NO329086B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat - Google Patents

Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat Download PDF

Info

Publication number
NO329086B1
NO329086B1 NO20015263A NO20015263A NO329086B1 NO 329086 B1 NO329086 B1 NO 329086B1 NO 20015263 A NO20015263 A NO 20015263A NO 20015263 A NO20015263 A NO 20015263A NO 329086 B1 NO329086 B1 NO 329086B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
substrate
lipase
determining
nag
hsl
Prior art date
Application number
NO20015263A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20015263D0 (no
NO20015263L (no
Inventor
Gunter Muller
Stefan Petry
Holger Jordan
Horst Kleine
Horst Wenzel
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of NO20015263D0 publication Critical patent/NO20015263D0/no
Publication of NO20015263L publication Critical patent/NO20015263L/no
Publication of NO329086B1 publication Critical patent/NO329086B1/no

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914Hydrolases (3)
    • G01N2333/916Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer samt substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmåte. Oppfinnelsen vedrører videre fremgangsmåter for identifisering av lipaser og lipasehemmere; fremgangsmåter for bestemmelse av aktiviteten av lipaser/lipasehemmere; fremgangsmåter for bestemmelse av en detergentvirkning eller cytotoksisitet av forbindelser og fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipidtransportere. Analysesystem for identifisering av en lipase/en lipasehemmer eller for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer er og en del av foreliggende oppfinnelse.
Lipaser, fosfolipaser og andre lipolytiske enzymer har stor betydning innen det bioteknologiske og medisinske området. Ved visse stoffskiftesykdommer kan forhøyet lipaseaktivitet i fettvev påvises, som delvis kan forklare patogenesen av denne sykdommen. Den største del av energireservene i kroppen er lagret i fettcellene som fettsyrer i triglycerider. De vesentlige ved insulin bevirkede anabolske prosesser omfatter stimulering av opptak av substrater for triglyceridsyntesen og forhøyelse av lipogenesen. En ytterligere viktig ved insulin fremkalt prosess er hemmingen av lipolysen, som foregår ved hjelp av de katabolske hormoner, i første linje katekolamin, som stimulerer hydrolysen av triglycerider og derved frigivelsen av fettsyrer. Et vesentlig problem knyttet til ikke-insulin-avhengig Diabetes Mellitus (NIDDM) er forårsaket av ikke-inhibert lipolyse i fettceller, som fører til forhøyede ikke-forestrede fettsyrer i plasma. Etter nåværende oppfatning stimulerer fettsyrene glukoneogenesen i leveren og reduserer glykoseutnyttelsen i skjelettmuskelene gjennom ennå lite karakteriserte molekylære mekanismer. Faktisk har det vært mulig å påvise at undertrykkelse av lipolyse i fettceller, ved hjelp av inhibitorer av lipolysen, slik som agonister av nikotinsyrereseptoren i fettcellene, senker både fettsyrekonsentrasjonen i plasma og gir et forhøyet blodsukkernivå i diabetiske dyr og pasienter. Dessverre er disse gunstige virkninger ikke særlig sterkt utrykt og har forholdsvis kort varighet. Dette kan bero på fysiologisk motregulering, fremkalt ved inngrep i reguleringsmekanismen for det hastighetsbestemmende enzym for lipolysen, den hormonsensitive lipase (HSL). Det forefinnes gode grunner til å anta at hemming av den lipolytiske reaksjonen vil føre til en forbedret terapi av nevnte NIDDM, i det minste med hensyn på undertrykkingen av fettsyrefirgivelsen fra fettcellene. Den direkte hemming av HSL ved hjelp av egnede inhibitorer skulle derved omgå de åpenbare vanskeligheter med et inngrep i den komplekse regulering av HSL.
Aktiviteten av lipolytiske enzymer undersøkes tradisjonelt med radiometriske, titrimetriske, enzymatiske eller fluorimetriske/fotometriske metoder. Radiometriske analyser er de mest følsomme, men de krever dyre radiomerkede substrater, er diskontinuerlige og forutsetter fraskillingen av det radiomerkede substrat fra det radiomerkede produkt. Slike separasjoner er ofte omstendelige og unngåelse/redusering av radioaktivt avfall er av økende betydning (relevant fremfor alt ved et stort antall tester). Titrimetriske tester er kontinuerlige og kan gjennomføres både med naturlige så vel som også med syntetiske substrater, men de lider imidlertid hyppig av en ganske lav sensitivitet og er ikke motstandsdyktig overfor betingelser som påvirker mengden av frigitte protoner.
Enzymatiske eller kromatografiske metoder for påvisning av et av produktene fra den lipolytiske reaksjon (for eksempel glycerol) er meget ømfintlige og relativt robuste, men også omstendelige ved gjennomføringen, da de før den egentlige enzymatiske/kromatografiske påvisning forutsetter opparbeidelse av inkubasjonsblandingen for lipasereaksjonen. Tilkoblingen til en enzymtest tillater bare endepunktmålinger ("time-stop" måling). Videre kan det ved undersøkelse av ukjente substanser (for eksempel leting etter potensielle inhibitorer) i prinsippet ikke utelates en virkning på enzymene for påvisningsreaksjonen, og det kreves derfor tilsvarende kontroller. Disse betraktninger har gitt motivasjon for utvikling av fluorimetriske/fotometriske metoder. Disse oppnår i prinsippet den samme sensitivitet som radiometriske metoder, men krever imidlertid anvendelse av syntetiske substrater eller prober som er modifisert med fluoroforer eller kromoforer. Tradisjonelle fluorometriske/fotometriske metoder forløper i likhet med de radiometriske prosedyrer diskontinuerlig og betinger fraskilling av substratet fra produkter. I nyere tid ble det utviklet kontinuerlige fluorimetriske/fotometriske analyser (S. Hendrickson, Analyt. Biochem 219 (1994) 1-8), basert på en forskyvning av fluorescens- henholdsvis ekstinksjonsmaksimum av produktet i sammenligning med substrat. Imidlertid begrenser alle disse metoder seg til påvisning av fosfolipase, lipoproteinlipase, kolesterinesterase, spingomyelinase og glukosyl-ceramidglukosidase. Substrater med fluorofor/kromofor grupper, egnet for kontinuerlige aktivitetsmåling av triglyceridspaltende enzymer (for eksempel hormonsensitiv lipase, monoglyceirdlipase, diglyceirdlipase, triglyceirdlipase, lipoproteinlipase, pankreatis lipase, hepatisk lipase, bakteriell lipase, PLA2, PLC, kolesterinesterase) er tidligere ikke kjent.
Chemistry and Physics of Lipids, 1991, vol. 60, side 83-91 omtaler en fremgangsmåte for å fremstille fluorescerende analoger av CDP-diacylglyserol og fosfatidylinositol. Nevnte analoger kan anvendes for å studere metabolisme og intracellulær trnasport av disse lipidene. Videre ble det vist at nevnte fosfatidylinositolanalog ble hydrolysert av fosfolipasen.
EP0253271 omtaler en fremgangmåte for å overvåke føtal lungemodning som involverer bestemmelse av forholdet mellom surfaktant og albumin. Nevnte forhold mellom surfaktant og albumin bestemmes ved å måle fluorescens polarisering av NBD-merket fosfatidylcholin og sammenlikne denne med en standardkurve.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, kjennetegnet ved at
a) en fettsyre forsynt med en fluorescensmarkør omsettes med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base for å gi et monoacylglycerid; b) dette monoacylglycerid underkastes en ultralydbehandling med fosfolipider i forholdet 1:10 til 10:1 mg/ml hvorfra substratet, som kan gjenkjennes ved et
fargeomslag fra gult til rødt, dannes.
En fluorescensmerking defineres som en kjemisk gruppe innenfor et molekyl som selv er i stand til lysemisjon ved lysaktivering. Slike grupper anvendes her for å fremstille substanser som selv i de minste konsentrasjoner på ca. 1 nM ennå kan påvises. For eksempel skal nevnes N,N-dimetylaminosulfonsyre (Dansyl) eller NBD, foretrukket
NBD.
Med en fettsyre forstår man for eksempel en langkjedet karboksylsyre, mettet eller umettet, med en kjedelengde fra C-8 til C-20, foretrukket C-12, C-14, C-16 og C-18, mettet eller umettet, særlig foretrukket er mettet C-12.
En fettsyre forsynt med en fluorescensmerking ble koblet med 2,3-epoksypropanol til et monoacylglycerid. Fra dette syntetiske substrat og fosfolipider, som for eksempel fosfatidylinositol og fosfatidylcholin alene eller felles, eventuelt i et vektforhold fra 10:1 til 1:10, foretrukket fra 3:1 til 1:3, særlig foretrukket 2:1, ble det ved ultralydbehandling som varte for eksempel i omtrent 1 til 10 minutter, foretrukket 1 til 6 minutter, særlig foretrukket 4 minutter, dannet miceller eller vesikler, som tjener som substrat for den lipase som skal undersøkes. Denne innbygning i miceller eller vesikler er forbundet med et fargeomslag fra gult til rødt, beroende på et ladningsoverføringskompleks av de i denne struktur romlig tett tilliggende aromater. Inkubasjon med lipase fører til avspalting av fettsyrene under frigivelse av merket fettsyre og glycerol.
Som fosfolipider løses for eksempel fosfatidylcholin (6 mg) og fosfatidylinositol (6 mg) i kloroform (hver 1 ml). For fremstilling av substratet sammenpipetteres to deler fosfatidylinositolløsning (for eksempel 83,5 ul) og en del fosfatidylcholinløsning (for eksempel 41,5 ul) og 100 ul NAG-løsning (10 mg i 1 ml kloroform) (sluttkonsentrasjon i test: 0,0375 mg fosfolipid/ml; 0,05 mg/NAG/ml). Etter fjernelse av kloroform tilsettes 20 ml 25 med mer Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl og to ultralydbehandlinger med en ultralydstav (Branson Sonifier Type II, standardmikrospiss, 25 W). 1. Behandling: Innstilling 2,2 x 1 min., derimellom for hvert 1 min. på is; 2. Behandling: Innstilling 4,2 x 1 min., derimellom for hvert 1 min. på is. Under denne prosedyren forandres fargen av substratløsningen fra gul (ekstinksjonsmaksimum 481 nm) til rød (ekstinksjonsmaksimum 550 nm) ved interinnføyning av NAG mellom fosfolipidmolekylene i vesiklene/micellene.
Den frie fettsyre danner ingen miceller eller vesikler. Derfor iakttar man ved avspaltingen av fettsyrene fra micellene/vesiklene et fargeomslag fra rødt til gult. Derved kan ødeleggelsen av micellene/vesiklene og dermed enzymaktiviteten av lipasen måles, enten visuelt (ved 481 nm, henholdsvis ved 550 nm), ved hjelp av fargeendringen fra rødt til gult ved hjelp av et kyvette-fotometer (for eksempel DU-640 fra firma Beckman (Munchen)) eller ved hjelp av et mikrotiterplateleseapparat (for eksempel "MicroPeta" fra firmaet Wallac (Turku, Finland) eller alternativt fluorimetrisk ved hjelp av et fosfoavbildingsapparat (for eksempel Storm 840 fra firmaet Molecular Dynamics (Krefeld)), en fluorescensscanner (for eksempel DA-2 fra firmaet Shimadzu (Osaka, Japan)) eller ved hjelp av en bildeanalysemetode (for eksempel ArrayScan fra firmaet Molecular Devices (USA)) som beror på et CCD-kamera (ladningskoblet apparat) som har en integrert koblingskrets for bearbeiding av elektriske og optiske signaler, hvor informasjonen lagres i form av elektriske ladninger og transmitteres.
Alle disse metoder foretrekkes i forbindelse med en høykapasitetsscreening (HTS). Videre metoder som beror på dette konsept, er målingen av cytotoksisiteten av forbindelser og virkningen av detergenter.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et substrat, kjennetegnet ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen. Nevnte substrat kan anvendes i en fremgangsmåte for identifisering av strukturer som begunstiger anordningen (arrangeringen) av aromater til
ladningsoverføirngskomplekser, foretrukket for identifisering av fosfolipid/lipidstrukturer, særlig foretrukket lipase/lipasehemmere.
Fremgangsmåten kan også anvendes for nedbryting av mono- eller tolags strukturer, enten krumme (for eksempel miceller eller vesikler) eller plane (for eksempel kunstig fremstilt plane tolags) som er fulgt av en fargeendring. Denne fargeendring kan følges målbart visuelt/optisk henholdsvis fluorimetrisk, som beskrevet i det foregående.
Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av monoacylglyceridet 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylester, idet 12-aminolaurinsyre først omsettes med 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol og deretter omsettes det erholdte mellomprodukt med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base, som alkalimetallkarbonat og alkalimetall-Ci-C4-alkanolat, foretrukket metanolat, som natriummetanolat eller kaliummetanolat, så vel som selve monoacylglyceridet 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylesteren.
Den oppgave som ligger til grunn for oppfinnelsen løses ved hjelp av en fremgangsmåte for identifisering av lipase/lipasehemmere, hvis tilstedeværelse fremkaller en fargeendring, karakterisert ved at
a) et substrat som beskrevet i det foregående ferdigstilles,
b) dette substrat inkuberes med en lipase (som for eksempel en hormon-sensitiv lipase, monoglyceirdlipase, diglyceirdlipase, triglyceirdlipase, lipoproteinlipase,
pankreatisk lipase, hepatisk lipase, bakteriell lipase, PLA2, PLC, kolesterinesterase, foretrukket en hormonsensitiv lipase og en kankreatisk lipase, særlig foretrukket en hormon-sensitiv lipase), og
c) fargeendringen bestemmes for eksempel visuelt/optisk eller fluorimetrisk.
Med et hormonsensitivt enzym forstår man et enzym som i sin aktivitet påvirkes av
fosforylering avhengig av sekundære signalstoffer (for eksempel cAMP) eller gjennom andre allosteriske mekanismer (for eksempel protein-protein vekselvirkning) som står under hormonkontroll. Hormoner som regulerer c-AMP-speilet er for eksempel adrenalin, noradrenalin, glukagon og insulin.
Lipidtransportører er proteiner som gjenkjenner lipider og ikke som lipider spalter disse, men i stedet transporterer disse gjennom biologiske membraner. Under lipaser skal det her forstås biologisk relevante kroppsegne lipaser, som definert for eksempel i R.D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998) 1694-1720.
Gjenstand for oppfinnelsen er likeledes en fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipase/lipasehemmere, idet et substrat som beskrevet i det foregående ferdigstilles, dette substrat inkuberes med en lipase og hastigheten for fargeendringen fra rødt til gult eller omvendt, fra gult til rødt, bestemmes og aktiviteten undersøkes for eksempel ved hjelp av en absorpsjonsmåling med et fotometer eller en fluorescensmåling med et fluorimeter.
En typisk reaksjon gjennomføres for eksempel i 1,5 ml Eppendorfbeholder eller 96 brønners plater i 60 min. ved 30°C. 10 ul av en testsubstans (for eksempel inhibitorer av HSL) anordnes i analysebuffere (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) i nærvær av 16,6% DMSO. 180 ul av substratløsningen (20 ug/ml fosfatidylcholin, 10 ug/ml fosfatidylinositol, 50 ug/ml NAG i analysebuffer) tilsettes. Etter en forinkubasjon i 15 min. ved 30°C tilpipetteres 20 ul HSL i analysebuffer og ekstinksjonen ved 481 nm i et kyvettefotometer (0,5 ml kyvette) henholdsvis mikrotiterplate-leseapparat måles med en gang (se ovenfor). Etter en bestemt inkubasjonstid som er variabel og avhenger av den valgte enzymkonsentrasjonen og kan utgjøre mellom 2 og 240 minutter, her 60 min. inkubasjon ved 30°C, måles ekstinksjonen på nytt. Økningen av ekstinksjonen i det gule området, her ved 481 nm, er et mål på enzymaktiviteten.
Analysesystemer for identifisering av en lipasehemmer henholdsvis for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer hører likeledes til gjenstanden for oppfinnelsen. De inneholder et substrat som beskrevet i det foregående, en ultralydanordning og eventuelt en anordning for visuell/optisk og/eller fluorimetrisk bestemmelse av fargeendringen fra rødt til gult henholdsvis ved siden av et substrat som beskrevet i det foregående og en ultralydanordning, en anordning for bestemmelse av hastigheten av fargeendringen og en anordning for absorpsjons- eller fluorescensmåling.
Analysesystemet kan også foreligge i form av et sett idet analysen er en lipaseanalyse.
Settet inneholder et substrat som beskrevet i det foregående eventuelt i en analysebuffer og en beholder for gjennomføring av testen, som for eksempel en Eppendorfbeholder eller en mikrotiterplate, foretrukket en mikrotiterplate.
Ytterligere gjenstander for oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter for bestemmelse av molekylære transport-overføringssystemer, for måling av detergensvirkning av forbindelser eller for undersøkelse av cytotoksisiteten av forbindelser (medikamenter og lignende) inneholdende et substrat som beskrevet i det foregående og en fosfolipase, for eksempel fosfolipase A2 (fra slangegift) eller C (Bacillus cereus).
Med transportører/overføringsproteiner forstår man proteiner som selv kjenner sentrale næringsstoffer som kullhydrater, lipider og proteiner og transporterer disse gjennom biologiske membraner henholdsvis overfører disse fra en bestemt biologisk membran til en annen. Transportør/overføringsproteiner, for eksempel isolert fra rotteileum, rekonstitueres (proteoliposomer) funksjonelt i fosfolipidvesikler (liposomer) henholdsvis inkuberes som løselige polypeptider sammen med liposomer og tilføres så til en som ovenfor beskrevet blanding av fosfolipider og NBD-glycerid og behandles med ultralyd. Transportprosessen henholdsvis overføringsprosessen av NBD-glyceridet fra de NBD-glyceirdholdige miceller/vesikler i hulrommet av proteoliposomene ved hjelp av transportørene henholdsvis i membranen av liposomene ved hjelp av overføringsproteinene, fører til oppløsning/nedbrytning av micellestrukturen og kan igjen følges fotometrisk eller fluorimetrisk som beskrevet i det foregående.
Detergensvirkningen av kjemiske forbindelser beror på den direkte nedbrytning av micellene/vesiklene. Da også biologiske membraner er oppbygget på denne måte, er slike forbindelser for det meste cytotoksiske. En nedbrytning av micellene lar seg med den foreliggende fremgangsmåte lett påvise ved hjelp av den beskrevne fargeendring.
Synteser:
Noen NBD-merkede fettsyrer som også 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (1) kan riktignok fås i handelen, men de er dyre. Selv om de første forsøk ennå ble gjennomført med materiale som kunne fås i handelen, kunne forbindelse (1) oppnås i gode utbytter ved omsetning av 12-aminolaurinsyre med 4-klor-7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol i MeOH.
Liste over forbindelser 1-9:
1 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre
2 2,3-epoksypropanol
3 Ri = OH R2 = OH
4 Ri = OAc R2 = OAc
5 Ri = OOC(CH2)3CH3 R2 = OOC(CH2)3CH3
6 Ri = OOC(CH2)i4CH3 R2 = OH
7 Ri = OOC(CH2)i4CH3 R2 = OAc
8 Ri = 0(CH2)i7CH3 R2 = 0(CH2)i7CH3
9a Ri, R2 = isopropyliden
3a Ri, R2 = OH
9b Ri, R2 = isopropyliden
3b Ri, R2 = OH
Ved hjelp av nuleofil addisjon av (1) til 2,3-epoksypropanol (2) kunne monoacylglyceridet (3) erholdes i gode utbytter. Forbindelsen (3) ble deretter acylert for å komme frem til triglyceridene (4) og (5). Ved hjelp av forestring av (1) med palmitinsyre ble diacylglyceridet (6) oppnådd. Også denne forbindelse ble omsatt til det tilsvarende triacylglycerid (7). Den samme metode ble anvendt for å omsette glyceroldieteren (8) til pseudotriacylglyceridet (9) hvori to acylrester er erstattet med langkjedede etere.
Alle syntetiserte forbindelser viste seg som substrat for lipasene, foretrukket for HSL, men viste imidlertid betraktelige aktivitetsforskjeller. Som "beste" substrat for lipasene viste monoacylglyceridet (3) seg. Innføringen av ytterligere acylgrupper, som i forbindelsene (4), (5), (6) og (7), førte til en nedsettelse av aktiviteten.
Dette kan lett forklares med en konkurranse om avspaltingene av NBD-acylgruppen ved hjelp av de nyinnførte acylrester. For å undersøke denne tese, ble et pseudotriacylglycerid (9) syntetisert, hvori to acylgrupper er erstattet med heksadecyleterenheter. Disse kan ikke avspaltes av lipasene og skulle derfor ikke konkurrere med NBD-fettsyreesteren. I biologiske tester viste denne forbindelse seg riktignok som et substrat, men da med liten aktivitet. Det er klart at lipasene i tillegg til det katalytiske området har et utstrakt hydrofobt bindeområde tilgjengelig for de langkjedede etergrupper slik at tilleiringen av fettsyreenheten hindres.
Da monoacylglyceridet (3) viste seg som godt substrat for lipaser, ble det undersøkt om det foreligger en regioselektiv preferanse for posisjon 1 eller 3. For disse undersøkelser ble de enantiomere regioisomerer (3 a) og (3b) syntetisert.
Syntesen av enantiomerene (3a, b) utgår fra D- og L-l,2-0-isopropylidenglycerol som forestres under dicykloheksylkarbodiimidaktivering med den NBD-merkede fettsyre (1). Avspaltingen av beskyttelsesgruppen skjedde med 1 N metanolisk HC1. Begge forbindelsene viste den samme biologiske aktivitet slik at anvendelsen av den enantiomerrike forbindelse ikke tilsa noen fordel.
1. 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (1):
Til en løsning av 12 aminolaurinsyre (18 g, 83,7 mmol) i MeOH (300 ml) tilsettes under omrøring 30% natriummetanolatløsning (14,5 ml, 76 mmol). Etter 5 minutter blir reaksjonsblandingen klar og man tilsetter en løsning av 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol (15 g, 75 mmol) i MeOH (300 ml). Reaksjonsblandingen, som snart mørkfarges, omrøres i 181 ved 25°C. Deretter tilsettes 1 M metanolisk HC1 (100 ml, 100 mmol) og løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum. Resten opptas i MeOH, filtreres over kiselgel, filtratet inndampes til tørrhet og resten renses ved hjelp av flashkromatografi (1:1 toluen-EtOAc). Man erholder (1) som rødt faststoff (26,4 g, 93%);
RF: 0,16 (1:1 toluen-EtOAc).
<*>H-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,35 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 3,48 (dt, 2 H, CH2NH2), 2,36 (t, 2 H, CH2COOH), 1,9 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2). MS (ESI-MS) 379,2 (M + 1).
2. 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3- dihydroksypropylester (3): En oppløsning av forbindelsen (1) (12 g, 31,7 mmol) og 2,3-dpoksypropanol (50 ml) i isopropanol (50 ml) omrøres i 161 ved 50°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum, resten tørkes ved 0,01 torr og renses ved hjelp av flash-kromatografi (diisopropyleter, eter, EtOAc). Man erholder forbindelsen (3) som rød olje (10,3 g, 71,8%);
RF: 0,18 (1:1 toluen-EtOAc); RF: 0,5 (30:5:1 CH2Cl2-MeOH-NH3) som krystalliseres fra EtOAc-dietyleter.
<t>ø-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,35 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1 H, ArH), 4,19 (dd, 2H, H-l, H-l'), 3,94 (m, 1 H, H-2), 3,65 (dd, 2H, H-3, H-3'), 3,48 (dt, 2 H, CHzNHz), 2,35 (t, 2 H, CH2COOH), 1,8 (m, 2 H, CH2), 1,6 (m, 2 H, CH2), 1,27 -1,15 (m, 14 H, 7 CH2). MS (ESI-MS) 453,4 (M+l).
3. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(S)-2,2- dimetyl[ 1,3]dioksolan-4-ylmetylester (9a): En oppløsning av forbindelse (1) (60 mg, 159 umol) i CH2CI2 (2 ml) tilsettes dicykloheksylkarbodiimid (160 mg, 770 umol) og omrøres i 30 min. ved 25°C. Deretter tilsettes en oppløsning av (R)-(2,2-dimetyl-[l,3]dioksolan-4-yl)-metanol (100 mg, 760 umol) og dimetylaminopyridin (94 mg, 770 umol) i CH2CI2 (2 ml) og reaksjonsoppløsningen omrøres videre i 41 ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (15:1 toluen-EtOAc). Forbindelsen (9a) erholdes som gul fluorescerende olje (46 mg, 58%).
RF 0,29 (4:1 toluen-EtOAc).
<J>H-NMR (CDCI3): 8 8,5 (d, 1 H, aromat.), 6,2 (m, 1 H, NH), 6,16 (d, 1 H, aromat.), 4,31 (m, 1 H,), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1 H), 3,48 (dt, 2 H, CH2NH2), 2,35 (t, 2 H, CO-Qfc), 2,0 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2), 1,42 (s, 3 H, CMe2), 1,37 (s, 3 H, CMe2). 4. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre (R)-2,2-dimetyl- [ 1,3]dioksolan-4-ylmetylester (9b): Forbindelse (9b) fremstilles som beskrevet for forbindelse (9a). Forbindelsen (9b) erholdes som fluorescerende olje (51,4 mg, 65%).
RF 0,29 (4:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (CDCI3): 8 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,2 (m, 1H, NH), 6,16 (d, 1 H, ArH), 4,31 (m, 1 H), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1H), 3,48 (dt, 2H, CH2NH2), 2,32 (t, 2H, CO-CH2), 2,0 - 1,2 (m, 18 H, 9 CH2), 1,42 (s, 3 H, CMe2), 1,37 (s, 3 H, CMe2).
5. 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(S)-2,3-dihydroksypropylester (3 a) og 12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-(R)-2,3-dihydroksypropylester (3b): Til en oppløsning av 13,9 mg (28,2 umol) av forbindelse (9a) henholdsvis 17,8 mg (36,1 umol) av forbindelse (9b) i 25 ml metanol tilsetter man metanolisk HC1 (1 M, 200 ul) og blandingen omrøres i 1,5 t ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (2:1,1:1 toluen-EtOAc). Man erholder fettsyreesteren (3a) og (3b) i et utbytte på 10,5 mg (82%) henholdsvis 9,3 mg (57%).
'H-NMR (CDCl3)-data og massespekteret er identiske med forbindelse (3).
6. Eddiksyre-2-acetoksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)- dodekanoyloksyj-propylester (4): Forbindelse (3) (12 mg, 26,5 umol) acetyleres i 2:1 pyridin/eddiksyreanhydrid (3ml). Etter 81 inndampes blandingen til tørrhet og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (1:2 toluen-EtOAc). Man erholder forbindelsen (4) som gul fluorescerende olje (13 mg, 91%).
RF 0,66 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,3 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 5,24 (m, 1H), 4,92 (m, 1H), 4,34 (m) 4,28,4,16, 3,48 (dt, 2H, CH2NH2), 2,32 (CH2COO), 2,1 (2 s, 6H, 2 OAc) 2,0 - 1,0 (m, 18 H, 9 CH2). MS (ESI-MS): 537,4 (M+l).
7. Heksansyre-2-heksanoyloksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4- ylamino)-dodekanoyloksy] -propylester (5): Til en løsning av forbindelse (2) (5 mg, 11 umol) i pyridin (300 ul) tilsettes heksansyreanhydrid (100 ul) og reaksjonsblandingen får stå i 161 ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Forbindelse (5) erholdes som gul fluorescerende olje (1,8 mg, 25%).
RF: 0,73 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 8 8,5 (d, 1H ArH), 6,25 (m, 1H, NH), 6,18 (d, 1H, ArH), 5,26 (m, 1H, H-2), 4,29 (dd, 2H, H-3, H-3'), 4,15 (dd, 2 H, H-l, H-l'), 3,46 (dt, 2H, CH2-NH), 2,34 (t, 6H, 3 CH2COO), 1,63 - 1,2 (m, 12 H, 6 CH2), 0,88 (m, 6H, 2 CH3). MS (ESI-MS): 649,5 (M+l).
8. Heksadekansyre-2-hydroksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)- dodekanoyloksy]-propylester (6): En løsning av forbindelse (1) (25 mg, 66 umol), 4-dimetylaminopyridin (9 mg, 73 umol) og 1,1-karbonyldiimidazol (15 mg, 73 umol) i CH2CI2 (5 ml) omrøres i 30 min. ved 25°C. Løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Forbindelse (6) erholdes som gul fluorescerende olje (9,5 mg, 21%).
RF: 0,25 (1:1 toluen-EtOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDC13): 6 8,54 (d, 1H ArH), 6,3 (m, 1H, NH), 6,19 (d, 1H, ArH), 4,20 (dd, 2H, H-l, H-l'), 4,15 (dd, 2H, H-3, H-3'), 4,12 (m, 1 H, H-2), 3,5 (dt, 2H, CH2-NH), 2,36 (t, 4H, 2 CH2COO), 1,82 (m, 2H, CH2-CH2-NH), 1,63 (m, 4H, 2CH2CH2COO), 1,47 (m, 2H, CH2-(CH2)2-NH), 1,31-1,26 (m, 22H, 11 CH2), 1,287 (m, 2H CH2), 1,26 (m, 2H, CH2), (m, 4H, 2 CH2CH2CH2COO), 1,31-1,26 (m, 18H, 9CH2), 1,3 (m, 2H, CH2), 1,26 (m, 2H, CH2), 0,89 (t, 3H, CH3). MS (ESI-MS): 649,5 (M+l).
9. Heksadekansyre-2-acetyloksy-3-[12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4- ylamino)-dodekanoyloksy] -propylester (7): Forbindelse (6) (t mg, 8,7 umol) acetyleres og opparbeides som beskrevet for forbindelse (4). Råproduktet renses ved hjelp av fiashkromatografi (9:1 toluen-EtOAc). Man erholder forbindelse (7) som gul fluorescerende olje (5,1 mg, 95%).
RF 0,71 (5:1 toluen-ETOAc).
'H-NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,5 (d, 1H, ArH), 6,25 (m, 1H, NH), 6,17 (d, 1H, ArH), 5,25 (m, 1H, H-2), 4,27 (dd, 2H, H-l, H-3), 4,15 (dd, 2H, H-l', H-3'), 3,73 (dt, 4H, CH2-NH), 2,3 (t, 2H, CH2COO), 2,08 (s, 3H, OAc), 1,8 (m, 2H, CH2-CH2-NH), 1,6 (m, 8H, 4CH2), 1,4-1 (m, 32H, 16 CH2), 0,85 (t, 3H, CH3).
MS(FAB-MS): 739 (M+Ll).
10.12-(7-nitro-benzo[l,2,5]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre 2,3-bis-oktadecyloksy-propylester (8): Til en løsning av forbindelse (1) (3 mg, 7,9 umol), dimetylaminopyridin (5 mg, 41 umol) og dicykloheksylkarbodiimid (5 mg, 24 umol) i CH2C12 tilsettes 2,3-bis-oktadecyloksypropan-l-og lignende (5 mg, 8,37 umol). Reaksjonsblandingen omrøres i 21 ved 25°C, løsningsmiddelet avdestilleres i vakuum og resten renses ved hjelp av fiashkromatografi (2:1 lettbensin-dietyleter). Man erholder forbindelsen (8) som gul fluorescerende olje (3,5 mg, 46%).
RF 0,55 (3:7 dietyleter/lettbensin). MS (FAB-MS): 957.8 (M+l).
Enzymfremstilling:
Fremstilling av den delvis rensede HSL:
Isolerte rottefettceller utvinnes fra bitestikkelfettvev fra ikke-behandlede hannrotter (Wistar, 220 - 250 g) ved kollagenasebehandling ifølge publiserte metoder. Fettcellene fra 10 rotter vaskes tre ganger ved flotasjon med hver gang 50 ml homogenisasjonsbuffer (25 ml Tris/HCl, pH 7,4,0,25 M sukrose, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml antipain, 20 ug/ml pepstatin) og opptas til slutt i 10 ml homogenisasjonsbuffer. Fettcellene homogeniseres i teflon-i-glass homogenisator (Braun-Melsungen) ved hjelp av 10 løfteslag ved 1500 rpm og 15°C. Homogenisatet sentrifugeres (Sorvall SM24-smårør, 5000 rpm, 10 min. 4°C). Underlaget mellom det ovenpåliggende fettsjikt og pelleten tas av og sentrifugeringen gjentas. Det derav resulterende underlag sentrifugeres på nytt (Sorvall SM24-smårør, 20000 rpm, 45 min., 4°C). Underlaget tas av og tilsettes 1 g heparin-sefarose (Pharmacia-Biotech, CL-6B, 5 x vasket med 25 mM Tris/HCl, pH 7,4,150 mM NaCl). Etter inkubasjon i 60 min. ved 4°C (utrysting med intervaller på 15 min.) sentrifugeres sammensetningen (Sorvall SM24-smårør, 3000 rpm, 10 min., 4°C). Det overliggende lag bringes ved tilsetning av iseddik til pH 5,2 og inkuberes i 30 min. ved 4°C. Utfellingen samles ved sentrifugasjon (Sorvall SS34,12000 rpm, 10 min., 4°C) og oppslemmes i 2,5 ml 20 mM Tris/HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 65 mM NaCl, 13% sukrose, 1 mM DTT, 10 ug/ml leupeptin/pepstatin/antipain. Suspensjonen dialyseres over natten ved 4°C mot 25 mM Tris/HCl, pH 7,4, 50% glycerol, 1 mM DTT, 10 ug/ml laupeptid, pepstatin, antipain og helles deretter inn på en hydroksyapatittkolonne (0,1 g pr. 1 ml suspensjon, ekvilibrert med 10 mM kaliumfosfat, pH 7,0, 30% glycerol, 1 mM DTT). Kolonnen vaskes med 4 volum ekvilibreirngsbuffer med en strømningstakt på 20 til 30 ml/t. HSL elueres med et volum ekvilibreringsbuffer inneholdende 0,5 M kaliumfosfat, og dialyseres deretter (se ovenfor) og konsentreres 5 til 10 ganger ved ultrafiltrasjon (Amicon Diaflo PM 10 filter) ved 4°C. Den delvis rensede HSL kan oppbevares i 4 til 6 uker ved -70°C.
Fremstillilng av NAG (NBD-monoacylglycerid)substratet:
6 mg fosfatidylcholin og 6 mg fosfatidylinositol oppløses hver i 1 ml kloroform. 10 mg NAG oppløses i 1 ml kloroform. To deler fosfatidylinositolløsning (for eksempel 83,5 ul) og en del fosfatidylcholinløsning (for eksempel 41,5 ul) og 100 ul NAG løsning sammenpipetteres i plastsintillasjonsbeholdere (sluttkonsentrasjon i test: 0,0375 mg fosfolipid/ml; 0,05 mg/NAG/ml). Kloroform fjernes fullstendig (225 ul totalvolum) ved overblåsing med en N2-strøm. Det tørkede substratet kan oppbevares i opp til 3 dager ved 4°C. For fremstilling av fosfolipidvesikler/celler med innføyd NAG (på testdagen) opptas det tørkede substrat i 20 ml analysebuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) og underkastes to ultralydbehandlinger med en ultralydstav (Branson Sonifier Type II, standardmikrospiss): 1. Behandling innstilling 2,2 x 1 min., mellom disse 1 min. på is; 2. Behandling innstilling 4,2 x 1 min., derimellom 1 min. på is. Under denne prosedyre forandrer fargen på substratløsningen seg fra gul (ekstinksjonsmaksimum 481 nm) til rød (ekstinksjonsmaksimum 550 nm) ved innleiring av NAG mellom fosfolipidmolekylene i vasiklene/micellene. Før benyttelse som substrat (i løpet av de neste 21) blir løsningen inkubert i enda 15 min. på is.
Indirekte NAG-analyse:
Analysen gjennomføres med 1,5 ml Eppendorfbeholdere eller 96-brønners plater i 60 min. ved 30°C. For påvisning av inhibitorer for HSL blir 10 ul av testsubstansen anordnet i analysebuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl) i nærvær av 16,6% DMSO. 180 ul av substratløsning (20 ug/ml fosfatidylcholin, 10 ug/ml fosfatidylinositol, 50 ug/ml NAG i analysebuffer) tilsettes dertil. Etter en forinkubasjon 1 15 min. ved 30°C tilpipetteres 20 ul av enzymløsningen i analysebuffere (fortynnet 1 til 4 ganger) og ekstinksjon ved 480 nm i et kyvettefotometer (0,5 ml kyvette) henholdsvis mikrotiterplateleseapparat (MicroPeta, Wallac) måles med en gang. Etter 60 min. inkubasjon ved 30°C måles ekstinksjonen på nytt. Økningen i ekstinksjonen ved 480 nm er et mål på enzymaktiviteten. Under standardbetingelser fører 20 ug partiell renset HSL til en ekstinksjonsendring på 4000 vilkårlige enheter.
Direkte NAG-analyse:
Alternativt til måling av ekstinksjonsendringen av substratløsningen undersøkes produktene fra HSL-reaksjonen ved hjelp av faseseparasjon/tynnsjiktkromatografi. For dette blir inkubasjonssammensetningen (200 ul totalvolum, se indirekte NAG-analyse) i 2 ml Eppendorfbeholdere med 1,3 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7) og tilsettes deretter 0,4 ml 0,1 M NaOH. Etter intensiv blanding (10 sek.) innledes faseseparasjonen ved sentrifugasjon (800 x g, 20 min., romtemperatur). Fra den vandige øvre fase avtas ekvivalente volum (for eksempel 0,4 ml) og ekstinksjonen bestemmes fotometrisk ved 481 nm. For tynnsjiktkromatografi tørkes den vandige fase (SpeedVac) og opptas deretter i 50 ul tetrahydrofuran. 5 ul prøver påføres på silikagel Si-60 plater (Merck, Darmstadt). Kromatografien gjennomføres med 78 ml dietyleter/22 ml lettbensin/1 ml iseddik som strømningsmiddel. Mengden av frigitt fluorescerende NBD-fettsyre bestemmes ved fosforavbilding (Molecular Dynamics, Storm 840 og ImageQuant Software) ved hjelp av en aktiveringsbølgelengde på 460 nm og emisjonsbølgelengde på 540 - 560 nm.
TAG-analyse:
For fremstilling av substratet blandes 25 - 50 uCi [<3>H]trioleoylglycerol (i toluen), 6,8 umol umerket trioleoylglycerol og 0,6 mg fosfolipid (fosfatidylcholin/fosfatidylinositol 3:1 vekt/volum), tørkes over N2 og opptas så i 2 ml 0,1 M KPj (pH 7,0) ved hjelp av ultralydbehandling (Branson 250, mikrospiss, innstilling 1 - 2,2 x 1 min. i 1-min. intervall). Etter tilsetning av 1 ml KP; og fornyet ultralydbehandling (4 x 30 sek. På is i 30-sek. Intervall) tilføyes 1 ml 20% BSA (i KPj) (sluttkonsentrasjon trioleoylglyserol 1,7 mM). For reaksjonen pipetteres 100 ul substratløsning til 100 ul HSL-løsning (HSL fremstilt som ovenfor, fortynnet i 20 mM KP;, pH 7,0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,02% BSA, 20 ug/ml pepstatin, 10 ug/ml leupeptin) og de inkuberes i 30 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7) og 1,05 ml 0,1 M K2CO3,0,1 M borsyre (pH 10,5) blandes godt og til slutt blir blandingen sentrifugert (800 x g, 20 min.). Etter faseseparasjon avtas en ekvivalent av den øvre fase (1 ml) og radioaktiviteten bestemmes ved hjelp av vaeskescintillasjonsmåling.
PNPB-analyse:
10 ul p-nitrofenylbutyrat (PNPB) (2 mM i acetonitril), 890 ul 0,1 M KPj (pH 7,25), 0,9% NaCl, 1 mM DTT og 100 ul HSL (fremstilt som ovenfor, fortynnet i denne buffer) inkuberes i 10 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7, vekt/volum) og kraftig omrysting, blir blandingen sentrifugert (800 x g, 20 min.) og inkubert i 3 min. ved 42°C. Deretter blir et ekvivalent volum av den øvre fase tatt av og absorpsjonen bestemt ved 400 nm.
Glyceryltributyrat-analyse:
For fremstilling av substratet tilsettes 5 uCi [l-<14>C]tributyrin (i toluen) til 1 ml 20 mM umerket tributyrin (i acetonitril). 10 ul av denne substratløsningen inkuberes med 390 ul 0,1 M KP; (pH 7,25), 0,9% NaCl, 1 mM DTT, 2% BSA og 100 ul HSL (fremstilt som ovenfor, fortynnet i denne buffer) i 30 min. ved 37°C. Etter tilsetning av 3,25 ml metanol/kloroform/heptan (10:9:7, vekt/volum) og 1 ml 0,1 M NaOH blir blandingen intenst blandet og til slutt sentrifugert (800 x g, 20 min.). Et ekvivalent volum (1 ml) av den ovenliggende fase avtas og radioaktiviteten bestemmes ved hjelp av væskescintillasj onsmåling.
Bestemmelse:
Substanser prøves på vanlig måte i fire uavhengige sammensetninger. Hemmingen av den enzymatiske aktivitet av HSL ved en testsubstans bestemmes ved sammenligning med en ikke-hemmet kontrollreaksjon. Beregningen av ICso-verdien skjer ved hjelp av en hernrnkurve med minst 10 konsentrasjoner av testsubstansen. For analyse av data benyttes programvarepakken GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT (Versjon 3,0).
Eksempler:
Eksempel 1: Kinetikk av spalting av NAG med HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med de angitte proteinmengder i delvis renset HSL (temperert fotometer) og til bestemte tidspunkter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm. For inaktivering inkuberes HSL i 15 min. ved 100°C (n = 8, middel ± standardavvik
SD).
Resultat: Opp til en proteinmengde på 20 ug forløper reaksjonen lineært i opp til 60 min. Ekstinksjonsforskjellen utgjør herved 0,8 - 0,9 OD. Ved mindre proteinmengder gis en linearitet opp til 180 min.
Økning av absorpsjon ved 481 nm ( vilkårlige enheter)
Eksempel 2: Avhengighet av spaltning av NAG av mengden av HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med de angitteproteinmengder i delvis renset HSL i 60 min. I delmengder av reaksjonssammensetningen bestemmes økningen i ekstinksjon ved 481 nm (dannelse av den fri NBD-fettsyre som produkt fra HSL-reaksjonen = indirekte NAG-analyse) eller minskingen i ekstinksjon ved 550 nm (forbruk av NAG som substrat for HSL-reaksjonen). Alternativt blir ytterligere delmengder ekstrahert med metanol/kloroform og den i den organiske fase inneholdte frigitte NBD-fettsyre bestemmes ved TLC-analyse og florimetri (Phosphorlmager Storm 840, Molecular Dynamics) (=direkte NAG-analyse) (n = 6, middel ± standardavvik SD).
Resultat: Opp til en proteinmengde på 20 ug forløper reaksjonen med hensyn til
produktdannelse (ekstinksjonsøkning ved 481 nm eller opptreden av fri NBD-fettsyre ifølge TLC-analyse) og som med hensyn til substratforbruket (ekstinksjonsminsking ved 550 nm) lineært. Overensstemmelsen mellom indirekte og direkte NAG-analyse taler for analyse av spaltingen av NAG i indirekte analyse.
Absorpsjonsendring [vilkårlige enheter]
Eksempel 3: Avhengighet av spaltingen av NAG ved HSL av
substratkonsentrasjonen
Forskjellige mengder av NAG (ved konstant forhold til fosfolipidene) inkuberes med de angitte mengder av delvis renset HSL i 60 min. og deretter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Spaltningshastigheten viser ved alle tre enzymmengder forløpet av en typisk metningskurve. På grunn av den enzymatiske spesielle karakter av HSL-reaksjonen ("todimensjonal" substratpresentasjon, "interfacial aktivasjon") lar seg imidlertid bare ved 5 ug protein og den laveste substratkonsentrasjon en tilnærmet lineær avhengighet seg fastslå. Et fornuftig kompromiss mellom substratavhengighet og signalstyrke (OD 0,6 til 0,7) representerer kombinasjonen av 20 ug protein og 0,05 mg/ml NAG.
Økning i absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 4: Avhengighet av spaltningen av NAG ved hjelp av HSL av forholdet
NAG og fosfolipider
NAG (0,05 mg/ml) prepareres som substrat med forskjellige mengder av fosfolipider (total mengde) under de angitte forhold mellom fosfatidylinositol og fosfatidylcholin ved ultralydbehandling og inkuberes deretter med delvis renset HSL (20 ug) i 60 min. Økningen i ekstinksjon ved 481 nm bestemmes (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Enzymhastigheten er størst ved et forhold fosfatidylinositol/fosfatidylcholin PI/PC (vektbasert) på 3:1 og 0,0375 til 0,075 totalfosfolipid. Det utpregede optimumsforløp for totalkonsentrasjonen av fosfolipidene så vel som også for deres sammensetning, taler for betydningen av presentasjonen av substratene av HSL (her NAG) i fosfolipidvesikler og/eller miceller henholdsvis for tildannelsen av et monolag av fosfolipider på den (nøytrale) kjerne av substratet.
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 5: Sammenligning av den indirekte/direkte NAG-analyse med en konvensjonell HSL-analyse ved bestemmelse av ICso-verdiene for forskjellige inhibitorer
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med 20 ug partiell renset HSL i 60 min. i nærvær av forskjellige konsentrasjoner (0,1 til 100 uM) av forskjellige substanser. I delmengder av sammensetningene bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (indirekte analyse) eller den frigitte NBD-FA ekstraheres med kloroform/metanol og bestemmes ved hjelp av TLC-analyse og fluorimetri (direkte analyse). Alternativt inkuberes [ H]trioleylglycerol med partiell renset HSL ifølge publiserte betingelser og det frigitte radiomerkede oleat bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol ved hjelp av væskescintillasjonsmåling. Fra hemmkurvene bestemmes ICso-verdien (n = 6, middel ± standard avvik SD).
Resultat: For alle testede substanser resulterte med de tre metoder typisk sigmoidale hemmkurver. ICso-verdiene lå ved indirekte/direkte NAG-analyse (ekstinksjonsøkning ved 481 nm/frigivelse av NBD-fettysyren) generelt med faktoren 4 til 10 lavere i forhold til spaltning av trioleoylglycerol ved hjelp av HSL, idet rangordningen av inhibitoren (ifølge deres ICso-verdier) dog var identisk for alle tre metoder. Dette bekrefter publiserte funn om at virkningen av inhibitorer av HSL avhenger av typen av substrat og substratpresentasjonen. Utover dette kan også de effektive substratkonsentrasjoner (NAG og trioleoylglycerid) mellom de to analyser være forskjellig (på grunn av substratfremstillingen som vesikler eller miceller knapt bestembar) og dermed forklare disse forskjeller ved kompetitive inhibitorer. De nesten identiske ICso-verdier, som ble oppnådd ifølge ekstinksjonsendringen og NBD-fettsyre-trigivelsen, taler for spalting av NAG ved hjelp av HSL og dermed frigivelse av NBD-fettsyre som årsak til ekstinksjonsøkningen ved 481 nm, dvs. at NAG-analysen vedrører den lipolytiske spalting av lipider.
IC50 [uM]
Eksempel 6: Sammenligning av den indirekte NAG-analyse med analyser på
TAG, PNPB og Tributyrin
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med 20 ug partiell renset HSL i 60 min. i nærvær av forskjellige konsentrasjoner (0,1 til 100 uM) av forskjellige substanser. I delmengder av sammensetningene bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm (indirekte analyse). Alternativt blir [<3>H]trioleoylglycerol (TAG), p-nitrofenylbutyrat (PNPB) eller [<14>C]tributyrin inkubert med delvis renset HSL og det frigitte radiomerkede oleat, p-nitrofenol henholdsvis butyrat bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol ved hjelp av væskescintillasjonsmåling henholdsvis fotometri. Fra hemmkurvene bestemmes ICso-verdien (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Den relative rangordning av inhibitorene, manifestert i ICso-verdiene, er identisk for de to analyser med lipidsubstrat (NAG og TAG). Dette gjelder i prinsippet også for de vannløselige substrater, tributyrin og PNPB, men noen virkestoffer, som signifikant reduserer HSL-aktiviteten overfor NAG og TAG, er uvirksomme i hemmingen av HSL overfor tributyrin og PNPB. Dette lar seg forklare med en interferens av disse hemmstoffer med lipidbindingen av HSL (ved hjelp av lipidbindingsdomenet), mens den katalytiske mekanisme ikke påvirkes. Vannløselige substrater spaltes derfor av HSL også i nærvær av disse hemmstoffer. ICso-verdiene for inhibitorer, som virker også ved vannløselige substrater, ligger generelt mellom de tilsvarende for NAG og TAG som substrat. Dette viser at NAG forholder seg som "lipidaktig" substrat for HSL i likhet med de autentiske triglycerider og NAG-analysen kan anvendes for påvisning av hemmstoffer som blokkerer lipidbindingen (så vel som også den katalytiske mekanisme) av HSL.
IC50 [uM]
Eksempel 7: Innvirkning av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler på
substratstabiliteten
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i nærvær av stigende konsentrasjoner av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler i 180 min. ved 37°C og deretter bestemmes ekstinksjonsminskingen av 550 nm (oppløsning av den spesielle substratstruktur) (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Substratet (fosfolipid-vesikler henholdsvis miceller) viste forskjellig ømfintlighet overfor de anvendte midler. Ekstinksjonen, dvs. mengden av substrat forringet seg i nærvær av 1% DMSO med 10%, ved etanol eller metanol med maks. 20%, ved 1% TX-100 eller SDS ved maks. 30%. Mest effektiv ved oppløsningen av vesiklene/micellene var DMF, med 1% var over 80% av NAG frigitt fra fosfolipid/vesikkelstrukturene. Rangordningen i effektiviteten for anvendte løsningsmidler og detergensmidler ved oppløsningen av substratstrukturen er forlikelig med en forskyvning av ekstinksjonsmaksimum (fra 481 nm til 550 nm) av NAG, henholdsvis den kromofore gruppe (NBD) ved innbygning i den apolare omgivelse av fosfolipidvesikkel/micellene og den derved betingede fjernelse fra den vandige omgivelse. Frigivelse av NAG fra disse strukturer i vandig miljø ved oppløsning av vesiklene/micellene (for eksempel ved hjelp av detergensmiddelet) eller frigivelse av den kromofore gruppe som NBD fettsyre ved hjelp av lipolytisk spalting (ved hjelp av HSL) av NAG fører til en forringelse av ekstinksjonen ved 550 nm og en økning av ekstinksjonen ved 481 nm. Med stabiliteten ved 1% DMSO oppfyller NAG-substratet en av basisforutsetningene for en robust HTS-analyse.
Absorpsjonsanalyse ved 550 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 8: Innvirkning av forskjellige detergensmidler og løsningsmidler på
aktiviteten av HSL
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes med HSL (20 ug) i nærvær av stigende konsentrasjoner av forskjellige midler i 60 min. Ekstinksjonen ved 481 nm bestemmes (n = 4, middel ± standard avvik SD).
Resultat: DMSO til 1% reduserte mengden av frigitt NBD-FA med omtrent 10%. Da ved denne DMSO-konsentrasjon opp til 10% NAG frigis fra
fosfolipidvesiklene/micellene ved oppløsning av strukturene, resulterer regnemessig en minsking av enzymaktiviteten med 20%. Ved 0,5% DMSO utgjør reduksjonen ennå 10%. TX-100, aceton, etanol og metanol bevirker mellom 0,1 og 1% en forhøyelse av HSL-aktiviteten, muligens fremkalt ved hjelp av en mer effektiv substratpresentasjon. Ved høye konsentrasjoner interfererer de med aktiviteten. DMF fører allerede ved konsentrasjoner fra 0,1% til et signifikant aktivitetstap av HSL.
Absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 9: Spalting av NAG ved hjelp av lipaser med forskjellig spesifisitet
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i 60 min. med 20 ug partiell HSL, 75 ug partiell renset LPL fra rotteadipozytter, 20 mU bakteriell lipase, 50 mU pankreatisk lipase, 100 mU PLA2 fra slangegift og 0,5 U PC-spesifikk fosfolipase fra Bacillus cereus. Økningen i ekstinksjon ved 481 nm bestemmes (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat: Under de gitte for HSL optimerte betingelser, viser som ventet, HSL (100%) og LPL (omtrent 70%) den største aktivitet. Den bakterielle og pankreatiske lipase er tydelig mindre aktiv (25 henholdsvis 1%), mens den bakterielle PC-spesifikke fosfolipase var praktisk inaktiv. Disse sterkt forskjellige aktiviteter viser spesifisiteten for de valgte betingelser ved den indirekte NAG-analyse for HSL, således blir for eksempel i grove celleekstrakter eventuelt inneholdte fosfolipaser ikke omfattet. Disse data viser imidlertid også den prinsipielle anvendbarhet av analyseprinsippet på andre lipaser.
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 10: Spaltning av forskjellige med NBD-fettsyre modifiserte
acylglycerider ved hjelp av HSL
NAG (0,05 mg/ml) eller forskjellige NBD-fettsyremodifiserte lipider i forskjellige konsentrasjoner inkuberes med 20 ug partiell renset HSL. Til bestemte tidspunkter bestemmes ekstinksjonen ved 481 nm bestemmes (n = 5, middel ± standard avvik SD).
Resultat:
Økning av absorpsjon ved 481 nm (vilkårlige enheter)
Eksempel 11: Hemming av HSL ved hjelp av diisopropylfosfofluoridat
NAG (0,05 mg/ml) inkuberes i 60 min. med 20 ug partiell renset HSL i nærvær av stigende konsentrasjoner av diisopropylfosfofluoridat. I delmengder av reaksjonssammensetningen bestemmes økningen i ekstinksjon ved 481 nm (indirekte NAG-analyse) eller etter ekstraksjon med kloroform/metanol bestemmes mengden av frigitt NBD-FA i den organiske fase ved hjelp fuorimetri (direkte NAG-analyse). Alternativt gjennomføres inkubasjonen av HSL med [<3>H]trioleoylglycerol som substrat (se ovenfor) og mengden av frigitt radiomerket oljesyre bestemmes etter ekstraksjon med kloroform/metanol. Spaltningsaktiviteten i fravær av inhibitor settes for hver analyse til 100% (n = 7, middel ± standard avvik SD).
Resultat:
I alle tre analyser vises typisk sigmoidale hemmkurver for diisopropylfosfofluoridat. De derav utregnede ICso-verdier skiller seg ikke signifikant fra hverandre for den indirekte (0,8 mM) eller direkte NAG-analyse (1,1 mM). For spaltingen av trioleoylglycerid utregnes med 2,0 mM en noe høyere ICso-verdi. Dette står i samsvar med de ovenfor konstaterte forskjeller i hemmvirkningene av de forskjellige inhibitorer, som iakttas med denne analyse (se eksempel 6 for mulig forklaring). Uavhengig derav står de oppnådde IC50-verdier for hemmingen av HSL ved hjelp av diisopropylfosfoflluoridat ved den indirekte NAG-analyse i godt samsvar med publiserte data (P. Stralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987,147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol.Chem. 258,1983,15146-15151: P. Belfrage, B. Jergill, P. Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75,1977,259-263).
% maksimal HSL-aktivitet
Eksempel 12: Gjennomførbarhet for den indirekte NAG-analyse i
mikrotiterplateformat
NAG inkuberes i forskjellige tidsrom med delvis renset HSL i et analysevolum på 200 ul i brønner i 96-brønners mikrotiterplater. Ekstinksjonen ved 481 nm undersøkes i et mikrotiterplate-leseapparat.
Resultat:
Under de valgte betingelser er reaksjonen opp til 60 min. lineær. Varianzen (standard avvik SD) ligger derved mellom 4 og 7%. Dermed er den indirekte NAG-analyse egnet for innsats i HT-screening.
Økning av absorpsjon ved 481 nm [vilkårlige enheter]
Anvendte forkortelser:
Vilk. enheter vilkårlige enheter
BSA Bovint serumalbumin
cAMP cyklisk adenosinmonofosfat
DCC dicykloheksylkarbodiimid
DMF N,N-dimetylformamid
DMSO dimetylsulfoksid
DTT ditiothreitol
EDTA etylendiamin-N,N-N' ,N'tetraeddiksyre
FAB-MS hurtig atombombardement massespektrometri HSL hormonsensitiv lipase
Kp, kaliumdihydrogenfosfat/kaliumfosfatbuffer
LPL lipoproteinlipase
NAG NBD-monoacylglycerid: 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre-2,3-dihydroksypropylester
NBD 4-klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3 -diazol
NBD-FA NBD-fettsyre: 12-(7-nitro-benzo[ 1,2,3 ]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre
NIDDM ikke-insulinavhengig Diabetes Mellitus
PLA2 fosfolipase A2
PLC fosfolipase C
PNPB p-nitrofenylbutyrat
SD standard avvik
SDS natriumdodecylsulfat
TAG [<3>H]-trioleoylglycerol
Tris Tris(hydroksymetyl)aminometan
TLC tynnsjiktkromatografi
TX-100 "Triton"X-100

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, karakterisert v e d at c) en fettsyre forsynt med en fluorescensmarkør omsettes med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base for å gi et monoacylglycerid; d) dette monoacylglycerid underkastes en ultralydbehandling med fosfolipider i forholdet 1:10 til 10:1 mg/ml hvorfra substratet, som kan gjenkjennes ved et fargeomslag fra gult til rødt, dannes.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fluorescensmarkøren er dansyl eller NBD.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at fluorescensmarkøren er NBD.
4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at fettsyren er en mettet eller umettet karboksylsyre med en kjedelengde fra C-8 til C-20.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at fettsyren er en mettet C-12-karboksylsyre.
6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at det som fosfolipider anvendes forsfatidylcholin og fosfatidylinositol alene eller sammen.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfatidylcholin og fosfatidylinositol anvendes sammen i forholdet fra 10:1 til 1:10.
8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at monoacylglyceridet er 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre.
9. Substrat, karakterisert ved at det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8.
10. Substrat ifølge krav 9, for anvendelse i en fremgangsmåte for identifisering av fosfolipid/lipidstrukturer.
11. Substrat ifølge krav 9, for anvendelse i en fremgangsmåte for identifisering av lipaser og lipasehemmere.
12. Fremgangsmåte for fremstilling av monoacylglyceridet 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre, karakterisert ved at den omfatter å først omsette 12-aminolaurinsyre med 7-klor-4-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazol og deretter omsette det erholdte mellomproduktet med 2,3-epoksypropanol i alkoholisk løsning ved romtemperatur under tilsetning av en base.
13. Glyceridrest, karakterisert ved at den er 2,3-dihydroksypropyl 12-(7-nitro-benzo[l,2,3]oksadiazol-4-ylamino)-dodekansyre.
14. Fremgangsmåte for identifisering av lipaser og lipasehemmere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9; b) å innkubere dette substratet med en lipase; og c) å bestemme fargeendring.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at høykapasitetsscreening (HTS) anvendes for å identifisere lipaser og lipasehemmere.
16. Fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipaser/lipasehemmere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9; b) å innkubere dette substratet med en lipase; c) å bestemme hastighet for fargeendring; og d) å fastslå aktiviteten
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at substratet innkuberes med en hormonsensitiv lipase.
18. Analysesystem for identifisering av en lipase/en lipasehemmer, karakterisert ved at det inneholder a) et substrat ifølge krav 9, b) en ultralydanordning og eventuelt c) en anordning for visuell/optisk og/eller fluorimetrisk bestemmelse av fargeendringen.
19. Analysesystem for bestemmelse av aktiviteten av en lipase/en lipasehemmer, karakterisert ved at det inneholder a) et substrat ifølge krav 9, b) en ultralydanordning, c) en anordning for bestemmelse av hastigheten av fargeendringen, og d) en anordning for absorpsjons- eller fluorescensmåling.
20. Fremgangsmåte for bestemmelse av en detergentvirkning eller cytotoksisitet av forbindelser, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9, b) å innkubere dette substratet med en testforbindelse, og c) å visuelt/optisk eller fluorimetrisk bestemme fargeendringen fra rødt til gult som kjennetegner cytotoksiske forbindelser og forbindelser med detergentvirkning.
21. Fremgangsmåte for bestemmelse av aktiviteten av lipidtransportere, karakterisert ved at den omfatter a) å tilveiebringe et substrat som definert i krav 9, b) å funksjonelt rekonstruere transportører/overføringsproteiner i liposomer og c) å tilsette liposomene fremstilt ifølge b) til substratet ifølge a) og bestemme fargeendringen visuelt eller optisk.
NO20015263A 1999-04-30 2001-10-26 Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat NO329086B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19919634A DE19919634C2 (de) 1999-04-30 1999-04-30 Test zur Bestimmung der Integrität komplexer Phospholipid/Lipid-Strukturen mit Hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter Acylglyceride und dessen Anwendung zur Bestimmung der Aktivität von Lipasen
PCT/EP2000/003308 WO2000067025A1 (de) 1999-04-30 2000-04-13 Bestimmung komplexer phospholipid/lipid-strukturen mit hilfe synthetischer fluoreszenz-markierter acylglyceride

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20015263D0 NO20015263D0 (no) 2001-10-26
NO20015263L NO20015263L (no) 2001-12-19
NO329086B1 true NO329086B1 (no) 2010-08-16

Family

ID=7906364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20015263A NO329086B1 (no) 1999-04-30 2001-10-26 Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6783949B1 (no)
EP (1) EP1177442B1 (no)
JP (1) JP3712232B2 (no)
KR (2) KR100723287B1 (no)
AR (1) AR023778A1 (no)
AT (1) ATE404868T1 (no)
AU (1) AU780683B2 (no)
BR (1) BR0010191A (no)
CA (2) CA2742143C (no)
DE (2) DE19919634C2 (no)
DK (1) DK1177442T3 (no)
ES (1) ES2310165T3 (no)
IL (2) IL145919A0 (no)
MX (1) MXPA01009393A (no)
NO (1) NO329086B1 (no)
NZ (1) NZ515085A (no)
PT (1) PT1177442E (no)
WO (1) WO2000067025A1 (no)
ZA (1) ZA200106627B (no)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2824334B1 (fr) 2001-05-03 2003-10-10 Coletica Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique
US7968306B2 (en) 2002-02-13 2011-06-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for measuring activity of a specific fraction of albumin
AU2003215175A1 (en) * 2002-02-13 2003-09-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Fluorescent phospholipase assay, phospholipase a2 inhibitor and stimulator, and the use thereof
FR2870741B1 (fr) * 2004-05-25 2008-03-14 Coletica Sa Phase lamellaires hydratees ou liposomes, contenant une monoamine grasse ou un polymere cationique favorisant la penetration intercellulaire, et composition cosmetique ou pharmaceutique la contenant.
KR101041808B1 (ko) * 2004-06-01 2011-06-17 엘지전자 주식회사 디엘피 프로젝터의 dmd 칩 냉각용 히트싱크의 구조
AU2005259218B2 (en) * 2004-07-01 2010-07-08 Dsm Ip Assets B.V. Novel method for screening and selecting enzymes
RU2424228C2 (ru) * 2005-03-30 2011-07-20 Юниверсити Оф Цюрих Ингибиторы нейротрипсина
CN113109479A (zh) * 2021-04-19 2021-07-13 湖北浩华生物技术有限公司 一种高效液相色谱检测三丁酸甘油酯的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63064C (fi) * 1980-04-09 1983-04-11 Ksv Chemicals Oy Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet
DE3786043T2 (de) * 1986-07-15 1993-11-25 Abbott Lab Fluoreszenzpolarisationsverfahren zur Überwachung der Reife der Lunge von Föten.

Also Published As

Publication number Publication date
ES2310165T3 (es) 2009-01-01
KR100770968B1 (ko) 2007-10-30
AU780683B2 (en) 2005-04-14
DE19919634C2 (de) 2001-06-07
DE50015310D1 (de) 2008-09-25
KR20060134224A (ko) 2006-12-27
MXPA01009393A (es) 2002-02-25
CA2384394C (en) 2011-11-08
CA2384394A1 (en) 2000-11-09
EP1177442A1 (de) 2002-02-06
EP1177442B1 (de) 2008-08-13
DE19919634A1 (de) 2000-11-23
ZA200106627B (en) 2002-07-31
JP3712232B2 (ja) 2005-11-02
AR023778A1 (es) 2002-09-04
CA2742143A1 (en) 2000-11-09
IL145919A0 (en) 2002-07-25
DK1177442T3 (da) 2008-12-08
NO20015263D0 (no) 2001-10-26
NZ515085A (en) 2004-04-30
BR0010191A (pt) 2002-02-13
US6783949B1 (en) 2004-08-31
WO2000067025A1 (de) 2000-11-09
KR100723287B1 (ko) 2007-05-30
IL145919A (en) 2010-06-16
KR20020022657A (ko) 2002-03-27
JP2002543428A (ja) 2002-12-17
PT1177442E (pt) 2008-10-15
ATE404868T1 (de) 2008-08-15
CA2742143C (en) 2014-03-18
AU3966100A (en) 2000-11-17
NO20015263L (no) 2001-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duque et al. New fluorogenic triacylglycerol analogs as substrates for the determination and chiral discrimination of lipase activities
Dennis Phospholipase A2 mechanism: Inhibition and role in arachidonic acid release
Reynolds et al. 1-Hexadecyl-2-arachidonoylthio-2-deoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholine as a substrate for the microtiterplate assay of human cytosolic phospholipase A2
US20050026235A1 (en) Fluorescent phospholipase assays and compositions
Volwerk et al. Activation of porcine pancreatic phospholipase A2 by the presence of negative charges at the lipid-water interface
CA1337656C (en) Substrates for phospholipases
NO329086B1 (no) Fremgangsmate for fremstilling av et substrat for bestemmelse av integriteten av komplekse fosfolipid/lipidstrukturer, substrat fremstilt ved nevnte fremgangsmate samt ulike anvendelser av nevnte substrat
US20110312008A1 (en) Enzymatic Assay for the Quantitative Determination of Phospholipase A1 or A2 Activity in a Sample
US5464754A (en) Assay and substrate for arachidonoyl-specific phospholipase A2
JPH06505627A (ja) 分析法
El Alaoui et al. Development of a high-throughput assay for measuring phospholipase A activity using synthetic 1, 2-α-eleostearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine coated on microtiter plates
Zandonella et al. Enantiomeric perylene‐glycerolipids as fluorogenic substrates for a dual wavelength assay of lipase activity and stereoselectivity
Lin et al. Use of short-chain cyclopentano-phosphatidylcholines to probe the mode of activation of phospholipase A2 from bovine pancreas and bee venom.
Piel et al. Chemoenzymatic synthesis of fluorogenic phospholipids and evaluation in assays of phospholipases A, C and D
JP2839038B2 (ja) 酵素活性のアッセイ
US20110312006A1 (en) Enzymatic Assay for the Quantitative Determination of Phospholipase A1 or A2 Activity in a Sample
Caramelo et al. A subnanogram assay for phospholipase activity based on a long-chain radioiodinatable phosphatidylcholine
Birner‐Grünberger et al. Fluorescent probes for lipolytic enzymes
Hermetter et al. Fluorescence spectroscopic studies on structure and function of lipolytic enzymes
Hassanein Studies on the endogenous phosolipids of mammalian kidney and their in vitro hydrolsis by endogenous phospholipases

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees