EA017608B1 - Способы и композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, термофильный микроорганизм, способ его получения и частицы, импрегнированные такими микроорганизмами - Google Patents

Abstract

Описан способ, относящийся к обработке углеводородной скважины, при котором внутрь ствола скважины вводят термофильные микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать химическое соединение для обработки скважин, в частности, когда ствол скважины представляет собой ствол эксплуатационной скважины и химическое соединение для обработки скважин представляет собой пептид, такой как полиАсп; дополнительные аспекты включают в себя термофильные микроорганизмы, созданные путем генной инженерии для продуцирования химического соединения для обработки скважин, и биореакторы, где микроорганизмы продуцируют химические соединения для обработки скважин для использования в среде ствола скважины.

Description

Данное изобретение относится к способу обработки углеводородной скважины, в частности, путем помещения внутрь скважины бактерий, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин или их предшественники или соединения, образующие их, и к частицам, композициям и структурам, содержащим эти бактерии.

В процессе использования углеводородной скважины (то есть газовой или нефтяной скважины) возникают различные проблемы, такие как коррозия металлических деталей, отложение, задерживающее поток углеводородов (например, отложение твердого осадка, газовых клатратов, сульфидов металлов, парафинов, гель-полимеров, микробных останков и так далее), образование токсического сероводорода сульфат-восстанавливающими бактериями, увеличение потока воды в эксплуатационную скважину и так далее.

Таким образом, например, когда морскую воду закачивают через ствол нагнетательной скважины в нефтеносный пласт для продвижения нефти через формацию (то есть горную породу) в ствол эксплуатационной скважины, различия растворенных веществ в закачиваемой воде и воде, уже присутствующей в формации, могут вызывать осаждение солей металлов в виде твердого осадка, таким образом, постепенно увеличивая засорение ствола эксплуатационной скважины.

Как правило, с этим борются путем применения закачки под давлением химических соединенийингибиторов образования твердого осадка, то есть химических соединений, которые разрушают твердый осадок и увеличивают поток нефти или газа. Это, как правило, предполагает остановку потока углеводородов, нагнетание водного раствора ингибитора образования твердого осадка в эксплуатационную скважину под давлением, чтобы доставить раствор ингибитора в формацию, и возобновление добычи. Такая обработка обычно предоставляет возможность для потока углеводородов в течение еще шести месяцев или около шести месяцев перед тем, как потребуется еще одна закачка под давлением, и каждая закачка под давлением вызывает некоторое повреждение формации, окружающей ствол эксплуатационной скважины, и, как результат, увеличение потока фрагментов формации (то есть крупинок горной породы) в скважину.

Ствол эксплуатационной скважины в нефтяной скважине с гравийными фильтрами, представляющими собой содержащие песок фильтрующие элементы, которые служат для того, чтобы захватывать фрагменты формации, как правило, направляется в пласт, несущий углеводороды, и предлагается включать в такие гравийные фильтры керамические частицы, покрытые химическими соединениями для обработки скважин, такими как ингибиторы образования твердого осадка (см. ЕР-А-656459 и νθ 96/27070), или бактериями (см. νθ 99/36667), или же эти химические соединения или бактерии импрегнированы в керамические частицы. Подобным образом, была предложена обработка формации, окружающей ствол эксплуатационной скважины, химическими соединениями для обработки скважин перед началом добычи углеводородов, например в 6В-А-2290096 и νθ 99/54592.

Также известны различные полимерные, олигомерные, неорганические и другие имеющие форму частиц носители для химических соединений для обработки скважины, например частицы ионообменной смолы (см. И8-А-4787455), полиакриламидные частицы (см. ЕР-А-193369), желатиновые капсулы (см. И8-3676363), олигомерные матрицы и капсулы (см. И8-А-4986353 и И8-А-4986354), керамические частицы (см. νθ 99/54592, νθ 96/27070 и ЕР-А-656459) и частицы самих химических соединений для обработки скважины (см. νθ 97/45625).

Частицы, покрытые или содержащие химические соединения для обработки скважины, тем не менее, неизбежно будут обеспечивать защиту только в течение ограниченного промежутка времени. Следовательно, существует потребность в средствах для обработки скважин, которые обеспечат продолжительный период защиты, например, против образования твердого осадка или других проблем, таких как коррозия или проблемы ограничения потока углеводородов.

В дополнение, один известный ингибитор образования твердого осадка представляет собой полиаспарагиновую кислоту (полиАсп). Тем не менее, общеизвестно, что сложно получать поли(аспарагиновую кислоту) в масштабе, который практически осуществим в производстве. Химический синтез полиАсп осуществляется, например, путем тепловой полимеризации из малеинового ангидрида и катализируется ортофосфорной кислотой. Химический синтез приводит к α,β-форме полимера, нежели чем к а-форме, обнаруженной в природе. Химический синтез также приводит к образованию побочных продуктов. Согласно настоящему изобретению, таким образом, предложен новый способ создания и использования полиАсп в среде скважины.

Авторы изобретения предлагают осуществлять обработку скважины путем введения внутрь скважины термофильных Агсйеа или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин.

Агсйеа представляют собой одну из трех систем микроорганизмов на земле, другие две представляют собой эубактерии и эукариоты (см. Но\\'1апб (Еб) Тйе 8шргщщд Агсйаеа ОхГогб Ишуегайу Рге55. 2000). Агсйеа могут быть разделены на три группы:

а) анаэробные метанпродуцирующие бактерии;

б) анаэробные и аэробные бактерии, усваивающие серу (например, 8и1Го1оЬа1е§ и Тйегшорго1еа1е5); и

- 1 017608

в) умеренно термофильные Т11егтор1а5та1е5.

Некоторые представители группы а) и большая часть группы б) являются термофильными, обладают способностью выживать при температурах 90-150°С. Подходящее определение и классификацию Аге11са можно найти в последнем издании Ветдеу'к Мапиа1 или Но\т1апб (Еб) (см. выше). Как правило, Агсйса можно идентифицировать по их клеточной стенке, которая лишена пептидогликанового каркаса, и по их цитоплазматической мембране, которая содержит простые эфиры глицерина и С₂₀ (фитанил) и С₄₀ (бифитанил) алкильных изопреноидов вместо сложных эфиров глицерина и жирных кислот. В дополнение, ДНК-зависимые РНК-полимеразы у Атсйеа отличаются от таковых у эубактерий тем, что они состоят из более чем четырех субъединиц и устойчивы к антибиотикам рифампицину и стрептоликлигину (81гер1о1усНд1п).

Согласно первому аспекту данного изобретения предложен способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь ствола эксплуатационной скважины вводят термофильных Атсйеа или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин. Подходящие микроорганизмы представляют собой галофильные и анаэробные, а также термофильные, например некоторые серувосстанавливающие бактерии, такие как штаммы Ое5и1Гоу|Ьпо-. ОеыбГоЬЫЬих-. ОеыбГоЬасЮг. ЭеыбГососсиу различные виды ВасШш, виды С1о8йтбшт, ТйегтоапаегоЬас1ег, ТйеттоапаегоЬшт, ТйегтоЬас1его1бе8, Тйегтобе8и1ГоЬас1:егшт, некоторые Ркеиботопак и так далее. Некоторые серувосстанавливающие бактерии могут также использовать другие метаболические пути через лактат или ацетат. Эти Атсйеа или другие термофильные микроорганизмы могут встречаться в природе, но обычно они генетически модифицированы для продуцирования химических соединений для обработки скважин. Атсйеа, в частности, генетически модифицированные Атсйеа, предпочтительны для использования в способах по данному изобретению. В особенно предпочтительном воплощении химические соединения для обработки скважин представляют собой агенты, которые ингибируют образование твердого осадка.

Термофильные бактерии, как правило, рассматриваются как проблема в нефтяных скважинах, поскольку обычно они являются бактериями, усваивающими серу, и продуцируют токсический сероводород.

Как было указано выше, в соответствии с настоящим изобретением предложено вводить микроорганизмы внутрь ствола эксплуатационной скважины, и, таким образом, данное изобретение не имеет отношения к введению микроорганизмов в нагнетательную скважину. Условия в этих двух скважинах очень различаются, исходя из понятий физической среды и осложнений при бурении, с которыми сталкиваются. Таким образом, эффективный способ обработки одной скважины вполне вероятно окажется неподходящим для другой скважины. Подобным образом, микроорганизмы, которые могут бурно размножаться в среде одной скважины, не обязательно выживут в другой.

Используемые микроорганизмы предпочтительно представляют собой микроорганизмы, характерные для углеводородного месторождения, в котором расположена скважина, подлежащая обработке. Описанные здесь способы сбора и идентификации подходящих характерных микроорганизмов могут использоваться в способах по данному изобретению. Тем не менее, могут использоваться другие Атсйеа, такие как Атсйеа, депонированные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Немецкой коллекции микроорганизмов (ОеийсНе 8атт1ипд уоп МЖгоогдаиктеп) (Э8М)) и Британской коллекции промышленных и морских бактерий (ΒτίίίδΗ СоИесбоп оГ 1пби51па1 апб Матте Вас1епа (С1МВ)).

Примеры подходящих видов включают в себя: Пе8и1£о1отаси1ит, Агсйаеод1оЬи8 (например, А. Ги1д1бк), ТйегтобеыбГогаЬбиу РейоГада (например, Р. тоЫШ), МеИапососош (например, М. 111егто1Ц1ю1горйик), ТйегтобекиИЫоЬаЛепа, 8и1£о1оЬа1е5, ТНегторгоЮабу ТНегтор1а5та1е5. Представители всех вышеупомянутых групп Атсйеа могут быть использованы в способах по настоящему изобретению при условии, что они проявляют необходимые термофильные свойства.

Атсйеа и другие бактерии или микроорганизмы, которые могут выживать при температурах, превышающих 50°С (более предпочтительно, при температурах, превышающих 70°С), могут рассматриваться как термофильные. Особенно предпочтительны такие микроорганизмы, в особенности Атсйеа, которые могут бурно размножаться при температурах, превышающих 90°С.

Удобно, если Атсйеа и другие бактерии или микроорганизмы могут быть факультативно анаэробными/строго анаэробными и иметь очень простые требования к питательным веществам. Это особенно важно, поскольку может возникнуть необходимость вводить бактерии и питательные вещества для них в ствол скважины, например в пористую материнскую породу. Удобно, если Атсйеа и другие бактерии или микроорганизмы могут использовать углеводороды с короткой цепью или ацетат в своем энергетическом обмене. Желаемые питательные вещества для удобства могут быть введены в пористую материнскую породу или введены вместе с бактериями или другими микроорганизмами в пористые частицы.

Атсйеа и другие бактерии или микроорганизмы могут быть генетически модифицированы с использованием стандартных способов для введения рабочих последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, представляющие собой химические соединения для обработки скважин или участвующие в продуцировании химических соединений, подходящих для использования в качестве химических

- 2 017608 соединений для обработки скважин. Таким образом, бактерии могут продуцировать химические соединения для обработки скважин непосредственно или могут продуцировать предшественники химических соединений для обработки скважин или соединения, образующие их. Возможно, что, в соответствии с генетической модификацией, эта последовательность представляет собой регуляторную, нежели чем кодирующую последовательность, которую вводят в организм-хозяин и которая ответственна за переключение или усиление экспрессии релевантной кодирующей последовательности.

Относительно трансформации Агскеа можно обратиться к следующим ссылкам на 3-й Международный конгресс по экстремофилам, проходивший 3-7 сентября 2000 года в Техническом университете Гамбурга (Гамбург):

Ь27: Рку^депекс РаИегпв οί ΡοβΙίΓαηβΟΓίρΙίοηαΙ ΜοάίΓίοαΙίοη ίη Ρίόοβοιηαΐ К.ΝΑ οί ТйегторйПев. Стат, Р. Ρ; Νοοη, К. К.; 81екег, К. О апб МсС1овкеу, 1. Α. Ггот 1ке Ипщегвку οί Шак;

Р132: Оуегехргеввюп ίη ЕвскепсЫа отк οί 1ке Сепе Собюд Γογ Скютве Эекубгодепаве Гют На^Гегах тебкеггапеГ, Евскфех, 1.; Рке, С; Реггег, Т апб Вοиеΐе, М. Т Гют 1ке Ипщегвку οί АксаШе;

Р122: ΜοΚαιΕπ Οοηίημ οί ап Ех1гете1у Ткегпюв1аЫе Ев1егаве Сепе Гют 1ке НуреПкетторкШс Агскаеοη ΞυΙίοΙοΕυβ βο1Γаίаπсшβ Ьу Ехргеввюп ίη ЕвскепсЫа ток, Μο^аηа, А.; Ашгка, V.; Όί ΕΓίζιΐο, Ν. апб Саппю, К. Гют Ιβίίΐυΐο б1 8аете беН'Αктеиίаζ^οие, ί’οηβίμΐίο ΝηζίοηηΕ бе11е Кгсегске (ΟΝΡ.);

Ь52: А Сепекс 8ув1ет кэг 1ке НуреПкетюркШс Αιτίκ-^οη Руготоссшв аЬуввг 8ркегор1ав1в ТгаивГсгιηηΐίοη апб Οοι-ΜΠ-Μίοη οί а 8кшк1е Vесΐο^, Ьшсав, 8.; Τοίίίη, Ь; Ζ^νаηον^с, Υ.; Ρο^πό, Р.; Скагкег, Ό. К.; Рпешг, Ό. апб ΕΓηυβο, С. Гют Ипщегвйе Раг1в-8шб.

Ссылки далее на Агскеа используют все необходимые изменения в отношении других термофильных бактерий или микроорганизмов, которые могут быть введены внутрь скважины в соответствии с настоящим изобретением.

Для экспрессии экзогенных генов в Агскеа в предшествующем уровне техники было описано и использовалось множество векторов. Например, Саппю е1 а1. (1998, Т Вас1егю1. 180 (12): 3237-40) описывает вектор, который особенно эффективен в 8ι.ι1Γο1ο^.ιβ βο1Γаίа^^сшβ. Кроме того, Саппю е1 а1. в ίοιΐΓηη1 Ехΐ^етοрк^1еβ 2001 5 (3): 153-9 описывает способы и векторы для трансформации Агскае. Также были получены шаттл-векторы, которые подходят для использования в Е. ток и 8ι.ι1Γο1ο^.ιβ (Саппю е1 а1, Пгв1 теекид οη ЕхкепюркПев ав се11 ЕасФпев, АНепв, 19-21 Арп1 1997). Эти публикации включены сюда посредством ссылки. Модификации этих векторов, которые могут быть желательны для использования с другими видами микроорганизмов, известны в уровне техники и находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники.

Еще один аспект данного изобретения составляет способ трансформации Агскеа, при котором в указанную Агскеа вводят молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессия которой прямо или косвенно приводит в результате к продукции, обычно самой Агскеа, химического соединения для обработки скважин.

Агскеа, которые были генетически модифицированы для продукции химических соединений для обработки скважин, составляют еще один аспект настоящего изобретения. Химическое соединение для обработки, продуцируемое Агскеа, будет использовано в среде ствола эксплуатационной скважины, и Агскеа обладает способностью выживать в этой среде.

Таким образом, гены, кодирующие полезные химические соединения для обработки скважин или ферменты или другие факторы, вовлеченные в продукцию организмом активных химических соединений для обработки скважин, могут быть введены в организм-хозяин Агскеа с использованием подходящих способов трансформации, хорошо известных из уровня техники. Общее руководство по способам клонирования можно найти, например, в ΜοΕαιΕίΓ Οοηίημ ΕώοπιΙοΓν тапша1 под редакцией МашаБв е1 а1., опубликованном в Οο16 8ргшд Наг^ит ^аЬο^аΐο^у Ргевв. Более конкретно, ссылка Ь52, например, демонстрирует каким образом можно добиться трансформации в гипертермофильной Агскеа Руготоссшв аЬуввЕ

Подходящие организмы, предоставляющие гены, могут представлять собой другие бактерии или микроорганизмы или высшие эукариоты, включающие в себя растения и млекопитающих. Продукт экспрессии должен быть стабильным в условиях ствола скважины, и, таким образом, он обычно может быть термостабильным. Таким образом, организмы-мишени для получения интересующих генов сами могут существовать в довольно экстремальных условиях окружающей среды. Ген, введенный в Агскеа, может быть модифицирован для усиления термостабильности экспрессируемого продукта. Кроме того, белки, экспрессируемые организмами, которые сами по себе не могут жить в стволе скважины, могут быть достаточно стабильными для сохранения в активной форме, когда они экспрессируются термофильными Агскеа. Белок, если требуется, может также содержать дополнительную модификацию, такую как добавление меток, например к1в-меток (к1в - гистидин) или тус-меток, которые улучшают выделение белка из системы.

Для некоторых из более простых химических соединения для обработки скважин, например, полиаминокислот, таких как полиаспартат, нуклеиновая кислота, кодирующая ген, может быть синтезирована бе ηονο (то есть ее не берут из другого организма) и введена в Агскеа обычным путем.

Трансформация, как правило, включает в себя плазмидный вектор, который также содержит ген для того, чтобы сделать возможной идентификацию успешно трансформированной Агскеа, например, ген

- 3 017608 устойчивости к антибиотикам, такой как ген хлорамфениколацетилтрансферазы. Когда микроорганизм вводят в ствол скважины, антибиотик также может быть введен, например, микроорганизм, питательные вещества и антибиотик могут быть совместно введены в пористые частицы. Таким образом, эндогенные бактерии могут быть подавлены, что дает конкурентные преимущества для роста модифицированного организма. Другие способы отбора трансформантов известны специалистам и включают в себя использование светочувствительного вектора (ΙίβΙιΙ зспзЮус уссЮг). люкс-гена (1их-депе), который заставляет положительные колонии светиться в темноте. Другие подходящие носители для трансформации бактерий включают в себя космиды и молекулы бактериофагов.

Как хорошо понятно из уровня техники, ген, введенный в Атсйеа, должен быть функционально связан с контролирующими последовательностями, которые совместимы с нормальной экспрессией генов в хозяине Агсйеа. Контролирующие последовательности включают в себя промоторы и возможно регуляторные последовательности, которые заставляют ген включаться или выключаться в ответ на химический или физический стимул. Ген может быть введен в хромосому Агсйеа и может регулироваться эндогенными контролирующими последовательностями, или, если вектор не введен, интересующий ген будет трансфицироваться вместе с подходящими регуляторными последовательностями и промоторами.

Может быть необходимо обеспечивать Агсйеа аминокислотами, кофакторами и так далее, необходимыми при продуцировании химических соединений для обработки скважин.

Примеры простых искусственных химических соединений для обработки скважин, которые могут быть получены таким способом, включают в себя богатые аспарагиновой кислотой или содержащие аспартатные повторы полипептиды, и олигопептиды, и полимеры, и олигомеры аспарагиновой кислоты, которые могут функционировать в качестве ингибиторов образования твердого осадка.

Особенно предпочтительная группа ингибиторов образования твердого осадка представляет собой молекулы, богатые аминокислотами, имеющими заряженные боковые цепи, в частности анионными аминокислотами, такими как аспарагиновая или глутаминовая кислота, а также включающими в себя катионные аминокислоты, такие как лизин, аргинин или гистидин. Такие молекулы, включающие в себя некодируемые генетически заряженные аминокислоты, могут быть синтезированы Агсйеа ίη зйи, хотя предпочтительны молекулы, которые могут быть образованы путем трансляции, и, таким образом, включают в себя лишь 20 генетически кодируемых аминокислот.

Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может представлять собой пептид (здесь не делается различий между пептидом и полипептидом), имеющий большое количество заряженных, в особенности кислых аминокислот. Такой пептид может состоять полностью из заряженных аминокислот или значительной доли заряженных аминокислот; например, вдоль его длины или его фрагмента от 30, предпочтительно от 50, до 100% всех аминокислот заряжены, например 60, 70, 80 или 90% всех аминокислот заряжены. Если у пептида имеется заряженный фрагмент, он включает в себя по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, предпочтительно 15 или большее количество остатков, имеющих такую долю заряженных, предпочтительно кислых, остатков, как обсуждалось выше. В полных определениях пептид для обработки скважин предпочтительно имеет по меньшей мере 3, предпочтительно 4 или более чем 4, более предпочтительно, 6 или более чем 6, например 8-14 заряженных остатков или от 15 до 25 заряженных остатков, в частности от 20 до 25 заряженных остатков. Заряженные остатки могут быть последовательными или разделены другими незаряженными остатками, но, как правило, должна присутствовать отчетливо заряженная природа пептида или его области/фрагмента.

Полимер может представлять собой сополимер, например аспарагиновой кислоты и гистидина, глицина, аланина, пролина, лейцина, серина или тирозина. Показано, что сополимеры аспарагиновой кислоты и пролина или гистидина могут представлять собой более эффективные ингибирующие образование твердого осадка полимеры, чем полимеры одной аспарагиновой кислоты. Незаряженные остатки предпочтительно представляют собой пролин. Хотя на Ν-конце пептида может также присутствовать метионин.

Заряженный полипептид наиболее предпочтительно представляет собой полиАсп. Здесь ссылка на полиАсп включает в себя сополимеры, обсуждавшиеся выше, но в каждом случае, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 70%, остатков в конечном пептидном продукте представляют собой аспарагиновую кислоту. Инициация трансляции требует еще одного остатка в первом положении (имеющего происхождение от стартового кодона) исходно экспрессирующегося пептида, как правило, этим остатком является метионин (Мет), хотя бактерии могут также использовать другие остатки в первом положении. Конечный продукт полиАсп, используемый для обработки скважин, может сохранять инициирующий остаток, или он может отщепляться, в особенности, когда ген полиАсп включает в себя сигнал или другую последовательность в 3'-5' направлении. Продукт полиАсп (без какой-либо сигнальной или меченой последовательности), как правило, имеет длину в 1575 аминокислот, например длину в 20-45 аминокислот, и предпочтительно включает в себя 1-8, например 2-4, остатка пролина.

Получение полиАсп из природного возобновляемого источника, такого как Агсйеа или бактерии, или ίη 8Йи в скважине или в биореакторе, представляет собой эффективное средство получения больших количеств полиАсп. Таким образом, использование Агсйеа или бактерий для получения полиАсп также

- 4 017608 является более экологически приемлемым, чем любой другой используемый в настоящее время способ. Получение полиАсп может осуществляться ίη δίΐιι в соответствии с тем, как описано в данной заявке, путем его экспрессии в генетически модифицированных термофильных АгеНса. или, в качестве альтернативы, может осуществляться в биореакторе.

Химическое соединение для обработки скважин может включать в себя молекулу белка, например экспрессирующийся в норме белок АгсНеа, который модифицирован для увеличения в нем количества заряженных остатков. Или путем увеличения количества заряженных, предпочтительно кислых остатков, обнаруженных по всей длине молекулы, но более предпочтительно путем добавления к молекуле заряженной области. Таким образом, экспрессирующийся белок может для удобства иметь заряженный домен, не обнаруженный в нативной молекуле. Это заряженный домен предпочтительно находится снаружи молекулы белка, так что он доступен и способен проявлять свои свойства ингибирования образования твердого осадка.

Белок или полипептид может экскретироваться АгсНеа или может оставаться прикрепленным к бактериальной клеточной поверхности. Более крупные белки могут пересекать клеточную стенку, располагая свои заряженные домены снаружи АгсНеа. Можно модифицировать секрецию пептида путем добавления или удаления сигнальных пептидов, которые направляют пептид, который должен секретироваться. Сигнальные пептиды для секреции или мембранной локализации хорошо известны в уровне техники. Сигнальные пептиды могут быть отщеплены во время или после процесса секреции или могут оставаться присоединенными к молекуле пептида. Когда сигнальная последовательность отщепляется таким образом, можно для удобства удалить инициирующий остаток метионина (Мет). Здесь ссылка на молекулы полиАсп включает в себя ссылку на молекулы, которые включают в себя такие сигнальные последовательности как сигнальная последовательность щелочной протеазы (ЩП).

Многие подходящие молекулы пептидов, ингибирующие образование твердого осадка, являются новыми и составляют еще один аспект настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, которые включают в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует эти молекулы пептидов, ингибирующие образование твердого осадка, или комплементарна последовательности, кодирующей эти молекулы пептидов, составляют еще один аспект настоящего изобретения. Генетическая конструкция, включающая в себя такие молекулы нуклеиновых кислот, функционально связанная с последовательностью промотора, составляет еще один аспект настоящего изобретения.

Пример нуклеиновой кислоты, кодирующей химическое соединение для обработки скважин, представляет собой 5'-САТ66АТ6АС6АТ6АТ6АССС66АТ6АТ6АС6АС6АТ6АС6АТ6АС6АТСС6С АССАТСАССАССАТСАТСАССАТСАТССТАСССАТСАССАТСАССАТСАТТААС-3'. Молекулы нуклеиновых кислот, включающие в себя эту последовательность, и полипептиды, включающие в себя аминокислотную последовательность, кодируемую этой последовательностью, ΜΌΌΌΌΌΡΌΌΌΌΌΌ ΌΌΌΡΌΌΌΌΌΌΌΌΌΡΚΗΗΗΗΗΗ, составляют дополнительные аспекты данного изобретения, а также вектор рЕТ11б-Акр в соответствии с тем, как описано в примере 2. Варианты и фрагменты этих последовательностей, которые также содержат большое количество остатков Асп (или триплеты, кодирующие их, как подходит) составляют дополнительные аспекты данного изобретения. Может быть предпочтительно сконструировать ген полиАсп таким образом, чтобы различные триплеты, кодирующие Асп, были включены для предотвращения саморенатурации, хотя эту проблему можно избежать, используя двухцепочечную ДНК (дцДНК).

Конкретные вызывающие интерес варианты представляют собой такие варианты, которые лишены С-концевых остатков Ηίδ (и связывающего аргинина). Если полиАсп слит с сигнальной последовательностью, он, как правило, лишен своего собственного инициирующего кодона и поэтому не включает в себя четыре основания САТО на 5' конце.

Другие полезные химические соединения для обработки скважин, которые могут продуцироваться АгсНеа, включают в себя спирты и глицерины, белковые и небелковые молекулы антифризов и биосурфактантов.

Данное изобретение также включает в себя применение встречающихся в природе микроорганизмов, то есть микроорганизмов, которые не модифицированы генетически и предпочтительно являются характерными для нефтехранилища или ствола скважины. Такие микроорганизмы размножаются в большом количестве конкретно в условиях, обнаруженных в этих месторождениях, и могут продуцировать продукты, которые полезны в данном изобретении. Такие продукты включают в себя органические кислоты, которые защищают от карбоната, криоглобулин, который действует против гидратов (например, газового гидрата, который представляет собой кристаллическое твердое вещество, состоящее из молекулы газа, окруженной сеткой из молекул воды), и ферменты, которые разрушают 8-8 мостики для уменьшения вязкости. Примеры таких микроорганизмов включают в себя АгсНеа, которые представляют собой экстремофилов, то есть экстремальных термофилов.

АгсНеа могут быть доставлены к месту в стволе скважины, находясь внутри или на поверхности частиц, например пористых неорганических частиц (например, диоксида кремния, оксида алюминия и так далее) или полимерных частиц или в капсулах, например коллоидах, и так далее. Эти частицыносители могут также нести питательные вещества для бактерий.

- 5 017608

Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложены частицы, импрегнированные термофильными Атсйеа, обладающими способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Атсйеа, генетически модифицированными для продуцирования химических соединений для обработки скважин.

Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложено применение термофильных Атсйеа, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Атсйеа, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин, для производства композиций для обработки углеводородных скважин.

Согласно еще одному аспекту, данное изобретение включает в себя композицию для обработки углеводородных скважин, включающую в себя жидкость-носитель, содержащую термофильных Лтсйеа, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Лтсйеа, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин.

Согласно еще одному аспекту, данное изобретение включает в себя трубный фильтр (1иЬи1ат ййет) для размещения внутри ствола скважины, содержащий термофильных Лтсйеа, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Лтсйеа, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин.

В способе по данному изобретению бактерии могут быть помещены внутрь ствола скважины перед добычей углеводородов (то есть извлечения нефти или газа из скважины) и/или после нее. Предпочтительно, бактерий помещают внутрь ствола скважины перед началом добычи, в частности, на завершающей стадии строительства скважины.

Бактерий можно поместить внутрь ствола скважины (например, в несущие углеводороды пласты или ответвления ствола скважины) или внутрь окружающей формации (например, внутрь трещин или внутрь самой горной породы). В первом случае, бактерий для удобства импрегнируют в частицы, содержащиеся внутри трубного фильтра, например гравийного фильтра или фильтрующей структуры, как описано в ЕР-А-656459 или \УО 96/27070; во втором случае, бактерий (возможно, импрегнированных внутрь частиц) предпочтительно размещают путем вдавливания жидкой композиции, содержащей этих бактерий, внутрь ствола скважины. Предпочтительно, перед началом добычи бактерий помещают как внутри скважины в фильтре, так и внутри окружающей формации. Бактерий, в качестве альтернативы, помещают внутрь частиц.

Когда бактерий (как правило, импрегнированные внутрь частиц) помещают внутрь окружающей формации, используемое давление должно быть достаточным для того, чтобы заставить бактерий проникнуть внутрь по меньшей мере на 1 м, более предпочтительно по меньшей мере на 1,5 м, еще более предпочтительно по меньшей мере на 2 м внутрь формации. Если желательно, бактерий можно использовать в сочетании с пористыми частицами для того, чтобы достигнуть проникновения внутрь формации приблизительно на 2 м или более. Композиции, включающие в себя такие небольшие пористые частицы и бактерии, по данному изобретению, которые могут быть введены вместе с питательными веществами, составляют еще один аспект данного изобретения.

Преимущественно, частицы, пропитанные или нагруженные (также здесь называемые импрегнированными) Атсйеа, по данному изобретению, имеют модовый размер (тобе ратйс1е бхе) (например, измеренный с использованием анализатора размера частиц СоиЙет) от 1 мкм до 5 мм, более предпочтительно от 10 мкм до 1000 мкм, в частности от 250 мкм до 800 мкм. Для помещения внутрь формации размер частиц предпочтительно составляет от 1 до 50 мкм, в частности от 1 до 20 мкм, например 1-5 мкм. Для любой конкретной формации, проницаемость формации (которая коррелирует с размером суженной части пор в формации) можно легко определить, используя образцы горной породы, взятые во время бурения, и, таким образом, может быть определен оптимальный размер импрегнированных частиц. Поскольку частицы, полученные в соответствии с тем, как описано в ЕР-В-3905, И8-А-4530956 и \УО 99/19375, имеют очень низкую дисперсность (то есть разброс размеров), может быть достигнуто высоко очень равномерное нанесение и глубокое проникновение в формацию. По этой причине, частицы предпочтительно имеют коэффициент вариации (КВ), составляющий менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 2%.

КВ определяют в процентах следующим образом:

КВ = 700 х стандартное отклонение , среднее где среднее представляет собой средний диаметр частиц, и стандартное отклонение представляет собой стандартное отклонение размера частиц. КВ предпочтительно рассчитывается по главной моде, то есть путем подгонки кривой мономодового распределения к обнаруженному распределению размера частиц. Таким образом, некоторые частицы, имеющие размер меньше или больше модового размера, могут быть исключены при расчете, который, например, может основываться на приблизительно 90% от общего числа частиц (то есть обнаруженных частиц). Такое определение КВ можно осуществлять на анализаторе размера частиц Сои11ет Ь8 130.

- 6 017608

Для размещения внутри фильтров импрегнированные частицы предпочтительно имеют модовый размер частиц от 50 до 5000 мкм, более конкретно от 50 до 1000 мкм, еще более предпочтительно от 100 до 500 мкм. В таких фильтрах импрегнированные частицы предпочтительно составляют от 1 до 99 мас.%, более предпочтительно от 2 до 30 мас.%, еще более предпочтительно от 5 до 20 мас.% от матрицы фильтра в виде частиц, причем оставшаяся часть матрицы включает в себя не растворимый в нефти и воде неорганический материал в виде частиц, предпочтительно неорганический оксид, такой как диоксид кремния, оксид алюминия или оксид алюминия-диоксид кремния. Особенно предпочтительно, если неорганический оксид имеет модовый размер частиц, аналогичный размеру импрегнированных полимерных частиц, например, в пределах 20%, более предпочтительно в пределах 10%. Что касается расположения внутри формации, импрегнированные частицы предпочтительно имеют низкую дисперсность, например КВ составляет менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 2%. Низкая дисперсность нужна для того, чтобы препятствовать засорению фильтров.

Поры частиц должны быть достаточно крупными для того, чтобы дать возможность микроорганизмам проникать без затруднений, например, радиус пор составляет до 2-4 мкм.

Импрегнированные частицы предпочтительно представляют собой частицы, имеющие объем пор, составляющий по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, например по меньшей мере до 85%.

Импрегнированные бактериями полимерные частицы, используемые по данному изобретению, например МРР или другие ступенчато выращенные полимерные частицы (51ер-дто^п ро1утег райШев), предпочтительно представляют собой гомо- и сополимеры винила, более предпочтительно гомо- и сополимеры стирола. Примеры подходящих мономеров включают в себя виниловые алифатические мономеры, такие как эфиры акриловой и метакриловой кислот, акрилонитрил, и виниловые ароматические мономеры, такие как стирол и замещенные стиролы. Предпочтительные полимеры представляют собой стироловые полимеры, возможно и предпочтительно сетчатые полимеры, например с дивинилбензолом, и частицы таких полимеров с диапазоном размеров и объемов пор имеются в продаже от Оупо 8рес1а11у Ро1утетв Л8 οί БШейгот. Норвегия. Если желательно, частицы могут быть обработаны (ГипсРопайвеб). например для получения поверхности с кислыми или основными группами (например, функциональными группами карбоксильной или амино), например для того, чтобы захватывать атомы металлов из воды, проникающей в частицы, чтобы уменьшить образование твердого осадка, облегчить адгезию частиц для образования поверхностей, облегчить агрегацию частиц или препятствовать ей и так далее. Обработанные частицы доступны от Эупо 8рес1аИу Ро1утетв Л8.

Предпочтительно, полимерная матрица импрегнированных частиц имеет точку размягчения выше температуры в скважине, например выше 70°С, более предпочтительно выше 100°С, еще более предпочтительно выше 150°С.

Как правило, когда частицы импрегнируют бактериями, их также импрегнируют питательными веществами для бактерий, например сахарозой, чтобы способствовать росту бактерий, как только частицы окажутся в воде. В качестве альтернативы, могут использоваться так называемые ультрамикробактерии, которые голодают на стадии введения, что облегчает их проникновение вглубь формации. Последующее введение питательных веществ затем стимулирует рост.

Примеры типичных химических соединений для обработки скважин, предшественников и образующих их соединений упоминаются в публикациях патентов, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки.

Так, например, типичные ингибиторы образования твердого осадка включают в себя неорганические и органические фосфонаты (например, аминотрисметиленфосфонат натрия), полиаминокарбоновые кислоты или их сополимеры, полиакриламины, поликарбоновые кислоты, полисульфоновые кислоты, фосфатные сложные эфиры, неорганические фосфаты, полиакриловые кислоты, инулины (например, натрий-карбоксиметилинулин), фитиновую кислоту и ее производные (в особенности карбоксильные производные), полиаспартаты и так далее.

Особенно предпочтительно применение экологически приемлемых ингибиторов образования твердого осадка, например инулинов, фитиновой кислоты и ее производных и полиаспартатов.

Когда ингибитор образования твердого осадка представляет собой полимер, он, безусловно, может содержать остатки одного или более чем одного различного сомономера, например сополимер аспарагиновой кислоты и пролина.

Другие полезные микробные продукты включают в себя ферменты, которые сами по себе способны синтезировать химические соединения для обработки скважин, такие как ингибиторы образования твердого осадка. Может быть необходимо трансформировать бактерии множеством генов, кодирующих различные ферменты, которые вовлечены в синтетический путь описанного химического соединения для обработки скважин. Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может быть прямо продуцировано Лтсйеа, то есть представлять собой продукт экспрессии, или получено косвенно в результате метаболизма или катаболизма внутри Лтсйеа. Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может быть белковым, например полипептидом или гликопротеином, но не обязательно, и мо

- 7 017608 жет быть полисахаридом или липидом.

В особенно предпочтительном воплощении, химическое соединение для обработки скважин может иметь двойную функцию. Этого можно легко достигнуть, например, путем получения слитого белка, который может иметь фрагмент, ингибирующий образование твердого осадка, и фрагмент, который действует, например, как ингибитор коррозии, биосурфактант или антифриз. Полиаспартат особенно полезен, поскольку он может действовать в качестве ингибитора образования твердого осадка и ингибитора коррозии.

Примеры предпочтительных химических соединений для обработки скважин включают в себя: ингибитор образования гидратов, ингибиторы образования твердого осадка, ингибиторы образования асфальтеновых отложений, ингибиторы образования парафиновых отложений и ингибиторы коррозии. Такие ингибиторы хорошо известны специалистам в области обработки скважин.

В некоторых специальных случаях, например, если сталкиваются с отложением карбонатов или органическим нафтенатным отложением, может быть подходящим введение описанных здесь микроорганизмов в нагнетательную скважину. Таким образом, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения также предложен способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь нагнетательной скважины вводят термофильных Атсбеа или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин. Предпочтительные признаки данного аспекта включают в себя применение Лтсйеа, которые были генетически модифицированы для продуцирования химических соединений для обработки скважин, в соответствии с тем, как обсуждалось выше. Микроорганизмы, вводимые в нагнетательную скважину, преимущественно, могут продуцировать органические кислоты и/или химические соединения, вовлеченные в ингибирование образования гидратов.

Когда бактерий вводят внутрь формации, они предпочтительно используются в виде дисперсии в жидком носителе. Для использования до и после завершения жидкий носитель предпочтительно включает в себя неводную органическую жидкость, например углеводород или смесь углеводородов, как правило углеводороды С3-С15 или нефть, например сырая нефть. Для исправляющей обработки (ситабуе 1геа(шеи1), то есть после того, как добыча продолжалась в течение некоторого периода времени, жидкий носитель может быть водным и неводным.

Импрегнация бактерий и, если желательно, питательных веществ и/или других химических соединений для обработки скважин в пористые частицы носителя может быть осуществлена с использованием любого обычного способа, например, путем приведения частиц в контакт с водной и неводной дисперсией бактерий и других химических соединений с последующим удалением растворителя, если потребуется, например путем дренирования, сушки или под вакуумом.

Тем не менее, особенно предпочтительно импрегнировать частицы бактериями путем смешивания в суспензии, то есть путем добавления количества дисперсии, которое близко к объему пор частиц, например от 0,8 до 1,2 от объема пор, более предпочтительно от 0,9 до 1,1 от объема пор. Еще более предпочтительно импрегнировать частицы с использованием способа пропитывания с помощью вакуума. Этот способ можно удобно осуществлять в роторном испарителе при 0-15 мбар (0-1500 Па) при комнатной температуре и продолжать при 50°С до тех пор, пока большая часть водной фазы не будет удалена. Желательно вводить бактерий в систему пор не только на поверхности. Если желательно, нагрузка частиц может быть увеличена путем осуществления более чем одной стадии импрегнации.

Для поддержания популяции микроорганизмов ίη кби могут быть предусмотрены различные способы. Микроорганизм может быть иммобилизован на пористой матрице с комплексом питательных веществ или введен вместе с питательными веществами в небольшие пористые частицы, которые затем могут быть введены глубоко (например, 2-10 м) в формацию. Высококонцентрированные инокуляты термофильных бактерий могут быть введены в пористые частицы. Преимущественно, некоторые виды бактерий, которые могут быть введены, способны к продуцированию жизнеспособных спор в среде скважины.

Данное изобретение также относится к биореактору для синтеза химических соединений для обработки скважин. Химические соединения для обработки скважин, таким образом, продуцируются в биореакторе и затем вводятся в углеводородную скважину. В предпочтительном воплощении, частицы описанного здесь типа, то есть пористые импрегнированные частицы, могут быть нагружены продуктами из биореактора. Биореактор, который может располагаться на участке ствола скважины или около него или удален от участка, может функционировать, для того чтобы создать возможность продуцирования любого химического соединения для обработки скважин, такого как было описано выше. Предпочтительно, биореактор может создать возможность для получения пептидных ингибиторов образования твердого осадка, таких как поли(аминокислоты), например полиАсп или другие преимущественно (положительно) заряженные полипептиды, подходящие для использования в качестве химических соединений для обработки скважин. Используемые в биореакторе микроорганизмы могут встречаться в природе, например встречающиеся в природе бактерии или Атсбеа, примеры которых были приведены выше, которые продуцируют химические продукты для обработки скважин, синтезируемые или путем модификации, или путем добавления регуляторных или структурных последовательностей. Не обязательно использовать

- 8 017608 термофильные виды, если используют биореактор. Могут использоваться любые микроорганизмы, например Е. со11.

Используемый здесь термин биореактор относится к любой системе для роста клеток в культуре, а именно микроорганизмов, таких как бактерии или Атсйеа. Питательные вещества можно подавать в биореактор, а образцы легко удалять из него.

Продукт, выделяемый от микроорганизмов, может секретироваться или оставаться в клетке. В том случае, когда продукт секретируется, его можно непрерывно удалять из клеточной культуральной среды путем удаления культуральной среды и заменой ее свежей средой для выращивания. Продукт может затем быть выделен из среды для выращивания с использованием стандартных способов. В качестве альтернативы, микроорганизмы могут быть удалены из биореактора, а продукт выделен после разрушения клеток с использованием способов, известных из уровня техники.

Для того чтобы добиться выделения продукта в том случае, когда он представляет собой экзогенный белок, этот белок может быть модифицирован таким образом, чтобы способствовать выделению, например его можно пометить с использованием метки, такой как Ык-метка или тус-метка. Такие метки и способы выделения хорошо известны из уровня техники.

Продукты, полученные в биореакторе, например пептидные ингибиторы образования твердого осадка, такие как полиАсп, или выделяют из лизированных микроорганизмов, или они секретируются и их выделяют из среды для выращивания. Может быть необходимо добавлять последовательности, которые кодируют аминокислотные сигналы, которые направляют секрецию белка при определенных условиях. Независимо от способа получения продукт затем можно смешать с получением общего препарата, необходимого для традиционной обработки путем закачки под давлением.

Биореакторы, таким образом, представляют собой экологически приемлемую систему для получения химических соединений для обработки скважин. Еще один аспект настоящего изобретения, следовательно, относится к применению биореактора для получения химических соединений для обработки скважин. Предпочтительно, химические соединения для обработки скважин представляют собой пептидные ингибиторы образования твердого осадка или другие вещества, которые полезны для скважины, включающие в себя заряженные пептиды. Наиболее предпочтительно, заряженный пептид представляет собой полиАсп или сополимер аспарагиновой кислоты и другой аминокислоты, как было определено выше.

Данное изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие не ограничивающие объем изобретения примеры и графический материал, на которых дано схематическое представление плазмиды рЕТ11б-Акрат1а1е, описанной в примере 2. Эта плазмида кодирует полиАсп и может быть использована для трансформации микроорганизмов, в соответствии с тем как здесь описано.

Пример 1. Клонирование гена полиаспартата (ПА).

Использовали систему экспрессии рЕТ Е. сой. Эта система имеет высокую избирательность РНКполимеразы бактериофага Т7 в отношении распознаваемых ею последовательностей промоторов, причем высокий уровень активности полимеразы и высокая эффективность трансляции опосредованы сигналами инициации трансляции Т7.

Олигонуклеотид для ПА.

Кодон, предпочтительный для ПА, исследовали в Собой икаде ба!аЬаке (1Шр:/Л\л\лт.ка/и8а.ог.)р/ собой/) перед синтезом. Нуклеотид для ПА синтезировали с использованием последовательности — ОАТОАТОАТ— 75 пар оснований (25 аминокислот), в дополнение к стартовому и стоп-кодонам и специфическим последовательностям для встраивания в вектор после расщепления рестриктазами (Еиго ОепТес).

Получение вектора и олигонуклеотидов.

Вектор рЕТ 11а (1 г/мл; 81та1адепе, Ьа 1о11а, Са, США) расщепляли рестриктазой Ыбе1 (37°С в течение ночи). Вектор обрабатывали кишечной щелочной фосфатазой теленка (С1АР; 81га1адепе) в соответствии с указаниями производителя. Вектор затем разделяли посредством электрофореза в агарозном геле (1% агароза), вырезали из геля и очищали с использованием реагентов для экстракции из геля (О1ас.|шск де1 ехйасбоп кй, 01адеп. ОтЬН, Нббеп, Тукк1апб).

Олигонуклеотиды (100 пмоль/л) нагревали (95°С, 5 мин), температуру затем уменьшали до 65°С со скоростью 1°С/мин и образец помещали на лед перед лигированием. Использовали соотношение между вектором и вставкой, рекомендуемое производителем.

Лигирование и трансформация.

Лигирование осуществляли в течение ночи при 18°С, используя несколько соотношений между вектором и вставкой. Использовали ДНК-лигазу фага Т4 и 10хлигазный буфер (рН 7,6).

Лигирующую смесь трансформировали в Е. со11 ΌΗ5 с использованием протокола тепловой шок: лигирующую смесь добавляли к компетентным клеткам (50 л), инкубировали на льду (30 мин), помещали на нагревающий блок при 42°С (45 с) и, наконец, на лед (2 мин). Клетки затем инокулировали в среду Луриа-Бертани (среду ЬВ), инкубировали в инкубаторе с перемешиванием (37°С, 3 ч) и распределяли по агару ЬВ с 5-бром-4-хлор-3-индолил-3-Э-галактопиранозидом (Х-да1), изопропилтиогалактозидом

- 9 017608 (ИПТГ) и ампициллином для отбора клонов. Чашки с ЬВ инкубировали при 37°С в течение ночи.

Выделение и секвенирование плазмидной ДНК.

Белые пигментированные клоны удаляли с агара ЬВ, инокулировали в среду ЬВ с ампициллином и инкубировали в инкубаторе при перемешивании в течение ночи (37°С). Плазмидную ДНК выделяли с использованием системы для очистки ДНК Χνί/агб Р1и§ 8У М1шргер (Рготеда. Мабщоп. ^1, США) в соответствии с указаниями производителя. Секвенирование плазмидной ДНК осуществляли с использованием реагентов для секвенирования Вф Эуе (Аррйеб Вюкуйетк. Еойег Сйу. СА. США) и праймером промотора Т7 в реакции. ДНК осаждали в этаноле и анализировали в секвенаторе АВ1 Ргщт ΌΝΑ377 (АррНеб Вюкуйетк).

Пример 2. В этом примере также используется система рЕТ Е. сой. описанная в примере 1. Олигонуклеотид для ПА.

Олигонуклеотиды

А 5'-САТ66АТ6АС6АТ6АТ6АССС66АТ6АТ6АС6АС6АТ6АС6АТ6АС6АТСС66АС0АТ 0АС6АС6АТ6АТ6АС6АТ6АТССТА66САТСАССАТСАССАТСАТТАА0-3' и Б 5'-6АТССТТААТ6АТ66Т6АТ66Т6АТ6ССТА66АТСАТС6ТСАТСАТС6ТС6ТСАТС0Т СС06АТС6ТСАТС6ТСАТС6ТС6ТСАТСАТСС666ТСАТСАТС0ТСАТС-3' были синтезированы в ЕигоОеп Тес.

Эквивалентные количества каждого олигонуклеотида отжигали путем их смешивания. нагревания до 95°С и охлаждения смеси со скоростью 1°С/мин до 65°С. Смешанные олигонуклеотиды затем помещали на лед. Эти смешанные олигонуклеотиды образуют двухцепочечную ДНК с липкими концами. совместимыми с сайтами рестриктаз №о1 и ВатН1. Таким образом. возможно прямое клонирование дцДНК-вставки. Получение вектора.

Вектор рЕТ116 (81га1;щепе) расщепляли рестриктазами ВатН1 и №о1 в соответствии с указаниями производителя. для того чтобы добиться полного расщепления. Вектор обрабатывали С1АР в соответствии с указаниями производителя. Расщепленный вектор затем отделяли от отрезанного фрагмента с использованием электрофореза в агарозном геле и очищали путем экстракции из геля.

Лигирование.

Для лигирования использовали несколько соотношений между вектором и вставкой. в соответствии с рекомендациями производителя.

Лигирование осуществляли. используя ДНК-лигазу фага Т4 и 10хлигазный буфер (рН 7.6). Реакцию осуществляли в течение ночи при 18°С. в соответствии со стандартными способами. Получающийся в результате вектор показан на чертеже.

Лигирующую смесь трансформировали в клетки Е. сой (ЭН10В). используя стандартный протокол тепловой шок. Трансформированные клетки затем инкубировали. наносили на чашки и отбирали.

Плазмидную ДНК выделяли из Е. сой и секвенировали в соответствии с тем. как описано в примере 1. для того чтобы подтвердить наличие вставки и ее последовательность.

Пример 3. Экспрессия и выделение полиаспартата.

Очищенную плазмидную ДНК трансформируют в Е. сой ЕР2566. которая экспрессирует ДНКполимеразу Т7. под контроль промотора 1ас. Трансформированных Е. со11 выращивают на среде 3ХЬВ. содержащей ампициллин (200 мкг/мл) в течение 7 часов при перемешивании. Экспрессию полиАсп индуцируют в одной культуре через 3 ч путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. Одну культуру оставляют неиндуцированной для сравнения. Культуру можно инкубировать при более низкой температуре с последующей индукцией для увеличения ее эффективности. Клетки собирают и ресуспендируют в одной десятой части объема 10 мМ трис(гидроксиметил)метиламина (Трис) рН 7.5 и обрабатывают ультразвуком. Получающуюся в результате смесь центрифугируют для отделения дебриса и супернатант фильтруют. Аликвоты культуральной среды. обработанных ультразвуком клеток и фильтрат используют в анализе. для того чтобы выяснить. секретируется ли пептид. или остается ли он в клетке. или присутствует в виде растворимого внутриклеточного/периплазматического белка.

Белковые образцы отбирают. используя стандартный электрофорез в полиакриламидном геле. используя 15-20% полиакриламидный гель. Наличие полосы приблизительно на уровне 5 кДа указывает на присутствие желаемого продукта.

Если необходимо. продукт может быть обнаружен с использованием стандартных способов иммуноблоттинга. таких как вестерн-блоттинг. используя антитела в отношении полиАсп на любой подходящей белковой метке.

Пример 4. Идентификация Агсйеа и бактерий. характерных для нефтяных месторождений. Этих микроорганизмов затем можно использовать для обработки углеводородной скважины в немодифицированном виде или предпочтительно генетически модифицированном виде для продуцирования полезного химического соединения для обработки скважин. такого как полиАсп.

1. Материалы и методы.

1.1. Отбор и обработка образца.

1.1.1. Отбор.

- 10 017608

Стерилизованные стеклянные колбы для образцов на 5 л (8сйой) с 5 мл 0,1% (мас./об.) восстановителя резазурина (8щта СНст1са1 Со., 8ΐ. Бошк, МА, США) на колбу доставляли на находящиеся в открытом море месторождения. Образцы собирали в виде сырого флюида из эксплуатационной скважины (нефть/вода) через эксплуатационный трубопровод перед отделением попутно добываемой воды. Колбы полностью заполняли. Верхний нефтяной слой закрывал воду от атмосферы, предотвращая окисление водных фаз.

Образцы посылали на берег в закрытых алюминиевых ящиках (периоды транспортировки 1-2 недели). В процессе транспортировки ящики хранили при температуре окружающей среды.

Никаких следов кислорода не было обнаружено в водных фазах по прибытии образцов на берег.

1.1.2. Фильтрация водных образцов.

После прибытия в лабораторию нефтяную и водную фазы образцов флюида из эксплуатационной скважины немедленно нагревали (70°С; 20 мин) и нагретые фазы разделяли в делительных воронках на 2 л. Биомассу микробов из 1-2 л воды собирали путем фильтрации через 0,22 мкм фильтры 81епуех СУ (Мййроге Согр., ВсбГогб. Ма, США), соединенные с предфильтрами Мй1ех АР (Мййроге). После фильтрации каждый фильтр 81епуех заполняли 2 мкл лизирующего буфера (50 мМ трис-НС1, рН 8,0; 40 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); 750 мМ сахароза) и хранили при -20°С до экстракции ДНК.

Один из образцов был сильно эмульгирован, что привело в результате к лишь небольшому количеству водной фазы. Эту эмульсионную фазу промывали стерильным буферным раствором, фазы разделяли и фильтровали (приблизительно 1 л фазы буфера), как было описано выше.

1.2. Подсчет клеток.

Количество клеток в водных фазах флюида из эксплуатационной скважины подсчитывали немедленно после доставки в лабораторию с использованием эпифлуоресцентной микроскопии. Образцы предварительно фильтровали (Мй1ех АР, Мййроге) и 100 мл фильтраты центрифугировали (6000хд; 10 мин для удаления крупных частиц и остаточных капель нефти). В супернатанты (10 мл) добавляли флуорохром 4',6-диамино-2-фенилиндол (ΌΑΡΙ; 0,6 мкг/мл) и образцы инкубировали при комнатной температуре (10 мин) с последующей фильтрацией через 0,22 мкм черные поликарбонатные фильтры (Мййроге). Фильтры помещали в флуоресцентный микрпоскоп (Бей/ Ωία1υχ с флуоресцентным блоком Р1оеторак и УФ-фильтром А и оборудованный цифровой камерой Ье1са ИС 100) в иммерсионном масле. Флуоресцирующие клетки подсчитывали при увеличении 1250х.

1.3. Амплификация образцов из месторождения путем полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.3.1. Экстракция и количественное определение нуклеиновой кислоты.

Замороженные фильтры 81епуех с микробными сообществами размораживали и лизировали непосредственно на фильтрах. Лизис осуществляли путем инкубации каждого фильтра с 2 мкг лизоцима (8щта; из маточного раствора 20 мг/мл; при 37°С в течение 30 мин). Смеси затем инкубировали при 55°С в течение 2 ч с 1 мкг протеиназы К (8щта; из маточного раствора 20 мг/мл) и 1 % (масс/об.) додецилсульфата натрия (8Ό8; ВюВай ЬаЬк, Кгсйтоп!, СА, США) из 20% маточного раствора. Лизаты переносили в стерильные пробирки, фильтры 81епуех промывали лизирующим буфером (55°С; 10 мин) и лизаты с каждого фильтра объединяли. Лизаты экстрагировали горячей смесью фенол-хлороформизоамиловый спирт (25:24:1) в соответствии со стандартными способами (8атЬгоок апй Ви88е1, 2001). Вкратце, каждый лизат (3 мл) смешивали с 6 мл горячей (60°С) смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, забуференной Трис-НС1 (рН 8,0), интенсивно перемешивали, поддерживали в горячем состоянии в течение 5 мин, затем охлаждали на льду с последующим разделением фаз путем центрифугирования (4000хд; 5 мин при 4°С; 1оиап Мойе1 1812, 8а1п1 На/айе, Франция). К каждой водной фазе добавляли ацетат натрия (0,2 объема 10 М растворов) и повторно экстрагировали 5 мл смеси фенол-хлороформизоамиловый спирт, забуференной Трис-НС1, с последующим центрифугированием. Водные фазы затем экстрагировали 5 мл горячей (60°С) смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали, как описано выше. Экстрагированные водные фазы осаждали 2,5 объемами 96% этанола (-20°С; 3 ч), осадки осаждали путем центрифугирования (4000хд) и капли осадков промывали 75% этанолом. Капли осадков сушили (Ν₂) после повторного центрифугирования и растворяли в 100 мкл стерильной сверхчистой воды (Вюсйгот АС, Вег1ш, Сегтапу). Экстракты нуклеиновой кислоты замораживали (-20°С).

Экстрагированные нуклеиновые кислоты оценивали с использованием полуколичественного метода анализа, используя бромистый этидий (8атЬгоок апй Ви88е1, 2001). Нуклеиновые кислоты (2 мкл) наносили пятнами на УФ трансиллюминационный столик (ВюКай), накрытый пластиковой пленкой (С1айРак) и в каждое пятнышко добавляли 2 мкл бромистого этидия (10 мг/мл в буфере ТЕ, рН 8,0). Пятнышки фотографировали под УФ-освещением и концентрации определяли по интенсивности окрашивания по сравнению со стандартными сериями ДНК лосося (8щта) в диапазоне 100-500 нг ДНК на пятнышко.

1.3.2. Олигонуклеотиды и реагенты для ПЦР.

1.3.2.1. Олигонуклеотиды для амплификации путем ПЦР.

Получали олигонуклеотидные праймеры, специфичные в отношении бактерий и Агсйеа (Текке е! а1., 1996; ПеЬопд, РНА8 И8А 89 (1): 5685-9, 1992).

Бактерии

- 11 017608

341ГВас: 5'-ССТ-АСО-66А-66С-А6С-АО-3' (прямой праймер)

907гВАС: 5'-ССС-С6Т-САА-ТТС-СТТ-Т6А-6ТТ-3' (обратный праймер)

Ожидаемый продукт ПЦР: 567 пар оснований (п.о.)

Агскеа

21ГАВСН: 5'-ТТС-СО6-ТТ6-АТС-СС6-СС6-ОА-3' (прямой праймер) 958гАКСН: 5'-ССС-6ОС-6ТТ-ОАА-ТТС-ААТ-Т-3' (обратный праймер) Ожидаемый продукт ПЦР: 938 п.о.

Праймеры были синтезированы в ЕитоОеи1ес, 8ета1ид, Бельгия. Праймеры разводили в стерильной воде в концентрации 50 мкМ, распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при -20°С.

1.3.2.2. Биотинилированные олигонуклеотиды.

Было получено множество биотинилированных олигонуклеотидов ДНК (5'- и 3'-меченных) (Тезке е1 а1., 1996; Маззаиа е1 а1., 1997) для анализа продуктов ПЦР методом саузерн-блоттинга:

δ подраздел/грамположительные бактерии (включающие в себя Оези1Го\зЬпо и Эези1ГоЬи1Ьиз)

385 8КВ: Биотин-5'-СО6-С6Т-С6С-Т6С-6ТС-А6О-3'-Биотин

Температура гибридизации: 50°С.

Эези1ГоЬас1ег и Эези1ГоЬас1ег1ит

804 8КВ: Биотин-5'-САА-СОТ-ТТА-СТ6-С6Т-6ОА-3'-Биотин

Температура гибридизации: 40°С.

Стеиатскаео1а (Группа I Агскеа)

554 АКСН-1:

Биотин-5'-ТТА-ООС-ССА-АТА-АТС-МТС-СТ-3'-Биотин

Температура гибридизации: 40°С.

Ешуатскаео1а (Группа II Агскеа)

554АКСН-11:

Биотин-5'-ТТА-6ОС-ССА-АТА-ААА-КСО-АС-3'-Биотин

Температура гибридизации: 40°С.

Все биотинилированные праймеры были синтезированы в ЕитоОеи1ес, 8етатд, Бельгия. Праймеры разводили в стерильной воде в концентрации 50 мкМ, распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при 20°С.

1.3.2.3. Дезоксинуклеотиды.

Маточные растворы дезоксинуклеотидов (дНТФ) готовили путем разбавления 100 мМ дНТФ. 2'-дезоксиаденозин 5'-трифосфата (дАТФ), 2'-дезокситимидин 5'-трифосфата (дТТФ), 2'-дезоксигуанозин 5'-трифосфата (дГТФ) и

2'-дезоксицитидин 5'-трифосфата (дЦТФ) (Атегзкат Ркатташа Вю1ес11. Р|зса1а\уау. N1, США). Каждый дНТФ (100 мкл) разводили в стерильной воде (600 мкл), получая в результате конечную концентрацию 10 мМ каждого дНТФ. Растворы распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при -20°С.

1.3.3. Проявительная ПЦР (Юискбо\уп РСК).

Экстрагированные ДНК (см. выше) или суспензии лизированных микробных клеток использовали в качестве ДНК-матрицы для амплификации путем ПЦР. Когда использовали суспензии лизированных клеток, бульонные культуры разводили в стерильной воде (10^-2) или колонии с чашек с агаровой средой суспендировали в стерильной воде с последующим нагреванием (100°С) в течение 10 мин.

100 мкл смеси для ПЦР, состоящей из 20 мкл дНТФ (10 мМ), 10 мкл прямого праймера (50 мкМ), 10 мкл обратного праймера (50 мкМ), 55 мкл стерильной воды и 5 мкл ДНК-полимеразы АтркТад (Реткт Е1тег Коске Мо1еси1аг 8уз1етз, ВтаискЬигд, N1, США).

ДНК-матрицу (1-10 мкл) разводили в 10 мкл [10х] буфера для ПЦР с 15 мкМ МдС1₂ (Реткш Е1тег Коске) и стерильной водой до конечного объема 90 мкл. Смесь нагревали (95°С) в течение 5-10 мин на нагревающем блоке. 10 мкл смеси для ПЦР добавляли в каждый образец, пока они еще находились в нагревающем блоке (95°С), и образцы немедленно переносили в ДНК-термоциклер (ΩΝΛ Ткегта1 Сус1ег, 1Сус1ег, ВюКаб).

ПЦР проводили в виде проявительного способа для уменьшения образования ложных побочных продуктов, используя следующую последовательность циклов:

Денатурация: 95°С в течение 1 мин.

Отжиг праймеров: 65-55°С в течение 1 мин.

Синтез ДНК (удлинение праймера): 72°С в течение 3 мин.

Число циклов: 35.

В течение первых 10 циклов температуру отжига постепенно уменьшали с 65 до 55°С на 1°С на каждый цикл в течение первых 10 циклов, с последующими 25 циклами с температурой отжига 55°С. Работу ПЦР останавливали посредством использования температуры 72°С в течение 15 мин перед охлаждением до 4°С.

- 12 017608

1.3.4. Электрофорез в агарозном геле.

1.3.4.1. Аналитический электрофорез.

Продукты ПЦР анализировали путем электрофореза в горизонтальном агарозном геле. Образцы (27 мкл) смешивали с [10х] гель-загрузочным (де1-1оабшд) буфером ТВЕ (3 мкл) (0,9 М Трис, 0,9 М борат, 20 мМ ЭДТА, рН 8,3, 50% (об. %) глицерин, 0,25% (мас./об.) бромфеноловый синий). В качестве стандарта использовали лэддер ДНК с низкой массой (Боте ΌΝΑ Ма88 Ьаббет, 01Ьсо ВРЬ. Ра181еу, Великобритания) в количестве 12 мкл стандарта в 3 мкл [10х] гель-загрузочного буфера ТВЕ.

Гели готовили путем нагревания агарозы (2,0 г; 8щта) в 160 мл [0,5х] ТВЕ (0,045 М Трис, 0,045 М борат, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3) в микроволновой печи (4 мин) с последующим охлаждением до 50°С на водяной бане. К агарозе добавляли бромистый этидий (10 мкл) из маточного раствора (10 мг/л бромистого этидия в стерильной воде) и расплавленный гель заливали горизонтально в пластиковый поддон (открытые края поддона запаяны) с гребенкой на 15 лунок или 20 лунок в аппарате для электрофореза (ВюВаб). Гель, погруженный в буфер ТВЕ [0,5х], оставляли на 20 мин при комнатной температуре и гребенку и перемычки осторожно убирали.

Приготовленные образцы и стандарт (см. выше) наносили в погруженные лунки геля (20 мкл образца и 10 мкл стандарта) и электрофорез проводили при постоянном напряжении (150 В) в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре, Визуализацию геля осуществляли на УФ трансиллюминационном столике (ВюВаб). Гели фотографировали на черно-белую пленку Ро1ато1б (время экспозиции 0,1-0,5 с) или на цифровую камеру (ОеЮос, 2000, ВюРаб).

1.3.4.2. Препаративный электрофорез.

Препаративный электрофорез в агарозном геле осуществляли в основном, как описано выше для аналитического подхода, за исключением того, что использовали легкоплавкую агарозу (81дта). Агарозу (1,3 г) плавили в 160 мл [0,5х] буфера ТВЕ или [1х] буфера ТАЕ (0,04 М Трис-ацетат, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА), раствор геля охлаждали до 35-50°С, добавляли бромистый этидий, и получали горизонтальный гель, как описано выше, за исключением того, что температуру устанавливали на уровне 4-5°С. Образцы наносили в соответствии с тем, как описано выше, и электрофорез проводили при постоянном напряжении 100 В в течение 1,5-2 ч.

После электрофореза гели фотографировали и отобранные полосы ДНК вырезали из агарозы стерильным скальпелем и переносили в микроцентрифужные пробирки. Перед дополнительной обработкой вырезанные кусочки агарозы обрабатывали путем быстрого центрифугирования и плавили при 65°С в течение 15 мин. Образцы поддерживали в расплавленном состоянии при 35-37°С.

1.3.5. Саузерн-блоттинг и гибридизация.

1.3.5.1. Блоттинг.

Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР с саузерн-блоттингом осуществляли, как описано выше (аналитический подход), за исключением того, что в гель не добавляли бромистый этидий. ДНК переносили из геля на мембраны НуЬопб Ν+ (Атетзйат Рйагтааа) путем диффундирующего блоттинга (б1йи8юп Ь1оШп§). После электрофореза гель замачивали в 10 объемах денатурирующего раствора (0,5 М ΝηΟΗ, 1,5 М №1С1) на 2х20 мин (медленное перемешивание) с последующей нейтрализацией (1 М ацетат аммония) в течение 2х 15 мин. Гель затем обрезали и помещали на стеклянную пластинку с хроматографической бумагой (3 мм Сйг, ^йа1тап, Ма1б8!опе, Великобритания), вымоченной в 1 М ацетате аммония. Концы хроматографической бумаги помещали в ванночку с буфером для переноса (0,2 М ацетат аммония). Гель окружали тонкой пластиковой пленкой (О1абРак) для предотвращения выпаривания буфера для переноса. Мембрану для переноса НуЬопб Ν+ вымачивали в 0,2 М ацетате аммония и помещали плотно на поверхность геля. Несколько слоев хроматографической бумаги (вымоченной в 0,2 М ацетате аммония) помещали на поверхность мембраны и стопку бумажных салфеток (5-8 см) помещали на поверхность хроматографических бумаг. Стеклянную чашку с грузом (300-400 г) помещали сверху бумажных салфеток.

Перенос ДНК осуществляли в течение ночи (8-12 ч) при комнатной температуре и бумажные салфетки меняли, когда они становились влажными. Качество блоттинга контролировали путем окрашивания геля в ванночке с бромистым этидием (0,5 мкг/мл в воде) в течение 45 мин. После блоттинга ДНК фиксировали на мембране НуЬопб под УФ светом в течение 40 с. Мембраны немедленно гибридизовали или помещали в пластик и хранили в темноте при 4°С.

1.3.5.2. Гибридизация.

Перед гибридизацией фиксированные мембраны предварительно гибридизовали в растворе (10 мл) 3х88С (растворе хлорида и цитрата натрия), 0,1% 8Ό8 и 1,0% блокирующего агента (Росйе Мо1еси1аг ВюсйетюаН) в течение 2 ч при выбранной температуре гибридизации для различных ДНК-зондов (см. выше) в гибридизаторе К.о11ет-В1о! НВ-3Э (Тесйпе, СатЬпбде, Великобритания). Биотинилированные ДНК-зонды затем помещали во вращающиеся колбы в гибридизаторе и инкубировали в течение 16-20 ч при температурах, описанных для различных ДНК-зондов (см. выше).

После гибридизации мембраны промывали в течение 10 мин в 50 мл 2х88С - 0,1% 8Ό8, 10 мин в 50 мл 0,1х88С - 0,1% 8Ό8 и 10 мин физиологическим раствором с фосфатным буфером Т (РВ8-Т) (все про

- 13 017608 мывки осуществляли при комнатной температуре). Мембраны инкубировали с экстравидинпероксидазой (Ех(тау1бт-Регохуба8е; 81дта Сйет1са1 Со., 81. Ьошк., МО), разбавленной РВ8-Т в отношении 1:2000, в течение 30 мин при комнатной температуре (перемешивание), промывали 2x10 мин РВ8-Т, 10 мин РВ8 (комнатная температура) и окрашивали (10-20 мин) в 30 мл РВ8 с использованием 2 таблеток диаминобензидина (ЭЛВ; 81дта) и 24 мл 30% безводной Н₂О₂. После окрашивания мембраны промывали водопроводной водой и фотографировали.

1.4. Денатурирующий электрофорез в градиенте концентрации геля (ДЭГГ).

1.4.1. Аналитический ДЭГГ.

ДЭГГ подвергали продукты ПЦР, образованные с использованием общих праймеров, определяющих бактерий (341 (ВАС и 907гВАС) или Атсйеа (21ГАКСН и 958гАКСН). К праймерам 341ГВАС и 21ГАКСН добавляли 40-членную СС-шпильку к 5'-концу (5'-ССС-ССС-ССС-ССС-ССС-ССС-СССССС-ССС-ССС-ССА-ССС-ССС-С-3'). ДЭГГ осуществляли с использованием 6% (мас./об.) полиакриламидных гелей (ПААГ) в [0,5 х] буфере ТАЕ (20 мМ Трис-ацетат, рН 7,4; 10 мМ ацетат, 0,5 мМ ЭДТА) с градиентом 20-70% денатурирующих агентов мочевины и формамида (100% денатурирующие агенты соответствуют 7 М мочевине и 40%(об.%) деионизированному формамиду) в универсальной системе для обнаружения мутаций ЭСобе ишуегаа1 Ми(а(юи Ие(ес(юп вуйет (ВюКаб).

Маточные растворы полиакриламида (ПАА)/бис-акриламида (БАА) (40%) состояли из 38,93 г акриламида и 1,07 г БАА, растворенных в деионизированной воде до конечного объема 100 мл, в то же время маточные растворы [50х] буфера ТАЕ получали путем смешивания 242 г Трис, 57,1 г уксусной кислоты и 100 мл 0,5 М ЭДТА в общем объеме 1000 мл с деионизированной водой. Готовили гели с линейным градиентом концентрации (толщина 1 мм) путем смешивания ПАА и БАА с денатурирующими агентами до получения линейного градиента концентрации от 20 до 70% в системе для получения градиента концентрации (ВюКаб модель 475). Растворы с 20% или 70% денатурирующими агентами описаны в табл. 1 ниже:

Таблица 1. Состав 20 и 70% денатурирующих растворов, используемых в ДЭГГ.

Химические соединения	Денатурирующие растворы
20%	70%
40% акриламид/БАА	15 мл	15 мл
[50 х] буфер ТАЕ	2 мл	2 мл
Формамид	8 мл	28 мл
Мочевина	8,4 г	29,4 г
Деионизированная вода	до 100 мл	до 100 мл

Для приготовления одного геля 18 мл каждого раствора смешивали с 200 мл персульфата аммония (10% (мас./об.) в деионизированной воде) и 20 мкл Ν,Ν,Ν'Ν'-тетраметилэтилендиамина (ΤΕΜΕΌ) (ВюКаб) и смеси немедленно переносили в один из двух шприцев на 30 мл, которые затем закрепляли в системе для получения градиента. Гель заливали как параллельный градиентный гель (16x16 см) с толщиной 1 мм и оставляли полимеризоваться в течение приблизительно 1 ч с гребенкой на 15 лунок. Камеру для электрофореза заполняли (1х) буфером ТАЕ, который нагревали до 60°С в камере и 1-2 полимеризованные геля помещали вертикально в камере для электрофореза.

Образец каждого продукта ПЦР (10 мкл) смешивали с 10 мкл буфера для образца (0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол, 70% глицерин, разведенный в деионизированной водой) и весь объем (20 мкл) наносили в каждую лунку.

Вертикальный электрофорез осуществляли при постоянной температуре (60°С) и напряжении (150 В) до тех пор, пока оба маркера не мигрировали к нижнему концу геля (приблизительно 4,5 ч).

После электрофореза гели окрашивали в 8УВК Со1б (Мо1еси1аг РтоЬек, Ье1беп, Нидерланды), разведенном в [1х] ТАЕ в отношении 1:10000, в течение 20-30 мин. Гели затем фотографировали с использованием системы СеЮос (ВюКаб).

Картины полос на гелях сопоставляли в отношении сходства и индексов сходства, рассчитываемых в опции ОиапЩу Опе программы СеЮос. Использовали способ с коэффициентом близости (бюе соеШс1еп(), основанный на следующей формуле для оценки сходства:

в

1-1

Сходство ⁼ 200 к &

где 8 и Т представляют собой векторы, представляющие собой две линии в одном и том же наборе полос, которые сравнивают.

1.4.2. Препаративный ДЭГГ.

- 14 017608

Препаративный ДЭГГ осуществляли в соответствии с тем, как описано для аналитического ДЭГГ, за исключением того, что вместо БАА в процессе приготовления геля использовали Ν,Ν'-бисакрилилцистеин (БАЦ; 81дта). БАЦ позволил остаться гелевому раствору годным после электрофореза (Миугет е! а1., 1996).

Образцы для ПЦР (300 мкл) осаждали с использованием 30 мкл 5 М №1С1 и 750 мкл этанола при 80°С в течение 1 ч, центрифугировали (20000/д, 2 мин) в микроцентрифуге (ЕррепбогГ Мобе1 5417С, ЕррепбогГ., НатЬигд, Германия). Осадок промывали 70% этанолом, сушили на нагревающем блоке (35°С, 20 мин) и растворяли в 30 мкл стерильной воды.

Гель заливали, образцы наносили и электрофорез проводили в соответствии с тем, как описано выше.

Гель окрашивали после электрофореза 8УБК Оо1б (см. выше) и избранные полосы вырезали при УФосвещении стерильным скальпелем. Каждый кусочек геля переносили в пробирку для микроцентрифуги, промывали 2/10 мин 100 мкл стерильной воды и воду удаляли. Добавляли β-меркаптоэтанол (100 мкл; ВюЯаб) и пробирки инкубировали в течение 16-20 ч при 37°С. В каждую пробирку добавляли деионизированную воду (100 мкл), 0,1 объем 5 М №1С1 и 2,5 объема ледяного этанола. Пробирки инкубировали при -80°С в течение 2 ч, центрифугировали (10000/д, 20 мин) в микроцентрифуге и супернатант осторожно удаляли. Пробирки сушили (35°С, 20 мин) и осадок растворяли в 100 мкл стерильной воды.

Содержание в образцах продуктов ПЦР оценивали в тех случаях, где ПЦР проводили с праймерами, определяющими бактерии, но без ОС-шпильки. Продукты ПЦР затем очищали с использование препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием низкоплавкой агарозы (см. выше).

1.5. Клонирование.

1.5.1 Клонирование ТОРО ТА.

Клонирование осуществляли с использованием набора для клонирования ТОРО ТА Цпуйгодеп, Саг1зЬаб, СА, США) с плазмидным вектором рСР 2.1-ТОРО и химически компетентных клеток ЕзейепеЫа со11 Опе 8йо1 ТОР10.

ДНК амплифицировали с использованием ПЦР, используя праймеры 341ГВАС и 907гВАС, определяющие бактерии. ПЦР осуществляли в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.3), за исключением того, что конечную остановку реакции при 72°С продлевали до 10 мин для того, чтобы создать адениновые выступы на 3'-конце. Продукты ПЦР очищали путем препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием легкоплавкой агарозы в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.4). Кусочки геля с продуктами ПЦР плавили в соответствии с тем, как описано (65°С, 15 мин), и поддерживали в расплавленном состоянии при 37°С до встраивания в вектор.

Расплавленные кусочки агарозы (4 мкл) осторожно смешивали с 1 мкл солевого раствора (1,2 М №С1, 0,06 М МдС1₂) и 1 мкл вектора ТОРО рСР 2.1. Лигирование осуществляли в течение 10 мин при 37°С. Пробирки помещали на лед и на льду (15 мин) осуществляли трансформацию вектора (4 мкл) в химически компетентные клетки ТОР10 (50 мкл) с последующим тепловым шоком (42°С, 30 с), и немедленно переносили на лед (10 мин). Трансформирующую реакционную смесь разводили в 250 мкл среды 8ОС (2% триптон, 0,5% экстракт из дрожжей, 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд8О₄, 20 мМ глюкоза) и реакцию осуществляли в перемешивающем инкубаторе при горизонтальном перемешивании (200 об/мин) при 37°С в течение 1 ч.

Суспензии распределяли по чашке с агаровой средой Луриа-Бертани (ЬВ) (1,5% агар, 1,0% триптон, 0,5% экстракт из дрожжей, 1,0% №С1, рН 7,0; 81дта), дополненной 50 мкг/мл антибиотика ампициллина или канамицина. Перед инокулированием на чашки наносили Х-да1 (5-бром-4-хлор-3-индолил^-Огалактопиранозид; 8щта), 40 мкл 40 мг/мл Х-да1 в диметилформамиде.

Суспензии (20 и 50 мкл) трансформантов распределяли на чашках с агаровой средой ЬВ (20 мкл суспензии разбавляли 20 мкл среды 8ОС перед распределением на чашке для того, чтобы обеспечить равномерное распределение). Чашки инкубировали в течение 20-24 ч при 37°С. Только трансформанты со встроенной плазмидой росли на среде вследствие наличия в плазмиде гена устойчивости. Колонии с продуктами ПЦР, встроенными в вектор, визуализировали в виде былых колоний в противоположность светло- или темно-синим колониям с векторами без встроенного продукта ПЦР. Отдельные белые колонии выделяли в жидкой среде ЬВ, дополненной ампициллином или канамицином (50 мкг/мл). Среду распределяли по 24-луночным стерильным планшетам для тканевых культур (Сотшпд 1пс., Сотшпд, ΝΥ, США) в количестве 2 мл среды/лунка. Клоны инкубировали в течение 20-24 ч на среде ЬВ и плазмиды очищали.

1.5.2. Выделение плазмид.

Плазмиды выделяли с использованием набора для выделения плазмид СепЕ1и1е Р1азт1б М1шртер (8щта) в соответствии с указаниями производителя.

Клоны трансформантов (2 мл) собирали путем центрифугирования в микроцентрифуге (ЕррепбогГ) при 14000/д в течение 2 мин. Осадки ресуспендировали в растворе для ресуспендирования (200 мкл) путем перемешивания. Добавляли лизирующий раствор (200 мкл), смесь осторожно переворачивали до ее осветления (8-10 раз) и лизис нейтрализовали в течение 3-5 мин с использованием 350 мкл смеси ней

- 15 017608 трализующий буфер/связывающий буфер. Дебрис осаждали путем центрифугирования (14000/д в течение 10 мин). Супернатанты переносили в связывающие колонки СепЕ1и1е Мгшргер, вмонтированные в микроцентрифужные пробирки, центрифугировали (14000/д в течение 2 мин) и проточную жидкость удаляли. Связывающие колонки затем промывали 750 мкл промывающего раствора и центрифугировали (14000/д в течение 2 мин), вытекающий раствор удаляли и колонки повторно центрифугировали (14000/д в течение 2 мин) для удаления каких-либо дополнительных растворов. Связывающие колонки затем переносили в новые микроцентрифужные пробирки, добавляли 100 мкл стерильной воды и пробирки центрифугировали (14000/д в течение 2 мин). Выделенные растворы с плазмидами хранили при 20°С.

1.5.3. Контроль позитивного встраивания продуктов ПЦР.

Позитивное встраивание продуктов ПЦР в трансформирующий вектор контролировали путем ПЦР с праймерами М13, определяющими последовательности вектора, фланкирующие вставленную последовательность.

Последовательности праймера:

Прямой праймер М13 (-20): 5'-6ТА-ААА-С6А-С66-ССА-6-3'

Обратный праймер М13: 5'-СА6-6АА-АСА-6СТ-АТ6-АС-3’

Сайты праймера соответствовали основаниям 391-406 (прямой праймер М13 -20) и 205-221 (обратный праймер М13) фрагмента Ьас2а вектора. Плазмида без позитивной вставки продукта ПЦР приводила в результате к продукту ПЦР М13 202 п.о., тогда как позитивный продукт ПЦР приводил в результате к продукту ПЦР 769 п. о.

Смесь ПЦР получали в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.3) с набором праймеров М13 (50 мкМ маточные растворы). Плазмидную ДНК-матрицу (2 мкл) разводили в буфере для ПЦР и стерильной воде до конечного объема 90 мкл в соответствии с тем, как описано выше, смешивали со смесью ПЦР. ПЦР проводили в соответствии со следующей последовательностью циклов:

Первичная денатурация: 94°С в течение 2 мин.

Денатурация: 95°С в течение 1 мин.

Отжиг праймеров: 55°С в течение 1 мин.

Синтез ДНК (удлинение праймеров): 72°С в течение 1 мин.

Число циклов: 30.

ПЦР останавливали при 72°С (7 мин) и охлаждении до 4°С.

1.5.4 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Продукты ПЦР М13 с позитивной вставкой продуктов ПЦР анализировали с использованием рестриктаз ЕсоК1 (81дта), Нае111 (81§та) и К§а1 (81дта), Рестриктазы и соответствующие ферменты (предлагаемые производителем; 8щта) описаны в табл. 2.

Таблица 2. Характеристики рестриктаз и их буферов.

Фермент	Активность	Распознаваемая последовательность	Буфер для расщепления	Состав буфера (1 х разведение)
ЕсоК1	40000 Ед/мл	5' С/ААТТС 3'	Буфер ЗН	50 мМ Трис-НС1 100 мМ ЫаС! 100 мМ МдС12 1 мМ дитиоэритрит рН 7,5
НаеШ	10000 Ед/мл	5' зе/сс 3'	Буфер ЗМ	10мМТрис-НС1 50 мМ ЫаС1 10 мМ МдС!г 1 мМ дитиоэритрит рН 7,5
Кза1	10000 Ед/мл	5' ЗТ/АС	Буфер ЗЬ	10 мМ Трис-НС1 10 мМ МдС12 1 мМ дитиоэритрит РН 7,5 I

А) Одна единица активности каждого фермента расщепляет 1 мг ДНК в течение 1 ч при 37°С. Плазмидную ДНК, амплифицированную путем ПЦР М13 (1, 5 или 10 мкл), смешивали с рестриктазами: 1,0 мкл ЕсоК1 (40 Ед), 2,0 мкл Нае111 (20 Ед) или 2,0 мкл К§а1 (20 Ед). Каждую смесь разводили до общего объема 50 мкл соответствующими буферами для ферментов в концентрации [1/] (см. табл. 2). Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 2,5 ч и помещали на лед для остановки реакции. Расщепление ферментами анализировали по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) путем

- 16 017608 аналитического электрофореза в агарозном геле.

1.6. Секвенирование плазмидной ДНК.

Очищенные плазмиды для секвенирования представляли собой плазмиды, амплифицированные путем ПЦР с набором праймеров Μ13. ДНК оценивали с использованием способа с бромистым этидием и осаждали 60% этанолом и 0,1 М Ыа-ацетатным буфером (ρΗ 4,6).

Осажденные продукты ПЦР подвергали секвенированию ДНК (МебРгоЬе).

Последовательности плазмид были представлены на рассмотрение в Национальный Центр Биотехнологической Информации (Ыабопа1 Сепбе £ог В1о1есНпо1оду 1пГогша1юп (ЫСВ1)) с использованием программы ВЬА8Т базы данных ЫСВ1 (Л115сНи1 е1 а1., 1997).

Филогенетические деревья и матрицы длины (Фйапсе табгсек) определяли с использованием программы Рйуйр Ыегрйаке о£ 1йе К1Ьо8ота1 Эа1аЬа5е Рго)ес1 (ΚΌΡ; МаМак е1 а1., 1997).

Claims (20)

1. Способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь ствола эксплуатационной углеводородной скважины вводят термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки указанной скважины, представляющего собой ингибитор образования твердого осадка, ингибитор образования гидратов, ингибитор образования асфальтеновых отложений, ингибитор образования парафиновых отложений или ингибитор коррозии, где химическое соединение является белком или пептидом, спиртом, глицерином, антифризом, биосурфактантом или органической кислотой.

2. Способ по п.1, где указанный термофильный микроорганизм также является галофильным и анаэробным.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный термофильный микроорганизм является характерным для углеводородного месторождения, в котором расположена скважина, подлежащая обработке.

4. Способ по любому из пп.1-3, где по меньшей мере 50% всех аминокислот в указанном белке или пептиде имеют заряженные боковые цепи.

5. Способ по п.4, где указанные заряженные аминокислоты представляют собой аспарагиновую кислоту.

6. Способ по п.4, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

7. Способ по любому из пп.1-6, где указанный микроорганизм представляет собой термофильную архебактерию.

8. Способ по любому из пп.1-7, где указанное химическое соединение секретируется микроорганизмом.

9. Способ по любому из пп.1-8, где указанный микроорганизм вводят в ствол скважины с помощью пористой частицы.

10. Частицы, импрегнированные термофильными микроорганизмами, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт, глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту.

11. Частицы по п.10, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

12. Композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, включающая в себя жидкость-носитель, содержащую термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для указанной обработки, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт, глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту.

13. Композиция по п.12, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

14. Термофильный микроорганизм, созданный путем генной инженерии для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6.

15. Микроорганизм по п.14, который представляет собой архебактерию.

16. Микроорганизм по п.14 или 15, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

17. Способ трансформации микроорганизма с получением термофильного микроорганизма по любому из пп.14-16, при котором в указанный микроорганизм вводят молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессия которой приводит к продуцированию химического соединения, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6.

18. Способ по п.17, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

- 17 017608

19. Способ обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, при котором внутрь ствола скважины вводят химическое соединение, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6, причем указанное химическое соединение было собрано из биореактора, содержащего микроорганизмы по любому из пп.14-16.

20. Способ по п.19, где указанное химическое соединение доставляют в ствол скважины с помощью пористых частиц.