NO329086B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat Download PDFInfo
- Publication number
- NO329086B1 NO329086B1 NO20015263A NO20015263A NO329086B1 NO 329086 B1 NO329086 B1 NO 329086B1 NO 20015263 A NO20015263 A NO 20015263A NO 20015263 A NO20015263 A NO 20015263A NO 329086 B1 NO329086 B1 NO 329086B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- substrate
- lipase
- determining
- nag
- hsl
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 title claims description 30
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 title claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims description 71
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims description 71
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 40
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 39
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 39
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 38
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 37
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 29
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 29
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 29
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 23
- -1 2,3-dihydroxypropyl 12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ylamino)-dodecanoic acid Chemical group 0.000 claims description 20
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 12
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 10
- 229940127470 Lipase Inhibitors Drugs 0.000 claims description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- PBLZLIFKVPJDCO-UHFFFAOYSA-N 12-aminododecanoic acid Chemical compound NCCCCCCCCCCCC(O)=O PBLZLIFKVPJDCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N Glycidol Chemical compound OCC1CO1 CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 7
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 7
- 229940086609 Lipase inhibitor Drugs 0.000 claims description 6
- IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-7-nitrobenzofurazan Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C2=NON=C12 IGHBXJSNZCFXNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 5
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 37
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- OJCRFSKMCMHIIO-UHFFFAOYSA-N 12-[(7-nitro-1,2,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=C1N=NO2 OJCRFSKMCMHIIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- RFPAAOVXVKCTEW-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl 12-[(7-nitro-1,2,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoate Chemical compound OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=C1N=NO2 RFPAAOVXVKCTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenyl butyrate Chemical compound CCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 9
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 9
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 7
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N Trioleoylglycerol Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 5
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- RNKNXWGHSDNVDS-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(hexanoyloxy)propyl 12-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]dodecanoate Chemical compound CCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 RNKNXWGHSDNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 4
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 4
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 4
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- OHGNFGZLMISVNC-UHFFFAOYSA-N [2-acetyloxy-3-[12-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]dodecanoyloxy]propyl] hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(C)=O)COC(=O)CCCCCCCCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C2=NON=C12 OHGNFGZLMISVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 4
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 4
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- XXJGBENTLXFVFI-UHFFFAOYSA-N 1-amino-methylene Chemical compound N[CH2] XXJGBENTLXFVFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 3
- YKLNKWAYYXTYBM-UHFFFAOYSA-N C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)OCC(COC(CCCCCCCCCCCNC1=CC=C(C=2C1=NON2)[N+](=O)[O-])=O)O Chemical compound C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)OCC(COC(CCCCCCCCCCCNC1=CC=C(C=2C1=NON2)[N+](=O)[O-])=O)O YKLNKWAYYXTYBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100421709 Schistosoma mansoni SM21.7 gene Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 3
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 102100036597 Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein Human genes 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000019267 Hepatic lipases Human genes 0.000 description 2
- 108050006747 Hepatic lipases Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710161551 Pectate lyase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100037883 Phospholipase B1, membrane-associated Human genes 0.000 description 2
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 2
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 2
- 101710179609 Probable pectin lyase C Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 125000000654 isopropylidene group Chemical group C(C)(C)=* 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010030416 proteoliposomes Proteins 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKFUXPVYODLUCH-IUPFWZBJSA-N (z)-2,3-bis[(z)-octadec-9-enyl]henicos-12-ene-1,2,3-triol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCC(O)(CO)C(O)(CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC VKFUXPVYODLUCH-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 1
- FDCJDKXCCYFOCV-UHFFFAOYSA-N 1-hexadecoxyhexadecane Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCCCCCC FDCJDKXCCYFOCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102100030643 Hydroxycarboxylic acid receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710125793 Hydroxycarboxylic acid receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000005398 Monoacylglycerol Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108020002334 Monoacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- RNVYQYLELCKWAN-RXMQYKEDSA-N [(4r)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl]methanol Chemical compound CC1(C)OC[C@@H](CO)O1 RNVYQYLELCKWAN-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- HYTACLVSJIFYBY-UHFFFAOYSA-N azane;dichloromethane;methanol Chemical compound N.OC.ClCCl HYTACLVSJIFYBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGNOYUCUPMACDT-UHFFFAOYSA-N dimethylsulfamic acid Chemical compound CN(C)S(O)(=O)=O YGNOYUCUPMACDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002305 glucosylceramides Chemical class 0.000 description 1
- PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N hexanoyl hexanoate Chemical compound CCCCCC(=O)OC(=O)CCCCC PKHMTIRCAFTBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003703 image analysis method Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N methoxide Chemical compound [O-]C NBTOZLQBSIZIKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000005830 nonesterified fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003322 phosphorimaging Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N potassium methoxide Chemical compound [K+].[O-]C BDAWXSQJJCIFIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 108700022737 rat Fat1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer samt substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmåte. Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåter for identifisering av lipaser og lipasehemmere; fremgangsmåter for bestemmelse av aktiviteten av lipaser/lipasehemmere; fremgangsmåter for bestemmelse av en detergentvirkning eller cytotoksisitet av forbindelser og fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipidtransportere. Analysesystem for identifisering av en lipase/en lipasehemmer eller for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer er og en del av foreliggende oppfinnelse.
Lipaser, fosfolipaser og andre lipolytiske enzymer har stor betydning innen det bioteknologiske og medisinske området. Ved visse stoffskiftesykdommer kan forhøyet lipaseaktivitet i fettvev påvises, som delvis kan forklare patogenesen av denne sykdommen. Den største del av energireservene i kroppen er lagret i fettcellene som fettsyrer i triglycerider. De vesentlige ved insulin bevirkede anabolske prosesser omfatter stimulering av opptak av substrater for triglyceridsyntesen og forhøyelse av lipogenesen. En ytterligere viktig ved insulin fremkalt prosess er hemmingen av lipolysen, som foregår ved hjelp av de katabolske hormoner, i første linje katekolamin, som stimulerer hydrolysen av triglycerider og derved frigivelsen av fettsyrer. Et vesentlig problem knyttet til ikke-insulin-avhengig Diabetes Mellitus (NIDDM) er forårsaket av ikke-inhibert lipolyse i fettceller, som fører til forhøyede ikke-forestrede fettsyrer i plasma. Etter nåværende oppfatning stimulerer fettsyrene glukoneogenesen i leveren og reduserer glykoseutnyttelsen i skjelettmuskelene gjennom ennå lite karakteriserte molekylære mekanismer. Faktisk har det vært mulig å påvise at undertrykkelse av lipolyse i fettceller, ved hjelp av inhibitorer av lipolysen, slik som agonister av nikotinsyrereseptoren i fettcellene, senker både fettsyrekonsentrasjonen i plasma og gir et forhøyet blodsukkernivå i diabetiske dyr og pasienter. Dessverre er disse gunstige virkninger ikke særlig sterkt utrykt og har forholdsvis kort varighet. Dette kan bero på fysiologisk motregulering, fremkalt ved inngrep i reguleringsmekanismen for det hastighetsbestemmende enzym for lipolysen, den hormonsensitive lipase (HSL). Det forefinnes gode grunner til å anta at hemming av den lipolytiske reaksjonen vil føre til en forbedret terapi av nevnte NIDDM, i det minste med hensyn på undertrykkingen av fettsyrefirgivelsen fra fettcellene. Den direkte hemming av HSL ved hjelp av egnede inhibitorer skulle derved omgå de åpenbare vanskeligheter med et inngrep i den komplekse regulering av HSL.
Aktiviteten av lipolytiske enzymer undersøkes tradisjonelt med radiometriske, titrimetriske, enzymatiske eller fluorimetriske/fotometriske metoder. Radiometriske analyser er de mest følsomme, men de krever dyre radiomerkede substrater, er diskontinuerlige og forutsetter fraskillingen av det radiomerkede substrat fra det radiomerkede produkt. Slike separasjoner er ofte omstendelige og unngåelse/redusering av radioaktivt avfall er av økende betydning (relevant fremfor alt ved et stort antall tester). Titrimetriske tester er kontinuerlige og kan gjennomføres både med naturlige så vel som også med syntetiske substrater, men de lider imidlertid hyppig av en ganske lav sensitivitet og er ikke motstandsdyktig overfor betingelser som påvirker mengden av frigitte protoner.
Enzymatiske eller kromatografiske metoder for påvisning av et av produktene fra den lipolytiske reaksjon (for eksempel glycerol) er meget ømfintlige og relativt robuste, men også omstendelige ved gjennomføringen, da de før den egentlige enzymatiske/kromatografiske påvisning forutsetter opparbeidelse av inkubasjonsblandingen for lipasereaksjonen. Tilkoblingen til en enzymtest tillater bare endepunktmålinger ("time-stop" måling). Videre kan det ved undersøkelse av ukjente substanser (for eksempel leting etter potensielle inhibitorer) i prinsippet ikke utelates en virkning på enzymene for påvisningsreaksjonen, og det kreves derfor tilsvarende kontroller. Disse betraktninger har gitt motivasjon for utvikling av fluorimetriske/fotometriske metoder. Disse oppnår i prinsippet den samme sensitivitet som radiometriske metoder, men krever imidlertid anvendelse av syntetiske substrater eller prober som er modifisert med fluoroforer eller kromoforer. Tradisjonelle fluorometriske/fotometriske metoder forløper i likhet med de radiometriske prosedyrer diskontinuerlig og betinger fraskilling av substratet fra produkter. I nyere tid ble det utviklet kontinuerlige fluorimetriske/fotometriske analyser (S. Hendrickson, Analyt. Biochem 219 (1994) 1-8), basert på en forskyvning av fluorescens- henholdsvis ekstinksjonsmaksimum av produktet i sammenligning med substrat. Imidlertid begrenser alle disse metoder seg til påvisning av fosfolipase, lipoproteinlipase, kolesterinesterase, spingomyelinase og glukosyl-ceramidglukosidase. Substrater med fluorofor/kromofor grupper, egnet for kontinuerlige aktivitetsmåling av triglyceridspaltende enzymer (for eksempel hormonsensitiv lipase, monoglyceirdlipase, diglyceirdlipase, triglyceirdlipase, lipoproteinlipase, pankreatis lipase, hepatisk lipase, bakteriell lipase, PLA2, PLC, kolesterinesterase) er tidligere ikke kjent.
Chemistry and Physics of Lipids, 1991, vol. 60, side 83-91 omtaler en fremgangsmåte for å fremstille fluorescerende analoger av CDP-diacylglyserol og fosfatidylinositol. Nevnte analoger kan anvendes for å studere metabolisme og intracellulær trnasport av disse lipidene. Videre ble det vist at nevnte fosfatidylinositolanalog ble hydrolysert av fosfolipasen.
EP0253271 omtaler en fremgangmåte for å overvåke føtal lungemodning som involverer bestemmelse av forholdet mellom surfaktant og albumin. Nevnte forhold mellom surfaktant og albumin bestemmes ved å måle fluorescens polarisering av NBD-merket fosfatidylcholin og sammenlikne denne med en standardkurve.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, kjennetegnet ved at
a) en fettsyre forsynt med en fluorescensmarkør omsettes med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base for å gi et monoacylglycerid; b) dette monoacylglycerid underkastes en ultralydbehandling med fosfolipider i forholdet 1:10 til 10:1 mg/ml hvorfra substratet, som kan gjenkjennes ved et
fargeomslag fra gult til rødt, dannes.
En fluorescensmerking defineres som en kjemisk gruppe innenfor et molekyl som selv er i stand til lysemisjon ved lysaktivering. Slike grupper anvendes her for å fremstille substanser som selv i de minste konsentrasjoner på ca. 1 nM ennå kan påvises. For eksempel skal nevnes N,N-dimetylaminosulfonsyre (Dansyl) eller NBD, foretrukket
NBD.
Med en fettsyre forstår man for eksempel en langkjedet karboksylsyre, mettet eller umettet, med en kjedelengde fra C-8 til C-20, foretrukket C-12, C-14, C-16 og C-18, mettet eller umettet, særlig foretrukket er mettet C-12.
En fettsyre forsynt med en fluorescensmerking ble koblet med 2,3-epoksypropanol til et monoacylglycerid. Fra dette syntetiske substrat og fosfolipider, som for eksempel fosfatidylinositol og fosfatidylcholin alene eller felles, eventuelt i et vektforhold fra 10:1 til 1:10, foretrukket fra 3:1 til 1:3, særlig foretrukket 2:1, ble det ved ultralydbehandling som varte for eksempel i omtrent 1 til 10 minutter, foretrukket 1 til 6 minutter, særlig foretrukket 4 minutter, dannet miceller eller vesikler, som tjener som substrat for den lipase som skal undersøkes. Denne innbygning i miceller eller vesikler er forbundet med et fargeomslag fra gult til rødt, beroende på et ladningsoverføringskompleks av de i denne struktur romlig tett tilliggende aromater. Inkubasjon med lipase fører til avspalting av fettsyrene under frigivelse av merket fettsyre og glycerol.
Som fosfolipider løses for eksempel fosfatidylcholin (6 mg) og fosfatidylinositol (6 mg) i kloroform (hver 1 ml). For fremstilling av substratet sammenpipetteres to deler fosfatidylinositolløsning (for eksempel 83,5 ul) og en del fosfatidylcholinløsning (for eksempel 41,5 ul) og 100 ul NAG-løsning (10 mg i 1 ml kloroform) (sluttkonsentrasjon i test: 0,0375 mg fosfolipid/ml; 0,05 mg/NAG/ml). Etter fjernelse av kloroform tilsettes 20 ml 25 med mer Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl og to ultralydbehandlinger med en ultralydstav (Branson Sonifier Type II, standardmikrospiss, 25 W). 1. Behandling: Innstilling 2,2 x 1 min., derimellom for hvert 1 min. på is; 2. Behandling: Innstilling 4,2 x 1 min., derimellom for hvert 1 min. på is. Under denne prosedyren forandres fargen av substratløsningen fra gul (ekstinksjonsmaksimum 481 nm) til rød (ekstinksjonsmaksimum 550 nm) ved interinnføyning av NAG mellom fosfolipidmolekylene i vesiklene/micellene.
Den frie fettsyre danner ingen miceller eller vesikler. Derfor iakttar man ved avspaltingen av fettsyrene fra micellene/vesiklene et fargeomslag fra rødt til gult. Derved kan ødeleggelsen av micellene/vesiklene og dermed enzymaktiviteten av lipasen måles, enten visuelt (ved 481 nm, henholdsvis ved 550 nm), ved hjelp av fargeendringen fra rødt til gult ved hjelp av et kyvette-fotometer (for eksempel DU-640 fra firma Beckman (Munchen)) eller ved hjelp av et mikrotiterplateleseapparat (for eksempel "MicroPeta" fra firmaet Wallac (Turku, Finland) eller alternativt fluorimetrisk ved hjelp av et fosfoavbildingsapparat (for eksempel Storm 840 fra firmaet Molecular Dynamics (Krefeld)), en fluorescensscanner (for eksempel DA-2 fra firmaet Shimadzu (Osaka, Japan)) eller ved hjelp av en bildeanalysemetode (for eksempel ArrayScan fra firmaet Molecular Devices (USA)) som beror på et CCD-kamera (ladningskoblet apparat) som har en integrert koblingskrets for bearbeiding av elektriske og optiske signaler, hvor informasjonen lagres i form av elektriske ladninger og transmitteres.
Alle disse metoder foretrekkes i forbindelse med en høykapasitetsscreening (HTS). Videre metoder som beror på dette konsept, er målingen av cytotoksisiteten av forbindelser og virkningen av detergenter.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et substrat, kjennetegnet ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Nevnte substrat kan anvendes i en fremgangsmåte for identifisering av strukturer som begunstiger anordningen (arrangeringen) av aromater til
ladningsoverføirngskomplekser, foretrukket for identifisering av fosfolipid/lipidstrukturer, særlig foretrukket lipase/lipasehemmere.
Fremgangsmåten kan også anvendes for nedbryting av mono- eller tolags strukturer, enten krumme (for eksempel miceller eller vesikler) eller plane (for eksempel kunstig fremstilt plane tolags) som er fulgt av en fargeendring. Denne fargeendring kan følges målbart visuelt/optisk henholdsvis fluorimetrisk, som beskrevet i det foregående.
Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av monoacylglyceridet 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylester, idet 12-aminolaurinsyre først omsettes med 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol og deretter omsettes det erholdte mellomprodukt med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base, som alkalimetallkarbonat og alkalimetall-Ci-C4-alkanolat, foretrukket metanolat, som natriummetanolat eller kaliummetanolat, så vel som selve monoacylglyceridet 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylesteren.
Den oppgave som ligger til grunn for oppfinnelsen løses ved hjelp av en fremgangsmåte for identifisering av lipase/lipasehemmere, hvis tilstedeværelse fremkaller en fargeendring, karakterisert ved at
a) et substrat som beskrevet i det foregående ferdigstilles,
b) dette substrat inkuberes med en lipase (som for eksempel en hormon-sensitiv lipase, monoglyceirdlipase, diglyceirdlipase, triglyceirdlipase, lipoproteinlipase,
pankreatisk lipase, hepatisk lipase, bakteriell lipase, PLA2, PLC, kolesterinesterase, foretrukket en hormonsensitiv lipase og en kankreatisk lipase, særlig foretrukket en hormon-sensitiv lipase), og
c) fargeendringen bestemmes for eksempel visuelt/optisk eller fluorimetrisk.
Med et hormonsensitivt enzym forstår man et enzym som i sin aktivitet påvirkes av
fosforylering avhengig av sekundære signalstoffer (for eksempel cAMP) eller gjennom andre allosteriske mekanismer (for eksempel protein-protein vekselvirkning) som står under hormonkontroll. Hormoner som regulerer c-AMP-speilet er for eksempel adrenalin, noradrenalin, glukagon og insulin.
Lipidtransportører er proteiner som gjenkjenner lipider og ikke som lipider spalter disse, men i stedet transporterer disse gjennom biologiske membraner. Under lipaser skal det her forstås biologisk relevante kroppsegne lipaser, som definert for eksempel i R.D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998) 1694-1720.
Gjenstand for oppfinnelsen er likeledes en fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipase/lipasehemmere, idet et substrat som beskrevet i det foregående ferdigstilles, dette substrat inkuberes med en lipase og hastigheten for fargeendringen fra rødt til gult eller omvendt, fra gult til rødt, bestemmes og aktiviteten undersøkes for eksempel ved hjelp av en absorpsjonsmåling med et fotometer eller en fluorescensmåling med et fluorimeter.
En typisk reaksjon gjennomføres for eksempel i 1,5 ml Eppendorfbeholder eller 96 brønners plater i 60 min. ved 30°C. 10 ul av en testsubstans (for eksempel inhibitorer av HSL) anordnes i analysebuffere (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) i nærvær av 16,6% DMSO. 180 ul av substratløsningen (20 ug/ml fosfatidylcholin, 10 ug/ml fosfatidylinositol, 50 ug/ml NAG i analysebuffer) tilsettes. Etter en forinkubasjon i 15 min. ved 30°C tilpipetteres 20 ul HSL i analysebuffer og ekstinksjonen ved 481 nm i et kyvettefotometer (0,5 ml kyvette) henholdsvis mikrotiterplate-leseapparat måles med en gang (se ovenfor). Etter en bestemt inkubasjonstid som er variabel og avhenger av den valgte enzymkonsentrasjonen og kan utgjøre mellom 2 og 240 minutter, her 60 min. inkubasjon ved 30°C, måles ekstinksjonen på nytt. Økningen av ekstinksjonen i det gule området, her ved 481 nm, er et mål på enzymaktiviteten.
Analysesystemer for identifisering av en lipasehemmer henholdsvis for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer hører likeledes til gjenstanden for oppfinnelsen. De inneholder et substrat som beskrevet i det foregående, en ultralydanordning og eventuelt en anordning for visuell/optisk og/eller fluorimetrisk bestemmelse av fargeendringen fra rødt til gult henholdsvis ved siden av et substrat som beskrevet i det foregående og en ultralydanordning, en anordning for bestemmelse av hastigheten av fargeendringen og en anordning for absorpsjons- eller fluorescensmåling.
Analysesystemet kan også foreligge i form av et sett idet analysen er en lipaseanalyse.
Settet inneholder et substrat som beskrevet i det foregående eventuelt i en analysebuffer og en beholder for gjennomføring av testen, som for eksempel en Eppendorfbeholder eller en mikrotiterplate, foretrukket en mikrotiterplate.
Ytterligere gjenstander for oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter for bestemmelse av molekylære transport-overføringssystemer, for måling av detergensvirkning av forbindelser eller for undersøkelse av cytotoksisiteten av forbindelser (medikamenter og lignende) inneholdende et substrat som beskrevet i det foregående og en fosfolipase, for eksempel fosfolipase A2 (fra slangegift) eller C (Bacillus cereus).
Med transportører/overføringsproteiner forstår man proteiner som selv kjenner sentrale næringsstoffer som kullhydrater, lipider og proteiner og transporterer disse gjennom biologiske membraner henholdsvis overfører disse fra en bestemt biologisk membran til en annen. Transportør/overføringsproteiner, for eksempel isolert fra rotteileum, rekonstitueres (proteoliposomer) funksjonelt i fosfolipidvesikler (liposomer) henholdsvis inkuberes som løselige polypeptider sammen med liposomer og tilføres så til en som ovenfor beskrevet blanding av fosfolipider og NBD-glycerid og behandles med ultralyd. Transportprosessen henholdsvis overføringsprosessen av NBD-glyceridet fra de NBD-glyceirdholdige miceller/vesikler i hulrommet av proteoliposomene ved hjelp av transportørene henholdsvis i membranen av liposomene ved hjelp av overføringsproteinene, fører til oppløsning/nedbrytning av micellestrukturen og kan igjen følges fotometrisk eller fluorimetrisk som beskrevet i det foregående.
Detergensvirkningen av kjemiske forbindelser beror på den direkte nedbrytning av micellene/vesiklene. Da også biologiske membraner er oppbygget på denne måte, er slike forbindelser for det meste cytotoksiske. En nedbrytning av micellene lar seg med den foreliggende fremgangsmåte lett påvise ved hjelp av den beskrevne fargeendring.
Synteser:
Noen NBD-merkede fettsyrer som også 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (1) kan riktignok fås i handelen, men de er dyre. Selv om de første forsøk ennå ble gjennomført med materiale som kunne fås i handelen, kunne forbindelse (1) oppnås i gode utbytter ved omsetning av 12-aminolaurinsyre med 4-klor-7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol i MeOH.
Liste over forbindelser 1-9:
1 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre
2 2,3-epoksypropanol
3 Ri = OH R2 = OH
4 Ri = OAc R2 = OAc
5 Ri = OOC(CH2)3CH3 R2 = OOC(CH2)3CH3
6 Ri = OOC(CH2)i4CH3 R2 = OH
7 Ri = OOC(CH2)i4CH3 R2 = OAc
8 Ri = 0(CH2)i7CH3 R2 = 0(CH2)i7CH3
9a Ri, R2 = isopropyliden
3a Ri, R2 = OH
9b Ri, R2 = isopropyliden
3b Ri, R2 = OH
Ved hjelp av nuleofil addisjon av (1) til 2,3-epoksypropanol (2) kunne monoacylglyceridet (3) erholdes i gode utbytter. Forbindelsen (3) ble deretter acylert for å komme frem til triglyceridene (4) og (5). Ved hjelp av forestring av (1) med palmitinsyre ble diacylglyceridet (6) oppnådd. Også denne forbindelse ble omsatt til det tilsvarende triacylglycerid (7). Den samme metode ble anvendt for å omsette glyceroldieteren (8) til pseudotriacylglyceridet (9) hvori to acylrester er erstattet med langkjedede etere.
Alle syntetiserte forbindelser viste seg som substrat for lipasene, foretrukket for HSL, men viste imidlertid betraktelige aktivitetsforskjeller. Som "beste" substrat for lipasene viste monoacylglyceridet (3) seg. Innføringen av ytterligere acylgrupper, som i forbindelsene (4), (5), (6) og (7), førte til en nedsettelse av aktiviteten.
Dette kan lett forklares med en konkurranse om avspaltingene av NBD-acylgruppen ved hjelp av de nyinnførte acylrester. For å undersøke denne tese, ble et pseudotriacylglycerid (9) syntetisert, hvori to acylgrupper er erstattet med heksadecyleterenheter. Disse kan ikke avspaltes av lipasene og skulle derfor ikke konkurrere med NBD-fettsyreesteren. I biologiske tester viste denne forbindelse seg riktignok som et substrat, men da med liten aktivitet. Det er klart at lipasene i tillegg til det katalytiske området har et utstrakt hydrofobt bindeområde tilgjengelig for de langkjedede etergrupper slik at tilleiringen av fettsyreenheten hindres.
Da monoacylglyceridet (3) viste seg som godt substrat for lipaser, ble det undersøkt om det foreligger en regioselektiv preferanse for posisjon 1 eller 3. For disse undersøkelser ble de enantiomere regioisomerer (3 a) og (3b) syntetisert.
Syntesen av enantiomerene (3a, b) utgår fra D- og L-l,2-0-isopropylidenglycerol som forestres under dicykloheksylkarbodiimidaktivering med den NBD-merkede fettsyre (1). Avspaltingen av beskyttelsesgruppen skjedde med 1 N metanolisk HC1. Begge forbindelsene viste den samme biologiske aktivitet slik at anvendelsen av den enantiomerrike forbindelse ikke tilsa noen fordel.
1. 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (1):
Til en løsning av 12 aminolaurinsyre (18 g, 83,7 mmol) i MeOH (300 ml) tilsettes under omrøring 30% natriummetanolatløsning (14,5 ml, 76 mmol). Etter 5 minutter blir reaksjonsblandingen klar og man tilsetter en løsning av 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol (15 g, 75 mmol) i MeOH (300 ml). Reaksjonsblandingen, som snart mørkfarges, omrøres i 181 ved 25°C. Deretter tilsettes 1 M metanolisk HC1 (100 ml, 100 mmol) og løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum. Resten opptas i MeOH, filtreres over kiselgel, filtratet inndampes til tørrhet og resten renses ved hjelp av flashkromatografi (1:1 toluen-EtOAc). Man erholder (1) som rødt faststoff (26,4 g, 93%);
RF: 0,16 (1:1 toluen-EtOAc).
<*>H-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,35 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 3,48 (dt, 2 H, CH2NH2), 2,36 (t, 2 H, CH2COOH), 1,9 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2). MS (ESI-MS) 379,2 (M + 1).
2. 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-
dihydroksypropylester (3): En oppløsning av forbindelsen (1) (12 g, 31,7 mmol) og 2,3-dpoksypropanol (50 ml) i isopropanol (50 ml) omrøres i 161 ved 50°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum, resten tørkes ved 0,01 torr og renses ved hjelp av flash-kromatografi (diisopropyleter, eter, EtOAc). Man erholder forbindelsen (3) som rød olje (10,3 g, 71,8%);
RF: 0,18 (1:1 toluen-EtOAc); RF: 0,5 (30:5:1 CH2Cl2-MeOH-NH3) som krystalliseres fra EtOAc-dietyleter.
<t>ø-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,35 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1 H, ArH), 4,19 (dd, 2H, H-l, H-l'), 3,94 (m, 1 H, H-2), 3,65 (dd, 2H, H-3, H-3'), 3,48 (dt, 2 H, CHzNHz), 2,35 (t, 2 H, CH2COOH), 1,8 (m, 2 H, CH2), 1,6 (m, 2 H, CH2), 1,27 -1,15 (m, 14 H, 7 CH2). MS (ESI-MS) 453,4 (M+l).
3. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(S)-2,2-
dimetyl[ 1,3]dioksolan-4-ylmetylester (9a): En oppløsning av forbindelse (1) (60 mg, 159 umol) i CH2CI2 (2 ml) tilsettes dicykloheksylkarbodiimid (160 mg, 770 umol) og omrøres i 30 min. ved 25°C. Deretter tilsettes en oppløsning av (R)-(2,2-dimetyl-[l,3]dioksolan-4-yl)-metanol (100 mg, 760 umol) og dimetylaminopyridin (94 mg, 770 umol) i CH2CI2 (2 ml) og reaksjonsoppløsningen omrøres videre i 41 ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (15:1 toluen-EtOAc). Forbindelsen (9a) erholdes som gul fluorescerende olje (46 mg, 58%).
RF 0,29 (4:1 toluen-EtOAc).
<J>H-NMR (CDCI3): 8 8,5 (d, 1 H, aromat.), 6,2 (m, 1 H, NH), 6,16 (d, 1 H, aromat.), 4,31 (m, 1 H,), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1 H), 3,48 (dt, 2 H, CH2NH2), 2,35 (t, 2 H, CO-Qfc), 2,0 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2), 1,42 (s, 3 H, CMe2), 1,37 (s, 3 H, CMe2). 4. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (R)-2,2-dimetyl-
[ 1,3]dioksolan-4-ylmetylester (9b): Forbindelse (9b) fremstilles som beskrevet for forbindelse (9a). Forbindelsen (9b) erholdes som fluorescerende olje (51,4 mg, 65%).
RF 0,29 (4:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (CDCI3): 8 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,2 (m, 1H, NH), 6,16 (d, 1 H, ArH), 4,31 (m, 1 H), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1H), 3,48 (dt, 2H, CH2NH2), 2,32 (t, 2H, CO-CH2), 2,0 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2), 1,42 (s, 3 H, CMe2), 1,37 (s, 3 H, CMe2).
5. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(S)-2,3-dihydroksypropylester (3 a) og 12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(R)-2,3-dihydroksypropylester (3b): Til en oppløsning av 13,9 mg (28,2 umol) av forbindelse (9a) henholdsvis 17,8 mg (36,1 umol) av forbindelse (9b) i 25 ml metanol tilsetter man metanolisk HC1 (1 M, 200 ul) og blandingen omrøres i 1,5 t ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (2:1,1:1 toluen-EtOAc). Man erholder fettsyreesteren (3a) og (3b) i et utbytte på 10,5 mg (82%) henholdsvis 9,3 mg (57%).
'H-NMR (CDCl3)-data og massespekteret er identiske med forbindelse (3).
6. Eddiksyre-2-acetoksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-
dodekanoyloksyj-propylester (4): Forbindelse (3) (12 mg, 26,5 umol) acetyleres i 2:1 pyridin/eddiksyreanhydrid (3ml). Etter 81 inndampes blandingen til tørrhet og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (1:2 toluen-EtOAc). Man erholder forbindelsen (4) som gul fluorescerende olje (13 mg, 91%).
RF 0,66 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,3 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 5,24 (m, 1H), 4,92 (m, 1H), 4,34 (m) 4,28,4,16, 3,48 (dt, 2H, CH2NH2), 2,32 (CH2COO), 2,1 (2 s, 6H, 2 OAc) 2,0 - 1,0 (m, 18 H, 9 CH2). MS (ESI-MS): 537,4 (M+l).
7. Heksansyre-2-heksanoyloksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-
ylamino)-dodekanoyloksy] -propylester (5): Til en løsning av forbindelse (2) (5 mg, 11 umol) i pyridin (300 ul) tilsettes heksansyreanhydrid (100 ul) og reaksjonsblandingen får stå i 161 ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Forbindelse (5) erholdes som gul fluorescerende olje (1,8 mg, 25%).
RF: 0,73 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 8 8,5 (d, 1H ArH), 6,25 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 5,26 (m, 1H, H-2), 4,29 (dd, 2H, H-3, H-3'), 4,15 (dd, 2 H, H-l, H-l'), 3,46 (dt, 2H, CH2-NH), 2,34 (t, 6H, 3 CH2COO), 1,63 - 1,2 (m, 12 H, 6 CH2), 0,88 (m, 6H, 2 CH3). MS (ESI-MS): 649,5 (M+l).
8. Heksadekansyre-2-hydroksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-
dodekanoyloksy]-propylester (6): En løsning av forbindelse (1) (25 mg, 66 umol), 4-dimetylaminopyridin (9 mg, 73 umol) og 1,1-karbonyldiimidazol (15 mg, 73 umol) i CH2CI2 (5 ml) omrøres i 30 min. ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Forbindelse (6) erholdes som gul fluorescerende olje (9,5 mg, 21%).
RF: 0,25 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 6 8,54 (d, 1H ArH), 6,3 (m, 1H, NH), 6,19 (d, 1H, ArH), 4,20 (dd, 2H, H-l, H-l'), 4,15 (dd, 2H, H-3, H-3'), 4,12 (m, 1 H, H-2), 3,5 (dt, 2H, CH2-NH), 2,36 (t, 4H, 2 CH2COO), 1,82 (m, 2H, CH2-CH2-NH), 1,63 (m, 4H, 2CH2CH2COO), 1,47 (m, 2H, CH2-(CH2)2-NH), 1,31-1,26 (m, 22H, 11 CH2), 1,287 (m, 2H CH2), 1,26 (m, 2H, CH2), (m, 4H, 2 CH2CH2CH2COO), 1,31-1,26 (m, 18H, 9CH2), 1,3 (m, 2H, CH2), 1,26 (m, 2H, CH2), 0,89 (t, 3H, CH3). MS (ESI-MS): 649,5 (M+l).
9. Heksadekansyre-2-acetyloksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-
ylamino)-dodekanoyloksy] -propylester (7): Forbindelse (6) (t mg, 8,7 umol) acetyleres og opparbeides som beskrevet for forbindelse (4). Råproduktet renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Man erholder forbindelse (7) som gul fluorescerende olje (5,1 mg, 95%).
RF 0,71 (5:1 toluen-ETOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,25 (m, 1H, NH), 6,17 (d, 1H, ArH), 5,25 (m, 1H, H-2), 4,27 (dd, 2H, H-l, H-3), 4,15 (dd, 2H, H-l', H-3'), 3,73 (dt, 4H, CH2-NH), 2,3 (t, 2H, CH2COO), 2,08 (s, 3H, OAc), 1,8 (m, 2H, CH2-CH2-NH), 1,6 (m, 8H, 4CH2), 1,4-1 (m, 32H, 16 CH2), 0,85 (t, 3H, CH3).
MS(FAB-MS): 739 (M+Ll).
10.12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre 2,3-bis-oktadecyloksy-propylester (8): Til en løsning av forbindelse (1) (3 mg, 7,9 umol), dimetylaminopyridin (5 mg, 41 umol) og dicykloheksylkarbodiimid (5 mg, 24 umol) i CH2C12 tilsettes 2,3-bis-oktadecyloksypropan-l-og lignende (5 mg, 8,37 umol). Reaksjonsblandingen omrøres i 21 ved 25°C, løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (2:1 lettbensin-dietyleter). Man erholder forbindelsen (8) som gul fluorescerende olje (3,5 mg, 46%).
RF 0,55 (3:7 dietyleter/lettbensin). MS (FAB-MS): 957.8 (M+l).
Enzymfremstilling:
Fremstilling av den delvis rensede HSL:
Isolerte rottefettceller utvinnes fra bitestikkelfettvev fra ikke-behandlede hannrotter (Wistar, 220 - 250 g) ved kollagenasebehandling ifølge publiserte metoder. Fettcellene fra 10 rotter vaskes tre ganger ved flotasjon med hver gang 50 ml homogenisasjonsbuffer (25 ml Tris/HCl, pH 7,4,0,25 M sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml antipain, 20 ug/ml pepstatin) og opptas til slutt i 10 ml homogenisasjonsbuffer. Fettcellene homogeniseres i teflon-i-glass homogenisator (Braun-Melsungen) ved hjelp av 10 løfteslag ved 1500 rpm og 15°C. Homogenisatet sentrifugeres (Sorvall SM24-smårør, 5000 rpm, 10 min. 4°C). Underlaget mellom det ovenpåliggende fettsjikt og pelleten tas av og sentrifugeringen gjentas. Det derav resulterende underlag sentrifugeres på nytt (Sorvall SM24-smårør, 20000 rpm, 45 min., 4°C). Underlaget tas av og tilsettes 1 g heparin-sefarose (Pharmacia-Biotech, CL-6B, 5 x vasket med 25 mM Tris/HCl, pH 7,4,150 mM NaCl). Etter inkubasjon i 60 min. ved 4°C (utrysting med intervaller på 15 min.) sentrifugeres sammensetningen (Sorvall SM24-smårør, 3000 rpm, 10 min., 4°C). Det overliggende lag bringes ved tilsetning av iseddik til pH 5,2 og inkuberes i 30 min. ved 4°C. Utfellingen samles ved sentrifugasjon (Sorvall SS34,12000 rpm, 10 min., 4°C) og oppslemmes i 2,5 ml 20 mM Tris/HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 65 mM NaCl, 13% sukrose, 1 mM DTT, 10 ug/ml leupeptin/pepstatin/antipain. Suspensjonen dialyseres over natten ved 4°C mot 25 mM Tris/HCl, pH 7,4, 50% glycerol, 1 mM DTT, 10 ug/ml laupeptid, pepstatin, antipain og helles deretter inn på en hydroksyapatittkolonne (0,1 g pr. 1 ml suspensjon, ekvilibrert med 10 mM kaliumfosfat, pH 7,0, 30% glycerol, 1 mM DTT). Kolonnen vaskes med 4 volum ekvilibreirngsbuffer med en strømningstakt på 20 til 30 ml/t. HSL elueres med et volum ekvilibreringsbuffer inneholdende 0,5 M kaliumfosfat, og dialyseres deretter (se ovenfor) og konsentreres 5 til 10 ganger ved ultrafiltrasjon (Amicon Diaflo PM 10 filter) ved 4°C. Den delvis rensede HSL kan oppbevares i 4 til 6 uker ved -70°C.
Fremstillilng av NAG (NBD-monoacylglycerid)substratet:
6 mg fosfatidylcholin og 6 mg fosfatidylinositol oppløses hver i 1 ml kloroform. 10 mg NAG oppløses i 1 ml kloroform. To deler fosfatidylinositolløsning (for eksempel 83,5 ul) og en del fosfatidylcholinløsning (for eksempel 41,5 ul) og 100 ul NAG løsning sammenpipetteres i plastsintillasjonsbeholdere (sluttkonsentrasjon i test: 0,0375 mg fosfolipid/ml; 0,05 mg/NAG/ml). Kloroform fjernes fullstendig (225 ul totalvolum) ved overblåsing med en N2-strøm. Det tørkede substratet kan oppbevares i opp til 3 dager ved 4°C. For fremstilling av fosfolipidvesikler/celler med innføyd NAG (på testdagen) opptas det tørkede substrat i 20 ml analysebuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) og underkastes to ultralydbehandlinger med en ultralydstav (Branson Sonifier Type II, standardmikrospiss): 1. Behandling innstilling 2,2 x 1 min., mellom disse 1 min. på is; 2. Behandling innstilling 4,2 x 1 min., derimellom 1 min. på is. Under denne prosedyre forandrer fargen på substratløsningen seg fra gul (ekstinksjonsmaksimum 481 nm) til rød (ekstinksjonsmaksimum 550 nm) ved innleiring av NAG mellom fosfolipidmolekylene i vasiklene/micellene. Før benyttelse som substrat (i løpet av de neste 21) blir løsningen inkubert i enda 15 min. på is.
Indirekte NAG-analyse:
Analysen gjennomføres med 1,5 ml Eppendorfbeholdere eller 96-brønners plater i 60 min. ved 30°C. For påvisning av inhibitorer for HSL blir 10 ul av testsubstansen anordnet i analysebuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) i nærvær av 16,6% DMSO. 180 ul av substratløsning (20 ug/ml fosfatidylcholin, 10 ug/ml fosfatidylinositol, 50 ug/ml NAG i analysebuffer) tilsettes dertil. Etter en forinkubasjon 1 15 min. ved 30°C tilpipetteres 20 ul av enzymløsningen i analysebuffere (fortynnet 1 til 4 ganger) og ekstinksjon ved 480 nm i et kyvettefotometer (0,5 ml kyvette) henholdsvis mikrotiterplateleseapparat (MicroPeta, Wallac) måles med en gang. Etter 60 min. inkubasjon ved 30°C måles ekstinksjonen på nytt. Økningen i ekstinksjonen ved 480 nm er et mål på enzymaktiviteten. Under standardbetingelser fører 20 ug partiell renset HSL til en ekstinksjonsendring på 4000 vilkårlige enheter.
Direkte NAG-analyse:
Alternativt til måling av ekstinksjonsendringen av substratløsningen undersøkes produktene fra HSL-reaksjonen ved hjelp av faseseparasjon/tynnsjiktkromatografi. For dette blir inkubasjonssammensetningen (200 ul totalvolum, se indirekte NAG-analyse) i 2 ml Eppendorfbeholdere med 1,3 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7) og tilsettes deretter 0,4 ml 0,1 M NaOH. Etter intensiv blanding (10 sek.) innledes faseseparasjonen ved sentrifugasjon (800 x g, 20 min., romtemperatur). Fra den vandige øvre fase avtas ekvivalente volum (for eksempel 0,4 ml) og ekstinksjonen bestemmes fotometrisk ved 481 nm. For tynnsjiktkromatografi tørkes den vandige fase (SpeedVac) og opptas deretter i 50 ul tetrahydrofuran. 5 ul prøver påføres på silikagel Si-60 plater (Merck, Darmstadt). Kromatografien gjennomføres med 78 ml dietyleter/22 ml lettbensin/1 ml iseddik som strømningsmiddel. Mengden av frigitt fluorescerende NBD-fettsyre bestemmes ved fosforavbilding (Molecular Dynamics, Storm 840 og ImageQuant Software) ved hjelp av en aktiveringsbølgelengde på 460 nm og emisjonsbølgelengde på 540 - 560 nm.
TAG-analyse:
For fremstilling av substratet blandes 25 - 50 uCi [<3>H]trioleoylglycerol (i toluen), 6,8 umol umerket trioleoylglycerol og 0,6 mg fosfolipid (fosfatidylcholin/fosfatidylinositol 3:1 vekt/volum), tørkes over N2 og opptas så i 2 ml 0,1 M KPj (pH 7,0) ved hjelp av ultralydbehandling (Branson 250, mikrospiss, innstilling 1 - 2,2 x 1 min. i 1-min. intervall). Etter tilsetning av 1 ml KP; og fornyet ultralydbehandling (4 x 30 sek. På is i 30-sek. Intervall) tilføyes 1 ml 20% BSA (i KPj) (sluttkonsentrasjon trioleoylglyserol 1,7 mM). For reaksjonen pipetteres 100 ul substratløsning til 100 ul HSL-løsning (HSL fremstilt som ovenfor, fortynnet i 20 mM KP;, pH 7,0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,02% BSA, 20 ug/ml pepstatin, 10 ug/ml leupeptin) og de inkuberes i 30 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7) og 1,05 ml 0,1 M K2CO3,0,1 M borsyre (pH 10,5) blandes godt og til slutt blir blandingen sentrifugert (800 x g, 20 min.). Etter faseseparasjon avtas en ekvivalent av den øvre fase (1 ml) og radioaktiviteten bestemmes ved hjelp av vaeskescintillasjonsmåling.
PNPB-analyse:
10 ul p-nitrofenylbutyrat (PNPB) (2 mM i acetonitril), 890 ul 0,1 M KPj (pH 7,25), 0,9% NaCl, 1 mM DTT og 100 ul HSL (fremstilt som ovenfor, fortynnet i denne buffer) inkuberes i 10 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7, vekt/volum) og kraftig omrysting, blir blandingen sentrifugert (800 x g, 20 min.) og inkubert i 3 min. ved 42°C. Deretter blir et ekvivalent volum av den øvre fase tatt av og absorpsjonen bestemt ved 400 nm.
Glyceryltributyrat-analyse:
For fremstilling av substratet tilsettes 5 uCi [l-<14>C]tributyrin (i toluen) til 1 ml 20 mM umerket tributyrin (i acetonitril). 10 ul av denne substratløsningen inkuberes med 390 ul 0,1 M KP; (pH 7,25), 0,9% NaCl, 1 mM DTT, 2% BSA og 100 ul HSL (fremstilt som ovenfor, fortynnet i denne buffer) i 30 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7, vekt/volum) og 1 ml 0,1 M NaOH blir blandingen intenst blandet og til slutt sentrifugert (800 x g, 20 min.). Et ekvivalent volum (1 ml) av den ovenliggende fase avtas og radioaktiviteten bestemmes ved hjelp av væskescintillasj onsmåling.
Bestemmelse:
Substanser prøves på vanlig måte i fire uavhengige sammensetninger. Hemmingen av den enzymatiske aktivitet av HSL ved en testsubstans bestemmes ved sammenligning med en ikke-hemmet kontrollreaksjon. Beregningen av ICso-verdien skjer ved hjelp av en hernrnkurve med minst 10 konsentrasjoner av testsubstansen. For analyse av data benyttes programvarepakken GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT (Versjon 3,0).
Eksempler:
Eksempel 1: Kinetikk av spalting av NAG med HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med de angitte proteinmengder i delvis renset HSL (temperert fotometer) og til bestemte tidspunkter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm. For inaktivering inkuberes HSL i 15 min. ved 100°C (n = 8, middel ± standardavvik
SD).
Resultat: Opp til en proteinmengde på 20 ug forløper reaksjonen lineært i opp til 60 min. Ekstinksjonsforskjellen utgjør herved 0,8 - 0,9 OD. Ved mindre proteinmengder gis en linearitet opp til 180 min.
Økning av absorpsjon ved 481 nm ( vilkårlige enheter)
Eksempel 2: Avhengighet av spaltning av NAG av mengden av HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med de angitteproteinmengder i delvis renset HSL i 60 min. I delmengder av reaksjonssammensetningen bestemmes økningen i ekstinksjon ved 481 nm (dannelse av den fri NBD-fettsyre som produkt fra HSL-reaksjonen = indirekte NAG-analyse) eller minskingen i ekstinksjon ved 550 nm (forbruk av NAG som substrat for HSL-reaksjonen). Alternativt blir ytterligere delmengder ekstrahert med metanol/kloroform og den i den organiske fase inneholdte frigitte NBD-fettsyre bestemmes ved TLC-analyse og florimetri (Phosphorlmager Storm 840, Molecular Dynamics) (=direkte NAG-analyse) (n = 6, middel ± standardavvik SD).
Resultat: Opp til en proteinmengde på 20 ug forløper reaksjonen med hensyn til
produktdannelse (ekstinksjonsøkning ved 481 nm eller opptreden av fri NBD-fettsyre ifølge TLC-analyse) og som med hensyn til substratforbruket (ekstinksjonsminsking ved 550 nm) lineært. Overensstemmelsen mellom indirekte og direkte NAG-analyse taler for analyse av spaltingen av NAG i indirekte analyse.
Absorpsjonsendring [vilkårlige enheter]
Eksempel 3: Avhengighet av spaltingen av NAG ved HSL av
substratkonsentrasjonen
Forskjellige mengder av NAG (ved konstant forhold til fosfolipidene) inkuberes med de angitte mengder av delvis renset HSL i 60 min. og deretter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Spaltningshastigheten viser ved alle tre enzymmengder forløpet av en typisk metningskurve. På grunn av den enzymatiske spesielle karakter av HSL-reaksjonen ("todimensjonal" substratpresentasjon, "interfacial aktivasjon") lar seg imidlertid bare ved 5 ug protein og den laveste substratkonsentrasjon en tilnærmet lineær avhengighet seg fastslå. Et fornuftig kompromiss mellom substratavhengighet og signalstyrke (OD 0,6 til 0,7) representerer kombinasjonen av 20 ug protein og 0,05 mg/ml NAG.
Økning i absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 4: Avhengighet av spaltningen av NAG ved hjelp av HSL av forholdet
NAG og fosfolipider
NAG (0,05 mg/ml) prepareres som substrat med forskjellige mengder av fosfolipider (total mengde) under de angitte forhold mellom fosfatidylinositol og fosfatidylcholin ved ultralydbehandling og inkuberes deretter med delvis renset HSL (20 ug) i 60 min. Økningen i ekstinksjon ved 481 nm bestemmes (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Enzymhastigheten er størst ved et forhold fosfatidylinositol/fosfatidylcholin PI/PC (vektbasert) på 3:1 og 0,0375 til 0,075 totalfosfolipid. Det utpregede optimumsforløp for totalkonsentrasjonen av fosfolipidene så vel som også for deres sammensetning, taler for betydningen av presentasjonen av substratene av HSL (her NAG) i fosfolipidvesikler og/eller miceller henholdsvis for tildannelsen av et monolag av fosfolipider på den (nøytrale) kjerne av substratet.
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 5: Sammenligning av den indirekte/direkte NAG-analyse med en konvensjonell HSL-analyse ved bestemmelse av ICso-verdiene for forskjellige inhibitorer
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med 20 ug partiell renset HSL i 60 min. i nærvær av forskjellige konsentrasjoner (0,1 til 100 uM) av forskjellige substanser. I delmengder av sammensetningene bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (indirekte analyse) eller den frigitte NBD-FA ekstraheres med kloroform/metanol og bestemmes ved hjelp av TLC-analyse og fluorimetri (direkte analyse). Alternativt inkuberes [ H]trioleylglycerol med partiell renset HSL ifølge publiserte betingelser og det frigitte radiomerkede oleat bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol ved hjelp av væskescintillasjonsmåling. Fra hemmkurvene bestemmes ICso-verdien (n = 6, middel ± standard avvik SD).
Resultat: For alle testede substanser resulterte med de tre metoder typisk sigmoidale hemmkurver. ICso-verdiene lå ved indirekte/direkte NAG-analyse (ekstinksjonsøkning ved 481 nm/frigivelse av NBD-fettysyren) generelt med faktoren 4 til 10 lavere i forhold til spaltning av trioleoylglycerol ved hjelp av HSL, idet rangordningen av inhibitoren (ifølge deres ICso-verdier) dog var identisk for alle tre metoder. Dette bekrefter publiserte funn om at virkningen av inhibitorer av HSL avhenger av typen av substrat og substratpresentasjonen. Utover dette kan også de effektive substratkonsentrasjoner (NAG og trioleoylglycerid) mellom de to analyser være forskjellig (på grunn av substratfremstillingen som vesikler eller miceller knapt bestembar) og dermed forklare disse forskjeller ved kompetitive inhibitorer. De nesten identiske ICso-verdier, som ble oppnådd ifølge ekstinksjonsendringen og NBD-fettsyre-trigivelsen, taler for spalting av NAG ved hjelp av HSL og dermed frigivelse av NBD-fettsyre som årsak til ekstinksjonsøkningen ved 481 nm, dvs. at NAG-analysen vedrører den lipolytiske spalting av lipider.
IC50 [uM]
Eksempel 6: Sammenligning av den indirekte NAG-analyse med analyser på
TAG, PNPB og Tributyrin
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med 20 ug partiell renset HSL i 60 min. i nærvær av forskjellige konsentrasjoner (0,1 til 100 uM) av forskjellige substanser. I delmengder av sammensetningene bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (indirekte analyse). Alternativt blir [<3>H]trioleoylglycerol (TAG), p-nitrofenylbutyrat (PNPB) eller [<14>C]tributyrin inkubert med delvis renset HSL og det frigitte radiomerkede oleat, p-nitrofenol henholdsvis butyrat bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol ved hjelp av væskescintillasjonsmåling henholdsvis fotometri. Fra hemmkurvene bestemmes ICso-verdien (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Den relative rangordning av inhibitorene, manifestert i ICso-verdiene, er identisk for de to analyser med lipidsubstrat (NAG og TAG). Dette gjelder i prinsippet også for de vannløselige substrater, tributyrin og PNPB, men noen virkestoffer, som signifikant reduserer HSL-aktiviteten overfor NAG og TAG, er uvirksomme i hemmingen av HSL overfor tributyrin og PNPB. Dette lar seg forklare med en interferens av disse hemmstoffer med lipidbindingen av HSL (ved hjelp av lipidbindingsdomenet), mens den katalytiske mekanisme ikke påvirkes. Vannløselige substrater spaltes derfor av HSL også i nærvær av disse hemmstoffer. ICso-verdiene for inhibitorer, som virker også ved vannløselige substrater, ligger generelt mellom de tilsvarende for NAG og TAG som substrat. Dette viser at NAG forholder seg som "lipidaktig" substrat for HSL i likhet med de autentiske triglycerider og NAG-analysen kan anvendes for påvisning av hemmstoffer som blokkerer lipidbindingen (så vel som også den katalytiske mekanisme) av HSL.
IC50 [uM]
Eksempel 7: Innvirkning av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler på
substratstabiliteten
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i nærvær av stigende konsentrasjoner av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler i 180 min. ved 37°C og deretter bestemmes ekstinksjonsminskingen av 550 nm (oppløsning av den spesielle substratstruktur) (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Substratet (fosfolipid-vesikler henholdsvis miceller) viste forskjellig ømfintlighet overfor de anvendte midler. Ekstinksjonen, dvs. mengden av substrat forringet seg i nærvær av 1% DMSO med 10%, ved etanol eller metanol med maks. 20%, ved 1% TX-100 eller SDS ved maks. 30%. Mest effektiv ved oppløsningen av vesiklene/micellene var DMF, med 1% var over 80% av NAG frigitt fra fosfolipid/vesikkelstrukturene. Rangordningen i effektiviteten for anvendte løsningsmidler og detergensmidler ved oppløsningen av substratstrukturen er forlikelig med en forskyvning av ekstinksjonsmaksimum (fra 481 nm til 550 nm) av NAG, henholdsvis den kromofore gruppe (NBD) ved innbygning i den apolare omgivelse av fosfolipidvesikkel/micellene og den derved betingede fjernelse fra den vandige omgivelse. Frigivelse av NAG fra disse strukturer i vandig miljø ved oppløsning av vesiklene/micellene (for eksempel ved hjelp av detergensmiddelet) eller frigivelse av den kromofore gruppe som NBD fettsyre ved hjelp av lipolytisk spalting (ved hjelp av HSL) av NAG fører til en forringelse av ekstinksjonen ved 550 nm og en økning av ekstinksjonen ved 481 nm. Med stabiliteten ved 1% DMSO oppfyller NAG-substratet en av basisforutsetningene for en robust HTS-analyse.
Absorpsjonsanalyse ved 550 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 8: Innvirkning av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler på
aktiviteten av HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med HSL (20 ug) i nærvær av stigende konsentrasjoner av forskjellige midler i 60 min. Ekstinksjonen ved 481 nm bestemmes (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: DMSO til 1% reduserte mengden av frigitt NBD-FA med omtrent 10%. Da ved denne DMSO-konsentrasjon opp til 10% NAG frigis fra
fosfolipidvesiklene/micellene ved oppløsning av strukturene, resulterer regnemessig en minsking av enzymaktiviteten med 20%. Ved 0,5% DMSO utgjør reduksjonen ennå 10%. TX-100, aceton, etanol og metanol bevirker mellom 0,1 og 1% en forhøyelse av HSL-aktiviteten, muligens fremkalt ved hjelp av en mer effektiv substratpresentasjon. Ved høye konsentrasjoner interfererer de med aktiviteten. DMF fører allerede ved konsentrasjoner fra 0,1% til et signifikant aktivitetstap av HSL.
Absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 9: Spalting av NAG ved hjelp av lipaser med forskjellig spesifisitet
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i 60 min. med 20 ug partiell HSL, 75 ug partiell renset LPL fra rotteadipozytter, 20 mU bakteriell lipase, 50 mU pankreatisk lipase, 100 mU PLA2 fra slangegift og 0,5 U PC-spesifikk fosfolipase fra Bacillus cereus. Økningen i ekstinksjon ved 481 nm bestemmes (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Under de gitte for HSL optimerte betingelser, viser som ventet, HSL (100%) og LPL (omtrent 70%) den største aktivitet. Den bakterielle og pankreatiske lipase er tydelig mindre aktiv (25 henholdsvis 1%), mens den bakterielle PC-spesifikke fosfolipase var praktisk inaktiv. Disse sterkt forskjellige aktiviteter viser spesifisiteten for de valgte betingelser ved den indirekte NAG-analyse for HSL, således blir for eksempel i grove celleekstrakter eventuelt inneholdte fosfolipaser ikke omfattet. Disse data viser imidlertid også den prinsipielle anvendbarhet av analyseprinsippet på andre lipaser.
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 10: Spaltning av forskjellige med NBD-fettsyre modifiserte
acylglycerider ved hjelp av HSL
NAG (0,05 mg/ml) eller forskjellige NBD-fettsyremodifiserte lipider i forskjellige konsentrasjoner inkuberes med 20 ug partiell renset HSL. Til bestemte tidspunkter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm bestemmes (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat:
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 11: Hemming av HSL ved hjelp av diisopropylfosfofluoridat
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i 60 min. med 20 ug partiell renset HSL i nærvær av stigende konsentrasjoner av diisopropylfosfofluoridat. I delmengder av reaksjonssammensetningen bestemmes økningen i ekstinksjon ved 481 nm (indirekte NAG-analyse) eller etter ekstraksjon med kloroform/metanol bestemmes mengden av frigitt NBD-FA i den organiske fase ved hjelp fuorimetri (direkte NAG-analyse). Alternativt gjennomføres inkubasjonen av HSL med [<3>H]trioleoylglycerol som substrat (se ovenfor) og mengden av frigitt radiomerket oljesyre bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol. Spaltningsaktiviteten i fravær av inhibitor settes for hver analyse til 100% (n = 7, middel ± standard avvik SD).
Resultat:
I alle tre analyser vises typisk sigmoidale hemmkurver for diisopropylfosfofluoridat. De derav utregnede ICso-verdier skiller seg ikke signifikant fra hverandre for den indirekte (0,8 mM) eller direkte NAG-analyse (1,1 mM). For spaltingen av trioleoylglycerid utregnes med 2,0 mM en noe høyere ICso-verdi. Dette står i samsvar med de ovenfor konstaterte forskjeller i hemmvirkningene av de forskjellige inhibitorer, som iakttas med denne analyse (se eksempel 6 for mulig forklaring). Uavhengig derav står de oppnådde IC50-verdier for hemmingen av HSL ved hjelp av diisopropylfosfoflluoridat ved den indirekte NAG-analyse i godt samsvar med publiserte data (P. Stralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987,147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol.Chem. 258,1983,15146-15151: P. Belfrage, B. Jergill, P. Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75,1977,259-263).
% maksimal HSL-aktivitet
Eksempel 12: Gjennomførbarhet for den indirekte NAG-analyse i
mikrotiterplateformat
NAG inkuberes i forskjellige tidsrom med delvis renset HSL i et analysevolum på 200 ul i brønner i 96-brønners mikrotiterplater. Ekstinksjonen ved 481 nm undersøkes i et mikrotiterplate-leseapparat.
Resultat:
Under de valgte betingelser er reaksjonen opp til 60 min. lineær. Varianzen (standard avvik SD) ligger derved mellom 4 og 7%. Dermed er den indirekte NAG-analyse egnet for innsats i HT-screening.
Økning av absorpsjon ved 481 nm [vilkårlige enheter]
Anvendte forkortelser:
Vilk. enheter vilkårlige enheter
BSA Bovint serumalbumin
cAMP cyklisk adenosinmonofosfat
DCC dicykloheksylkarbodiimid
DMF N,N-dimetylformamid
DMSO dimetylsulfoksid
DTT ditiothreitol
EDTA etylendiamin-N,N-N' ,N'tetraeddiksyre
FAB-MS hurtig atombombardement massespektrometri HSL hormonsensitiv lipase
Kp, kaliumdihydrogenfosfat/kaliumfosfatbuffer
LPL lipoproteinlipase
NAG NBD-monoacylglycerid: 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylester
NBD 4-klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3 -diazol
NBD-FA NBD-fettsyre: 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,3 ]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre
NIDDM ikke-insulinavhengig Diabetes Mellitus
PLA2 fosfolipase A2
PLC fosfolipase C
PNPB p-nitrofenylbutyrat
SD standard avvik
SDS natriumdodecylsulfat
TAG [<3>H]-trioleoylglycerol
Tris Tris(hydroksymetyl)aminometan
TLC tynnsjiktkromatografi
TX-100 "Triton"X-100
Claims (21)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, karakterisert v e d at c) en fettsyre forsynt med en fluorescensmarkør omsettes med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base for å gi et monoacylglycerid; d) dette monoacylglycerid underkastes en ultralydbehandling med fosfolipider i forholdet 1:10 til 10:1 mg/ml hvorfra substratet, som kan gjenkjennes ved et fargeomslag fra gult til rødt, dannes.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fluorescensmarkøren er dansyl eller NBD.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at fluorescensmarkøren er NBD.
4.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at fettsyren er en mettet eller umettet karboksylsyre med en kjedelengde fra C-8 til C-20.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at fettsyren er en mettet C-12-karboksylsyre.
6.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at det som fosfolipider anvendes forsfatidylcholin og fosfatidylinositol alene eller sammen.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfatidylcholin og fosfatidylinositol anvendes sammen i forholdet fra 10:1 til 1:10.
8.
Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at monoacylglyceridet er 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre.
9.
Substrat, karakterisert ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8.
10.
Substrat ifølge krav 9, for anvendelse i en fremgangsmåte for identifisering av fosfolipid/lipidstrukturer.
11.
Substrat ifølge krav 9, for anvendelse i en fremgangsmåte for identifisering av lipaser og lipasehemmere.
12.
Fremgangsmåte for fremstilling av monoacylglyceridet 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre, karakterisert ved at den omfatter å først omsette 12-aminolaurinsyre med 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol og deretter omsette det erholdte mellomproduktet med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base.
13.
Glyceridrest, karakterisert ved at den er 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre.
14.
Fremgangsmåte for identifisering av lipaser og lipasehemmere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9; b) å innkubere dette substratet med en lipase; og c) å bestemme fargeendring.
15.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at høykapasitetsscreening (HTS) anvendes for å identifisere lipaser og lipasehemmere.
16.
Fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipaser/lipasehemmere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9; b) å innkubere dette substratet med en lipase; c) å bestemme hastighet for fargeendring; og d) å fastslå aktiviteten
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at substratet innkuberes med en hormonsensitiv lipase.
18.
Analysesystem for identifisering av en lipase/en lipasehemmer, karakterisert ved at det inneholder a) et substrat ifølge krav 9, b) en ultralydanordning og eventuelt c) en anordning for visuell/optisk og/eller fluorimetrisk bestemmelse av fargeendringen.
19.
Analysesystem for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer, karakterisert ved at det inneholder a) et substrat ifølge krav 9, b) en ultralydanordning, c) en anordning for bestemmelse av hastigheten av fargeendringen, og d) en anordning for absorpsjons- eller fluorescensmåling.
20.
Fremgangsmåte for bestemmelse av en detergentvirkning eller cytotoksisitet av forbindelser, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9, b) å innkubere dette substratet med en testforbindelse, og c) å visuelt/optisk eller fluorimetrisk bestemme fargeendringen fra rødt til gult som kjennetegner cytotoksiske forbindelser og forbindelser med detergentvirkning.
21.
Fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipidtransportere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9, b) å funksjonelt rekonstruere transportører/overføringsproteiner i liposomer og c) å tilsette liposomene fremstilt ifølge b) til substratet ifølge a) og bestemme fargeendringen visuelt eller optisk.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19919634A DE19919634C2 (de) | 1999-04-30 | 1999-04-30 | Test zur Bestimmung der Integrität komplexer Phospholipid/Lipid-Strukturen mit Hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter Acylglyceride und dessen Anwendung zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen |
PCT/EP2000/003308 WO2000067025A1 (de) | 1999-04-30 | 2000-04-13 | Bestimmung komplexer phospholipid/lipid-strukturen mit hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter acylglyceride |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20015263D0 NO20015263D0 (no) | 2001-10-26 |
NO20015263L NO20015263L (no) | 2001-12-19 |
NO329086B1 true NO329086B1 (no) | 2010-08-16 |
Family
ID=7906364
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20015263A NO329086B1 (no) | 1999-04-30 | 2001-10-26 | Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6783949B1 (no) |
EP (1) | EP1177442B1 (no) |
JP (1) | JP3712232B2 (no) |
KR (2) | KR100770968B1 (no) |
AR (1) | AR023778A1 (no) |
AT (1) | ATE404868T1 (no) |
AU (1) | AU780683B2 (no) |
BR (1) | BR0010191A (no) |
CA (2) | CA2384394C (no) |
DE (2) | DE19919634C2 (no) |
DK (1) | DK1177442T3 (no) |
ES (1) | ES2310165T3 (no) |
IL (2) | IL145919A0 (no) |
MX (1) | MXPA01009393A (no) |
NO (1) | NO329086B1 (no) |
NZ (1) | NZ515085A (no) |
PT (1) | PT1177442E (no) |
WO (1) | WO2000067025A1 (no) |
ZA (1) | ZA200106627B (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2824334B1 (fr) * | 2001-05-03 | 2003-10-10 | Coletica | Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique |
WO2003069305A2 (en) * | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Fluorescent phospholipase assay, phospholipase a2 inhibitor and stimulator, and the use thereof |
US7968306B2 (en) | 2002-02-13 | 2011-06-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for measuring activity of a specific fraction of albumin |
FR2870741B1 (fr) * | 2004-05-25 | 2008-03-14 | Coletica Sa | Phase lamellaires hydratees ou liposomes, contenant une monoamine grasse ou un polymere cationique favorisant la penetration intercellulaire, et composition cosmetique ou pharmaceutique la contenant. |
KR101041808B1 (ko) * | 2004-06-01 | 2011-06-17 | 엘지전자 주식회사 | 디엘피 프로젝터의 dmd 칩 냉각용 히트싱크의 구조 |
CA2569922A1 (en) | 2004-07-01 | 2006-01-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel method for screening and selecting enzymes |
CN101193858B (zh) * | 2005-03-30 | 2012-01-04 | 苏黎世大学 | 神经蛋白酶抑制剂及其确定 |
CN113109479A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-13 | 湖北浩华生物技术有限公司 | 一种高效液相色谱检测三丁酸甘油酯的方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI63064C (fi) * | 1980-04-09 | 1983-04-11 | Ksv Chemicals Oy | Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet |
EP0253271B1 (en) * | 1986-07-15 | 1993-06-02 | Abbott Laboratories | Fluorescence polarization method for monitoring fetal lung maturity |
-
1999
- 1999-04-30 DE DE19919634A patent/DE19919634C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-04-13 BR BR0010191-5A patent/BR0010191A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-04-13 ES ES00918871T patent/ES2310165T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 MX MXPA01009393A patent/MXPA01009393A/es active IP Right Grant
- 2000-04-13 KR KR1020067025036A patent/KR100770968B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-04-13 PT PT00918871T patent/PT1177442E/pt unknown
- 2000-04-13 EP EP00918871A patent/EP1177442B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 CA CA2384394A patent/CA2384394C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 WO PCT/EP2000/003308 patent/WO2000067025A1/de active IP Right Grant
- 2000-04-13 JP JP2000615813A patent/JP3712232B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 DK DK00918871T patent/DK1177442T3/da active
- 2000-04-13 AT AT00918871T patent/ATE404868T1/de active
- 2000-04-13 IL IL14591900A patent/IL145919A0/xx unknown
- 2000-04-13 AU AU39661/00A patent/AU780683B2/en not_active Ceased
- 2000-04-13 DE DE50015310T patent/DE50015310D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 NZ NZ515085A patent/NZ515085A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-04-13 KR KR1020017013831A patent/KR100723287B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-04-13 CA CA2742143A patent/CA2742143C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-27 AR ARP000102002A patent/AR023778A1/es active IP Right Grant
- 2000-05-01 US US09/562,022 patent/US6783949B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-13 ZA ZA200106627A patent/ZA200106627B/xx unknown
- 2001-10-14 IL IL145919A patent/IL145919A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-26 NO NO20015263A patent/NO329086B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20015263D0 (no) | 2001-10-26 |
EP1177442A1 (de) | 2002-02-06 |
ZA200106627B (en) | 2002-07-31 |
NO20015263L (no) | 2001-12-19 |
KR100723287B1 (ko) | 2007-05-30 |
EP1177442B1 (de) | 2008-08-13 |
DK1177442T3 (da) | 2008-12-08 |
DE19919634C2 (de) | 2001-06-07 |
ATE404868T1 (de) | 2008-08-15 |
PT1177442E (pt) | 2008-10-15 |
BR0010191A (pt) | 2002-02-13 |
DE19919634A1 (de) | 2000-11-23 |
IL145919A (en) | 2010-06-16 |
WO2000067025A1 (de) | 2000-11-09 |
KR20020022657A (ko) | 2002-03-27 |
CA2742143A1 (en) | 2000-11-09 |
DE50015310D1 (de) | 2008-09-25 |
AU780683B2 (en) | 2005-04-14 |
US6783949B1 (en) | 2004-08-31 |
KR20060134224A (ko) | 2006-12-27 |
IL145919A0 (en) | 2002-07-25 |
ES2310165T3 (es) | 2009-01-01 |
CA2384394C (en) | 2011-11-08 |
NZ515085A (en) | 2004-04-30 |
AR023778A1 (es) | 2002-09-04 |
CA2384394A1 (en) | 2000-11-09 |
CA2742143C (en) | 2014-03-18 |
AU3966100A (en) | 2000-11-17 |
MXPA01009393A (es) | 2002-02-25 |
JP2002543428A (ja) | 2002-12-17 |
JP3712232B2 (ja) | 2005-11-02 |
KR100770968B1 (ko) | 2007-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Duque et al. | New fluorogenic triacylglycerol analogs as substrates for the determination and chiral discrimination of lipase activities | |
Reynolds et al. | 1-Hexadecyl-2-arachidonoylthio-2-deoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholine as a substrate for the microtiterplate assay of human cytosolic phospholipase A2 | |
US20050026235A1 (en) | Fluorescent phospholipase assays and compositions | |
Volwerk et al. | Activation of porcine pancreatic phospholipase A2 by the presence of negative charges at the lipid-water interface | |
CA1337656C (en) | Substrates for phospholipases | |
NO329086B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat | |
US20110312008A1 (en) | Enzymatic Assay for the Quantitative Determination of Phospholipase A1 or A2 Activity in a Sample | |
US5464754A (en) | Assay and substrate for arachidonoyl-specific phospholipase A2 | |
JPH06505627A (ja) | 分析法 | |
El Alaoui et al. | Development of a high-throughput assay for measuring phospholipase A activity using synthetic 1, 2-α-eleostearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine coated on microtiter plates | |
Zandonella et al. | Enantiomeric perylene‐glycerolipids as fluorogenic substrates for a dual wavelength assay of lipase activity and stereoselectivity | |
Lin et al. | Use of short-chain cyclopentano-phosphatidylcholines to probe the mode of activation of phospholipase A2 from bovine pancreas and bee venom. | |
Piel et al. | Chemoenzymatic synthesis of fluorogenic phospholipids and evaluation in assays of phospholipases A, C and D | |
JP2839038B2 (ja) | 酵素活性のアッセイ | |
US20110312006A1 (en) | Enzymatic Assay for the Quantitative Determination of Phospholipase A1 or A2 Activity in a Sample | |
Jiménez‐Atiénzar et al. | Determination of the phospholipase activity of patatin by a continuous spectrophotometric assay | |
Caramelo et al. | A subnanogram assay for phospholipase activity based on a long-chain radioiodinatable phosphatidylcholine | |
Birner‐Grünberger et al. | Fluorescent probes for lipolytic enzymes | |
Yu et al. | Carbonothioate phospholipids as substrate for a spectrophotometric assay of phospholipase A2 | |
Hermetter et al. | Fluorescence spectroscopic studies on structure and function of lipolytic enzymes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |