foretrukket minst 2 m, i formasjonen. Om ønsket, kan bakteriene anvendes i forbindelse med porøse partikler for å oppnå en penetrasjon på ca. 2 m eller mer inn i formasjonen. Sam-mensetninger som omfatter slike små, porøse partikler og bakterier i samsvar med oppfinnelsen, og som kan blandes sammen med næringsstoffer, utgjør et ytterligere aspekt av oppfinnelsen.

Partikler som er gjennomfuktet eller ladet (også angitt her som impregnert) med Archea i samsvar med oppfinnelsen har fortrinnsvis modus partikkelstørrel-ser (f.eks. som målt med em Coulter-analyserer for partikkelstørrelser) på 1 nm til 5 mm, mer foretrukket 10 nm til 1000 nm, spesielt 250 til 800 nm. For anbringelse inne i formasjonen er modus partikkelstørrelsen fortrinnsvis 1 til 50 nnn, spesielt 1 til 20nnn, f.eks. 1 - 5 nnn. For hvilken som helst spesielle formasjon kan forma-sjonspermeabilitet (som korrelerer til porestrupe-størrelsene i formasjonen) lett bestemmes under anvendelse av bergartprøver tatt under boring, og den optimale impregnerte partikkelstørrelse kan således bestemmes. Ettersom partiklene pro dusert som beskrevet i EP-B-3905, US-A-4 530 956 og WO 99/19375 har en svært lav dispersitet (dvs. størrelsesvariasjon), kan det oppnås en svært ensartet avsetning og dyp penetrasjon inn i formasjonen. Av denne årsak har partiklene fortrinnsvis en variasjonskoeffisient (CV) på mindre enn 10%, mer foretrukket mindre enn 5%, enda mer foretrukket mindre enn 2%.

CV bestemmes i prosent som

hvor middel er den midlere partikkeldiameter og standardavvik er standardavviket i partikkelstørrelse. CV beregnes fortrinnsvis på hovedmodusen, dvs. ved å til-passe en monomodal fordelingskurve til den påviste partikkelstørrelsesfordeling.

Enkelte av partiklene under eller over modus størrelse kan således ikke være tatt med i beregningen som f.eks. kan være basert på ca. 90% av samlet partikkelan-tall (dvs. av påvisbare partikler). En slik bestemmelse av CV er gjennomførbar på en Coulter-partikkelstørrelsesanalyserer av typen LS 130.

For anbringelse i filtere har de impregnerte partiklene fortrinnsvis modus partikkelstørrelser på 50 til 5000 nm, mer spesielt 50 til 1000 nm, enda mer foretrukket 100 til 500 nnn. I slike filtere utgjør de impregnerte partiklene fortrinnsvis 1 til 99 vekt%, mer foretrukket 2 til 30 vekt%, enda mer foretrukket 5 til 20 vekt% av den partikkelformige filtermatriksen, idet den gjenværende matriksen omfatter partikkelformig olje- og vannuløselig uorganisk materiale, fortrinnsvis et uorganisk oksyd så som silika, alumina eller alumina/silika. Spesielt foretrukket har det uorganiske oksyd en modus partikkelstørrelse som er tilsvarende den for de impregnerte polymerpartiklene, f.eks. innenfor 20%, mer foretrukket innenfor 10%. Når det gjelder i-formasjon-anbringelsen, så har de impregnerte partiklene fortrinnsvis lav dispersitet, f.eks. en CV på mindre enn 10%, mer foretrukket mindre enn 5%, enda mer foretrukket mindre enn 2%. Den lave dispersitet tjener til å forhindre tilstopping av filterne.

Porene i partiklene vil være store nok til at det er mulig for mikroorganismene å penetrere uten vanskeligheter, f.eks. en poreradius på opptil 2-4 nnn.

De impregnerte partiklene er fortrinnsvis partikler med et porevolum på minst 50%, mer foretrukket minst 70%, f.eks. opptil minst 85%.

De bakterielt impregnerte polymerpartiklene som anvendes i samsvar med oppfinnelsen, f.eks. MPP eller andre trinn-dyrkede polymerpartikler er fortrinnsvis vinyl-homo- og kopolymerer, mer foretrukket styreniske homo- and kopolymerer. Eksempler på egnede monomerer omfatter vinylalifatiske monomerer så som estere av akryl- og metakrylsyrer, akrylnitril og vinylaromatiske monomerer så som styren og substituerte styrener. Foretrukne polymerer er styreniske polymerer, eventuelt og fortrinnsvis tverrbundne, f.eks. med divinylbenzen, og partikler av slike polymerer er kommersielt tilgjengelige i et område av størrelser og porevolu-mer fra Dyno Specialty Polymers AS i Lillestrøm, Norge. Om ønsket, kan partiklene funksjonaliseres, f.eks. for å tilveiebringe sure overflategrupper eller basiske overflategrupper (f.eks. karboksyl- eller aminofunksjoner), f.eks. for å ødelegge metallatomer fra vann som når partiklene med det formål å redusere beleggdan-nelse, for å fremme partikkeladhesjon til formasjonsoverflater, for å fremme eller hindre partikkelaggregering, etc. Også her er funksjonaliserte partikler tilgjengelig fra Dyno Specialty Polymers AS.

Fortrinnsvis har polymermatriksen til de impregnerte partiklene et myk-ningspunkt over de temperaturene som påtreffes nede i hullet, f.eks. over 70°C, mer foretrukket over 100°C, enda mer foretrukket over 150°C.

Generelt vil partiklene der hvor de er impregnert med bakterier også være impregnert med næringsstoffer for bakteriene, f.eks. sakkarose, slik at bakteriell vekst fremmes straks partiklene kommer i vann. Alternativt kan det anvendes så-kalte "ultramikrobakterier" som er "utsultet" under injeksjonstrinnet, noe som gjør at de lettere penetrerer dypt inn i formasjonen. Påfølgende administrasjon av næringsstoffer vil så stimulere vekst.

Eksempler på typiske brønnbehandlingskjemikalier, forløpere og generatorer er nevnt i de patentpublikasjonene som det her er referert til, hvorav innholdet av alle herved inkorporeres ved referanse.

Således omfatter f.eks. typiske belegginhibitorer uorganiske og organiske fosfonater (f.eks. natriumaminotrismetylenfosfonat), polyaminokarboksylsyrer eller kopolymerer derav, polyakrylaminer, polykarboksylsyrer, polysulfonsyrer, fosfat-estere, uorganiske fosfater, polyakrylsyrer, inuliner (f.eks. natriumkarboksymetyl-inulin), phytinsyre og derivater (spesielt karboksyliske derivater) derav, polyaspartater, etc.

Anvendelse av miljøvennlige belegginhibitorer, f.eks. inulintyper, fytinsyre og derivater derav og polyaspartater, er spesielt foretrukket.

Der hvor belegginhibitorer! er en polymer, så kan den selvsagt inneholde rester av én eller flere forskjellige ko-monomerer, f.eks. en kopolymer av asparginsyre og prolin.

Andre gunstige mikrobielle produkter omfatter enzymer som i seg selv er i stand til å syntetisere brønnbehandlingskjemikalier så som belegginhibitorer. Det kan være nødvendig å omvandle bakteriene med en pluralitet av gener som koder for forskjellige enzymer som er involvert i en syntetisk vei for et beskrevet brønn-behandlingskjemikalie. Brønnbehandlingskjemikaliet kan således produseres direkte ved hjelp av Archea, dvs. et ekspresjonsprodukt, eller produseres indirekte som et resultat av metabolisme eller katabolisme innen Archea. Brønnbehand-lingskjemikaliet kan således være proteinholdig, f.eks. et polypeptid eller glykopro-tein, men ikke nødvendigvis, og kan være et polysakkarid eller et lipid.

I en spesielt foretrukken utførelse kan brønnbehandlingskjemikaliet ha en todelt funksjon. Dette kan lett oppnås, f.eks. ved produksjon av et fusjonsprotein som kan ha en belegginhiberende del og en del som virker f.eks. som en korrosjonsinhibitor, biooverflateaktivt middel eller anti-frysemiddel. Polyaspartat er spesielt anvendbart ettersom det kan fungere som belegginhibitor og en korrosjonsinhibitor.

Eksempler på foretrukne brønnbehandlingskjemikalier inkluderer: hydratinhibitor, belegginhibitorer, asfalteninhibitorer, voksinhibitorer og korrosjonsinhibito-rer. Slike inhibitorer er velkjente for fagfolk som arbeider innenfor feltet brønnbe-handling.

Under visse spesielle omstendigheter, f.eks. dersom det oppstår problemer med karbonatbelegg eller med utfelling av organisk naftenat, kan det være hensiktsmessig å innføre mikroorganismene som her er drøftet inn i injeksjonsbrøn-nen. I et ytterligere aspekt tilveiebringer således foreliggende oppfinnelse også en fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn; en fremgangsmåte som omfatter at det ned i en injeksjonsbrønn sendes termofile/Arcfrea-bakterier eller andre termofile bakterier eller mikroorganismer som er blitt genetisk modifisert for å produsere brønnbehandlingskjemikalier, er drøftet i det foregående. Mikroorganismene som innføres i injeksjonsbrønnen kan med fordel produsere organiske syrer og/eller kjemikalier som er involvert i hydratinhibering.

Der hvor bakteriene er anbrakt i selve formasjonen, anvendes de fortrinnsvis som en dispersjon i en flytende bærer. Forfor- eller etter-kompletteringsformål består den flytende bæreren fortrinnsvis av en ikke-vandig organisk væske, f.eks. et hydrokarbon eller en hydrokarbonblanding, typisk et C3til C15hydrokarbon, eller olje, f.eks. råolje. For helbredende behandling, f.eks. etter at produksjon har pågått i noen tid, kan den flytende bæreren være vandig eller ikke-vandig.

Impregnering av bakteriene og om ønsket næringsstoffene og/eller andre brønnbehandlingskjemikalier inn i porøse bærerpartikler kan gjennomføres på hvilken som helst konvensjonell måte, f.eks. ved å bringe partiklene i kontakt med en vandig eller ikke-vandig dispersjon av bakteriene eller andre kjemikalier, fulgt om nødvendig av løsemiddelfjerning, f.eks. ved drenering, tørking eller under vakuum.

Det er imidlertid spesielt foretrukket å impregnere partikler med bakteriene ved hjelp av oppslemmingsblanding, f.eks. ved å tilsette en mengde av dispersjon som ligger nær opptil porevolumet til partiklene, f.eks. 0,8 til 1,2 ganger porevolumet, mer foretrukket 0,9 til 1,1 ganger porevolumet. Enda mer foretrukket er det å impregnere partiklene ved en gjennomfuktingsprosedyre under anvendelse av vakuum. Prosessen kan på enkel måte gjennomføres i en rotasjonsfordamper ved 0-15 mbar ved romtemperatur og fortsette ved 50°C inntil mesteparten av vann-fasen er fjernet. Det er ønskelig å innføre bakterier i poresystemet ikke bare på overflaten. Om ønsket, kan partikkelladingen økes ved å gjennomføre mer enn ett impregneringstrinn.

Forskjellige metoder kan anvendes for å opprettholde mikroorganisme-populasjonen in situ. Mikroorganismen kan immobiliseres i den porøse matriksen med ernæringspakker eller ko-injiseres med næringsstoffer inn i små porøse partikler som deretter kan injiseres dypt (f.eks. 2 - 10 m) inn i formasjonen. En høy konsentrasjon av inokulater av de termofile bakteriene kan føres inn i de porøse partiklene. Fortrinnsvis er enkelte av de innførte bakterielle artene i stand til å av produsere levedyktige sporer i omgivelsene i brønnen.

Oppfinnelsen omfatter også en bioreaktor for syntetisering av brønnbe-handlingskjemikalier. Brønnbehandlingskjemikaliene lages således i bioreaktoren og anvendes deretter for hydrokarbonbrønnen. I en foretrukken utførelse kan partikler av den typen som her er beskrevet, dvs. porøse impregnerbare partikler, lades med produktene fra bioreaktoren. Bioreaktoren, som kan være anbrakt på eller i nærheten av stedet for borehullet eller langt fra borehullet, kan ha som funksjon å muliggjøre produksjon av ethvert brønnbehandlingskjemikalie, så som de som er beskrevet i det foregående. Fortrinnsvis kan bioreaktoren muliggjøre produksjonen av peptidbelegginhibitorer så som poly(aminosyrer), f.eks. polyAsp eller andre hovedsakelig (positivt) ladede polypeptider som er egnet for anvendelse som brønnbehandlingskjemikalier. Organismene som anvendes i bioreaktoren kan være naturlig forekommende, f.eks. naturlig forekommende bakterier eller Archea, som eksemplifisert i det ovenstående at produkt-brønnbehandlings-kjemikalieprodukter syntetiseres enten ved modifisering eller ved å tilsette regulerende eller strukturelle sekvenser. Det er ikke nødvendig å anvende termofile arter dersom det anvendes en bioreaktor. Enhver mikroorganisme kan anvendes, f.eks. E. Coli.

Bioreaktor, som begrepet anvendes her, angir ethvert system for veksten av celler i kultur, nemlig mikroorganismer så som bakterier eller Archea. Næringsstoffer kan tilføres til bioreaktoren og prøver tas ut uten vanskeligheter.

Produktet isolert fra organismene kan være utsondret eller kan være holdt tilbake i cellen. I det tilfellet hvor produktet er utsondret, kan det fjernes kontinuerlig fra celle-kulturmediet, ved å fjerne kulturmediet og erstatte det med det friske vekstmediet. Produktet kan så isoleres fra vekstmediet under anvendelse av standard teknikker. Alternativt kan mikroorganismene fjernes fra bioreaktoren og produktet isoleres etter celleødeleggelse, under anvendelse av teknikker som er kjent innenfor fagområdet.

For å fremme isolering av produktet, i det tilfellet hvor det er et eksogent protein, kan proteinet modifiseres for å fremme isolering f.eks. merkes under anvendelse av et tag, så som et his tag eller et mye tag. Slike tags og isoleringsteknikker er velkjent innenfor fagområdet.

Produktene laget i bioreaktoren, f.eks. peptidbelegginhibitorer så som polyAsp, isoleres enten fra lysede mikroorganismer eller utsondres og isoleres fra vekstmediet. Det kan være nødvendig å tilsette sekvenser som koder for amino-syresignaler som styrer utsondringen av proteinet under visse omstendigheter. Uansett produksjonsmodus så kan produktet deretter blandes inn i den generelle formuleringen som er nødvendig for en tradisjonell pressebehandling.

Bioreaktorer tilveiebringer således et miljøvennlig system for produksjon av brønnbehandlingskjemikalier. Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er derfor an-vendelsen aven bioreaktor for å produsere brønnbehandlingskjemikalier. Brønn-behandlingskjemikaliene er fortrinnsvis peptidiske belegginhibitorer, eller andre substanser som er anvendbare nede i borehullet, inkludert ladede peptider. Mest foretrukket er det ladede peptidet polyAsp eller en kopolymer av asparginsyre og en annen aminosyre som beskrevet i det foregående.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ytterligere med referanse til følgende ikke-begrensende eksempler og figurene hvor: Fig. 1 viser et skjematisk bilde av plasmidet pET11 d-aspartat beskrevet i eksempel 2. Dette plasmidet koder for polyAsp, og kan anvendes for å omdanne mikroorganismer som her beskrevet.

EKSEMPEL 1

Kloning av gen for polyaspartat (PA)

Det ble anvendt et pET E. Co//'-ekspresjonssystem. Dette systemet har en sterk selektivitet av den bakteriofage T7 RNA-polymerasen for dens kognate promotor sekvenser, det høye aktivitetsnivå av polymerasen og den høye transla-sjonseffekt mediert ved T7 igangsettingssignalene for omsetting.

Oligonukleotid for PA

Kodonpreferanse for PA ble undersøkt i the "Codon usage database"

(http://www.kazusa.or.jp/codon/) før syntese. PA nukleotid ble syntetisert med sekvensen —GATGATGAT— 75 basispar (25 aminosyrer), i tillegg til start- og stoppkodoner og spesifikke sekvenser for ligering til vektor etter nedbryting med restriksjonsenzymer (Euro GenTec).

Fremstilling av vektor og oligonukleotider

Vektor pET 11a (1 g/ml; Stratagene, La Jolla, CA, USA) ble nedbrutt med restriksjonsenzymet Ndel (37°C over natten). Vektoren ble behandlet med "kalve-innvolls-alkalisk fosfatase" (CLAP; Stratagene) som beskrevet av fremstilleren. Vektoren ble så utskilt ved hjelp av agarose-gelelektroforese (1% agarose), skåret i tynne skiver fra gelen og renset ved hjelp av gelekstraksjonsreagenser (Qiaquick gel-ekstraksjonssett, Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland).

Oligonukleotider (100 pmol/l) ble oppvarmet (95°C, 5 min.), temperaturen ble deretter redusert med 1°C/min. til 65°C og prøven anbrakt på is før ligering. Det ble brukt et forhold mellom vektor og "insert" i overensstemmelse med anbefalinger fra produsenten.

Ligering og omvandling

Ligering ble gjennomført over natten ved 18°C under anvendelse av flere forskjellige forhold mellom vektor og "innsert". Det ble anvendt T4 DNA ligase og 10x ligase buffer (pH 7,6).

Ligeringsblandingen ble omvandlet til E. coli DH5 med en "varmesjokk"-protokoll: En ligeringsblanding ble påført komponentcellene (50 I), inkubert på is (30 min.), anbrakt på en oppvarmingsblokk ved 42°C (45 sekunder) og til slutt på is (2 min.). Cellene ble så inokulert i LB-medium, inkubert i en rysteinkubator (37°C, 3 timer) og påført på LB-agar med x-gal, ITPG og ampicillin for utvelgelse av kloner. LB-plater ble inkubert ved 37°C over natten.

Isolering og sekvensering av plasmid-DNA

Hvitpigmenterte kloner ble valgt fra LB-agaren, inokulert i LB-næringsbul-jong med ampicillin, og inkubert i en rysteinkubator over natten (37°C). Plasmid-DNA ble isolert med Wizard Plus SV Miniprep DNA-rensesystem (Promega, Madi-son, Wl, USA) som beskrevet av produsenten. Sekvensering av plasmid-DNA ble gjennomført med "Big Dye" sekvenseringsreagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og med T7 promotor primer i reaksjonen. DNA ble utfelt i etanol og analysert i en AB I Prism DNA377 Sequencer (Applied Biosystems).

Eksempel 2

Også i dette eksemplet ble det pET E.Coli-systemet som er beskrevet i eksempel 1 anvendt.

Oligonukleotid for PA

GTCATC-3' ble syntetisert ved hjelp av EuroGen Tee.

Like mengder av hvert oligonukleotid ble sammenkoplet ved å blande sammen under oppvarming til 95°C og la blandingen kjøle seg av med 1°C/minutt til 65°C. De blandede oligonukleotidene ble så plassert på is. Dette danner et dobbeltstrenget DNA med klebrige ender kompatibelt med restriksjonsenzym-stedene Ncol og BamHI, slik at retningskloning av dsDNA innsatsen ble mulig.

Fremstilling av vektor

Vektor pETild (Stratagene) ble nedbrutt med restriksjonsenzymene BamHI og Ncol i samsvar med produsentens instruksjoner for å sikre fullstendig nedbryting. Vektoren ble behandlet med CIAP som beskrevet av produsenten. Den ned- brutte vektoren ble så utskilt fra det fjernede fragmentet ved hjelp av agarosegel-elektroforese og renset ved hjelp av gelekstraksjon.

Ligering

For ligering ble det anvendt flere forhold mellom vektor og "insert" i overensstemmelse med anbefalinger fra produsenten.

Ligering ble gjennomført under anvendelse av T4DNA-ligase og 10x ligase buffer (pH 7,6). Reaksjonen ble gjennomført over natten ved 18°C, i samsvar med standard teknikker. Den resulterende vektoren er vist på fig. 1.

Ligeringsblandingen ble omvandlet til (DH10B) E.coli celler under anvendelse av en standard "varmesjokk"-protokoll. De omvandlede cellene ble så inkubert, utplatet og utvalgt.

Plasmid-DNA ble isolert fra E.Coli og sekvensert som beskrevet i eksempel 1 for å påvise nærværet av insert og sekvensen derav.

Eksempel 3

Ekspresjon og isolering av PolyAspartat

Renset plasmid-DNA omvandles til E. Coli ER2566, som uttrykker T7 DNA-polymerasen, under kontroll av en lac promotor. Den omvandlede E. Coli kultive-res i 3XLB-medium, som inneholder ampicillin (200 ng/ml) i 7 timer, under rysting. Ekspresjonen av polyAsp induseres i én kultur etter 3 timer ved tilsetning av IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM. En ytterligere kultur beholdes unindusert for sammenligningsformål. Kulturen kan inkuberes ved en lavere temperatur etter induksjon, med det formål å øke virkningen av induksjon. Cellene høstes og sus-penderes på nytt i en tiendels volum av 10 mM Tris med pH 7,5 og sonikeres. Den resulterende blandingen sentrifugeres for å separere cellerester og supernatanten filtreres. Alikvoter av kulturmediet, sonikerte celler og filtrat tas ut for analyse, for å bestemme hvorvidt peptid utsondres eller holdes tilbake i cellen eller er nærværende som et løselig intracellulært/periplasmisk protein.

Proteinprøvene separeres under anvendelse av standard polyakrylamid-gelelektroforese, ved anvendelse av en 15% - 20% polyakrylamidgel. Et band ved omtrent 5kD viser nærværet av det ønskede produktet.

Om nødvendig kan produktet påvises under anvendelse av standard immuno-blottingsteknikker så som western Blots, under anvendelse av antilegemer rettet mot polyAsp på et passende proteinmerke.

Eksempel 4

Identifisering av Archea og bakterier som hører til på oljefelter

Disse mikroorganismene kan så anvendes som de er for å behandle en hydrokarbonbrønn, eller de modifiseres fortrinnsvis genetisk for å produsere et anvendbart brønnbehandlingskjemikalie så som polyAsp.

1. Materialer og metoder

1.1 Prøvetaking og bearbeiding

1.1.1 Prøvetaking

Steriliserte 5-liters prøveglasskolber (Schott) med 5 ml 0,1% (vekt/volum) resazurin reduksjonsmiddel (Sigma Chemical Co., St. Louis, MA, USA) pr. kolbe ble sendt til feltene offshore. Prøver ble innsamlet som råproduksjonsfluid (olje/ vann) fra produksjonsrørledningen før utskilling av produsert vann. Kolber ble fylt fullstendig. Det øverste oljelaget forseglet vannet fra atmosfæren, hvilket elimi-nerte oksygenering av vannfasene.

Prøver ble sendt i land i forseglede Al-kasser (transportperioder 1 - 2 uker). Under transporten ble kassene holdt ved omgivelsestemperatur.

Det ble ikke påvist spor av oksygen i vannfasene når prøvene kom på land.

1.1.2 Filtrering av vannprøver

Etter ankomst til laboratoriet ble olje- og vannfasene av produksjonsfluid-prøvene umiddelbart oppvarmet (70°C; 20 minutter) og de varme fasene adskilt i 2-liters skilletrakter (2 I). Mikrobiell biomasse fra 1 - 2 I vann ble oppsamlet ved filtrering gjennom 0,22 nm filtere av typen Sterivex GV (Millipore Corp., Bedford, Ma, USA) forbundet med Millex AP-prefiltere (Millipore). Etter filtrering ble hvert Sterivex-filter fylt med en 2 ni lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0; 40 mM EDTA; 750 mM sakkarose) og lagret ved -20°C inntil DNA-ekstraksjon.

Én av prøvene var godt emulgert, hvilket resulterte i bare en liten vannfase. Denne emu Isj onsfasen ble vasket med en steril bufferløsning, faseseparert og filtrert (omtrent 1 I bufferfase) som beskrevet i det foregående.

1.2 Celletellinger

Celleantallet i vannfaser av produksjonsfluidene ble telt opp umiddelbart

etter ankomsten på laboratoriet ved hjelp av epifluorescensmikroskopi. Prøver ble for-filtrert (Millex AP, Millipore), og 100 ml filtrater sentrifugert (6000 x g; 10 minutter for å fjerne grove partikler og rester av små oljedråper. Fluorkrom 4'6-diamino-

2-fenylindol (DAPI; 0,6 ng/ml) ble anvendt for supernatantene (10 ml) og prøvene inkubert ved romtemperatur (10 minutter), fulgt av filtrering gjennom 0,22 nm sorte polykarbonatfiltere (Millipore). Filterne ble montert i etfluorescensmikroskop (Leitz Dialux med Ploemopak fluorescensenhet og UV-filter A og utstyrt med et digitalt kamera av typen Leica DC 100) med neddykkingsolje. Fluorescerende celler ble tellet opp med 1250x forstørrelse.

1.3 Polymerasekjedereaksjon (per) amplifikasjon for reservoarprøver 1.3.1 Nukleinsyreekstraksjon og kvantifisering

De frosne Sterivex-filterne med mikrobielle kolonier ble tint og lysert direkte på filterne. Lysis ble gjennomført ved inkubering av hvert filter med 2 ng lysozym (Sigma; fra en 20 mg/ml forrådsløsning; 37°C i 30 minutter). Blandingene ble så inkubert ved 55°C i 2 timer med 1 ng Proteinase K (Sigma; fra en 20 mg/ml forrådsløsning) og 1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat (SDS; BioRad Labs, Richmont, CA, USA) fra en 20% forrådsløsning.

Lysatene ble overført til sterile rør, Sterivex-filterne vasket med lysisbuffer (55°C; 10 minutter), og lysatene fra hvert filter samlet. Lysatene ble ekstrahert med varm fenol-kloroform-isoamylalkohol (25:24:1) i samsvar med standard prosedyrer (Sambrook og Russel, 2001). Kort sagt ble hvert lysat (3 ml) blandet med 6 ml varm (60°C) Tris-HCI bufret fenol-kloroform-isoamylalkohol (pH 8,0), kraftig rystet, holdt varmt i 5 minutter, deretter avkjølt på is, fulgt av fasesepara-sjon ved sentrifugering (4000 x g; 5 minutter ved 4°C; Jouan Model 1812, Saint Nazaire, Frankrike). Natriumacetat (0,2 volumer av 10 M løsninger) ble anvendt for hver vannfase, og disse ble ekstrahert på nytt med 5 ml Tris-HCI bufret fenol-kloroform-isoamylalkohol, fulgt av sentrifugering. Vannfasene ble så ekstrahert med 5 ml varm (60°C) kloroform-isoamylalkohol (24:1) og sentrifugert som beskrevet i det foregående. De ekstraherte vannfasene ble utfelt ved hjelp av 2,5 volumer av 96% etanol (-20°C; 3 timer), utfellingene ble pelletisert ved hjelp av sentrifugering (4000 x g) og pelletene vasket med 75% etanol. Pelletene ble tørket (N2) etter sentrifugering på nytt og oppløst i 100 ni sterilt ultrarent vann (Biochrom AG, Berlin, Germany). Nukleinsyreekstraktene ble frosset (-20°C).

Ekstraherte nukleinsyrer ble semi-kvantifisert ved hjelp av en etidiumbro-midmetode (Sambrook og Russel, 2001). Nukleinsyrer (2 ni) ble spottet på en UV transilluminator-tabell (BioRad) omhyllet av plastfilm ("GladPak"), og 2 n' etidiumbromid (10 mg/ml i TE-buffer, pH 8,0) ble påført på hver flekk. Flekkene ble foto grafert under UV-belysning og konsentrasjoner bestemt ved sammenligning av intensitet med en standardserie av lakse-DNA (Sigma) i området 100 - 500 ng DNA pr. flekk.

1.3.2 Oligonukleotider og PCR reagenser

1.3.2.1 Oligonukleotider for PCR amplifikasjon

Oligonukleotid-primere ble fremstilt spesifikt for bakterier og Archea (Teske et al., 1996; DeLong, PNAS USA 89(1 ):5685-9, 1992):

Bakterier

Forventet PCR-produkt: 567 bp

Archea

Forventet PCR-produkt: 938 bp

Primerne ble syntetisert av EuroGentec, Seraing, Belgia. Primerne ble fortynnet i sterilt vann ved konsentrasjoner på 50 nM, fordelt i 50 ni alikvoter og lagret ved -20°C.

1.3.2.2 Biotinylerte oligonukleotider

Et antall biotinylerte DNA-oligonukleotider (5 - og 3'-merket) ble fremstilt (Teske et al., 1996; Massana et. al., 1997) for Southern blotting analyse av PCR-produkter: 8 underavdeling/gram-positive bakterier (inkludert Desulfovibrio og Desulfobulbus) Hybridiseringstemperatur: 50°C Desulfobacter og Desulfobacterium

Hybridiseringstemperatur: 40°C

Crenarchaeota (gruppe I Archea)

554 ARCH-I:

Hybridiseringstemperatur: 40°C

Euryarchaeota (gruppe II Archea) 554 ARCH-II:

Hybriseringstemperatur: 40°C

Alle biotinylerte primere ble syntetisert av EuroGentec, Seraing, Belgia. Primerne ble fortynnet i sterilt vann i konsentrasjoner på 50 nM, fordelt i 50 ni alikvoter og lagret ved -20°C.

1.3.2.3 Deoksynukleotider

Forrådsløsninger av deoksynukleotider (d'NTP) ble fremstilt ved å fortynne 100 mM av d'NTP'ene 2'-deoksyadenosin-5'-trifosfat (d'ATP), 2'-deoksytymidin-5'-trifosfat (dTTP), 2'-deoksyguanosin-5'-trifosfat (dTTP) og 2'-deoksycytidin-5'-tri-fosfat (d'CTP) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Hver d'NTP (100 ni) ble fortynnet i sterilt vann (600 nO, hvilket resulterte i endelige konsentrasjoner på 10 mM av hver d'NTP. Løsningene ble fordelt i alikvoter på 50 n' og lagret ved -20°C.

1.3.3 "Touchdown" PCR

Ekstrahert DNA (se over) eller lyserte mikrobielle cellesuspensjoner ble anvendt som DNA templat for PCR-amplifikasjon. Når lyserte cellesuspensjoner ble anvendt, så ble næringsbuljongkulturer fortynnet i sterilt vann (10-<2>) eller kolonier fra agarplater suspendert i sterilt vann, fulgt av oppvarming (100°C) i 10 minutter.

En PCR-blanding av 100 ni blanding bestod av 20 ni d'NTP (10 mM), 10 ni forover primer (50 nM), 10 n' revers primer (50 nM), 55 n' sterilt vann og 5 n' AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Eimer Roche Molecular Systems, Branchburg,

NJ, USA).

DNA templat (1 -10 ni) ble fortynnet i 10 ni [10x] PCR-buffer med 15 nM MgCb (Perkin Eimer Roche) og med sterilt vann til et endelig volum på 90 ni. Blandingen ble oppvarmet (95°C) i 5 -10 minutter på en oppvarmingsblokk. En PCR-blanding på 10 n' ble påført på hver prøve mens prøvene fremdeles befant seg i oppvarmingsblokken (95°C), og prøvene ble umiddelbart overført til en DNA Thermal Cycler (iCycler, BioRad).

PCR ble gjennomført som en "touchdown" metode for å redusere generering av falske biprodukter og med følgende sekvenssykluser:

Denaturering: 95°C i 1 minutt

Primer-sammenkopling: 65 - 55°C i 1 minutt

DNA-syntese (primer ekstensjon): 72°C i 3 minutter

Antall sykluser: 35

I løpet av de første 10 syklusene ble sammenkoplingstemperaturen gradvis redusert fra 65 til 55°C med 1 °C for hver cyklus under de første 10 cyklusene, fulgt av 25 sykluser med sammenkoplingstemperatur på 55°C. The PCR-omgangene ble avsluttet med 72°C i 15 minutter før avkjøling til 4°C.

1.3.4 Agarosegel-elektroforese

1.3.4.1 Analytisk elektroforese

PCR-produkter ble analysert ved horisontal agarosegel-elektroforese. Prøver (27 ni) ble blandet med [10x] gel-ladende TBE-buffer (3 ni) (0,9 M Tris, 0,9 M borat, 20 mM EDTA, pH 8,3, 50% (volum/volum) glycerol, 0,25% (vekt/volum) bromfenolblått). En lav DNA Mass Ladder (Gibco BRL, Paisley, UK) ble anvendt som standard, 12 n' standard i 3 n' [10x] gel-ladende TBE-buffer.

Geler ble fremstilt ved å varme opp agarose (2,0 g; Sigma) i 160 ml [0,5x] TBE (0,045 M Tris, 0,045 M borat, 1 mM EDTA, pH 8,3) i en mikrobølgeovn (4 minutter), fulgt av avkjøling til 50°C i vannbad. Etidiumbromid (10 nO fra en forråds-løsning (10 mg/l etidiumbromid i sterilt vann) ble påført agarosen, og den smeltede gelen ble støpt horisontalt på et plastbrett (åpne ender av brettet forseglet) med en "kam" med 15 brønner eller 20 brønner i elektroforeseapparatet (BioRad). Gelen ble hensatt ved romtemperatur i 20 minutter, senket ned i [0,5x] TBE-buffer, og kammen og forseglingene forsiktig fjernet.

Preparerte prøver og standard (se ovenfor) ble anvendt for de nedsunkede gelbrønnene (20 ni prøve og 10 n' standard) og elektroforese gjennomført med konstant spenning (150 V) i 1,5 - 2 timer ved romtemperatur. Geldokumentasjon ble gjennomført over en UV-transilluminatortabell (BioRad). Gelene ble fotografert ved hjelp av sort/hvit Polaroid-film (0,1 - 0,5 sekunders eksponeringstid), eller ved hjelp av digitalt kamara (GelDoc, 2000, BioRad).

1.3.4.2 Preparativ elektroforese

Preparativ agarosegel-elektroforese ble i utgangspunktet gjennomført som beskrevet i det foregående for den analytiske tilnærmingen, bortsett fra at det ble anvendt en lavtsmeltende agarose (Sigma). Agarose (1,3 g) ble smeltet i 160 ml [0,5x] TBE-buffer eller [1x] TAE-buffer (0,04 M Tris-acetat, pH 8,0; 1 mM EDTA), gelløsningen avkjølt til 35 - 50°C, etidiumbromid tilført, og den horisontale gelen som beskrevet i det foregående, bortsett fra at den innstilte temperaturen var 4 - 5°C. Prøver ble påført som beskrevet i det foregående, og elektroforese gjennom-ført ved 100 V konstant spenning i 1,5 - 2 timer.

Etter elektroforese ble gelene fotografert og utvalgte DNA-bånd skåret ut fra agarosen med en steril skalpell og overført til mikrosentrifugerør. Før ytterligere bearbeiding ble agaroseskivene pelletert med en kort sentrifugering og smeltet ved 65°C i 15 minutter. Prøvene ble holdt i smeltet tilstand ved 35 - 37°C.

1.3.5 Southern blotting og hybridisering

1.3.5.1 Blotting

Ved Southern blotting ble agarosegelelektroforese av PCR-produkter gjen-nomført som beskrevet i det foregående (analytisk tilnærming), bortsett fra at det ikke ble tilsatt etidiumbromid til gelen. DNA ble overført fra gelen til Hybond N+ membraner (Amersham Pharmacia) ved diffusjonsblotting.

Etter elektroforese ble gelen neddykket i 10 volumenheter av denature-ringsløsning (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI) i 2 x 20 minutter (langsom omrøring), fulgt av nøytralisering (1 M ammoniumacetat) i 2 x 15 minutter. Gelen ble så trimmet og anbrakt på en glassplate med kromatografisk papir (3 mm Chr, Whatman, Maidstone, UK) neddykket i 1 M ammoniumacetat. Endene av det kromatogra-fiske papiret ble anbrakt i et bad av transfer-buffer (0,2 M ammoniumacetat). Rundt gelen ble det lagt en tynn plastfilm ("GladPak") for å forhindre at transfer-buffer fordampet. Hybond N+ transfer-membranen ble neddykket i 0,2 M ammoniumacetat og anbrakt stramt på toppen av gelen. Flere lag av kromatografisk papir (neddykket i 0,2 M ammoniumacetat) ble anbrakt på toppen av membranen, og en stabel med papirhåndklær (5-8 cm) ble anbrakt på toppen av de kromato-grafiske papirene. En glassplate med en vekt (300 - 400 g) ble anbrakt på toppen av papirhåndklærne.

DNA transfer ble gjennomført over natten (8-12 timer) ved romtemperatur, og papirhåndklærne ble byttet når de ble våte. Blottingkvaliteten ble kontrollert ved å farve gelen i et bad av etidiumbromid (0,5 ng/ml i vann) i 45 minutter. Etter blotting ble DNA festet til Hybond-membranen under UV-lys i 40 sekunder. Membranene ble hybridisert umiddelbart eller omhyllet i plast og lagret (mørkt) ved 4°C.

1.3.5.2 Hybridisering

Før hybridisering ble festede membraner prehybridisert i en løsning (10 ml) av 3 x SSC, 0,1% SDS og 1,0% blokkeringsmiddel (Roche Molecular Biochemi-cals) i 2 timer ved den valgte hybridiseringstemperaturen for de forskjellige DNA-probene (se over) i en hybridiserer av type Roller-Blot HP-3D (Techne, Cam-bridge, UK). Biotinylerte DNA-prober ble så tilført rollerflaskene i hybridisereren og inkubert i 16 - 20 timer ved de temperaturene som er beskrevet for de forskjellige DNA-probene (se over).

Etter hybridisering ble membranene vasket i 10 minutter i 50 ml 2 x SSC - 0,1% SDS, 10 minutter i 50 ml 0,1 x SSC - 0,1% SDS og 10 minutter med PBS-T (all vasking ved romtemperatur). Membranene ble inkubert med Extravidin-Per-oksydase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), fortynnet 1:2000 i PBS-T i 30 minutter ved romtemperatur (omrøring), vasket 2x10 minutter med PBS-T, 10 minutter med PBS (romtemperatur) og fremkalt (10-20 minutter) i 30 ml PBS med 2 tabletter diaminobenzidin (DAB; Sigma) og 24 ml 30% vannfritt H2O2. Etter frem-kalling ble membranene skyllet i springvann og fotografert.

1.4 Denatureringsgradient-gelelektroforese (DGGE)

1.4.1 Analytisk DGGE

Ved hjelp av DGGE ble PCR-produkter generert med generelle primere definerende defining bakterier (341fBAC og 907rBAC) eller Archea (21fARCH og 958rARCH). Til primerne 341f BAC og 21fARCH ble en 40 mer GC-klemme (damp) satt til 5'-enden (5'-CGC-CCG-CCG-CGC-GCG-000-GGC-GGG-GCG-GGG-GCA-CGG-GGGG-3').

DGGE ble gjennomført med 6% (vekt/volum) polyakrylamid (PAA) -geler i [0,5x] TAE-buffer (20 mM Tris-acetat, pH 7,4; 10 mM acetat; 0,5 mM EDTA) med en 20 - 70% gradient av denatureringsmidlene urea og formamid (100% denatureringsmidler svarer til 7 M urea og 40% (volum/volum) deionisert formamid) i et DCode Universal Mutation Detection system (BioRad).

Forrådsløsninger av PAA/Bis-akrylamid (Bis) (40%) bestod av 38,93 g akrylamid og 1,07 g Bis oppløst i deionisert vann til 100 ml, mens forrådsløsninger av [50x] TAE-buffer ble dannet ved å blande 242 g Tris, 57,1 g eddiksyre og 100 ml 0,5 M EDTA til et samlet volum på 1000 ml med deionisert vann. Lineære gra-dientgeler (tykkelse 1 mm) ble fremstilt ved å blande PAA og Bis med denatureringsmidler for å generere en 20 til 70 lineær gradient i et gradientleveringssystem

(BioRad modell 475). Løsninger med 20% eller 70% denatureringsmidler er beskrevet i tabell 1 under:

For fremstilling av én gel ble 18 ml av hver løsning blandet med 200 ml ammoniumpersulfat (10% (vekt/volum) i deionisert vann) og 20 ni TEMED (BioRad), og blandingene ble umiddelbart overført til hver av to 30-milliliters sprøyter som deretter ble anbrakt i gradient-leveringssystemet. Gelen ble støpt som en parallell gradientgel (16x16 cm) med en tykkelse på 1 mm, og fikk polymerisere i omtrent 1 time, og med kam med 15 brønner. Elektroforesetanken ble fylt med [1x] TAE-buffer som ble oppvarmet til 60°C i tanken og 1 - 2 polymeri-serte geler anbrakt vertikalt i elektroforesetanken.

Hver prøve (10 ni) av PCR-produktet ble blandet med 10 n' prøvebuffer (0,05% bromofenolblått, 0,05% xylencyanol, 70% glycerol, fortynnet i deionisert vann), og hele volumet (20 ul) anvendt i hver brønn.

Vertikal elektroforese ble gjennomført med kontinuerlig temperatur (60°C) og spenning (150 V) inntil begge markørerne hadde migrert til bunnen av gelen (omtrent 4,5 timer).

Etter elektroforese ble gelene farget i SYBR Gold (Molecular Probes, Leiden, Nederland), fortynnet 1:10000 i [1x] TAE i 20-30 minutter. Gelene ble så fotografert med GelDoc-systemet (BioRad).

Gelbåndmønstrene ble sammenlignet for likhet og likhetseksponenter generert med Quantity One valg av GelDoc-softwareprogrammet. Dice-koeffisient-metoden ble anvendt, basert på følgende formel for likhet:

hvor S og T er vektorer som utgjør to felter i de samme båndsett som sammen-lignes.

1.4.2 Preparativ DGGE

Preparativ DGGE ble gjennomført som beskrevet for den analytiske DGGE, bortsett fra at N,N'-bis-akrylylcystein (BAC; Sigma) ble anvendt i stedet for Bis under gelgenerering. BAC muliggjorde gelløsning etter elektroforese (Muyzer et al., 1996).

PCR-prøver (300 ni) ble utfelt med 30 ni 5 M NaCI og 750 ni etanol ved -80°C i 1 time, sentrifugert (20 000 x g, 2 minutter) i en mikrosentrifuge (Eppendorf, modell 5417C, Hamburg-Eppendorf, Tyskland). Pelleten ble vasket med 70% etanol, tørket på en oppvarmingsblokk (35°C, 20 minutter) og oppløst i 30 n' sterilt vann.

Gelen ble støpt, prøver påført, og elektroforese gjennomført som beskrevet i det foregående.

Gelen ble farvet etter elektroforese med SYBR Gold (se over), og utvalgte bånd skåret ut under UV-belysning med sterile skalpeller. Hver gelskive ble overført til et mikrosentrifugerør, vasket 2x10 minutter med 100 n' sterilt vann og vannet fjernet. p-Merkaptoetanol (100 ni; BioRad) ble anvendt og rørene inkubert i 16-20 timer ved 37°C. Deionisert vann (100 nO, 0,1 volumenheter 5 M NaCI og 2,5 volumenheter iskald etanol ble anvendt i hvert rør. Rørene ble inkubert ved -80°C i 2 timer, sentrifugert (10 000 x g, 20 minutter) i en mikrosentrifuge og supernatanten forsiktig fjernet. Rørene ble tørket (35°C, 20 minutter), og pelleten ble oppløst i 100 ni sterilt vann.

Innholdet av PCR-produkt i prøvene ble sjekket i PCR med primere som definerer bakterier, men uten GC-klemme. PCR-produktene ble så renset i preparativ agarosegelelektroforese med agarose med lavt smeltepunkt (se over).

1.5 Kloning

1.5.1 TOPO TA-kloning

Kloning ble gjennomført med TOPO TA kloningssett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), med pCR 2,1-TOPO plasmidvektoren og One Shot TOP10 kjemisk skikkede Escherichia co//'-celler.

DNA ble amplifisert i PCR under anvendelse av 341fBAC og 907rBAC pri-merdefininerende Bacteria. PCR ble gjennomført som beskrevet i det foregående (se avsnitt 3.4.3), bortsett at den endelige avslutning ved 72°C ble forlenget til 10 minutter for å generere 3'-adenine overheng. PCR-produktene ble renset i preparativ agarosegelelektroforese med agarose med lavt smeltepunkt som beskrevet i det foregående (se avsnitt 3.4.4.). Gelskivene med PCR-produkter ble smeltet som beskrevet (65°C, 15 minutter) og holdt smeltet ved 37°C inntil de ble ligert inn i vektoren.

Smeltede agaroseskiver (4 nO ble forsiktig blandet med 1 ni saltløsning (1,2 M NaCI, 0,06 M MgCb) og 1 ni TOPO pCR 2,1 vektor. Ligeringen ble gjennomført i 10 minutter ved 37°C. Rørene ble anbrakt på is, og overføring av vektoren (4 ni) til kjemisk kompetente TOP10 celler (50 nO utført på is (15 minutter), fulgt av varmesjokk (42°C, 30 sekunder), og umiddelbar overføring til is (10 minutter). Transformasjonsreaksjonen ble fortynnet i 250 n' SOC-medium (2% Tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI210 mM MgS04, 20 mM glukose), og reaksjonen gjennomført i en rysteinkubator ved 37°C i 1 time med 200 omdr./min. horisontal rysting.

Suspensjonene ble spredd på agarplate med Luria-Bertani (LB) agar-medium (1,5% agar, 1,0 Tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 1,0% NaCI, pH 7,0; Sigma) supplert med 50 ng/ml ampicillin eller kanamycin antibiotika. Før inokulering ble platene påført X-gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-b-D-galaktopyranosid; Sigma), 40n' av 40 mg/ml X-gal i dimetylformamid.

Suspensjoner (20 og 50 nO av transformanter ble fordelt på LB-agarplatene (20 ni suspensjoner ble fortynnet med 20 n' SOC-medium før fordeling på plate for å sikre jevn fordeling). Platene ble inkubert i 20 - 24 timer ved 37°C. Bare transform anter med innsatt plasmid vokste på mediet, noe som skyldtes plasmi-dets motstandsgen. Kolonier med PCR-produkter ligert inn i vektoren ble visua-lisert som hvite kolonier, i motsetning til lyse- eller mørkeblå kolonier med vektorer uten PCR-produktinnsats. Adskilte hvite kolonier ble isolert i flytende LB-medium, supplert med ampicillin eller kanamycin (50 ng/ml). Mediet ble fordelt i plater av steril vevkultur med 24 brønner (Corning Inc., Corning, NY, USA), med 2 ml medi-um/brønn. Klonene ble inkubert 20 - 24 timer i LB-mediet og plasmidene renset.

1.5.2 Isolering av plasmider

Plasmidene ble isolert med et GenElute Plasmid Miniprep sett (Sigma), i samsvar med instruksjonene fra produsenten. Transformante kloner (2 ml) ble høstet ved hjelp av sentrifugering i en mikrosentrifuge (Eppendorf) ved 14 000 x g i 2 minutter. Pelletene ble resuspendert i en resuspensjonsløsning (200 ni) ved hjelp av rotasjon. En lysisløsning (200 ni) ble tilsatt, blandingen forsiktig invertert inntil den var klar (8-10 ganger), og lysis nøytralisert i løpet av 3 - 5 minutter med 350 ni nøytraliserings/bindebuffer. Cellerestene ble pelletert ved hjelp av sentrifugering (14 000 x g i 10 minutter). Supernatantene ble overført til GenElute Miniprep bindingskolonner samlet i mikrosentrifugerør, sentrifugert (14 000 x g i 2 minutter), og gjennomstrømningsvæsken avhendet. Bindingskolonnene ble så vasket med 750 n' vaskeløsning og sentrifugert (14 000 x g i 2 minutter), avløpene avhendet og kolonnene sentrifugert på nytt (14 000 x g i 2 minutter) for å fjerne det som måtte finnes av ytterligere løsninger. Bindingskolonnene ble så overført til nye mikrosentrifugerør, 100 ni sterilt vann tilsatt, og rørene sentrifugert (14 000 x g i 2 minutter). De isolerte plasmidløsningene ble lagret ved -20°C.

1.5.3 Regulering av positiv PCR-insert

Positive PCR inserter i transformantvektoren ble regulert ved hjelp av PCR med M13 primere definerende vektorsekvenser flankerende den innsatte sekvensen.

Primer-sekvensene var:

Primersetene er i samsvar med basene 391-406 (M13 Forward -20) og 205-221 (M13 Reverse) av LacZa-fragmentet av vektoren. Et plasmid uten et positivt PCR-produkt innsatt ville gi et 202 bp M13 PCR-produkt som resultat, mens et positivt PCR-produkt ville gi et 769 bp PCR-produkt.

En PCR-blanding ble fremstilt som beskrevet i det foregående (se avsnitt 3.4.3) med M13 primer-settet (50 nM forrådsløsninger). Plasmid-DNA templat (2 ni) ble fortynnet i PCR-buffer og sterilt vann til et endelig volum på 90 ni som beskrevet i det foregående, blandet med PCR-blanding. PCR-en ble gjennomført samsvar med følgende sekvenssykluser:

Opprinnelig denaturering: 94°C i 2 minutter

Denaturering: 95°C i 1 minutt

Primer-sammenkopling: 55°C i 1 minutt

DNA syntese (primerforlengelse): 72°C i 1 minutt

Antall cykluser: 30

PCR-gjennomføringen ble avsluttet ved 72°C (7 minutter) og avkjøling ved 4°C.

1.5.4 Restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme (RFLP)

M13 PCR-produkter med positivt PCR-produkt "insert" ble analysert med restriksjonsendonukleasene EcoRI (Sigma), Haelll (Sigma) og Rsal (Sigma). Restriksjonsenzymene og korresponderende enzymer (levert av produsenten, Sigma) er beskrevet i tabell 2.

A) Én enhet av hvert enzym spalter 1 mg 1 DNA på 1 time ved 37°C

Plasmid-DNA amplifisert av M13 PCR (1,5 eller 10 ni) ble blandet med restriksjonsenzymer: 1,0 ni EcoRI (40 U), 2,0 ni Haelll (20 U) eller 2,0 ni Rsa\ (20 U). Hver blanding ble fortynnet til et samlet volum på 50 n' rned den respektive enzymbuffer [1x] -konsentrasjon (se tabell 2). Reaksjonsblandingene ble inkubert ved 37°C i 2,5 timer og anbrakt på is for å stoppe reaksjonen. Enzymnedbrytingen ble analysert som restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme (RFLP) på analytisk agarosegel-elektroforese.

1.6 Sekvensering av plasmid-DNA

For sekvensering ble rensede plasmider PCR amplifisert med M13 primer sett. DNA ble målt ved hjelp av etidiumbromidmetoden og utfelt med 60% etanol og 0,1 M Na-acetatbuffer (pH 4,6).

De utfelte PCR-produktene sendt til DNA-sekvensering (MedProbe).

Sekvenser av plasmidene ble sendt til "the National Centre for Biotechno-logy Information" (NCBI) under anvendelse av BLAST-programmet i NCBI-data-basen (Altschul et al., 1997).

Pylogenetiske trær og avstandsmatrikser ble bestemt med Phylip-interfasen ved the Ribosomal Database Project (RDP; Maidak et al., 1997).

Claims (38)

1. Fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn,karakterisert vedat den omfatter at det ned i et borehull føres termofile mikroorganismer som er modifisert genetisk for å produsere et brønnbehandlings-kjemikalie.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert vedat nevnte termofile mikroorganisme også er halofil og anaerob.

3. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 eller 2, karakterisert vedat nevnte termofile mikroorganisme er hjemmehørende på hydrokarbonfeltet hvor brønnen som skal behandles er lokalisert.

4. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte brønnbehandlingskjemikalie er en belegginhibitor, hydratinhibitor, asfalteninhibitor, voksinhibitor eller en korrosjonsinhibitor.

5. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat brønnbehandlingskjemikaliet er et protein- eller peptidmolekyl, en alkohol, et glycerol, et proteinholdig eller ikke-proteinholdig anti-frysemolekyl, et bio-overflateaktivt middel eller en organisk syre.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 5, karakterisert vedat minst 50% av alle aminosyrer i nevnte protein eller peptid har ladede sidekjeder.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert vedat nevnte ladede aminosyrer er asparginsyre.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert vedat brønnbehandlingskjemikaliet er polyAsp eller en kopolymer derav.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8 karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

10. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte mikroorganisme er en termofil Archea eller termofile bakterier.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 10, karakterisert vedat nevnte termofile mikroorganisme er en termofil Archea.

12. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte borehull er et produserende borehull.

13. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 11,karakterisert vedat nevnte borehull er et injeksjonsborehull.

14. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat brønnbehandlingskjemikaliet utsondres av mikroorganismen.

15. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat nevnte mikroorganismer transporteres til stedet nede i borehullet i eller på partikler.

16. Fremgangsmåte i henhold til krav 15, karakterisert vedat nevnte partikler også fører med seg næringsstoffer for de termofile mikroorganismene.

17. Fremgangsmåte i henhold til krav 15 eller 16, karakterisert vedat nevnte partikler har en moduspartikkelstørrelse på 1 nm til 5 mm.

18. Partikler egnet for å føres ned i et borehull, karakterisert vedat de er impregnert med termofile mikroorganismer som er modifisert genetisk for å produsere et brønnbehandlingskjemikalie.

19. Partikler i henhold til krav 18, karakterisert vedat brønnbehandlingskjemikaliet er polyAsp eller en kopolymer derav.

20. Partikler i henhold til krav 19, karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

21. Blanding for hydrokarbonbrønnbehandling, karakterisert vedat den omfatter en bærervæske som inneholder termofile mikroorganismer som er modifisert genetisk for å produsere et brønn-behandlingskjemikalie.

22. Blanding i henhold til krav 21, karakterisert vedat nevnte brønnbehandlingskjemikalie er polyAsp eller en kopolymer derav.

23. Blanding i henhold til krav 22,karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

24. Mikroorganisme, karakterisert vedat den er genetisk utviklet for å produsere et brønn-behandlingskjemikalie valgt fra polyAsp eller en kopolymer derav.

25. Mikroorganisme i henhold til krav 24, karakterisert vedat den er termofil.

26. Mikroorganisme i henhold til krav 24 eller 25, karakterisert vedat den er en Archea.

27. Mikroorganisme i henhold til hvilke som helst av kravene 24 til 26,karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

28. Mikroorganisme i henhold til hvilke som helst av kravene 24 til 27,karakterisert vedat 30% til 100% av aminosyrene i nevnte polyAsp eller en kopolymer derav er sure aminosyrer.

29. Fremgangsmåte for omforming av en mikroorganisme,karakterisert vedat den omfatter at et nukleinsyremolekyl som koder polyAsp eller en kopolymer derav innføres i nevnte mikroorganisme.

30. Fremgangsmåte i henhold til krav 29, karakterisert vedat nevnte mikroorganisme er termofil.

31. Fremgangsmåte i henhold til krav 29 eller 30, karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

32. Bioreaktor, karakterisert vedat den omfatter en kultur av mikroorganismer som er modifisert genetisk for å produsere et brønnbehandlingskjemikalie valgt fra polyAsp eller en kopolymer derav.

33. Bioreaktor i henhold til krav 32,karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.

34. Bioreaktor i henhold til krav 32 eller 33, karakterisert vedat 30% til 100% av aminosyrene i nevnte polyAsp eller en kopolymer derav er sure aminosyrer.

35. Fremgangsmåte for behandling av en hydrokarbonbrønn,karakterisert vedat den omfatter høsting av polyAsp eller en kopolymer derav fra en bioreaktor hvor en kultur av mikroorganismer som er modifisert genetisk for å produsere nevnte polyAsp eller en kopolymer derav og deretter transportere nevnte polyAsp eller en kopolymer derav ned i et borehull.

36. Fremgangsmåte i henhold til krav 35, karakterisert vedat nevnte borehull er et produserende borehull.

37. Fremgangsmåte i henhold til krav 35 eller 36, karakterisert vedat nevnte polyAsp eller en kopolymer derav transporteres ned i borehullet i eller på partikler.

38. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 35 til 37,karakterisert vedat kopolymeren er en kopolymer av asparginsyre og en aminosyre valgt fra gruppen bestående av histidin, glycin, alanin, prolin, leucin, serin eller tyrosin.