NO338200B1 - Dekontamineringsløsninger og anvendelse derav for denaturering, modifisering, degradering, solubilisering og fjerning av proteiner, nukleinsyremolekyler og mikroorganismer - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen vedrører et trekomponentsystem sammensatt av surfaktanter, vitaminer og metallioner for effektiv og simultan destruksjon og fjerning av kontaminerende proteiner, nukleinsyrer og mikroorganismer fra overflater, slik som laboratoriebenker, gulv, anordninger og instrumenter. Disse ikke korrosive og ikke toksiske løsninger for fjeminger av proteiner, nukleinsyrer og mikroorganismer er anvendt spraying, skuring, eller bløtlegging på kontaminerte overflater, slik at proteiner og nukleinsyremolekyler er ødelagt, solubilisert, innaktivert og fjernet, og mikroorganismer er også drept svært effektivt og på samme tid er alt genetisk materiale inaktivert.

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Oppfinnelsen vedrører en dekontamineringsløsning for behandling av overflater som er dekontaminert av uønskede proteiner, nukleinsyremolekyler eller mikroorganismer. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelsen av nevnte dekontamineringsløsning og et egnet buffersystem.

Den dynamiske utviklingen i molekylær biologi øker viktigheten av nye metoder og teknikker for deteksjon og amplifisering av DNA molekyler eller proteiner. [Sambrook, J. et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuar, 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.]. Aktuelle eksempler vedrører medisinsk diagnostikk, rettsanalyser og biomedisinsk forskning.

Med oppfinnelsen av polymerasekjedereaksjon (PCR) er det selv mulig å detektere enkeltmolekyler. Et nytt problem ved de ekstreme sensitiviteter til disse nye deteksjonsmetoder er kontaminering av overflater i laboratorier, på utstyr eller arbeidsmaterialer med uønskede nukleinsyremolekyler, proteiner eller mikroorganismer.

I tillegg medfører mikrobekontamineringer alvorlige problemer og kommersielle tap for eksempel i området næringsmiddelteknologi, i produksjonen, sykehus, hygieneinstitusjoner og også i husholdningen.

Kjent teknikk

Derfor har det i en lengre tid vært kjent forskjellig dekontamineringsløsninger som anvender aggressive kjemiske midler slik som for eksempel formaldehyd, alkoholer, fenoler, natriumazid, natriumhypoklorid mot mikroorganismer eller sterke oksiderende midler slik som for eksempel hypoklorid, blekesubstanser eller mineralsyrer som denaturerer proteiner og modifiserer nukleinsyrer slik at de er uegnet for amplifiseringsmetoder slik som for eksempel polymerasekjedereaksjonen (PCR), nick translasjon med klenow polymerase, trådfortrengningsamplifikasjon, ligasekjedereaksjon, transkripsjonsmediert amplifikasjon, "rolling-circle"-amplifikasjon og flere andre.

De aggressive kjemikalier og sterkt oksiderende midler anvendt for dekontaminering medfører permanente modifikasjoner og denatureringer av proteiner og destabiliserer og modifiserer DNA dobbelttråden og derved blokkerer amplifikasjonsreaksjoner. Generelt blir modifikasjoner og operative skader introdusert ved spesielt reaktive kjemiske grupper i målmolekylene.

Derfor er slike aggressive kjemikalieløsninger i dag anvendt ved vasking og skylling av utstyr, instrumenter og overflater.

Hovedbakdelene med disse løsninger og metoder er kun selektive virkninger mot proteiner, DNA eller mikroorganismer og ufullstendig fjerning av alle nuleinsyremolekyler, de gjenværende modifiserte molekyler, kun delvis degradering og den korrosive virkning av de anvendte kjemikalier på utstyr, instrumenter, overflater og også mot hud og mucosmembraner til kunden.

En mindre forbedring av effektiviteten av disse metoder ble oppnådd ved å kombinere midlene i løsningen med overflateaktive kjemikalier som detergenter. Men fortsatt er det et problem med de aggressive kjemikaliesubstansene og den ufullstendige destruksjon og fjerning av nukleinsyrer, proteiner og mikroorganismer.

Den kommersielle interesse av slike løsninger er understreket av de allerede tilgjengelige og markedsførte produkter for dekontamineringsløsninger mot DNA og proteinkontamineringer så vel som antimikrobielle midler opplistet under et stort antall av forskjellige handelsnavn.

Fra DE-A-I 9 936 428 er det for eksempel kjent et baktericid som inneholder jern (EI) - ioner (Fe<3+>), L-askorbinsyre og et eller flere medlemmer fra gruppen bestående av sorbinsyre, benzosyre og para-hydroksybenzosyreester. Den bakteriedrepende effekten til denne sammensetningen kan forsterkes, for eksempel ved å tilsette en liten mengde av et overflateaktivt middel.

Bakdelene med de nåværende konvensjonelle dekontamineringsløsninger og metoder er deres kun begrensede virkning mot forskjellige biologiske molekyler som proteiner eller nukleinsyrer eller kun antimikrobielle virkninger og det høye korrosive og aggressive kjemikaliepotensialet i kombinasjon med skadelige egenskaper som medfører alvorlige helseproblemer. Spesielt for dekontaminering av mikroorganismer er det i dag kun tilgjengelig løsninger som dreper eller innaktiverer mikroorganismene, men som ikke innaktiverer eller degraderer genomene, genetisk informasjon eller ekstra kromosomal DNA molekyler.

Det er vel kjent at fysiologiske konsentrasjoner av mikromolarmengder av vitaminer og antioksidanter i kombinasjon med divalente metallioner resulterer i delvis skade og delvis brudd av tråder i nukleinsyremolekyler (Podiatry S.J., Katz Y., Eek P., Kwon O., Lee J.H,. Chen S., Corpse C, Data A, Data SK and Levine M. (2003) Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention. J. Am. Coll. Nut. 1, 18-35; Blocking O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. (2003) Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Depriviation Stress: a Review. Annals Botany 91:179-194; Veal J. M., Merchant K. & Rill R. L. (1991) The influence of reducing agent and 1,10-phenanthroline concentration on DNA cleavage by phenanthroline + copper. Nucl Acids Res Vol. 19, No. 12, 3383-3388). Disse er kun valgte og isolerte utfall som kun kan anvendes på enkeltsaker.

De siste oppdagelser i moderne molekylær biologi og genteknologi viser at genetisk informasjon alene eller selv enkeltgener og fragmenter derav så vel som spesifikke proteiner er tilstrekkelig til å medføre sykdom eller uønskede og skadelige forandringer i den genetiske informasjon.

Derfor er det for anvendelsesformål nødvendig med nye forbedrede protokoller, midler, metoder og løsninger for effektivt å på samme tid forsiktig og ikke skadelig dekontaminering av overflater og utstyr fra proteiner, nukleinsyre og mikroorganismer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Målet med den heri beskrevne oppfinnelse er derfor å overkomme dagens begrensninger og bakdeler i kjent teknikk og å utvikle nye metoder og løsninger som ikke anvender aggressive kjemikalier eller kraftig oksiderende og korrosive midler og som i tillegg fullstendig dekontaminerer dekontamineringssubstratene.

Ifølge oppfinnelsen, er dette mål oppnådd ved en dekontamineringsløsning som omfatter en synergistisk blanding av

a) minst et vitamin i konsentrasjoner fra 10 mM til 100 mM, og

b) minst et metallion i konsentrasjoner fra 1 mM til 100 mM, og

c) minst en overflateaktiv substans i konsentrasjoner fra 0,1 % til 10 % (vekt) i

forhold til totalløsningen.

Ved å anvende naturlige antioksidanter i kombinasjon med metallioner og overflateaktive midler, ble det uventet og overraskende funnet at ulike vitaminer i kombinasjon med metallioner og detergenter resulterer i en ekstremt rask og kraftig trådbeskadigelse og modifikasjoner i nukleinsyremolekyler og proteiner. Denne overraskende effekt fører til effektiv dreping av mikroorganismer ved innaktivering og degradering av deres genetiske informasjon og proteiner. Spesielt overraskende og nytt er oppdagelsen at trekomponentsystemet ifølge denne oppfinnelsen oppviser innaktivering og degradering i pH området på 2 til 8,5 med en hovedsakelig sammenlignbar effekt. Idet en kan arbeide innen et sammenlignbart mildt pH område, hindrer løsningen ifølge oppfinnelsen at overflaten som skal behandles skades og er også hudkompatibel for anvenderen. Med spraying, skuring eller immersjon i løsninger av de tre komponenter, blir proteiner og nukleinsyrer denaturert, solubilisert, innaktivert, degradert og fjernet og dermed blir mikroorganismer også drept med høy effektivitet.

I en fordelaktig utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt at blandingen har en pH verdi i området mellom pH 3 og 7, foretrukket mellom pH 4 og 6.1 slike pH områder er løsningen ifølge oppfinnelsen stabil over en lang tidsperiode og tillater tilstrekkelig degradering av nukleinsyre. I tillegg er hudkompatibilitet optimal i området mellom pH 4 og 6.

Spesielt foretrukket er en fordelaktig utførelsesform hvor blandingen i tillegg omfatter et buffersystem inkludert karbonater og derivater av ravsyre, og hver foretrukket er i en konsentrasjon mellom 1 mM og 500 mM. Ved anvendelse av dette buffersystem ifølge oppfinnelsen med dekontamineringsløsningen ifølge oppfinnelsen, kan pH verdien i løsningen, som er i det sure området grunnet de løste komponenter spesielt de sure vitaminer, bli økt opp til, for eksempel, en nøytral eller svakt basisk område uten presipitering av de oppløste metallioner.

I en foretrukket utførelsesform av dekontamineringsløsningen ifølge oppfinnelsen, er vitaminene eller deres respektive salter eller syrederivater inneholdt i løsningen ifølge oppfinnelsen en eller flere forbindelser og/eller deres relaterte spalter valgt fra gruppen av vannløselige vitaminer med egenskaper som antioksidanter, som for eksempel vitamin C, riboflavin og niacin. De blir anvendt i konsentrasjoner på 10 mM til 100 mM i forhold til totalvolum av løsningen.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform av dekontamineringsløsningen ifølge oppfinnelsen er metallionene som er anvendt ifølge oppfinnelsen di- og/eller tri-valente ioner av metaller funnet i 4. gruppe og/eller sub-gruppe I, II og Vin i periodesystemet. De er anvendt som salter i kombinasjon med deres organiske og/eller uorganiske syrer og baser. Ifølge oppfinnelsen er en eller flere forbindelser valgt fra sub-gruppe Vin, spesielt er jern, kobolt, nikkel, kobber eller sink foretrukket. De er anvendt i konsentrasjoner på 1 mM til 100 mM, i forhold til totalvolum av løsningen, spesielt i konsentrasjoner på 5 mM til 10 mM.

De overflateaktive substanser inneholdt i løsningen ifølge oppfinnelsen kan være, for eksempel, anioniske, ikke ioniske, amfotære eller kationisk inerte tensider eller egnede blandinger derav. Spesielt kan alkyletersulfat, alkyl og/eller arylsulfonat alkylsulfat, amfotensider, betainer, alkylamidoalkylaminer, alkylsubstituerte aminosyrer, alkylsubstituerte aminosyrer, asylerte aminosyrer, og amfotenside kombinasjoner bli anvendt. I prinsippet er alle inerte tensider anvendbare. Inert betyr at de ikke forstyrrer eller reduserer den synergistiske løsning og dets effekter. Ifølge oppfinnelsen er anioniske og ikke ioniske tensider foretrukket. De er anvendt i konsentrasjoner på 0,1 % til 10 % (vekt), i forhold til totalvolum av løsningen, spesielt i konsentrasjonene på 0,2 % til 0,5 % (vekt).

Dekontamineringsløsningene ifølge oppfinnelsen kan omfatte ytterligere vanlig inerte adjuvanter og additiver som for eksempel egnede buffersubstanser for å gi en spesifikk pH verdi, som for eksempel, tris (tris(hydroksymetyl)-aminometan), MES (2(morfolino)etansulfonsyre), HEPES (2-[4-(2-hydroksyetyl)-l-piperasinyl]-etansulfonsyre, og/eller MOPS (3-(N-morfolino)propansulfonsyre). Buffersystemene er anvendt i konsentrasjoner på 1 mM til 500 mM i forhold til totalvolum av løsningen.

Effektive virkninger av det nye trekomponentsystemet er enda mer overraskende idet det er vist at de forskjellige isolerte substanser alene ikke oppviser en spesiell degraderingseffekt og også at blandinger av komponentene utenfor området av oppfinnelsen ikke er effektive eller kun oppviser en begrenset effekt. Kun kombinasjonen av vitaminer med metallioner og detergenter, foretrukket i en passende blanding, resulterer i en synergistisk effekt og i en rask og kraftig degradering av biomolekyler. Spesielt, ved å holde de korrekt foretrukne konsentrasjoner, en effektiv aktivitet av dekontamineringsløsningen ifølge oppfinnelsen besørges.

I prinsippet kan alle typer overflater bli behandlet på en veldig forsiktig måte for fjerning av proteiner, nukleinsyrekontamineringer og mikroorganismer.

Generelt oppnås dekontaminering ved spraying eller skuring av de oppfinnelsens relaterte løsninger på kontaminerte overflater eller ved immersjon. En residenstid på 0,5 til 2 minutter ved romtemperatur eller noe høyere temperatur er normalt tilstrekkelig for fullstendig denaturering, modifisering, degradering, solubilisering eller fjerning av proteiner, nukleinsyrer og mykere organismer fra overflatene. De anvendte metodene er derimot variable og kan bli tilpasset til de forskjellige oppgaver.

En annen hensikt med denne oppfinnelsen er anvendelsen av de oppfinnelsesrelaterte dekontamineringsløsninger for denaturering, modifisering, degradering, solubilisering og fjerning av proteiner og nukleinsyremolekyler fra overflater.

Det nye og fordelaktige buffersystem med karbonat og derivater av ravsyre er spesielt egnet for dekontamineringsløsning ifølge foreliggende oppfinnelse. De forskjellige blandinger med pH verdier mellom pH 2 og 8,5 gir alltid klare løsninger med svak gul til lys oransje farge som er stabil over lange tidsperioder og som også oppviser i pH området pH 4,5 til pH 6 en svært effektiv degradering av DNA molekyler som vist sammenlignet med den sterke mineral 0,5 molar fosforsyre med pH 1,5, som vist i fig. 5.

I en fordelaktig utførelsesform av buffersystemet ifølge oppfinnelsen, er det tilveiebrakt at karbonatene og derivatene av ravsyre foreligger i konsentrasjoner mellom 1 mM og 500 mM.

Løsningen som omfatter buffersystemet kan fordelaktig bli justert til en pH verdi fra området fra pH 2 til 8,5, spesielt fra 3 til 7, foretrukket fra 4 til 6. Derved er det besørget at de ytterligere komponenter oppløst i løsningen ikke er forringet og i tillegg kan en hudkompatibel løsning bli fremstilt.

Derfor vedrører foreliggende oppfinnelse også en metode for tilpasning av pH verdien av en løsning som omfatter en blanding av

a) minst et vitamin i konsentrasjoner fra 10 mM til 100 mM, og

b) minst et metallion i konsentrasjoner fra 1 mM til 100 mM, og

c) minst en overflateaktiv substans i konsentrasjoner fra 0,1 % til 10 % (vekt) i

forhold til totalløsningen,

hvori blandingen kan bli justert med buffersystemet ifølge oppfinnelsen til en pH verdi i området fra 2 til 8,5, spesielt fra 3 til 7, foretrukket fra 4 til 6.

Kort beskrivelse av figurene

Oppfinnelsen er illustrert med ikke begrensende figurer, eksempler og tabeller vist i de følgende deler: Fig. 1 til 5 viser effektiv degradering av DNA molekyler ved trekomponentsystemet sammenlignet med konvensjonelle andre løsninger innen teknikken. Fig. 6 viser blokkering av PCR amplifisering av DNA molekyler etter behandling med det nye trekomponentsystemet. Fig. 7 viser testen av kjent teknikk for RNaseA enzyminnaktivering sammenlignet med det nye trekomponentsystemet. Fig. 8 viser effektive degraderingen av genomisk DNA og ekstra kromosomal genetisk materiale på innsiden av mikroorganismer ved trekomponentsystemet.

Tabell 1 viser en test for antimikrobiell tilvirkning av det nye trekomponentsystemet.

Tabell 2 viser foretrukket basisk sammensetning og foretrukket blandinger for trekomponentsystemet inneholdende detergenter, vitaminer og metallioner.

Fig. 1 til 5 viser effektiv degradering av DNA molekyler med det nye trekomponentsystemet sammenlignet med konvensjonelle andre løsninger innen teknikken. Identiske alikvoter av DNA plasmid (Ypp351) ble behandlet i 2 minutter med de oppramsede løsninger. Deretter ble DNA prøvene denaturert og enkelttrådet DNA molekyler ble separert med gelelektroforese på en agarosegel (1 %). Etter farging med etylbromid ble de viste bilder tatt. Kontrollen viser intakt plasmid DNA etter behandling med sterilt vann. Introduksjon av hakk (fra engelsk nicks) i DNA tråden resulterer i en reduksjon av størrelsen og molekylvekt av det respektive DNA molekylet. Denne effekten kan bli identifisert i gelen ved sammenligning med kontroll og den molekylære vektmarkøren. I hver prøve var 5 ug DNA til stede i 5 ul sterilt trisbuffer (1 mM; pH 8,0) og ble behandlet i 2 minutter ved romtemperatur med 5 ul av de oppramsede løsninger. Deretter ble prøvene blandet med 5 (il 100 mM tris (pH 12) og bromfenol blå markør og ble denaturert i 5 minutter ved 95°C. De denaturerte prøver ble umiddelbart nedkjølt til 4°C og identiske alikvoter av 1 ug DNA ble lastet per gelkolonne (fra engelsk lane). DNA molekyler ble farget med etidiumbromid etter gel elektroforese i en 1 % agarosegel og fotografert.

Fig. 1 viser sammenligningen av nukleinsyredegradering med vitaminer og metallioner alene og med trekomponentsystemet inneholdende vitaminer, metallioner og detergenter. (M: markør DNA 1 kb stige; C: kontroll: DNA + 5 ul sterilt H20; 1: 5 mM FeCl3;2: 1 mM FAD; 3: 1 mMFAD + 1 mMFeCl3;4: lOOmMNAD; 5: 100 mM NAD + 5 mM FeCl3; 6: 100 mM tiamin; 7: 100 mM tiamin + 5 mM FeCl3; 8: 100 mM vitamin C; 9: 100 mM vitamin C + 5 mM FeCl3; 10: mM Na-askorbat; 11: 100 mM Na-askorbat + 5 mM FeCl3; 12: 100 mM askorbinsyre + 5 mM FeCl3). Alle prøver inneholdt 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20. Fig. 2 viser test for nukleinsyredegradering med blandinger inneholdende vitamin C, metallioner og detergenter. L: 1 kb stige; M: markør DNA Lambda EcdBl/ HindIR; 1: 10 mM vitamin C; 2: 100 mM vitamin C; 3: 10 mM FeCl3; 4: 100 mM vitamin C + 10 mM FeCl3; 5: 10 mM ZnCl2; 6: 100 mM vitamin C + 10 mM ZnCl2; 7: DNA-OFF™; C: kontroll: 5 ul sterilt H20). Alle prøver inneholdt 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20. Fig. 3 viser sammenligning av nukleinsyredegradering med blandinger inneholdende askorbinsyre eller Na-askorbat. (M: markør DNA Lamda EcdRUHindQl; C; kontroll: 5 ul sterilt H20; 1: DNA-OFF™; 2: 100 mM HAc + 10 mM FeCl3 + 0,2 % Triton X-100; 3: 100 mM askorbinsyre + 0,2 % Triton X-100; 4: 100 mM askorbinsyre + 10 mM FeS04 + 0,2 % Triton X-100; 5: 100 mM askorbinsyre + ZnCl2 + 0,2 % Triton X-100; 6: 100 mM Na-askorbat + 0,2 % Triton X-100; 7: 100 mM Na-askorbat + 10 mM FeCl3+ 0,2 % Triton X-100; 8: 100 mM Na-askorbat + ZnCl2 + 0,2 % Triton X-100). Fig. 4 viser sammenligning av nukleinsyredegradering med blandinger inneholdende mineralsyrer, askorbinsyre eller Na-askorbat (pH 6 til 8,5). (M: markør DNA Lambda EcoBI/ Hindm C: kontroll: DNA + 5 ul sterilt H20; 1: RNase-OFF™ (prøve 1); 4: DNA-OFF™ (prøve 2); 5: 0,5 M H3P04; 6: 0,5 M HN03; 7: 100 mM askorbinsyre + 10 mM FeCl3; 8: 10 mM askorbinsyre + 10 mM FeCl3; 9: 100 mM Na-askorbat + 10 mM FeCl3; 10: blanding som i 9 men hvor pH er 6; 11: blanding som i 9 men hvor pH er 7. 1; 12: blanding som i 9 men hvor pH er 8; 13: blanding som i 9 men hvor pH er 8,5). Prøvene med nummer 5 til 13 inneholdt 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20. Fig. 5 viser et eksempel for det nye buffersystem inneholdende natriumkarbonat og ravsyre sammenlignet med mineralsyre. Den basiske blandingen inneholder 50 mM askorbinsyre, 5 mM FeCl3og 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20. (M: markør DNA 1 kb stige), C: kontroll: DNA + 5 ul sterilt H20; 1: blanding med pH 10; 2: blanding med pH 9; 3: blanding med pH 7; 4: blanding med pH 6; 5: blanding med pH 4; 6: 0,05 M H3P04(pH 1,5) med 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20. Fig. 6 viser en blokkering av PCR amplifikasjon for DNA molekyler etter behandling med det nye trekomponentsystemet (blanding av: 100 mM vitamin C + 10 mM FeCl3+ 0,2 % Triton X-100 og 0,2 % Tween 20). Forskjellige mengder (0,1 til 1 ng) av DNA prøven ble lyofilisert i PCR røret. PCR rørene inneholdende lyofilisert DNA ble behandlet i 20 sekunder med de oppramsede løsninger. Deretter ble rørene vasket to ganger med 100 ul av sterilt, destillert vann. Til slutt ble rørene fylt med en 50 ul PCR reaksjonsblanding og PCR reaksjonen ble utført. PCR reaksjonsblandingen inneholdt et par med primere for amplifisering av kontroll DNA (scIMP2 gen av gjær) og test DNA (scPCPl gen av gjær). Kontroll DNA (1 ng) indikerer en suksessfull PCR reaksjon. Et bånd med test DNA viser at intakt DNA molekyler for dette gen fortsatt var til stede. I tilfelle av fullstendig fjerning eller blokkering av test DNA skal det ikke være noe amplifisert DNA tråd i gelen. DNA ble farget med etidiumbromid etter gelelektroforese i en 1 % agarosegel og gelen ble fotografert. Som positiv kontroll ble den konvensjonelle DNA-OFF™ anvendt. Sterilt vann (H20) ble brukt som en negativ kontroll. Fig. 7 viser test av kjent teknikk for RNaseA enzyminnaktivering sammenlignet med det nye trekomponentsystemet. Identiske alikvoter for 10 ug NRaseA ble lyofilisert i Eppendorfrør. Deretter ble hvert rør behandlet med 1 ml av de oppramsede løsninger, vorteksert i 20 sekunder og til slutt innkubert for 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble hvert rør vasket to ganger med 1 ml av sterilt vann. Etterpå ble 5 um av total RNA fra E. coli tilsatt til rørene og innkubert i 30 minutter ved 37°C. Deretter ble totalt RNA prøver blandet med formamid/bromfenol blå buffer og denaturert ved 95°C i 5 minutter. Etterpå ble den fullstendige 5 ug total RNA prøve lastet på en agarose gel (1,2 %) og separert ved gelelektroforese. Etter farging med etidiumbromid ble det viste bildet tatt. Ubehandlet kontroll representerer intakt total RNA. Med tilstedeværelse av aktive RNaseA er disse RNA molekyler degradert. I tilfelle av suksessfull fullstendig innaktivering av RNaseA vil også total RNA molekyler være intakt.

(C: kontroll av total RNA; 1: RNase-OFF (A); 2: RNase-OFF (B); 3: askorbinsyreblanding med 100 mM vitamin C + 10 mM FeCl3+ 0,5 % SDS; 4: tom kolonne; 5: H20; 6: 10 ug RNaseA; 7: tom kolonne; C: kontroll av total RNA).

Fig. 8 viser effektiv degradering av genomisk DNA og ekstra kromosomalt genetiske materiale inne i mikroorganismer ved det nye trekomponentsystemet. En rekombinant Escherichia coli stamme med ekstra-kromosomalt plasmid (YEp3351) ble dyrket over natt i LB, amp medium. Alikvoter på 5 ul fra E. coli suspensjonen ble behandlet med 5 ul lysozym løsning (1 mg/ml) i 5 minutter og deretter innkubert med 5 ul av de oppramsede løsninger (1 - 5) for ytterligere 5 minutter. Etter tilsats av bromfenol blå ble prøver lastet på gel brønnene og separert ved elektroforese av DNA molekylene. Kun for prøve nr. 5 som inneholdt trekomponentsystemet ble en massiv degradering av DNA molekylene identifisert. For kontrollen med sterilt vann (C) og for prøve 3 og 4 ble lysering av cellene observert og derfor ekstra-kromosomalt plasmid DNA frigitt og migrerer inn i gelen. For prøve 1 og 2 observerer man en presipitering av lysatet og DNAet og derfor forble alle DNA molekyler på bunnen av gelbrønnen.

(M: markør 1 kb stige; C: kontroll med H20; 1: 70 % etanol; 2: 0,5 % Bacillozid™; 3: 0,5 % SDS; 4: 0,5 % Na-Azide + 0,5 % SDS; 5: 100 mM vitamin C + 10 mM FeCl3 + 0,5 % SDS; C: kontroll: 5 ul sterilt H20).

Tabell 1 viser test for antimikrobiell virkning av det nye trekomponentsystemet. Friskt dyrkede kulturer av de oppramsede mikroorganismer ble justert til et celletall på IO<6>i en 50 ul volum og blandet i et forhold på 1:1 med 50 ul vann, 70 % etanol eller blandinger av trekomponentsystemet (100 mM askorbinsyre, 10 mM FeCk og 0,5 % SDS). Etter en innkuberingstid på 2 minutter ble 100 jxl prøvene inneholdende mikroorganismene sådd ut på de respektive media. Etter en innkuberingsperiode på 1 - 3 dager ved 28°C ( Saccharomyces cerevisiae og Candida Parapsilosis) eller 37°C { Escherichia coli og Bacillus subtilis) ble antallet av dyrkede kolonier bestemt. I testprøver med sterilt vann overlevde alle mikroorganismer. Testprøve med 70 % etanol eller trekomponentsystemet viste ingen tegn til levende cellekolonier, noe som indikerer at alle mikroorganismer var drept under disse betingelser.

Tabell 2 oppsummerer foretrukne sammensetninger av løsningen med trekomponentsystemet inneholdende overflateaktive substanser, vitaminer og metallioner for fjerning av DNA molekyler fra overflater og utstyr.

Liste med forklaringer av forkortelsene i figurene

amp: ampisillin

Bacillozid™: kommersiell antibakteriell løsning

C: kontroll

DNase-OFF™: kommersiell løsning for innaktivering av DNA EtBr: etidiumbromid

FAD: flavin adenin dinukleotid

HAc: eddiksyre

M: molekylvektsmarkør

PCR: polymerasekjedereaksjon

RNase-OFF™: kommersiell løsning for innaktivering av RNase RNaseA: ribonukleoase A (fra bovin pankreas)

RT: romtemperatur

sc: Saccharomyces cerevisiae

scIMP2: Saccharomyces cerevisiae gen for indre membranprotease 2 scPCPl: Saccharomyces cerevisiae gen for prosessering av cytokrom c peroksidase SDS: natriumdodekylsulfat

TX: Triton X-100 (ikke ionisk detergent)

Yep351: gjær episomalt plasmid

Claims (11)

1. Dekontamineringsløsningkarakterisert vedat den omfatter en synergistisk blanding av: a) minst et vitamin i konsentrasjoner fra 10 mM til 100 mM, og b) minst et metallion i konsentrasjoner fra 1 mM til 100 mM, og c) minst en overflateaktiv substans i konsentrasjoner fra 0,1 % til 10 % (vekt) i forhold til totalløsningen.

2. Dekontamineringsløsning ifølge krav 1karakterisertv e d at blandingen har en pH verdi i området mellom pH 2 og 8,5.

3. Dekontamineringsløsning ifølge krav 1 eller 2karakterisertv e d at blandingen ytterligere omfatter et buffersystem som inkluderer karbonater og derivater av ravsyre,.

4. Dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3karakterisert vedat nevnte vitaminer, deres relaterte salter eller syrederivater er minst en forbindelse valgt fra gruppen bestående av vannløselige vitaminer som har karakteristika av en antioksidant.

5. Dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4karakterisert vedat nevnte metallioner er hentet fra fjerde gruppe og subgruppene I, n, eller Vin i periodesystemet.

6. Dekontamineringsløsning ifølge krav 5karakterisertv e d at nevnte metallioner er salter fra de respektive syrer eller baser.

7. Dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 6karakterisert vedat nevnte overflateaktive substans er minst en forbindelse valgt fra gruppen bestående av anioniske, ikke ioniske, amfotære eller kationiske tensider eller egnede blandinger derav.

8. Dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7karakterisert vedat nevnte metallioner ifølge b) er anvendt i konsentrasjoner på 5 mM til 10 mM.

9. Dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8karakterisert vedat nevnte overflateaktive substans ifølge c) er anvendt i konsentrasjoner på 0,2 % til 5 % (vekt) i forhold til totalløsningen.

10. Ikke-terapeutisk anvendelse av dekontamineringsløsninger ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9 for denaturering, modifisering, degradering, solubilisering og fjerning av proteiner og nukleinsyremolekyler fra overflater.

11. Fremgangsmåte for justering av pH-verdi av en dekontamineringsløsning ifølge hvilket som helst av kravene ltil9karakterisert vedat blandingen justeres ved et buffersystem omfattende karbonater og derivater av ravsyre til en pH-verdi i området mellom 2 til 8,5.