NO333805B1 - Anvendelse av 4-hydroxy tamoxifen for fremstilling av et medikament, og farmasoytiske sammensetninger - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer fremgangsmåter for behandling og forhindring av brystkreft ved adminisfrering av 4-hydroksytamoxifen til en pasient. Den fremskaffer også farmasøytiske sammensetninger av 4-hydroksytamoxifen som passer for perkutan adminisfrasjon. Når perkutant adminisfrert til en pasients bryst, konsentteres hydroksytamoxifen lokalt og utøver en anti-østtogenisk effekt. I pasienter med brystcancer reduserer denne effekten tumorproliferasjonen. I pasienter med risiko for utvikling av brystcancer, forhindrer den anti-østtogene effekten dannelse av tumorer.

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av 4-hydroksy tamoxifen(4-OHT) for fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forhindring av brystkreft, samt farmasøytiske sammensetninger.

Brystkreft utgjør et signifikant helseproblem for kvinner i USA og i hele verden. Trass i fremskritt i oppdagelse og behandling av sykdommen, forblir brystkreft den nest hyppigste årsak til cancer-relaterte dødsfall hos kvinner, noe som påvirker mer enn 180, 000 kvinner USA alene per år. For kvinner i Nordamerika, er sannsynligheten for å få brystkreft i løpet av livet, en til åtte.

Ingen universell suksessfull fremgangsmåte for forhindring eller behandling av brystkreft eksisterer i dag. Behandling av sykdommen avhenger av en kombinasjon av tidlig diagnose (ved rutine brystskreeningsprosedyrer) og aggressiv behandling, som kan omfatte en eller flere av forskjellige behandlinger slik som kirurgi, radioterapi, kjemoterapi og hormonterapi. Disse behandlingene er farlige, toksiske, kostbare og ofte ineffektiv spesielt for behandlingen av metastatiske sykdommer.

Den vanligst foreskrevne hormonelle medisineringen for brystkreft er tamoxifen. Det virker ved blokkering av effekten av østrogen, som fremmer veksten av brystkreftceller. Som en behandling for brystkreft, senker eller stopper tamoxifen veksten av cancerceller som allerede er til stede i kroppen, og den hjelper til å forhindre gjenopptreden og utviklingen av nye cancere. Det å ta tamoxifen i 5 år reduserer risikoen for gjenopptreden med omkring halvparten hos pasienter med østrogenreseptor-positive cancere. Tamoxifen reduserer også forekomsten av brystkreft som involverer det andre brystet (kontralateralt) i både premenopausale og postmenopausale kvinner. Videre, har tamoxifen nylig blitt funnet å redusere forekomsten av brystkreft hos kvinner med høy risiko for utvikling av sykdommen.

Trass sine fordeler, har tamoxifen signifikante ulemper. Dets virkning påvirker potensielt alle østrogenreseptorbærende celler i kroppen, og som både en agonist og antagonist, fremtvinger tamoxifen et stort spekter av systemiske effekter. Disse øker risikoen for endometrial cancer, endometrial hyperplasi og polypper, dyp venetrombose og pulmonar embolisme, endring i leverenzymenivåer, og okulare toksisiteter, inkludert katarakt. Videre, rapporterte pasienter behandlet med oral tamoxifen at de har hetetokter, vaginal utflod, depresjon, amenorrhea, og kvalme (Ibis, 2002; Fentiman 1986,1988,1989).

På grunn av tamoxifens ulemper har noen cancerforskere foreslått å benytte 4- hydroksytamoxifen, en metabolitt av tamoxifen, for brystkreft. I in vitro studier hemmer 4- hydroksytamoxifen veksten av både normale og cancerøse brystceller (Nomura,1985; Malet, 1988,2002; Charlier, 1995). I tillegg viser transdermalt levert 4-hydroksytamoxifen en anti-tumoreffekt på humane brysttumorer dyrket subkutant i mus (U. S. patent Nr. 5,904, 930).

Begrensede eksperimenter i mennesker har vist at perkutant administrert 4- hydroksytamoxifen kan bli konsentrert i lokale brysttumorer, med meget liten systemisk distribusjon (Mauvais-Jarvis, 1986). Imidlertid, den viste den mest vidtgående rapporterte studien av denne typen, i hvilken pasientene ble behandlet i tre uker, at konsentrasjonen i brystvev av 4-hydroksytamoxifen administrert perkutant forble lavere enn de observert etter oral tamoxifenbehandling (Pujol, 1995). Følgelig, konkluderte forskerne med at de ikke kunne foreslå perkutan 4-hydroksytamoxifen som en alternativ tamoxifenbehandling.

Det er viktig at ingen av de rapporterte studiene som angår 4-hydroksy tamoxifen i mennesker har evaluert en anti-tumor effekt. Denne mangelen etterlater det viktigste spørsmålet vidåpent, nemlig om perkutant administrert 4-hydroksy tamoxifen faktisk utøver noen effekt på brystkreft i mennesker. Det eksisterer derfor enda et sterkt behov for brystkreftbehandlinger og .profylakse som gir få systemiske bieffekter.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår ifølge et første aspekt anvendelse av 4-hydroksy tamoxifen for fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forhindring av brystkreft, hvori nevnte medikament er i form at en passende for perkutan administrasjon og 4-hydroksy tamoxifen er i en bærer inneholdende en penetreringsforsterker valgt blant isopropylmyristat.

Øvrige utførelsesformer av dette første aspektet er angitt i de uselvstendig kravene 2 til 7.

Ifølge et andre aspekt angår foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning for perkutan administrasjon omfattende 4- hydroksy tamoxifen og minst isopropylmyristat som en penetreringsforsterker.

Øvrige utførelsesformer av dette andre aspektet er angitt i de uselvstendige kravene 9 til 21.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 illustrerer metabolismen av tamoxifen.

Figur 2 illustrerer den gjennomsnittlige plasmakonsentasjonen av 4-hydroksy tamoxifen i sunne kvinner etter kutan administrasjon. Figur 3 illustrerer konsentrasjonen av 4-hydroksy tamoxifen i vev, ifølge adminstrasjonsmodus og -dose. Panel B viser konsentrasjonen av 4-hydroksy tamoxifen i plasma.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer

Et viktig aspekt ved foreliggende oppfinnelse er den overraskende oppdagelsen at 4- hydroksy tamoxifen, når administrert perkutant, er effektiv ikke bare for behandling, men også i forhindring av brystkreft. Videre, resulterer perkutant administrert 4-hydroksy tamoxifen i lavere plasmanivåer av medikamentet enn standarddosen av oral tamoxifen, noe som medfører færre negative bieffekter. Følgelig, er perkutan 4- hydroksy tamoxifen et alternativ til tamoxifen både for behandling og profylakse i denne sammenhengen.

Oppfinnerne har utført den første studien for å demonstrere at 4-hydroksy tamoxifen reduserer brysttumorproliferasjon in vivo i mennesker (se Eksempel 4, nedenfor).

Kort sagt, de administrerte 4-hydroksy tamoxifen gel perkutant til humane pasienter diagnostisert med østrogenreseptorpositiv brystkreft. Etter kun 2-3 uker administrasjon, observerte oppfinnerne dose-relatert reduksjoner i tumorvevproliferasjonsindekser, hvor den høyeste dosen (2.0 mg/dag) viste tilnærmet ekvivalens med en standard dose av oral tamoxifen. Tumor vevsproliferasjonsindeksene som ble evaluert, var Ki67 (Gerdes 1984; Schluter 1993) og Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)

(Waseem, 1990). Selv om perkutan 4-hydroksy tamoxifen gel og oral tamoxifen var ekvivalente i reduksjon av tumor vevsproliferasjon, var 4-hydroksy tamoxifen plasmanivåer betydelig lavere i pasienter som mottok 4-hydroksy tamoxifen gel.

Forbindelsen 4-hydroksytamoxifen, eller 1- [4- (2-N- dimetylaminoetoksy) fenyl]-l- (4-hydroksyfenyl)-2-fenylbut-l-en, utgjør en aktiv metabolitt av den vel karakteriserte anti-østrogenforbindelsen, tamoxifen. På grunn av nærværet av en dobbelbinding mellom to karbonatomer, eksisterer 4-hydroksy tamoxifen i to stereoisomere former. Ifølge den medisinske og biokjemiske litteraturen, er isomere former av 4-hydroksy tamoxifen ofte betegnet som cis og trans isomerer. Fra et rent kjemisk synspunkt, er imidlertid disse betegnelsene ikke strengt nøyaktige, på grunn av at hvert dobbeltbundet karbonatom ikke inneholder en identisk kjemisk gruppe.

Derfor er det mer riktig å referere til isomerene som E (den såkalte cis-formen) og Z (den såkalte trans-form) konfigurasjoner. Både E- og Z-isomerene av 4-hydroksy tamoxifen, enten alene eller I kombinasjon, er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse. Z-isomeren er imidlertid foretrukket, på grunn av et den er mer aktiv en E-isomeren.

4-Hydroksy tamoxifen virker som en selektiv østrogenreseptormodulator (SERM) som viser en vevsspesifisitet for østrogenreseptive vev. I brystvev, virker den som en østrogenantagonist. Studier har vist at 4-hydroksy tamoxifen kan regulere transkripsjonen aktivitet av østrogen-relaterte reseptorer, som kan bidra til dens vevsspesifikke aktivitet. In vitro, har 4-hydroksy tamoxifen store kraft enn

tamoxifen, målt ved bindingsaffinitet til østrogenreseptorer, eller ERs, og en bindingsaffinitet tilsvarende til østradiol for østrogenreseptorer (Robertson et al., 1982; Kuiper etal., 1997). Z-4- hydroksy tamoxifen inhiberer veksten I kultur av normale human epiteliske brystceller 100 ganger mer enn Z-tamoxifen (Malet et al.1988).

Selv om 4-hydroksy tamoxifen er en tamoxifenmetabolitt, er dens nytte mot brystkreft ikke bebudet ved tidligere erfaring med tamoxifen som sådan. Tamoxifen blir kraftig metabolisert i mennesker, som vist i

Figur 1. Således, er dets virkning in vivo nettoresultatet av individuelle virkninger av de opprinnelige forbindelsene og dets metabolittforbindelser som konkurrerer om å oppta reseptorer i målvevene. For eksempel, se Jordan, 1982. Hver av disse forbindelsene manifesterer forskjellige og uforutsigbare biologiske aktiviteter I forskjellige celler, delvis bestemt ved hver enkel forbindelses individuelle effekt på østrogen-reseptorkonformasjon. Det vil si østrogenreseptorbinding av hver forbindelse genererer en unik reseptor-ligand konformasjon som rekrutterer forskjellige kofaktorer, og resulterer i varierende farmakologier for de forskjellige forbindelser (Wijayaratne et al., 1999;Giambiagi et al., 1988).

Flere eksempler på disse varierende effektene har blitt dokumentert. For eksempel er tamoxifen, men ikke 4-hydroksy tamoxifen et kraftig rottelever carcinogen. (Carthew etal., 2001; Sauvez etal., 1999). Videre initierer ifølge rapporter tamoxifen, men ikke 4-hydroksy tamoxifen apoptose i p53 (-) normale humane brystepitelceller (Dietze et al., 2001Derimot utviser 4-hydroksy tamoxifen en signifikant inhibitorisk effekt på østronsulfataseaktivitet i brystcancercellelinjer, mens tamoxifen har liten eller ingen effekt i så måte (Chetrite et al., 1993).

Tidligere studier med 4-hydroksy tamoxifen forutser heller ikke dets effektivitet for brystkreftbehandling og -forhindring. Evnen til et hvilket som helst medikament i å hemme tymorcellevekst in vitro eller i axenograftanalyse er en grov indikator på hvordan medikamentet kan virke i mennesket (Gura, 1997). Cellekultur, et kunstig miljø, gir ingen informasjon med hensyn på hvordan medikamentet virker I et fullstendig biologisk system, og dyr prosesserer ofte ikke medikamenter på samme måte som mennesket. Videre, evaluerer kun tidligere humane studier med 4- hydroksy tamoxifen medikamentlevering, og gir ingen informasjon med hensyn på medikamentets effekt på brysttumorer. Derimot har eksperimenter utført av foreliggende oppfinnere overraskende vist at 4-hydroksy tamoxifen, administrert perkutant, forårsaker dose-relatert reduksjon i tumor vevsproliferasjonsindekser.

Fremgangsmåter for fremstilling av 4-hydroksy tamoxifen er velkjent. U. S. patent Nr. 4,919,937 beskriver for eksempel en syntese avledet fra Robertson og Katzenellenbogen, 1982, som skjer i trinn: Trinn 1-Reaksjon mellom 4-( B-dimetylaminoetoksy)- a-etyldeoksybenzoin og p-(2-tetrahydropyranyloksy) fenylmagnesiu bromid;

Trinn 2-Separat fra trinn, dannelse av l-(4-hydroksypenyl)-2-fenyl-l- butanon ved hydroksylering av 1,2-difenyl-l-butanon;

Trinn 3-Reaksjon mellom produktene fra trinnene 1 og 2 for å danne 1- (4- dimetylaminoetoksyfenyl)-l-[p-2-tetrahydropyranyloksy) fenyl] -2-fenylbutan-l-ol;

Trinn 4-Dehydrering med metanol/saltsyre gir [p- ( B- dimetylaminoetoksy)phenyl]-Z l-(p-hydroksyfenyl)-2-feny-l-but-l-en=4-OH-tamoxifen, en blanding av E og Z isomerer;

Trinn 5-Separasjon av E og Z isomerer ved kromatografi og krystallisering til constant spesifikk aktivitet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse, kan 4-hydroksy tamoxifen bli administrert til en pasient som er diagnostisert med brystkreft. Canceren vil fortrinnsvis være østrogenreseptor positiv, da det er antatt at 4-hydroksy tamoxifen primært utøver sin effekt ved påvirkning av østrogenreseptorer. I tillegg, er det foretrukket at brystkreften er lokalisert i brystet. For eksempel, kan en primær brysttumor og/eller en metastatisk tumor som kun er lokalisert i brystet, bli behandlet ved topikal administrasjon. Brystkrefttumorer på et annet sted som er tilgjengelige for topikalt administrert 4-hydroksy tamoxifen kan imidlertid også bli behandlet på denne måten.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også administrasjon av 4-hydroksy tamoxifen profylaktisk, til en pasient med øket risiko for utvikling av brystkreft. Mange risikofaktorer for brystkreft er vel etablert. For eksempel, familiehistorie av brystkreft, personlig historie av brystkreft, tidligere brystbiopsi-oppdagelse av proliferativ brystsykdom slik som atypisk hyperplasia, og tidligere brystbestråling, gir alle pasienten en øket risiko for utvikling av brystkreft. Spesielle genetisk risikofaktorer omfatter BRCA1, BRCA2, ATM, CHEK-2 og p53 mutasjoner. Visse livsstilrelaterte risikofaktorer for kvinner omfatter forsinket barnefødsel inntil en alder etter 30, langtids bruk av orale prevensjonsmidlet, og langtidsbruk av hormonerstatningsterapi. En fagmann innen medisin kan evaluere disse og andre risikofaktorer for å bestemme om en pasient vil ha fordeler av profylaktisk bruk av 4-hydroksy tamoxifen. Ved å gjøre en slik vurdering kan legen benytte Gail-modellen.

4-Hydroksy tamoxifen er spesielt nyttig for forhindring av brystkreft i pre-menopausale kvinner. I denne populasjonen må et anti-østrogen konkurrere med store mengder sirkulerende østrogen for å binde til østrogenreseptorer. På grunn av at 4-hydroksy tamoxifen har 100 ganger høyere affinitet for

østrogenreseptorer enn tamoxifen, er den bedre i stand til å konkurrere om reseptorene ved lave doser. Evnen til å benytte lave doser er spesielt viktig i en profylaktisk sammenheng, hvor pasientens eksponering for medikamentet er langtids og det bieffekter er mindre tolererbare.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan 4-hydroksy tamoxifen bli administrert i mange doseringsformer og via et hvilket som helst system som leverer den aktive forbindelsen til brystet og/eller tumor østrogenreseptorer in vivo. Fortrinnsvis blir 4-hydroksy tamoxifen levert ved "perkutan administrasjon," en frase som betegner en hvilken som helst leveringsmodus for et medikament fra overflaten av pasientens hud, gjennom stratum corneum, epidermis, og dermis lagene, og inn i mikrosirkulasjonen. Dette blir typisk oppnådd ved diffusjon ned en konsentrasjonsgradient. Diffusjonen kan opptre via intracellulær penetrering (gjennom cellene), intercellulær penetrering (mellom cellene), transappendageal penetrering (gjennom hårfolliklene, svette- og talgkjertler) eller en hvilken som helst kombinasjon av disse.

Perkutan administrasjon av 4-hydroksy tamoxifen gir flere fordeler. For det første, unngås den hepatiske metabolismen som opptrer etter oral administrasjon (Mauvais-Jarvis et al.,1986). For det andre, reduserer perkutan administrasjon betydelig den systemiske medikamenteksponeringen, og den medfølgende risikoen for ikke-spesifikk aktiverende østrogenreseptorer gjennom kroppen; dette på grunn av at den topikale 4-hydroksy tamoxifen primært blir absorbert inn i lokale vev. Spesielt, når 4-hydroksy tamoxifen blir påført perkutant på brystene, akkumuleres høye konsentrasjoner i brystvevet, antagelig på grunn av mange østrogenreseptorer deri, uten å skape en høy plasmakonsentrasjon (Mauvais- Jarvis etal., supra). Ifølge foreliggende oppfinnelse, kan derfor 4-hydroksy tamoxifen bli påført på en hvilken som helst hudoverflate, men fortrinnsvis på ett teller begge bryst.

Selv om oppfinnelsen ikke er begrenset til noen bestemt teori, opptrer klinisk signifikante bieffekter av anti-østrogenmidler når middelet erstatter østradiol i andre vev enn målvevet. På grunn av at 4-hydroksy tamoxifen og østradiol har tilsvarende bindingsaffiniteter for østrogenreseptorer, vil en konkurranse mellom dem for reseptorbinding være omtrent lik når konsentrasjonen til forbindelsene er omkring lik hverandre. Dersom 4-hydroksy tamoxifen konsentrasjonen er større enn østradiol-konsentrasjonen, vil den første være bundet fortrinnsvis til østrogenreseptorer og vice versa.

Følgelig er doser av 4-hydroksy tamoxifen som resulterer i plasmakonsentrasjoner som er mindre enn omkring 80 pg/mL, eller den gjennomsnittlige østradiolkonentrasjonen i normale premenopausale kvinner, foretrukket. Mer foretrukket vil doser av 4-hydroksy tamoxifen resultere I plasmakonsentrasjoner som er mindre enn omkring 50pg/mL. Den daglige dosen for administrasjon kan initielt bli estimert basert på absorpsjonskoeffisientene til 4-hydroksy tamoxifen, den ønskede brystvevskonsentrasjonenen, og plasmakonsentrasjonen som ikke må overskrides. Naturligvis kan den

initielle dosen bli optimalisert i den enkelte pasienten, avhengig av individuell respons.

Som angitt ovenfor, ved å målrette 4-hydroksy tamoxifen mot brystvev, kan høye konsentrasjoner bli oppnådd i vevet uten samtidig å øke 4-hydroksy tamoxifen plasmanivåer til et punkt hvor signifikant systemisk konkurranse for østradiolreseptorer opptrer. Ved en perkutan dose på 1 mg/bryst/dag,overskrider 4-hydroksy tamoxifen konsentrasjonen i brystvev normale østradiolkonsentrasjoner i brystvev med en faktor på 4.(Barrat et al., 1990; Pujolet al., supra). Videre, når 4-hydroksy tamoxifen påført på denne måten, konsentrasjoner i brystvevet som er en størrelsesorden høyere enn konsentrasjonen i plasma, dvs. 10:1. Derimot, er forholdet mellom brystvev til plasma av 4-hydroksy tamoxifen etter oral administrasjon av tamoxifen omkring 5:1.

I en perkutan formulering, skal doser i området 0,5-2.0 mg/bryst/dag av 4- hydroksytamoxifen oppnå det ønskede resultat, hvor doser på omkring 0,5-1,0 mg/bryst/dag er foretrukket. I spesielle utførelsesformer, er doseringen omkring 0,5,0,75 eller 1,0 mg/bryst/dag av 4-hydroksy tamoxifen.

Perkutan administrasjon kan bli utført på hovedsakelig to forskjellige måter: (i) ved blanding av en terapeutisk aktiv forbindelse eller dets ikke-toxiske farmasøytisk akseptabelt salt med passende farmasøytiske bærere og, eventuelt penetreringsforsterkere for å danne salver, emulsjoner, lotioner, oppløsninger, kremer, geler og liknende, hvor en mengde av nevnte preparat blir påført på huden, eller (ii) ved inkorporering av det terapeutisk aktive stoffet inn i plastre eller transdermale leveringssystemer ifølge kjent teknologi.

Effektiviteten ved perkutan medikamentadministrasjon avhenger av mange faktorer, inkludert medikamentkonsentrasjonen, overflateareal for applikasjon, tid og varighet for applikasjon, hudhydrering, fysiokjemiske egenskaper til medikamentet, og fordelingen av medikamentet mellom formuleringen og huden. Medikamentformuleringer som er ment for perkutan anvendelse drar fordeler av disse faktorene for å oppnå optimal levering. Slike formuleringer omfatter ofte penetreringsforsterkere som forbedrer perkutan absorpsjon ved reduksjon av motstanden i stratum corneum ved reversibelt å endre dens fysiokjemiske egenskaper, endre hydreringen av stratum corneum, virke som ko-oppløsningsmiddel, eller endre organisasjonen av lipider og proteiner i de intercellulære rom.

Slike forsterkere av perkutan absorpsjon omfatter overflateaktive midler, DMSO, alkohol, aceton, propyleneglycol, polyetylenglycol, fettsyrer eller fettalkoholer og deres derivater, hydroksysyrer, pyrrolidoner, urea, essensielle oljer og blandinger derav. I tillegg til kjemiske forsterkere, kan fysikalske metoder øke perkutan absorpsjon. For eksempel kan okklusive bandasjerer indusere hydrering av huden. Andre fysiske metoder omfatter ionoforese og sonoforese, som benytter henholdsvis elektriske felt og høyfrekvens ultralyd for å øke adsorpsjonen av medikamentene som blir dårlig absorbert på grunn av deres størrelse og ioniske karakteristikker.

De mange faktorer og metoder som angår perkutan medikamentlevering er beskrevet i REMINGTON : THE SCIENCE og PRACTICE OF PHARMACY, Alfonso R. Gennaro (Lippincott Williams & Wilkins, 2000), på Sidene 836-58, Og i PERKUTAN ABSORPTION: DRUGS COSMETICS MECHANISMS METHODOLOGY, Bronaugh og Maibach (Marcel Dekker, 1999). Som disse publikasjonene gjør klart, kan de i det farmasøytiske feltet manipulere de forskjellige faktorene og metodene for å oppnå effektiv perkutan levering.

4-Hydroksy tamoxifen er et stort og meget lipofilt molekyl som således uten assistanse fra penetreringsforsterkere penetrerer huden dårlig. Følgelig, omfatter formuleringer av 4-hydroksy tamoxifen benyttet I foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis en eller flere penetreringsforsterkere. Alkoholer er foretrukne forsterkere da 4-hydroksy tamoxifen er oppløselig i alkohol. Isopropylmyristat er også en foretrukket forsterker.

For perkutan administrasjon, kan 4-hydroksy tamoxifen bli levert i en salve, krem, gel, emulsjon, lotion, pulver, olje eller tilsvarende formulering. Hva dette angår, kan formuleringen omfatte vanlige hjelpestoffer, inkludert vegetabilske oljer, slik som mandelolje, olivenolje, ferskenkjerneolje, jordnøttolje, lakserolje og liknende, animalske oljer, DMSO, fett og fettliknende stoffer, lanolin lipider, fosfatider, hydrokarboner slik som parafiner, petroleum gele, vokser, detergent, emulgerende midler, lecitin, alkoholer, carotin, polyoler eller polyglykoler slik som glycerol (eller glycerin), glyceroletere, glycoler, glycoletere, polyetylenglycol, polypropylenglycol, ikke-volatile fettalkoholer, syrer, estere, volatile alkoholforbindelser, urea, talk, cellulosederivater, fargestoffer, antioksidanter og konserveringsmidler.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan 4-hydroksy tamoxifen også bli levert via et transdermalt plaster. Ifølge en utførelsesform omfatter plasteret et reservoar for 4- hydroksy tamoxifen formuleringen. Plasteret kan omfatte (a) en oppløsninges-impermeabel dekkfolie, (b) et lagliknende element som har en kavitet, (c) en mikroporøs eller semi- permeabel membran, (d) et selvklebende lag, og (e) eventuelt en avtakbar dekkfilm. Det lagliknende elementet som har en kavitet, kan være dannet av dekkfolien og membranen. Alternativt, kan plasteret omfatte (a) en oppløsnings-impermeabel dekkfolie, (b) et åpenporig skum, et skum med lukkede porer, et vevsliknende lag eller et vevsliknende lag som reservoar, (c) dersom laget ifølge (b) ikke er selvklebende, et selvklebende lag, og (d) eventuelt en avtagbar dekkfilm.

ifølge foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, blir 4-hydroksy tamoxifen formulert i en

hydroalkoholisk gel. Mengden av 4-hydroksy tamoxifen i en slik gel kan variere fra omkring 0.001 til omkring 1.0 gram 4-hydroksy tamoxifen per 100 gram gel. Foretrukket er det i området fra omkring 0.01 til omkring 0.1 gram 4-hydroksy tamoxifen perlOO gram gel.

Det er også foretrukket at 4-hydroksy tamoxifen-formuleringene omfatter en eller flere fettsyreestere som en penetreringsforsterker. Et sterkt foretrukket eksempel på en fettsyreester penetreringsforsterker er isopropylmyristat. Når isopropylmyristat blir benyttet i en gel, kan mengden variere fra omkring 0,1 til omkring 5,0 gram per 100 gram gel. Fortrinnsvis er mengden av isopropylmyristat i området fra omkring 0,5 til omkring 2,0 gram per 100 gram gel.

4-Hydroksy tamoxifen formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse, vil omfatte en eller flere ikke-vandige bærere. Disse bærerne må være i stand til å oppløse både 4- hydroksy tamoxifen og en hvilken som helst benyttet penetreringsforsterker. De må også ha et lavt kokepunkt, fortrinnsvis lavere enn 100 sc ved atmosfærisk trykk, for å tillate hurtig avdamping etter kontakt med huden. Eksempler på passende ikke-vandige bærere omfatter etanol, isopropanol og etylacetat. Etanol og isopropanol er foretrukket. Spesielt bidrar etanol effektivt til den perkutane absorpsjonen av 4-hydroksy tamoxifen ved hurtig evaporering etter kontakt med huden. Mengden av den ikke-vandige bæreren i en gelformulering er vanligvis i området mellom 54 og 85 vekt %, og foretrukket mellom 65 % og 75%.

Formuleringer kan også omfatte en vandig bærer, som tillater oppløsning av eventuelle hydrofile molekyler I en formulering, og også fremmer diffusjon av lipofile molekyler fra formuleringen til huden. En vandig bærer kan også regulere pH. Vandige bærere omfatter alkaliserende og basiske bufferoppløsninger, inkludert fosfatbuffrede oppløsninger, f.eks. dibasisk eller monobasisk natriumsulfat), citratbuffrede oppløsninger (f.eks. natriumcitrat eller kaliumcitrat) og ret tog slett renset vann.

Mengden av en vandig bærer ligger fortrinnsvis i området 15% og 45vekt % av en gelformulering, og mer foretrukket mellom 25% og 35%.

Videre, kan 4-hydroksy tamoxifen-formuleringer omfatte et eller flere gellingsmidler for å øke viskositeten til en formulering og/eller for å virke som et oppløsende middel. Avhengig av gellingsmiddlets nature, kan det omfatte mellom 0,1 % og 20vekt % av en formulering, foretrukket mellom 0. 5% og 10%, og enda mer foretrukket mellom 1% og 5%. Foretrukne gellingsmidler omfatter karbomerer, cellulosederivater, poloxamerer og poloxaminer. MMer bestemt er foretrukne gellingsmidler kitosan, dextran, pektiner, naturlig gummi og cellulosederivater slik som etylcellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksyetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose (HPMC), carboxymetylcellulose(CMC), og liknende. Et sterkt foretrukket gellingsmiddel er

hydroksypropylcellu lose.

Når en formulering omfatter et gellingsmiddel, spesielt en ikke prenøytralisert acrylpolymer, kan den foretrukket også omfatte et nøytraliseringsmiddel. Forholdet nøytraliseringsmiddel/gellingsmiddel er foretrukket mellom 10 :1 og 0,1:1, mer foretrukket mellom 7:1 og 0,5 :1, og enda mer foretrukket mellom 4 :1 og 1:1. Et nøytraliseringsmiddel skal i nærvær av polymeren danne salter som er oppløselige i bæreren. Et nøytraliseringsmiddel skal også tillate optimal svelling av polymerkjeden under nøytralisering av ladninger og dannelse av polymersalter. Nyttige nøytraliseringsmidler omfatter natriumhydroksid, ammonium hydroksid, kalium hydroksid, arginin, aminometylpropanol og trometamin. Fagmannen vil velge et nøytraliseringsmiddel ifølge dypen gellingsmiddel benyttet i en formulering. Når cellulosederivater er benyttet som gellingsmidler, er imidlertid ingen nøytraliseringsmidler nødvendige.

Tabell 1 beskriver sammensetningen til to sterkt foretrukne 4-hydroksy tamoxifen gel-formuleringer.

Referanse til de følgende, illustrative eksempler vil hjelpe til å gi mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen.

Eksempel 1: Demonstrasjon av perkutan 4-hydroksy tamoxifen-levering

Fire pasienter med brystkreft mottok [3H]-4-hydroksy tamoxifen i alkoholisk oppløsning påført direkte på brystene ved angitte intervaller mellom 12 timer til 7 dager før kirurgi for å skjære ut sykt vev. Etter kirurgi inneholdt både det utskårne vevet og det normale brystvevet som omga tumoren radioaktivitet.

(Kuttenn et. al., 1985).

I en oppfølgingsstudie, mottok 9 av 12 pasienter som var satt opp for kirurgisk fjerning av hormonavhengig brystkreft Z[3H]-4-hydroksy tamoxifen (80, uCi) i en 60% alkoholisk oppløsning og tre pasienter mottok Z[3H]-tamoxifen (80 uCi) for sammenligning.

Pasientene mottok [3H]-merket medikament påført direkte på de angrepne brystene ved angitte intervaller som varierte fra 12 timer til 7 dager før kirurgi for å fjerne sykt vev. Brysvev fra tre regioner: tumoren, vevet som umiddelbart omgir tumoren og normalt vev, ble tatt u tog umiddelbart frosset I flytende nitrogen.

I tillegg ble plasma- og urinprøver tatt ved oppsatte intervaller og frosset inntil analyse.

Tabell 2 viser resultater fra de utførte analysene. 4-Hydroksy tamoxifen ble konsentrert hovedsakelig i de cytosoliske og nukleære fraksjonene av brystvevet, hvor østrogenreseptorer er til stede. I disse intracellulære setene forblir 4-hydroksy tamoxifen ikke-metabolisert, bortsett fra begrenset isomerisering fra Z- til E-formen.

Tilbakeholdelse i brystet varte omkring 4 dager i 4-hydroksy tamoxifen-gruppen, men var kortere og svakere i tamoxifen-gruppen.

Prosentdelen av radioaktivitet identifisert som [3H]-4-hydroksy tamoxifen i brysvev etter perkutan administrasjon avtok sakte over syv dager (fra 97 % til 65 %). Under denne perioden skjedde en progressiv isomerisering av Z isomeren til E isomeren, med tilsvarende prosentdeler observert ved dag 7 (32% og 33%).

Radioaktiviteten i blodet på grunn av [3H]-4-hydroksy tamoxifen avtok gradvis, med et platå fra dag 4 til 6. Dette er i motsetning til [3H]-tamoxifen, som hurtig fremkom i blodet, med et platå ved to dager. Etter 36 timer etter perkutan [3H]-4- hydroksy tamoxifen administrasjon, viste kun 0,5% av den administrerte radioaktiviteten I blodet.

I motsetning til det tilnærmede fraværet av 4-hydroksy tamoxifen metabolisme i brystvevet, opptrådte markert metabolisme i blodet. I blod, 24 timer etter administrasjon, representerte 68% radioaktiviteten 4-hydroksy tamoxifen, 18% representerte N-desmetyl-4- hydroksy tamoxifen, og 11% representerte bisfenol.

Topp urineliminering opptrådte ved en senere tid etter perkutan administrasjon av 4-hydroksy tamoxifen sammenlignet med perkutan tamoxifen. Etter applikasjon av 4-hydroksy tamoxifen, ble en progressiv økning av metabolitter, for det meste N- desmetyl-4-hydroksy tamoxifen og bisfenol, observert i urinen.

Dette eksempelet demonstrerer at perkutan applikasjon av 4-hydroksy tamoxifen til brystene resulterer i en betydelig og holdbar lokal vevskonsentrasjon av medikamentet, med minimal metabolisme, stabil og meget lave plasmakonsentrasjoner, og sakte eliminasjon via urinen.

Eksempel 2: Demonstrasjon av farmakokinetikken og farmakodynamikken av perkutant administrert 4-OH-Tamoxifen sammenlignet med 20 mg oral tamoxifen

Denne studien sammenlignet vevs- og plasmakonsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen etter perkutan administrasjon via en hydroalkoholisk gel med vevs- og plasmakonsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen etter oral administrasjon av tamoxifen (Pujol,1995).

Trettien pasienter som var satt opp for brystkreftkirurgi ble tilfeldig satt opp i en av fem grupper. De mottok behandling med enten oral tamoxifen eller perkutan 4- hydroksy tamoxifen som angitt I Tabell 3. Behandling var daglig og varte I 3-4 uker før kirurgi. Denne studien evaluerte tre forskjellige doser av 4-hydroksy tamoxifen (0,5,1, eller 2mg/dag) og to områder med applikasjon (enten begge brystene eller på et stort område hud inkludert armer, underarmer og skuldrer). En gruppe pasienter mottok 20 mg/dag (10 mg b. i. d.) av oral tamoxifen (Nolvaldex<*>)

4-hydroksytamoxifen gelen (20 mg 4-hydroksy tamoxifen/100g hydroalkoholiskgel; Besins-International Laboratories) var pakket i trykksatte dosemålende pumper som ga 1.25 g gel/oppmålte dose (dvs. 0.25 mg 4- hydroksy tamoxifen/dose).

Under kirurgi, ble to prøver (1 cm<3>hver) av brystvev skåret ut, en og den andre makroskopisk normal. De ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen inntil de ble analysert. Blodprøver ble tatt på dagen for og dagen før kirurgi. Alle vev- og plasmaprøver ble analysert for 4-hydroksy tamoxifen-konsentrasjon ved gasskromatografi/massepektrometri (GC-MS).

Pre- og post-behandlings blodprøver ble analysert for fullstendig blodtellinger (CBC), bilirubin, serum glutamin-pyruvin transaminase (SGPT), serum glutamin- oxaloeddiksyretransaminase (SGOT), alkalisk fosfatase, creatinin, østradiol, follikkel-stimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), kjønnshormon-bindende globulin (SHBG), kolesterol, høy-densitets lipoprotein (HDL), lav-densitets lipoprotein(LDL), triglycerider, fibrinogen, og anti-trombin III.

Tabell 4 nedenfor oppsummerer konsentrasjonen av 4-hydroksy tamoxifen funnet i brystvev og plasma. Normale og tumorbrystvev inneholdt tilsvarende konsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen i alle fem behandlingsgruppene. 4-hydroksy tamoxifen ble konsentrert I høyere mengder I brystvev når gelen var påført direkte på brystene enn på andre hudoverflater.

Bieffekter var ikke noe signifikant problem. Kutan behandling forårsaket ikke noen lokal irritasjon. En kvinne i Gruppe 2 (0.5 mg/dag av 4-hydroksy tamoxifen gel) rapporterte uklarhet, cystitis, og mild vaginitis som opptrådte på den syvende dagen av behandlingen. En kvinne i Gruppe 1 (oral tamoxifen) rapporterte hetetokter og mild vaginitis på behandlingens femte dag.

Ingen forskjeller eksisterte mellom pre- og postbehandling blodprøver for noen av de hematologiske eller kjemiske evalueringene i pasienter som mottok 4- hydroksy tamoxifen gel. Imidlertid, en statistisk signifikant reduksjon I anti-trombin III og fibrinogen og en statistisk signifikant økning I blodplate- og lymfocyttellinger ble observert i den orale tamoxifengruppen, noe som var i samsvar med de biologiske effektene til dette medikamentet observert i de andre studiene.

Eksempel 3 : Demonstrasjon av toleranse og farmakokinetikk av perkutant

administrert 4-OH-tamoxifen i sunne kvinner

Denne studien demonstrerer toleransen og farmakokinetikken av topakalt påført 4-hydroksy tamoxifen gel i sunne premenopausale kvinner, i alderen 18-45. Hver deltaker påførte gelen daglig i en varighet på to menstruasjonssyklusser.

Tre doser of gelkonsentrasjoner ble testet som oppgitt I tabell 5.

For Grupper A-C, ble gelen inneholdende 20 mg 4-hydroksytamoxifen/lOO g, dispensert fra en trykksatt målepumpe som leverte 0.25 mg 4-hydroksy tamoxifen/dose. Studien av Gruppe C ble utsatt da mengden gel var for stor til å bli påført på ett enkelt bryst. Grupper D og E mottok en mer konsentrert gel som innehold nesten tre ganger så mye 4-hydroksy tamoxifen: 57 mg 4-hydroksy tamoxifen/100 g, eller 50 mg 4-hydroksy tamoxifen/100 mL gel. Denne mer konsentrerte gelen ble også levert med en målepumpe som ga 0,25 mg 4- hydroksytamoxifen/dose.

Ved slutten av en menstruasjonssyklus, mottok hver pasient en enkel dose, etter hvilken serielle blodprøver ble tatt ved 0,0. 5,1,1.5, 2, 3, 4, 6,12,18, 24, 36, 48, og 72 timer.

Den første dagen etter menstruasjon startet behandlingen som bestod av daglig påføring av felen over to menstruasjonssykluser. Blodprøver ble tatt 24 timer etter morgenpåføringen av gelen på dagene 7, 20 og 25 av den første og andre syklusen. På den siste dagen av administrasjonen, dag 25 av den andre menstruasjonssyklusen, ble serielle blodprøver tatt før påføring og ved 0.5,1,1.5, 2, 3, 4, 6,12,18, 24, 36, 48, og 72 timer etter applikasjon av gelen. Prøvene ble analysert for 4-hydroksy tamoxifen, østradiol, progesteron, FSH og LH.

Plasmakonsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen forble detekterbare 72 timer etter den siste påføringen av gel. Derfor, for å sikre at datapunktene ble tatt inntil 4- hydroksy tamoxifen ble ikke-detekterbar I blodet, ble ytterligere blodprøver tatt fra deltakerne ved intervaller opp til 92 dager etter den siste påføringen av gel.

Tabell 6 viser det gjennomsnittlige standardavviket (SD) for plasmakonsentrasjoner av 4- hydroksy tamoxifen, med områder i parentes. En enkel 0,5 mg dose produserte ikke detekterbare plasmakonsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen, men 6 av 12 pasienter hadde detekterbare plasmakonsentrasjoner (> 5pg/ml_) etter en enkel dose på 1 mg. Figur 2 viser plasmakonsentrasjon -tidskurven, etter den siste administrasjonen på dag 25 av den andre menstruasjonssyklusen. Tabell 7 viser gjennomsnittlige farmakokinetiske parametere som er relatert til den siste administrasjonen, på dag 25 av den andre menstruasjonssyklusen.

Tabell 7: Gjennomsnittlige farmakokinetiske parametere for4-hydroksy-tamoxifen i sunne kvinner etter den siste administrasjonen

Dataene er konsistente med en doserespons over de tre testede dosene (0.5,1, og 2 mg). Den mer konsentrerte gelen ble bedre absorbert, med omkring det doble enn den mindre konsentrerte gelen basert på AUC og Cav.

Biologisk toleranse var utmerket hos alle 36 pasientene. Behandlingen påvirket ikke FSH, LH, østradiol, eller progesteron hormonnivåer under menstruasjonssyklusene.

Videre var ekkografisk undersøkelse av ovariene ved slutten av behandlingen normal hos alle pasientene og viste utviklende follikler av normal størrelse. En pasient utviklet allergiske reaksjoner overfor gelen og 10 reporterte akne i ansiktet (5 av hvilke hadde en tidligere historie med akne).

Til oppsummering, indikerer denne studien at eksponeringen overfor 4-hydroksy tamoxifen etter topikal applikasjon økte med dosen, at plasmakonsentrasjoner av 4-hydroksy tamoxifen er lavere enn typeiske østradiolkonsentrasjoner (80pg/mL), og at der ikke var noe detekterbare laboratorie- eller kliniske bevis på systemiske effekter.

Eksempel 4: Demonstrasjon at perkutant administrert 4-Hydroksy

Tamoxifen forårsaker doseavhengige reduksjoner i tumorvevs

proliferasjonsindekser

Denne studien demonstrerer at perkutant administrert 4-hydroksy tamoxifen forårsaker doserelaterte reduksjoner i brysttumorvev proliferasjonsindekser. Det er den første direkte sammenligningen av 4-hydroksy tamoxifen gel med tamoxifen og ikke-behandlede kontroller på biologisk endepunkter av brystkreft i mennesket. Resultatene viser at perkutan administrasjon av 4-hydroksy tamoxifen gel i 2-3 uker gir doseavhengige reduksjoner i tumorvev proliferasjonsindeks (Ki-67 og PCNA) i postmenopausale kvinner som er satt opp for å gjennomgå kirurgi for brystkreft, med omkring ekvivalens mellom 2.0 mg/dag 4-hydroksytamoxifendose og 20 mg/dag oral tamoxifen.

Østrogen- og progesteronreseptornivåer viste ikke doserelaterte reduksjoner med 4-hydroksytamoxifen-behandling. Plasmanivåer av 4-hydroksy tamoxifen var konsistent høyere i den orale tamoxifengruppen enn i 4-hydroksytamoxifen-gel-gruppene, og tumorvevkonsentrasjoner av 4-hydroksytamoxifen økte med økning av dosen av 4- hydroksytamoxifen-gel.

Foreliggende studie gir også informasjon om de biologiske prosessene som ligger under effektene av tamoxifen. Gruppen som mottok 2 mg perkutan 4-hydroksy tamoxifen viste den samme cytostatisk effekt på brystkreftcell-proliferasjonsom den orale tamoxifengruppen trass i markert lavere plasma 4-hydroksy tamoxifen konsentrasjoner. Dette funnet viser at en hovedeffekt av tamoxifen er lokalt mediert av østrogenreseptorer i tumorvev.

Design av studie

En randomisert, åpen, fase Mb studie med parallelle grupper ble utformet for å sammenligne effektene av tre dosenivåer av 4-hydroksytamoxifen, oral tamoxifen og ingen behandling på markører for tumorproliferasjon (Ki-67 og PCNA). Ki-67 antigen ble detektert med MIB 1 antistoff og PCNA (Proliferative Cell Nuclear Antigen) ble detektert med PC-10 monoklonalt antistoff.

Pasienter

Deltakere i studien var postmenopausal kvinner diagnostisert med østrogenreseptor positiv invasiv brystkreft, som bestemt ved Trucut biopsi. Kriteriet for inkludering inkluderte alder > 50 år, histologisk bekreftet Tl eller T2 østrogenreseptor-positiv primær brystkreft, og klar for kirurgi innen 1 måned fra biopsien. Pasienter med inflammatorisk cancer, kjent metastase eller lymfeknuteinvolvering, ble ekskludert sammen med pasienter med tidligere radioterapi eller kjemoterapi og pågående hormonerstatningsterapi (en minimum utvaskingsperiode på 8 dager ble observert førTrucut biopsien). Andre eksklusjonskriterier var en historie med tromboflebitis som krevde antikoagulantbehandling, retinopati, cutanøs allergi overfor alkohol eller brystdermatitis som kontraindikerer applikasjonen av en gel.

Pasienter ble randomisert til en av fem behandlingsgrupper: 0.5 mg/d 4-OHT (0.5 ml gel [0.25 mg 4-OHT] applisert på hvert bryst daglig); 1.0mg/d 4-OHT (1 ml gel [0.5 mg 4-OHT] applisert på hvert bryst daglig); 2.0 mg/d 4-OHT (2 ml gel [1.0 mg 4-OHT] applisert på hvert bryst daglig); oral tamoxifen (20 mg/d som en enkel dose) eller ingen behandling (ubehandlet kontroll). Pasienter ble satt opp for tumorfjerningskirurgi med kurerende hensikt mellom dag 15 og dag 22 etter starten av behandlingen. På dagen før kirurgi, ble en blodprøve også tatt for bestemmelse av 4-OHT-konsentrasjoner.

På dagen for kirurgi, ble pasienter på nytt vurdert for ledsagende terapi, ledsagende tilstander, hematolog, biokjemi, plasma 4-OHT, estron (El), og østradiol (E2) konsentrasjoner.

Tumorprøvetaking

En Tru-cut/kjerne biopsi tatt ved den første kliniske undersøkelsen for diagnostisk formål ble benyttet som en pre-randomiserings tumorprøve. En post-behandlingsprøve ble tatt ved den endelige kirurgiske fjerningen. Alle vevsprøvene ble fikset i 3,7 % formalin umiddelbart etter fjerning, så omsluttet i parafinvoks for seksjonering og påfølgende analyse av biologiske markører. Tumorekstrakter (før og etter behandling) ble også lagret i flytende nitrogen for påfølgende analyse av østrogen- og progesteronreseptorer, så vel som nivåer av 4-OHT.

Analyse av Tumormarkørekspresjon

Proliferasjonsassosiert antigenekspresjon. Ki67 og Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) merkingsindekser (LI) ble målt på parafinomsluttede seksjoner av pre- og post-behandlingsvevsprøvene. Ki67 antigenet ble målt ved bruk av det monoklonale antistoffet MIB1 (DAKO,Danmark) som benyttet under rutinebetingelser i patologien. Anti-PCNA (DAKO) fullførte panelet av antistoffer benyttet for å analysere proliferasjon i fikserte vev. Deteksjon ble gjort uten varmedenaturering. Seks serielle seksjoner ble analysert i hvert tilfelle for å standardisere prøvene. Analyser ble utført med et datamaskinassistert system (Systéme microphotométrique å balayage automatique ;Samba-Alcatel, Grenoble, France). For hvert preparat ble optisk densitets (OD) terskler bestemt ved bruk av ekte mikroskopiske bilder av det analyserte feltet som referanse. Målinger av immunofarging ble utført ved x 25. Tyve felt ble analysert for hver seksjon. Farget nukleær overflate ble bestemt (segmentering og terskeldannelse) og et Ll-skår (fargede celler / motfargede elementer) OS immunofarging ble uttrykt i tilfeldige enheter. Kontroll av immunofargings kvantitativ analyse og reproduserbarhet av prosedyren ble utført:- ved sammenligning med gjentagende målinger gjort på de samme preparatene, - ved sammenligning med målinger kompilert på seks sekvensielle seksjoner av den samme prøven. Evaluering av vevsvariasjoner av immunofargings kvantitativ analyse ble utført ved sammenligning av OD immunofargingsmålinger av 20 felt tatt fra ikke-konsekutive seksjoner fra hver prøve. Intensiteten av PCNA immunoreaktivitet vist ved aktivt prolifierende celler i lymfenoder (centroblaster) tjente som en referanse for terskler av positiv farging i brystvev. Resulter er uttrykt som LI.

Østrogen- og progesteronreseptorekspresjon. Østrogen- (ER) og progesteron- (PgR) reseptorkonsentrasjoner ble analysert i tumorvev før og etter behandlingmed enten ligand bindingsanalyse (LBA) ved bruk av den Dextran-Coated Charcoal metoden (Korenman, 1974) og/eller ved immunohistokjemisk (ICH) metode på paraffin- omsluttede seksjoner. Cut-off for ER positivitet var mer enn 10 fmol/mg målt ved bruk av radioimmunoanalyse eller mer enn 10% av tumorceller merket med en immunoenzymatisk analyse (Bevitt, 1997).

4-OHT analyse. Konsentrasjoner av 4-OHT i plasma, tumorvev, og normalvev ble utført ved bruk av gasskromatografi (GC) kombinert med massespektrometri (MS) benyttet i den negative ionkjemiske ioniseringsmodus ("Negative lon Chemical lonization-mode") (NICI) (Girault, 1993). Kvantifiseringsgrensene for metoden var 5pg/ml for henholdsvis plasma- og 50pg/g for vevsprøvene. Tumorekstrakter og normalt brystvev fremskaffet ved tid for kirurgi (etter behandling) ble lagret i flytende nitrogen inntil påfølgende analyse av 4-OHT.

Statistisk analyse

Basert på den planlagte prøvestørrelsen på 14 pasienter i kontrollgruppen og 42 pasienter (3 grupper) tildelt 4-ORT gel, hadde studien god kraft (90%) for å detektere en hypotetisk 50 % større relativ reduksjon i Ki-67 merkingsindeks i 4-OHT gruppen enn i gruppen uten behandling ved bruk av en tosidig test med 5% type I feil. Det primære effektivitetsendepunktet var endring i ekspresjon av tumorproliferasjonmarkør. Andre studievariable var ansett å være sekundær endepunkt. Denne "per protokoN"-analysen inkluderte kun de som mottok minst 13 dager behandling, fullført ved slutten av behandlingsanalysen for det primære endepunktet, og hadde ingen signifikante protokollavvik eller — brudd.

Behandlingsgruppesammenligninger ble gjort ved bruk av variansanalyse (ANOVA).

Kruskal-Wallis-testen ble benyttet i tilfeller hvor distribusjonen av data var ikke-symmetrisk/ikke-normalt. Kategoriske variabler ble analysert ved bruk av Fisher's eksakt-test.

Hypotesetesting ble utført ved a=0. 05 signifikansnivået justert for multiple sammenligninger. Slutninger falt i de to følgende kategorier for de målte variablene- testing for forskjeller blant de fem behandlingsgruppene ;-undersøkelse av forskjeller blant de tre dosenivåene av 4-OHT;-undersøkelse av forskjeller mellom hvert dosenivå av 4- OHT og oral tamoxifen.

Resultater

Patientkarakteristikker. Totalt 55 pasienter ble registrert i testen. Seks pasienter ble ekskludert fra analysen: en (i 4-OHT 1.0 mg/d gruppen) trakk tilbake sitt samtykke, en (0.5mg/d) ble tapt for oppfølging, en (2.0 mg/d) var østrogenreseptor negativ ved starten av studien, en (0.5mg/d) mottok hormonerstatningsterapi, og to (0.5 og 1.0 mg/d) avbrøt sin behandling etter kun 6 og 12 dager.

Derfor var totalt 49 pasienter evaluerbare for effektivitet. Grupper ble godt balansert med hensyn på tumorstørrelse, varighet av amenorrhea, og tumorgrad ved kirurgi. Pasienter i den ubehandlede kontrollgruppen var eldre enn de i de aktive behandlingsgruppene (Tabell 7).

Proliferasjons-assosiert antigen ekspresjon. Etter justering for baselinjenivåer, varierte tumorvev Ki-67 Lis etter behandling signifikant blant de fem gruppene (Tabell 8). Behandlede pasienter (4-OHT [alle doser] og oral tamoxifen) hadde signifikant lavere gjennomsnittlige Ki-67 LI skår sammenlignet med de ubehandlede gruppene (P=0. 0054). Gjennomsnittlig Ki-67 LI skår etter behandling var dose-avhengig for 4-OHT behandlingsgruppene. Videre, blir en doserespons sammenheng med omtrent ekvivalens mellom 4-OHT 2.0 mg/d gruppen og den orale tamoxifengruppen demonstrert i Tabell 9A som viser prosentdelen av pasienter som hadde avtatt i Ki-67 LI med >1, >2 eller >3 vilkårlige enheter (%). Der er ingen signifikante forskjeller i Ki-67 merking mellom tamoxifen og noen doser av4-OH. Tumorvev responser for de forskjellige behandlingene målt ved PCNA LI tilsvarte de målt ved Ki-67 LI (Tabell 8, 9B). Etter behandling, skilte tumorvev PCNA LI for de fire behandlede gruppene seg signifikant, fra den ubehandlede kontrollen (P=0.002). Som det kan sees med Ki-67 Us, viste prosentdelen av pasienter som hadde avtatt i PCNA indeks på, eller enheter (%) en sterk behandlingseffekt av 4-OHT spesielt for 4-OHT 1 og 2mg/d gruppene, i forhold til ubehandlede kontroller og viste omkring ekvivalens med oral tamoxifen (Tabell 9B).

Der var ingen signifikante forskjeller i PCNA merking mellom tamoxifen og noen dose av 4-OHT. Respons definert som en tumor med en PCNA LI eller Ki-67 LI reduksjon på 3 vilkårlige enheter, demonstrerte en tendens til å øke med 4-OHT dosering. Imidlertid var prøvestørrelsen ikke tilstrekkelig til å demonstrere signifikansen for sammenhengen.

ER ekspresjon. Ved bruk av RIA, var prebehandlings ER-konsentrasjoner statistisk tilsvarende over gruppene hvor de gjennomsnittlige verdiene varierte fra 5 til 56fmol/mg. Individuelle verdier viste et vidt område (9 opp til 321 fmol/mg). Behandling av ER-positive tumorer med tamoxifen eller 4-OHT resulterte i en signifikant reduksjon (P=0. 012) i ER-konsentrasjon i forhold til den ubehandlede kontrollgruppen. Ved bruk av ICH, viste ER-konsentrasjon (% av merkede celler) de samme gjennomsnittsverdier ved basislinjen (70 til 85 %) over gruppene og viste ingen statistisk signifikant økende trend etter behandling i alle grupper.

PgR ekspresjon. RIA målinger av PgR var sprett vidt ved basislinjen og økte etter behandling i alle grupper, uten noen statistisk signifikans eller doserelatert mønster. PgR resultater med ICH målinger indikerte ikke noen konsistent effekt av behandling eller dose-relaterte endringer.

4-OHT vevs- og plasmakonsentrasjoner (Tabell 10, Figur 3). 4-OHT median konsentrasjon var omkring 2 ganger høyere enn i den orale tamoxifengruppen (4237 pg/g) sammenlignet med den i 2.0 mg/d 4-OHT gruppen (1698 pg/g). Trass i en økning av median vevs 4-OHT konsentrasjoner (pg/g) ifølge de leverte perkutane dosene (687,1377 og 1698 pg/g for henholdsvis 0.5,1 og 2mg/d), var forskjellen mellom de

tre gruppene ikke statistisk signifikant (P=0.13). Nontumoral vev 4-OHT konsentrasjon var omkring halvparten av de i tumorvev i alle bortsett fra 0,5 mg/d gruppen. For 4-OHT median plasmakonsentrasjon, var der en signifikant forskjell mellom de 4 behandlingsgruppene (P=0.0015) med et høyere nivå for den orale tamoxifen-gruppen versus 4-OHT gel-gruppene (1495 pg/ml versus 31,35 henholdsvis 164pg/ml). Videre var der en signifikant (P=0. 035) økning av plasma 4 OHT med økende 4-OHT perkutan dose.

Siterte publikasjoner

Barrat, J., B. de Lignines, L. Marpeau, L. Larue, S. Fournier, K. Nahoul, G. Linares, H.

Giorgi, og G. Contesso, Effet in vivo de l'administrasjon locale de progesterone sur l'activitymitotique des galactophores humains, J.Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. 19 : 269-274 (1990) (Fransk).

Bevitt D, Milton ID, Piggot N, Henry L, Carter MJ, Toms GL, et al. New monoclonal antibodies to estrogen og progesterone receptors effective for paraffin section immunohistochemistry, J. Pathol., 183 :228-32

(1997).

Bronaugh og Maibach, Perkutan Absorption: Drugs Cosmetics Mechanisms Methodology, Marcel Dekker 1999.

Carthew, P., P. N. Lee, R. E Edwards, R. T. Heydon, B. M. Nolan, E. A. Martin, Cumulative exposure to tamoxifen : DNA adducts og liver cancer in the rat, Arch.

Toxicol., 75: 375-80 (2001).

Charlier, C., A. Chariot, N. Antoine, M. P. Merville, J. Gielen, V. Castronovo, Tamoxifen og its active metabolitt inhibit growth of estrogen receptor-negativeMDA-MB-435 cells, 49 (3):351-8 (1995).

Chetrite, G., C. Varin, L. Delalonde, J. R. Pasqualini, Effectof promegestone, tamoxifen,4-hydroksytamoxifen og ICT164, 384 on the oestrone sulphatase activity of human breast cancer cells, Anticancer Res., 13 (4) 931-4 (Jul-Aug. 1993).

Dietze, E. C, L. E. Caldwell, S. LGrupin, M. Mancini, og V. L. Seewald, Tamoxifen, but not 4-hydroksytamoxifen initiates apoptosis in p53 (-) normal human mammary epithelial cells by inducing mitochondrial depolarization, J. Biol. Chem., 276 (7): 5384-94 (Feb. 16, 2001).

Fentiman, I. S., Tamoxifen og mastalgia. An emerging indication, Drugs 32:477-80 (1986).

Fentiman, I. S., M.Caleffi, H. Hamed, andM. A. Chaudary, Dosage and duration of tamoxifen treatment for mastalgia : a controlled trial, British Journal of Kirurgi 75: 845- 46(1988).

Fentiman, I. S., M.Caleffi, H. Hamed, og M. A. Chaudary, Studies of tamoxifen in kvinner with mastalgia, British Journal of Clinical Practice, Supplement 68,43(11): 34- 36 (1989)) Fischer,W., K.KIokkers, A.Sendl-Lang,Transdermal system in the form of a patch comprising a tamoxifen derivative, U. S. Patent 5,904, 930.

Gerdes, J., H. Lenke, Baisch, H. H. Wacker, U. Schwab, H. Stein, Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67, J. Immunology, 133:1710-15(1984).

Giambiagi, N. og J.R.Pasqualini, Immunological differences between the estradiol-, tamoxifen og 4-hydroksy-tamoxifen estrogen receptor complexes detected by two monoclonal antibodies, J. Steroid Biochem., 30 (l-6):213-7 (1988).

Girault J, Istin B, Fourtillan J. B. Quantitative measurement of 4-Hydroksy Tamoxifen in human plasma og mammary tumours by combined Gas Chromatography/Negative Chemical lonization Mass Spectrometry, Biol. Mass. Spectrom., 22: 395-402 (1993).

Gura, T, Systems for identifying new drugs are often faulty, Science, 278:1041-42 (1997).

IBIS Investigators, First results from the International Brystkreft Intervention Study (IBIS-1): a randomised prevention trial, Lancet, 360 (9336): 817-24 (2002).

Jordan, V. C., Metabolittes of tamoxifen in animals og man: identification, pharmacology, og significance, Brystkreft Res. Treat., 2 (2) 123-38(1982).

Korenman SG, Stevens RH, Carpenter LA, Robb M, Niswender GD, Sherman BM.

Estradiol radioimmunoassay without chromatography: procedure, validation og normal values, J. Clin.Endocrinol Metab., 38: 718-20 (1974).

Kuiper, G.G. J. M., B. Carlsson, K. Grandien, E.Enmark, J.Heggblad, S. Nilsson, J. Gustafsson, Comparison of the ligand binding specificity og transcript tissue distribution of estrogen receptors a and ,Endocrinology,138:863-870 (1997).

Kuttenn, F. og P. Mauvais-Jarvis, Intratumoral levels og metabolismof 4- hydroksytamoxifen after percutaneous administration at the breast level, C. R. Acad. Sei. III. 300:457-462(1985) (Fransk).

Malet C, A. Gompel, P. Spritze, NBricourt, NH Yaneva, I. Mowszowicz, F. Kutten og P MauvaisJarvis, Tamoxifen og hydroksytamoxifen isomers versus estradiol effects on normal human breast cells in culture, Cancer Research, 48 :7193-7199(1988).

Malet, C., P. Spritzer, CCumins, D. Guillaumin, P.Mauvais-Jarvis, F. Kuttenn, Effect of 4-hydroksytamoxifen isomers on growth og ultrastructural aspects of normal human breast epithelial (HBE) cells in culture, J. SteroidBiochem. & Mol.Bio., 82 : 289-96 (2002).

Mauvais-Jarvis, P., N. Baudot, D. Castaigne, P. Banzet, og F. Kuttenn, Trans-4-hydroksytamoxifen konsentrasjon og metabolism after local percutaneous administration to human breast, Cancer Research, 46:1521-1525 (1986).

Murphy, C. S., S. M. Langan-Fahey, R. McCague, og V. C. Jordan, Structure-function relationships of hydroksylated metabolittes of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro, Mol.Pharmac.38 :737-743 (1990).

Nemani M, Linares-Cruz G, Bruzzoni-Giovanelli H, Roperch JP, TuynderM,Bougueleret L, et al. Activation of the human homologue of the Drosophila sina gene in apoptosis og tumor suppression, Proe. Nati.

Acad. Sei., 93: 9039-42 (1996).

Nomura, Y., H. Tashiro, F.Takaeko, Effects of antiestrogens og medroxyprogesterone acetate on the clonogenic growth of tamoxifen-sensitive og resistant human breast cancer cells, Jpn. J. Cancer Chemotherapy, 12 (4): 844-50(1985).

Pujol, H., J. Girault, P. Rouanet, S. Fournier, J. Grenier, J. Simony, J. B. Fourtillan, og J. L. Pujol, Phase 1 study of percutaneous 4-hydroksy-tamoxifen with analysesof 4- hydroksy-tamoxifen konsentrationsr in breast og normal breast tissue, CancerChemother. Pharmacol., 36:493-498 (1995).

Remington: The Science og Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins, 2000, pp.836-858.

Robertson og Katzenellenbogen, J. Org. Chem., 47: 2387 (1982).

Robertson, D. W., J. A. Katzenellenbogen, D. J. Long, E. A. Rorke og B. S.

Katzenellenbogen, Tamoxifen antiestrogens. A comparison of the activity, pharmacokinetics, og metabolic activation of the cis og trans isomers of tamoxifen, J.

SteroidBiochemistry, 16 (1): 1-13(1982).

Sauvez,F., D. Salin-Drouin, M. Attia, H.Bertheux, og R.Forster, Cutaneously applied 4-hydroksytamoxien is not carcinogenic in female rats. Carcinogenesis, 20: 843-50 (1999).

Schluter, C., M. Duchrow, C. Wohlensberg, MHG Becker, G. Key, H. D. Flag, The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67 : a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements representing a new kind of cell maintaining proteins, Cell Biology, 123: 513-22 (1993).

Waseem, N. H., D. P. Lane, Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structural conservation og the detection of the nucleolar form, J. Cell. Sei., 96:121-9 (1990).

Wijayaratne, A. L., S. C. Nagel, L. A. Paige, D. J. Christensen, J. D. Norris, D. M. Fowlkes, og D. P. McDonnell, Comparative Analyses of Mechanistic Difference among Antiestrogens, Endocrinology, 140 (12):5828-5840 (1999).

Claims (21)

1. Anvendelse av 4-hydroksy tamoxifen for fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forhindring av brystkreft, hvori nevnte medikament er i form at en passende for perkutan administrasjon og 4-hydroksy tamoxifen er i en bærer inneholdende en penetreringsforsterker valgt blant isopropylmyristat..

2. En anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte medikament inneholder en mengde av 4-hydroksy tamoxifen slik at omkring 0,25 til 2.0 mg/bryst, foretrukket omkring 0,5 til 1,0 mg/bryst av nevnte 4-hydroksy tamoxifen kan bli administrert til en pasient per dag.

3. En anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte medikament inneholder en mengde av 4-hydroksy tamoxifen slik at omkring 0.25 mg/bryst, foretrukket omkring 0.5mg/bryst, mer foretrukket omkring 0.75 mg/bryst, enda mer foretrukket omkring 1.0 mg/bryst, av nevnte 4-hydroksy tamoxifen kan bli administrert per dag.

4. En anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor nevnte 4-hydroksy tamoxifen er formulert i en alkoholisk oppløsning.

5. En anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor nevnte 4-hydroksy tamoxifen er formulert i en hydroalkoholiskgel.

6. En anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte hydroalkoholiske gel omfatter etylalkohol, og hydroksypropylcellu lose.

7. En anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor nevnte brystkreft er østrogenreseptor-positiv.

8. En farmasøytisk sammensetning for perkutan administrasjon omfattende 4- hydroksy tamoxifen og minst isopropylmyristat som en penetreringsforsterker.

9. En farmasøytisk sammensetning ifølge krav 8, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er i form valgt blant gruppen omfattende en hydroalkoholisk gel, en hydroalkoholisk oppløsning, et plaster, en salve, en krem, en emulsjon, en lotion, et pulver eller en olje.

10. En farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 8 og 9, hvor den farmasøytiske sammensetningen er en hydroalkoholisk sammensetning inneholdende isopropylmyristat som penetreringsforsterkeren, en vandig bærer, en alkoholisk bærer og et gellingsmiddel.

11. En farmasøytisk sammensetning ifølge krav 10, hvor den farmasøytiske sammensetningen videre omfatter et nøytraliseringsmiddel.

12. En farmasøytisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 11, hvor penetreringsforsterkeren ytterligere omfatter minst en fettsyreester.

13. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 13 , hvor nevnt farmasøytiske sammensetning omfatter: a) 0,001 til 1,0 vekt % av 4-hydroksy tamoxifen, b) 0,1 til 5 vekt % isopropylmyristat, c) 54 til 85 vekt % alkohol, d) 15 til 45 vekt % vandig bærer, e) 0,1 % til 20 vekt % gellingsmiddel, hvor prosentdelen av komponentene er vekt til vekt av sammensetningen.

14. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 13 , hvor nevnt farmasøytiske sammensetning omfatter: a) omkring 0,01 til 0,1 vekt % av 4-hydroksy tamoxifen, b) omkring 0,5 til 2 vekt % isopropylmyristat, c) omkring 65 til 75vekt % alkohol, d) omkring 25 til 35vekt % vandig bærer, e) omkring 0,5 til 5 vekt % gellingsmiddel, hvor prosentdelen av komponentene er vekt til vekt av sammensetningen.

15. En sammensetning ifølge krav 14, hvor 4-hydroksy tamoxifen utgjør omkring 0,01, 0,02,0,03, 0,04,0,05, 0,06, 0,07, 0,08,0,09, eller 0,10vekt % av sammensetningen.

16. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 14 og 15, hvor isopropylmyristatet utgjør omkring 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,1,0,1,1,1,2,

1,3,1,4,1,5,1,6,1,7,1,8,1,9 eller 2,0 vekt % av sammensetningen.

17. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 16, hvor alkoholen er etanol eller isopropanol, og utgjør omkring 60 til 75 vekt % av sammensetningen.

18. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 17 til 17, hvor den vandige bæreren er en fosfatbufret oppløsning, og utgjør omkring 25 til 35 vekt % av sammensetningen.

19. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av 14 til 18, hvor gellingsmiddelet er en polyacrylsyre, hydroksypropylcellulose eller annet cellulosederivat, og utgjør omkring 0,1 til 5 vekt % av sammensetningen.

20. En sammensetning ifølge krav 19, som ytterligere omfatter et nøytraliseringsmiddel valgt blant gruppen omfattende natriumhydroksid, ammoniumhydroksid, kaliumhydroksid, arginin, aminometylpropanol og trometamin, hvor nevnte nøytraliseringsmiddel er i et forhold med hensyn på gellingsmiddelet på mellom 10:1 og 0,1:1, foretrukket mellom 7:1 og 0,5 :1, enda mer foretrukket mellom 4:1 og 1:1.

21. En sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 20, som er pakket i en enhetsdosepakke eller i en multidosebeholder med en målepumpe.