JP2002543428A

JP2002543428A - 合成蛍光標識アシルグリセリドによる複合リン脂質／脂質構造の決定

Info

Publication number: JP2002543428A
Application number: JP2000615813A
Authority: JP
Inventors: ギュンター・ミュラー; シュテファン・ペートリ; ホルガー・ヨルダン; ホルスト・クライネ; ホルスト・ヴェンツェル
Original assignee: アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2002-12-17
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: ES2310165T3; KR100770968B1; AU780683B2; DE19919634C2; DE50015310D1; KR20060134224A; MXPA01009393A; CA2384394C; CA2384394A1; EP1177442A1; EP1177442B1; DE19919634A1; ZA200106627B; JP3712232B2; AR023778A1; NO329086B1; CA2742143A1; IL145919A0; DK1177442T3; NO20015263D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、芳香族物質の配置に助力して電荷転移複合体、例えば複合リン脂質／脂質構造（二重層、単層、集合体、ミセル）などを与える構造を、合成蛍光標識アシルグリセリドを用いて同定するための簡単な連続的試験、およびリパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性を決定するためのその使用、この試験に使用するためのモノアシルグリセリド、ならびにその製造方法、それから得られる基質および該基質の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、芳香族物質の配置に助力して例えば複合リン脂質／脂質構造（二重
層、単層、集合体、ミセル）のような電荷転移複合体を与える構造を合成蛍光標
識アシルグリセリドにより同定するための簡単な連続的試験、およびリン脂質／
脂質阻害剤の活性を決定するためのその使用に関する。

【０００２】リパーゼ、ホスホリパーゼおよび他の脂肪分解酵素は、バイオテクノロジーお
よび医学の分野において極めて重要である。ある種の代謝不全において、脂肪組
織中で上昇したリパーゼ活性を検出することができ、この上昇した活性は、一部
はこの疾患の発生機序の原因であると考えられている。身体のエネルギー予備の
大部分は脂肪組織の細胞中に脂肪酸のトリグリセリドとして貯蔵される。インス
リンにより引き起こされる本質的な同化過程には、トリグリセリド合成のための
物質吸収の刺激および脂肪生成の増加が含まれる。インスリンにより引き起こさ
れるもう一つの重要な過程は、脂肪分解の阻害であり、その異化性ホルモン、主
としてカテコールアミンによる過程は、トリグリセリドの加水分解を刺激し、こ
れにより脂肪酸の遊離を誘発する。インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）と
結びついた重要な問題は、脂肪細胞の非阻害脂肪分解にその原因があることであ
り、これはエステル化されていない脂肪酸の血漿中レベルを上昇させる。この考
えによれば、脂肪酸は肝臓における糖新生を刺激し、まだ充分には確認されてい
ない分子機構により、骨格筋のグルコース利用を減少させる。事実、脂肪分解阻
害剤、例えば脂肪細胞のニコチン酸受容体の作動剤により脂肪細胞中での脂肪分
解を抑制すると、血漿中の脂肪酸濃度および糖尿病の動物および患者の上昇した
血糖の両者を低下させる。残念ながら、これらの有益な効果は特に著しく顕著で
はなく、比較的に短い時間しか持続しない。これは、脂肪分解の速度決定酵素で
あるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）が調節機構に介入することにより引き起
こされる生理的反対調節に基づくのかもしれない。脂肪分解反応の阻害が、少な
くとも脂肪細胞から脂肪酸を遊離させるのを抑制することに関して、改善された
ＮＩＤＭＭの治療に導くであろうと推定するのにもっともな理由がある。この場
合、好適な阻害剤によりＨＳＬを直接に阻害することは、ＨＳＬの複雑な調節へ
の介入という自明の困難を回避するはずである。

【０００３】脂肪分解酵素の活性は、伝統的には放射測定法、滴定法、酵素法または蛍光測
定／光度測定法を用いて調査される。放射測定法は最も感度が良いが、高価な放
射標識基質を必要とし、不連続的であり、放射性標識生成物から放射性標識基質
を分離しなければならない。このような分離はしばしば面倒であり、放射性廃棄
物の回避／低減は重要性を増している（特に試験数が多い場合に当てはまる）。

【０００４】滴定試験は連続的であり、天然基質および合成基質の両者を用いて実施できる
が、かなり低い感度にたびたび苦しめられ、プロトンの放出量に影響を与える状
態では影響を受けやすい。

【０００５】脂肪分解反応産物の一つ（例えばグリセロール）を検出するための酵素法また
はクロマトグラフ法は極めて感度が高く、比較的に適切なものであるが、実際に
酵素法／クロマトグラフ法で検出する前にリパーゼ反応のインキュベーションバ
ッチを処理することが必要なので、同様に取り扱いの点で複雑である。酵素試験
のカップリングは終点測定（「タイムストップ」測定）しか許容しない。さらに
未知物質の研究（例えば潜在的阻害剤の探索）において、酵素に対する検出反応
の影響を原則として除外することができず、それ故に適切なコントロールを必要
とする。

【０００６】これらの考慮により蛍光測定／光度測定法の開発が促進された。これらは原則
として放射測定法の感度があるが、発蛍光団または発色団で修飾された合成基質
またはサンプルを必要とする。伝統的な蛍光測定／光度測定法は放射測定手法と
同様に、進行が不連続的であり、生成物から基質を分離することが必要である。
最近、連続的な蛍光測定／光度測定アッセイが開発され (S. Hendrickson, Anal
yt. Biochem 219 (1994) 1-8)、これは基質と比較した、生成物の蛍光極大また
は吸光極大のシフトに基づいている。しかしながらこれら全ての方法は、ホスホ
リパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリナーゼおよびグルコシルセラミドグルコシダーゼの検出に限られている。
トリグリセリド切断酵素（例えばホルモン感受性リパーゼ、モノグリセリドリパ
ーゼ、ジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパー
ゼ、膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼ、細菌リパーゼ、ＰＬＡ₂、ＰＬＣ、コレステ
ロールエステラーゼ）の連続的活性測定に適する発蛍光団／発色団基を有する基
質は、まだ知られていない。

【０００７】それ故に本発明の目的は、芳香族物質の配置に助力して例えば複合リン脂質／
脂質構造（二重層、単層、集合体、ミセル）のような電荷転移複合体を与える構
造を合成蛍光標識アシルグリセリドにより同定するための簡単な連続的試験、お
よびリパーゼのような脂質結合タンパク質の活性を決定する方法を開発すること
である。

【０００８】脂質輸送体は、脂質を認識するがリパーゼのようには切断せず、その代わりに
生物学的膜を通して輸送するタンパク質である。ここでリパーゼとは、例えば R
.D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998) 1694-1720 において定義さ
れているような、生物学的に関連する内因性リパーゼを意味すると理解される。

【０００９】ホルモン感受性酵素とは、その活性がリン酸化依存性の第二メッセンジャー（
例えばｃＡＭＰ）により影響を受けるか、またはホルモンのコントロール下にあ
る他のアロステリック機構（例えばタンパク質-タンパク質相互作用）により影
響を受ける酵素を意味すると理解される。ｃＡＭＰレベルを調節するホルモンは
、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、グルカゴンおよびインスリンである
。

【００１０】本発明は、ａ) 蛍光標識を備えた脂肪酸を、アルコール溶液中、例えばＣ₁〜Ｃ₄−アルカ
ノール、好ましくはメタノールなどの中で、室温において、塩基、例えば非親核
性無機塩基、好ましくはアルカリ金属炭酸塩およびアルカリ金属Ｃ₁〜Ｃ₄−アル
カノレート、特に好ましくはメタノレート、例えばナトリウムメタノレートまた
はカリウムメタノレートを添加して、2,3-エポキシプロパノールと反応させてモ
ノアシルグリセリドを生成させ、ｂ) このモノアシルグリセリドをリン脂質と共に１：１０〜１０：１、好まし
くは１：２〜３：１、特に好ましくは１：１〜１.５：１の比（mg／ml）で超音
波処理に供し、これから、黄色から赤色への変色により認識可能な基質を生成さ
せることを含む、基質の製造方法に関する。

【００１１】蛍光標識とは、光で励起した後にそれ自体が光を発することが可能である分子
内の化学基と定義される。ここで、このような基は、約１nMの最低濃度でもなお
基質自体が検出可能である基質を製造するために用いられる。例えばＮ,Ｎ−ジ
メチルアミノスルホン酸（dansyl、ダンシル）またはＮＢＤ、好ましくはＮＢＤ
を挙げることができる。

【００１２】脂肪酸とは、例えば、飽和または不飽和であり、Ｃ-８〜Ｃ-20の鎖長を有する
長鎖カルボン酸、好ましくは飽和または不飽和Ｃ-12、Ｃ-14、Ｃ-16およびＣ-18
カルボン酸、特に好ましくは飽和Ｃ-12カルボン酸を意味すると理解される。

【００１３】蛍光標識を備えた脂肪酸を、2,3-エポキシプロパノールを用いてモノアシルグ
リセリドと結合させた。この合成基質およびリン脂質、例えばホスファチジルイ
ノシトールおよびホスファチジルコリンの各単独または一緒から、場合により１
０：１〜１：１０、好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１の重量比
において、例えば約１〜１０分間、好ましくは１〜６分間、特に好ましくは４分
間持続する超音波処理により、調査すべきリパーゼの基質として役立つミセルま
たは小嚢を形成した。ミセルまたは小嚢中へのこの取り込みは、この構造におい
て空間的に近接している芳香族物質の電荷転移複合体に基づいて、黄色から赤色
への変色を伴う。リパーゼと共にインキュベートすると、脂肪酸が除去されるこ
とになり、標識脂肪酸およびグリセロールが遊離される。

【００１４】リン脂質として、例えばホスファチジルコリン（６mg）およびホスファチジル
イノシトール（６mg）をクロロホルム（各１ml）に溶解する。基質を製造するた
めに、２部のホスファチジルイノシトール溶液（例えば８３.５μｌ）および１
部のホスファチジルコリン溶液（例えば４１.５μｌ）および１００μｌのＮＡ
Ｇ溶液（１mlのクロロホルム中１０mg）をピペットで一緒にする（試験における
最終濃度：０.０３７５mgのリン脂質／ml；０.０５mg／ＮＡＧ／ml）。クロロホ
ルムを除去した後、２０mlの２５mM tris／ＨＣｌ、ｐＨ７.４；１５０mlのＮａ
Ｃｌを添加し、超音波プローブ（Branson Sonifier タイプ II、標準マイクロチ
ップ、２５Ｗ）を用いて、二通りの超音波処理を行う。第一処理：セッティング
２、２×１分、合間にそれぞれ氷上で１分；第二処理：セッティング４、２×１
分、合間にそれぞれ氷上で１分。この手順の間に、基質溶液の色は、小嚢／ミセ
ルのリン脂質分子間にＮＡＧが介在するために、黄色（吸光極大４８１nm）から
赤色（吸光極大５５０nm）に変わる。

【００１５】遊離脂肪酸はミセルまたは小嚢を形成しない。それ故に赤色から黄色への変色
はミセル／小嚢から脂肪酸が除去される間に観察される。こうしてミセル／小嚢
の破壊、従ってリパーゼの酵素活性の破壊を、赤色から黄色への変色により視覚
的に（４８１nmまたは５５０nmにおいて）、キュベット光度測定器（例えば Bec
kman (Munich) からの DR-640）またはマイクロタイタープレートリーダー（例
えば Wallac (Turku, Finland) からの Microβeta）を用いて、あるいはその代
わりにホスホ装置（例えば Molecular Dynamics (Krefeld) からの Storm 840）
、蛍光スキャナー（例えば Shimazu (Osaka, Japan) からの DA-2）を用いて、
またはＣＣＤ（チャージ−カップルド装置）（この装置は電気信号および光学的
信号を処理するための集積回路を有し、この装置では情報が貯蔵され電荷の形態
で伝達される）に基づくイメージ分析方法（例えば Molecular Devices (USA)
からの ArrayScan）を用いて、蛍光測定法により、測定することができる。

【００１６】これら全ての方法は、好ましくは高速処理スクリーニング（ＨＴＳ）と組み合
わせて採用される。この概念に基づく他の方法は、化合物の細胞毒性および界面
活性剤の作用の測定である。

【００１７】本発明はまた、上記方法により製造された基質、ならびに芳香族物質の配置に
助力して電荷転移複合体を与える構造の同定方法に、好ましくはリン脂質／脂質
構造、特に好ましくは上記のようなリパーゼ／リパーゼ阻害剤の同定方法に使用
するための基質の使用に関する。この方法は、単層または二重層構造［これらの
構造は湾曲している（例えばミセルまたは小嚢）か、または平面的である（例え
ば人工的に作成されたまっすぐな二重層）］の破壊であって変色を伴う破壊にも
使用することができる。変色は、上記のように視覚的／光学的に、または蛍光測
定法により測定可能な手段で監視することができる。

【００１８】本発明はさらに、１２−アミノラウリン酸を、アルコール溶液中で室温におい
て塩基、例えばアルカリ金属炭酸塩およびアルカリ金属Ｃ₁〜Ｃ₄−アルカノレー
ト、好ましくはメタノレート、例えばナトリウムメタノレートまたはカリウムメ
タノレートを添加して、最初に７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１
,３−ジアゾールと反応させ、次いで得られた中間体を２,３−エポキシプロパノ
ールと反応させることによる、モノアシルグリセリドである１２−（７−ニトロ
ベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ)-ドデカン酸２,３−
ジヒドロキシプロピルの製造方法、およびモノアシルグリセリドである１２−（
７−ニトロベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカ
ン酸２,３−ジヒドロキシプロピルそれ自体に関する。

【００１９】本発明の目的は、ａ) 上記のように基質を製造し、ｂ) この基質をリパーゼ（例えばホルモン感受性リパーゼ、モノグリセリドリ
パーゼ、ジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパ
ーゼ、膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼ、細菌リパーゼ、ＰＬＡ₂、ＰＬＣ、コレス
テロールエステラーゼなど、好ましくはホルモン感受性リパーゼおよび膵臓リパ
ーゼ、特に好ましくはホルモン感受性リパーゼ）と共にインキュベートし、ｃ) 変色を、例えば視覚的／光学的または蛍光測定的に測定することを含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤（その存在が変色を生じさせる）の同定方法
によって達成される。

【００２０】本発明はさらに、上記方法により同定されたリパーゼおよびリパーゼ阻害剤に
関する。本発明は同様に、上記のような基質を製造し、この基質をリパーゼと共にイン
キュベートし、赤色から黄色へ、または逆に黄色から赤色への変色度を測定し、
例えば光度測定器での吸光度測定または蛍光測定器での蛍光測定により活性を確
認する、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性の測定方法に関する。

【００２１】典型的な反応は、例えば１.５ml エッペンドルフ容器または９６穴プレートに
おいて、３０℃で６０分間行われる。１０μｌの試験物質（例えばＨＳＬの阻害
剤）を、１６.６％のＤＭＳＯの存在下にアッセイ用緩衝液（２５mM tris／ＨＣ
ｌ、ｐＨ７.４；１５０mM ＮａＣｌ）に導入する。１８０μｌの基質溶液（アッ
セイ用緩衝液中の２０μｇ／mlのホスファチジルコリン、１０μｇ／mlのホスフ
ァチジルイノシトール、５０μｇ／mlのＮＡＧ）を添加する。３０℃で１５分間
のプレインキュベーションの後、アッセイ用緩衝液中の２０μｌのＨＳＬをピペ
ットで添加し、直ちにキュベット光度測定器（０.５mlキュベット）またはマイ
クロタイタープレートリーダーで４８１nmにおいて吸光度を測定する（上記参照
）。あるインキュベーション時間（これは可変であり、選択された酵素濃度に依
存し、２〜２４０分間であってよい）、この場合は３０℃で６０分間のインキュ
ベーションの後、吸光度を再び測定する。黄色領域、この場合は４８１nmにおけ
る吸光度の増加は、酵素活性の尺度である。

【００２２】リパーゼ阻害剤を同定するための、またはリパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性を
測定するためのアッセイ系もまた、本発明の主題である。これらの系は上記のよ
うな基質、超音波装置および場合により赤色から黄色への変色を視覚的／光学的
および／または蛍光測定的に測定するための装置、または上記のような基質およ
び超音波装置に加えて、変色度を測定するための装置および吸収または蛍光測定
のための装置を含む。

【００２３】アッセイ系はキットの形態で存在することもでき、アッセイはリパーゼアッセ
イである。キットは、場合によりアッセイ用緩衝液中の上記のような基質、および試験を
行うための容器、例えばエッペンドルフ容器またはマイクロタイタープレートな
ど、好ましくはマイクロタイタープレートを含む。

【００２４】本発明の他の主題は、上記のような基質およびホスホリパーゼ、例えばホスホ
リパーゼＡ₂（ヘビ毒から）またはホスホリパーゼＣ（バチルス・セレウス）を
含む、分子の輸送／転移系の測定方法、化合物の界面活性作用の測定方法または
化合物（医薬など）の細胞毒性の調査方法に関する。

【００２５】輸送体／転移タンパク質とは、それら自体が炭水化物、脂質およびタンパク質
のような主要栄養素を認識し、生物学的膜を通してこれらを輸送するか、または
これらをある生物学的膜から別の膜に転移させるタンパク質を意味すると理解さ
れる。輸送体／転移タンパク質、例えばラット回腸から単離されたものは、リン
脂質小嚢（リポソーム）中で機能的に再構築される（プロテオリポソーム）か、
または可溶性ポリペプチドとしてのリポソームと共にインキュベートされ、次い
で上記のようなリン脂質およびＮＢＤ−グリセリドの混合物に添加され、超音波
で処理される。ＮＢＤ−グリセリドが輸送体によりＮＢＤ-グリセリド含有ミセ
ル／小嚢からプロテオリポソームの内腔中へ、または転移タンパク質によりリポ
ソームの膜中へ輸送される過程または転移される過程は、ミセル構造の溶解／破
壊を引き起こし、次に上記のように光度測定的または蛍光測定的に監視すること
ができる。

【００２６】化学的化合物の界面活性作用はミセル／小嚢の直接の破壊に基づいている。生
物学的膜もこのようにして構築されるので、このような化合物は通常細胞毒性で
ある。ミセルの破壊は、本発明の方法を用いて上記の変色により容易に検出する
ことができる。

【００２７】合成：少数のＮＢＤ−標識脂肪酸、例えば１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オ
キサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸（１）は確かに市販されているが
、高価である。最初の実験は市販の材料を用いても行ったが、１２−アミノラウ
リン酸と４−クロロ−７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾールとをメタ
ノール中で反応させることにより、化合物（１）を良好な収率で得ることができ
た。

【００２８】化合物１〜９のリスト

【化１】

【００２９】（１）を２,３−エポキシプロパノール（２）に親核付加させることにより、
モノアシルグリセリド（３）を良好な収率で得ることができた。次いで化合物（
３）を、トリグリセリド（４）および（５）を得るためにアシル化した。ジアシ
ルグリセリド（６）は、（１）をパルミチンでエステル化することにより得られ
た。この化合物を同様に反応させて相当するトリアシルグリセリド（７）を得た
。グリセロールジエーテル（８）を反応させるために同じ方法を用い、二つのア
シル基が長鎖エーテルで置き換えられたプソイドトリアシルグリセリド（９）を
得た。

【００３０】合成した全ての化合物は、リパーゼ、好ましくはＨＳＬの基質であることが判
明したが、かなりの活性差を示した。リパーゼの「最良の」基質は、モノアシル
グリセリド（３）であることが判明した。化合物（４）、（５）、（６）および
（７）におけるように、他のアシル基の導入は活性の低下を引き起こした。

【００３１】これは、ＮＢＤアシル基の除去において新たに導入されたアシル基と競争する
ことによって容易に説明できる。この仮説を確認するために、二つのアシル基が
ヘキサデシルエーテル単位で置き換えられたプソイドトリアシルグリセリド（９
）を合成した。これらの単位はリパーゼから除去することができないので、ＮＢ
Ｄ脂肪酸エステルと競争しないはずである。生物学的試験において、この化合物
は基質であるが活性が低いことが、実際に判明した。明らかに、触媒領域に加え
て、リパーゼは、脂肪酸単位の付加が妨げられるように長鎖エーテル基に接近可
能な延長した疎水性結合領域を有する。

【００３２】モノアシルグリセリド（３）はリパーゼの良好な基質であることが判明したの
で、１位または３位に対する部位選択的優先性があるかどうかを調査した。この
調査のために、エナンチオマー部位異性体（３ａ）および（３ｂ）を合成した。

【００３３】エナンチオマー（３ａ、ｂ）の合成は、ジシクロヘキシルカルボジイミド活性
化によりＮＢＤ−標識脂肪酸（１）でエステル化された D-およびＬ−１,２−Ｏ
−イソプロピリデングリセロールから出発する。１Ｎメタノール性ＨＣｌを用い
て保護基を除去した。両化合物は同一の生物学的活性を示し、エナンチオマー的
に純粋な化合物の使用は何の利益もないようであった。

【００３４】１．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ
）ドデカン酸（１）：３０％濃度のナトリウムメタノレート溶液（１４.５ml，７６mmol）を、Ｍｅ
ＯＨ（３００ml）中の１２−アミノラウリン酸（１８ｇ，８３.７mmol）の溶液
に撹拌しながら加える。５分後に反応混合物は透明になり、ＭｅＯＨ（３００ml
）中の７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアソール（１５
ｇ，７５mmol）の溶液を加える。反応混合物（これはすぐに暗色になる）を２５
℃で１８時間撹拌する。次いで１Ｍメタノール性ＨＣｌ（１００ml，１００mmol
）を加え、溶剤を真空留去する。残留物をＭｅＯＨに吸収させ、この混合物をシ
リカゲルを通して濾過し、濾液を蒸発乾固し、残留物をフラッシュクロマトグラ
フィー（１：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。（１）が赤色固体として
得られる（２６.４ｇ，９３％）。 R_F: 0.16 (1:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d,
1H, ArH), 3.48(dt, 2H, CH ₂NH₂), 2.36(t, 2H, CH ₂COOH), 1.9-1.2(m, 18H, 9C
H₂) MS (ESI-MS) 379.2 (M+1)

【００３５】２．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ
）ドデカン酸２,３−ジヒドロキシプロピル（３）：イソプロパノール（５０ml）中の化合物（１）（１２ｇ，３１.７mmol）の溶
液を５０℃で１６時間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物を０.０１トルで乾
燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ジイソプロピルエーテル、エーテル、Ｅ
ｔＯＡｃ）で精製する。化合物（３）が赤色油として得られる（１０.３ｇ，７
１.８％）。 R_F：0.18 (1:1 のトルエン／ＥｔＯＡｃ)；R_F：0.5 (30:5:1 のCH₂Cl₂−MeOH
−NH₃)、これはEtOAc／ジエチルエーテルから結晶化する。 ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d,
1H, ArH), 4.19(dd, 2H, H-1, H-1′), 3.94(m, 1H, H-2), 3.65(dd, 2H, H-3,
H-3′), 3.48(dt, 2H, CH ₂NH₂), 2.35(t, 2H, CH ₂COOH), 1.8(m, 2H, CH₂), 1.6
(m, 2H, CH₂), 1,27-1,15(m, 14H, 7CH₂) MS (ESI-MS) 453.4 (M+1)

【００３６】３．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ
）ドデカン酸 (Ｓ)−２,２−ジメチル［１,３］ジオキソラン−４−イルメチル
（９ａ）：ＣＨ₂Ｃｌ₂（２ml）中の化合物（１）（６０mg，１５９μmol）の溶液をジシ
クロヘキシルカルボジイミド（１６０mg，７７０μmol）で処理し、２５℃で３
０分間撹拌する。次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（２ml）中の(Ｒ)−（２,２−ジメチル［１,
３］ジオキソラン−４−イル）メタノール（１００mg，７６０μmol）およびジ
メチルアミノピリジン（９４mg，７７０μmol）を加え、反応溶液を２５℃でさ
らに４時間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィ
ー（１５：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（９ａ）が黄色蛍光
性油として得られる（４６mg，５８％）。 R_F: 0.29 (4:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, 芳香族), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, 芳
香族), 4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH ₂NH₂), 2.35
(t, 2H, CO-CH ₂), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH₂), 1.42(s, 3H, CMe₂), 1.37(s, 3H, C
Me₂)

【００３７】４．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ
）ドデカン酸 (Ｒ)−２,２−ジメチル［１,３］ジオキソラン−４−イルメチル
（９ｂ）：化合物（９ｂ）は化合物（９ａ）について記載したようにして製造する。化合
物（９ｂ）が黄色蛍光性油として得られる（５１.４mg，６５％）。 R_F: 0.29 (4:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, ArH),
4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH ₂NH₂), 2.32(t, 2H,
CO-CH ₂), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH₂), 1.42(s, 3H, CMe₂), 1.37(s, 3H, CMe₂)

【００３８】５．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ
）ドデカン酸 (Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロピルおよび１２−（７−ニトロベ
ンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 (Ｒ)− ２,
３−ジヒドロキシプロピル（３ｂ）：メタノール性ＨＣｌ（１Ｍ，２００μl）を、メタノール２５ml中の化合物（
９ａ）１３.９mg（２８.２μmol）または化合物（９ｂ）１７.８mg（３６.１μm
ol）の溶液に加え、この混合物を２５℃で１.５時間撹拌する。溶剤を真空留去
し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２：１, １：１のトルエン／Ｅｔ
ＯＡｃ）で精製する。脂肪酸エステル（３ａ）および（３ｂ）がそれぞれ１０.
５mg(８２％）および９.３mg（５７％）の収量で得られる。 ¹H-NMR (CDCl₃) データおよびマススペクトルは化合物（３）と同一である。

【００３９】６．酢酸２−アセトキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキ
サジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（４）：化合物（３）（１２mg, ２６.５μmol）を２：１のピリジン／無水酢酸（３ml
）中でアセチル化する。８時間後、この混合物を蒸発乾固し、残留物をフラッシ
ュクロマトグラフィー（１：２のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（
４）が黄色蛍光性油として得られる（１３mg, ９１％）。 R_F: 0.66 (1:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.18(d, 1
H, ArH), 5.24(m, 1H), 4.92(m, 1H), 4.34(m), 4.28, 4.16,3.48(dt, 2H, CH ₂N
H₂), 2.32(CH₂COO), 2.1(2s, 6H, 2OAc), 2.0-1.0(m, 18H, 9CH₂) MS (ESI-MS): 537.4 (M+1)

【００４０】７．ヘキサン酸２−ヘキサノイルオキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［
１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピ
ル（５）：無水ヘキサン酸（１００μl）をピリジン（３００μl）中の化合物（２）（５
mg, １１μmol）に加え、反応混合物を２５℃で１６時間放置する。溶剤を真空
留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１のトルエン／ＥｔＯ
Ａｃ）で精製する。化合物（５）が黄色蛍光性油として得られる（１.８mg, ２
５％）。 R_F: 0.73 (1:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.18(d,
1H, ArH), 5.26(m, 1H, H-2), 4.29(dd, 2H, H-3, H-3′), 4.15(dd, 2H, H-1,
H-1′), 3.46(dt, 2H, CH ₂NH₂), 2.34(t, 6H, 3CH ₂COO), 1.63-1.2(m, 12H, 6CH ₂ ), 0.88(m, 6H, 2CH₃) MS (ESI-MS): 649.5 (M+1)

【００４１】８．ヘキサデカン酸２−ヒドロキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２
,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（
６）：ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ml）中の化合物（１）（２５mg, ６６μmol）、４−ジメチル
アミノピリジン（９mg，７３μｍｏｌ）および１,１−カルボニルジイミダゾー
ル（１５mg, ７３μmol）の溶液を２５℃で３０分間撹拌する。溶剤を真空留去
し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）
で精製する。化合物（６）が黄色蛍光性油として得られる（９.５mg, ２１％）
。 R_F: 0.25 (5:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.54(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.19(d,
1H, ArH), 4.20(dd, 2H, H-1, H-1′), 4.15(dd, 2H, H-3, H-3′), 4.12(m, 1H
, H-2), 3.5(dt, 2H, CH ₂-NH), 2.36(t, 4H, 2CH ₂COO), 1.82(m, 2H, CH₂-CH₂-N
H), 1.63(m, 4H, 2CH₂CH₂COO), 1.47(m, 2H, CH₂-(CH₂)₂-NH), 1.31-1.26(m, 22
H, 11CH₂), 1.287(m, 2H,CH₂), 1.26(m, 2H, CH₂), (m, 4H, 2CH₂CH₂CH₂COO), 1
.31-1.26(m, 18H, 9CH₂), 1.3(m, 2H, CH₂), 1.26(m, 2H, CH₂), 0.89(t, 3H, C
H₃) MS (ESI-MS): 649.5 (M+1)

【００４２】９．ヘキサデカン酸２−アセチルオキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［
１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピ
ル（７）：化合物（６）（６mg, ８.７μmol）を、化合物（４）について記載したように
アセチル化し、処理する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１の
トルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（７）が黄色蛍光性油として得られ
る（５.１mg, ９５％）。 R_F: 0.71 (5:1 トルエン／EtOAc) ¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.17(d,
1H, ArH), 5.25(m, 1H, H-2), 4.27(dd, 2H, H-1, H-3), 4.15(dd, 2H, H-1′,
H-3′), 3.73(dt, 4H, CH₂-NH), 2.3(t, 2H, CH₂COO), 2.08(s, 3H, OAc), 1.8(
m, 2H, CH₂-CH₂-NH), 1.6(m, 8H, 4CH₂), 1.4-1(m, 32H, 16CH₂), 0.85(t, 3H,
CH₃) MS (FAB-MS): 739 (M+Li)

【００４３】 10．［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミ
ノ）ドデカン酸２，３−ビス−オクタデシルオキシ−プロピル（８）：２,３−ビス−オクタデシルオキシプロパン−１−オール（５mg, ８.３７μmo
l）を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の化合物（１）（３mg, ７.９μmol）、ジメチルアミノピ
リジン（５mg, ４１μmol）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（５mg, ２
４μmol）の溶液に加える。反応混合物を２５で２時間撹拌し、溶剤を真空留去
し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２：１の石油エーテル／ジエチル
エーテル）で精製する。化合物（８）が黄色蛍光性油として得られる（３.５mg,
４６％）。 R_F：0.55 (３：７のジエチルエーテル／石油エーテル） MS (FAB-MS)：957.8 (M+1)

【００４４】酵素の製造：部分的に精製したＨＳＬの製造：単離ラット脂肪細胞を、未処理の雄ラット（Wistar, ２２０−２５０ｇ）の精
巣上体脂肪組織から、刊行された方法に従ってコラゲナーゼ処理することにより
得る。１０匹のラットからの脂肪細胞を、各５０mlの均質化緩衝液（２５ml tri
s／ＨＣｌ, pH７.４, ０.２５Ｍ蔗糖, １mM ＥＤＴＡ, １mM ＤＴＴ, １０μg／
ml leupetin, １０μg／ml antipain, ２０μg／ml pepstatin）で浮遊させるこ
とにより３回洗浄し、最後に１０mlの均質化緩衝液中に溶解させる。脂肪細胞を
、ガラス入りテフロン（登録商標）ホモジナイザー（Braun-Melsungen）中で１５００rpmおよび１５℃において１０ストロークで均質化する。この均質化物を遠心する（Sorvall SM24 チューブ, 5000rpm, １０分, ４℃）。上の脂肪層とペレットとの間の底部層を除去し、遠心を繰り返す。これから生じた底部層を再び遠心する（Sorvall SM24 チューブ, 20,000rpm, ４５分, ４℃）。底部層を除去し、１ｇのヘパリン−Sepharose で処理する（Pharmacia Biotech, CL-6B, ２５ mM tris／ＨＣｌ, pH７.４, １５０mM ＮａＣｌで５回洗浄)。４℃で６０分間のインキュベーション（１５分間隔で振盪）の後、このバッチを遠心する（Sorval l SM24 チューブ, 3000rpm, １０分, ４℃）。氷酢酸を加えて上澄み液をpH５. ２にし、４℃で３０分間インキュベートする。沈殿を遠心して集め（Sorvall SS 34, 12,000rpm, １０分, ４℃）、２.５mlの２０mM tris／ＨＣｌ, pH７.０, １ mM ＥＤＴＡ, ６５mM ＮａＣｌ, １３％蔗糖, １mM ＤＴＴ, １０μg／mlの leu petin／pepstatin／antipain に懸濁させる。この懸濁液を２５ml tris／ＨＣｌ , pH７.４, ５０％グリセロール, １mM ＤＴＴ, １０μg／mlの leupetin、peps tatin、antipain に対して４℃で一夜透析し、次いでヒドロキシルアパタイトカラムにかける（１mlの懸濁液当たり０.１ｇ、１０mMリン酸カリウム, pH７.０, ３０％グリセロール, １mM ＤＴＴで平衡化）。カラムを４体積の平衡化緩衝液で２０〜３０ml／ｈの流速で洗浄する。０.５Ｍリン酸カリウムを含む１体積の平衡化緩衝液でＨＳＬを溶離し、次いで透析し（上記参照）、４℃での限外濾過（Amicon Diaflo PM 10 フィルター）で５〜１０倍濃縮する。この部分精製したＨＳＬは -７０℃で４〜６週間貯蔵できる。

【００４５】ＮＡＧ(ＮＢＤ-モノアシルグリセリド)基質の製造：６mgのホスファチジルコリンおよび６mgのホスファチジルイノシトールをそれ
ぞれ１mlのクロロホルムに溶解する。１０mgのＮＡＧを１mgのクロロホルムに溶
解する。２部のホスファチジルイノシトール溶液（例えば８３.５μl）および１
部のホスファチジルコリン溶液（例えば４１.５μl）および１００μｌのＮＡＧ
溶液を、ピペットでプラスチック製シンチレーション容器内で一緒にする（試験
における最終濃度：リン脂質０.０３７５mg／ml；ＮＡＧ０.０５mg／ml）。ク
ロロホルム（全体積２２５μｌ）をＮ₂気流で吹き飛ばして完全に除去する。こ
の乾燥物質は４℃で３日まで貯蔵できる。介在ＮＡＧを有するリン脂質小嚢／ミ
セルを製造する（試験日）ために、上記乾燥物質をアッセイ用緩衝液（２５mM t
ris／ＨＣｌ、pH７.４；１５０mM ＮａＣｌ）に溶解させ、超音波プローブ（Bra
nson Sonifier タイプII、標準マイクロチップ）を用いて二通りの超音波処理を
行う。第一処理セッティング２、２×１分、各場合に氷上で１分；第二処理セッ
ティング４、２×１分、各場合に氷上で１分。この手順の間に基質溶液の色は、
小嚢／ミセルのリン脂質分子間にＮＡＧが介在するため、黄色（吸光極大４８１
nm）から赤色（吸光極大５５０nm）に変わる。基質として使用する前（次の２時
間以内）、この溶液をさらに１５分間氷上でインキュベートする。

【００４６】間接的ＮＡＧアッセイ：このアッセイは、１.５mlエッペンドルフ容器または９６穴プレートで３０℃
において６０分間行われる。ＨＳＬの阻害剤を見出すために、アッセイ用緩衝液
（２５mM tris／ＨＣｌ、pH７.４；１５０mM ＮａＣｌ）中の１０μｌの試験物
質を１６.６％ＤＭＳＯの存在下に導入する。１８０μｌの基質溶液（アッセイ
用緩衝液中の２０μｇ／mlのホスファチジルコリン、１０μｇ／mlのホスファチ
ジルイノシトール、５０μｇ／ml ＮＡＧ）を加える。３０℃で１５分間プレイ
ンキュベートした後、アッセイ用緩衝液中の２０μｌの酵素溶液（１〜４倍希釈
）をピペットで加え、直ちに吸光度を４８０nmにおいてキュベット光度測定器（
０.５ml キュベット）で、またはマイクロタイタープレート（microβeta, Wall
ac）で測定する。３０℃で６０分間インキュベートした後、吸光度を再び測定す
る。４８０nmにおける吸光度の増加は酵素活性の尺度である。標準的条件下で、
２０μｌの部分精製ＨＳＬは４０００ arb. units の吸光度の変化を生じさせる
。

【００４７】直接的ＮＡＧアッセイ：基質溶液の吸光度の変化を測定する代わりに、ＨＳＬ反応の生成物を相分離／
薄層クロマトグラフィーで調査する。このために、インキュベーションバッチ（
全体積２００μｌ、間接的ＮＡＧアッセイ参照）を、２mlエッペンドルフ容器中
で１.３mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）と、次いで
０.４mlの０.１ＭＮａＯＨと混合する。徹底的に撹拌した後（１０秒間）、遠
心（８００×ｇ、２０分、室温）により相分離を開始させる。上の水相から等体
積（例えば０.４ml）を取り、吸光度を４８１nmにおいて測定する。薄層クロマ
トグラフィーのために水相を乾燥し（SpeedVac）、次いで５０μｌのテトラヒド
ロフランに溶解させる。５μｌのサンプルをシリカゲル Si−60プレート（Merck
, Darmstadt）に適用する。７８mlのジエチルエーテル／２２mlの石油エーテル
／１mlの氷酢酸を溶離剤として用いてクロマトグラフィーを行う。遊離した蛍光
性ＮＢＤ脂肪酸の量を、ホスホ造影法（Molecular Dynamics, Storm 840 および
ImageQuant ソフトウェア）により４６０nmの吸光波長および５４０〜５６０nm
の発光波長において測定する。

【００４８】ＴＡＧアッセイ：基質を製造するために、２５〜５０μＣｉの［³Ｈ］トリオレオイルグリセロ
ール（トルエン中）、６.８μＭの未標識トリオレイルグリセロールおよび０.６
mgのリン脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルイノシトール３：１w/v
）を混合し、Ｎ₂上で乾燥し、次いで超音波処理（Branson 250、マイクロチップ
、セッティング１−２、１分の間隔で２×１分）により２mlの０.１ＭＫＰｉ（
pH７.０）に溶解させる。１mlのＫＰｉを加え、新たに超音波処理（氷上で３０
秒の間隔で４×３０秒）した後、１mlの２０％ＢＳＡ（ＫＰｉ中）を加える（ト
リオレオイルグリセロールの最終濃度１.７mM）。反応のため、１００μｌの基
質溶液を１００μｌのＨＳＬ溶液（上記のように製造したＨＳＬ、２０mM ＫＰ
ｉ、pH７.０、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０.０２％ＢＳＡ、２０μｇ／mlの
pepstatin、１０μｇ／mlの leupeptin 中に希釈）にピペットで加え、３７℃
で３０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプ
タン（１０：９：７）および１.０５mlの０.１ＭＫ₂ＣＯ₃、０.１Ｍホウ酸（pH
１０.５）を加えた後、このバッチをよく混合し、最後に遠心する（８００×ｇ
、２０分）。相分離した後、１等量の上相（１ml）を取り、放射活性を液体シン
チレーション測定により決定する。

【００４９】ＰＮＰＢアッセイ：１０μｌの酪酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＢ）（アセトニトリル中２mM）、
８９０μｌの０.１ＭＫＰｉ（pH７.２５）、０.９％ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴお
よび１００μｌのＨＳＬ（上記のように製造、この緩衝液中に希釈）を３７℃で
１０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタ
ン（１０：９：７, w/v）を加え、激しく振盪した後、このバッチを遠心し（８
００×ｇ、２０分）、４２℃で３分間インキュベートする。次いで等量の上相を
取り、吸収を４００nmにおいて測定する。

【００５０】トリブチリンアッセイ：基質を製造するために、５μＣｉの［１−¹⁴Ｃ］トリブチリン（トルエン中）
を１mlの未標識トリブチリン（アセトニトリル中）に加える。１０μｌのこの基
質溶液を、３９０μｌの０.１ＭＫＰｉ（pH７.２５）、０.９％ＮａＣｌ、１mM
ＤＴＴ、２％ＢＳＡおよび１００μｌのＨＳＬ（上記のように製造、この緩衝
液中に希釈）と共に３７℃で１０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノ
ール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７, w/v）および１mlの０.１ＭＮ
ａＯＨを加えた後、このバッチを激しく混合し、最後に遠心する（８００×ｇ、
２０分）、４２℃で３分間インキュベートする。次いで等量（１ml）の上相を取
り、放射活性を液体シンチレーショ測定により決定する。

【００５１】分析：物質を四つの独立したバッチにおいて普通のように試験する。試験物質による
ＨＳＬの酵素活性の阻害を、未阻害コントロール反応と比較することにより決定
する。ＩＣ₅₀値を、少なくとも１０種の濃度の試験物質を用いた阻害曲線により
計算する。データ分析のために、ソフトウェアパッケージ GRAPHIT, Elsevier-B
IOSOFT（version 3.0）を用いる。

【００５２】

【実施例】

実施例１：ＨＳＬによるＮＡＧ切断の動力学ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を表示した量の部分精製ＨＳＬタンパク質と共にイ
ンキュベートし（温度制御光度測定器）、４８１nmにおける吸光度を特定の時点
で測定する。不活性化のためにＨＳＬを１００℃で１５分間インキュベートした
（ｎ＝８、平均±ＳＤ）。

【００５３】結果：２０μｇのタンパク質量まで、反応は６０分まで線形に進行した。この
場合の吸光度の差は０.８〜０.９ＯＤであった。より少ないタンパク質量の場合
、線形性は１８０分まで得られた。

【００５４】

【表１】

【００５５】実施例２：ＨＳＬ量に対するＮＡＧ切断の依存性ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を表示した量の部分精製ＨＳＬタンパク質と共に６
０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度の増加（ＨＳＬ反応の生成
物としての遊離ＮＢＤ脂肪酸の形成＝間接的ＮＡＧアッセイ）または５５０nmに
おける吸光度の減少（ＨＳＬ反応の基質としてのＮＡＧの消費）を、反応バッチ
のアリコートにおいて測定した。その代わりに、他のアリコートをメタノール／
クロロホルムで抽出し、有機相中に含まれる遊離したＮＢＤ脂肪酸をＴＬＣ分析
および蛍光測定法（ホスホ造影装置 Storm 840, Molecular Dynamics）により測
定した（＝間接的ＮＡＧアッセイ）（ｎ＝６、平均±ＳＤ）。

【００５６】結果：反応は２０μｇのタンパク質量まで、生成物の形成（４８１nmにおける
吸光度の増加またはＴＬＣ分析による遊離ＮＢＤ脂肪酸の生成）および基質の消
費（５５０nmにおける吸光度の減少）に関して線形に進行した。間接的および直
接的ＮＡＧアッセイ間での一致は、間接的アッセイにおけるＮＡＧ切断の分析を
支持していた。

【００５７】

【表２】

【００５８】実施例３：基質濃度に対するＨＳＬによるＮＡＧ切断の依存性種々の量のＮＡＧ（リン脂質に対する比率は一定）を表示した量の部分精製Ｈ
ＳＬと共に６０分間インキュベートし、次いで吸光度を４８１nmにおいて測定し
た（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。

【００５９】結果：三つの全ての酵素量で、切断率は典型的な飽和曲線の経過を示した。し
かしながら、ＨＳＬ反応の酵素的特異性（「二次元的」基質の現出、「界面活性
化」）のために、５μｇのタンパク質および最低基質濃度でのみ、ほぼ線形の依
存性を測定することができた。２０μｇのタンパク質および０.０５mg／mlのＮ
ＡＧの組み合わせが、基質依存性とシグナル強度（ＯＤ０.６〜０.７）との間
の合理的な妥協であった。

【００６０】

【表３】

【００６１】実施例４：ＮＡＧとリン脂質との比に対するＨＳＬによるＮＡＧ切断の依存性表示した比のホスファチジルイノシトール対ホスファチジルコリンを有するリ
ン脂質を種々の量（全量）で用いて超音波処理し、次いで部分精製ＨＳＬ（２０
μｇ）と共に６０分間インキュベートすることにより、ＮＡＧ（０.０５mg／ml
）を基質として製造した。４８１nmにおける吸光度の増加を測定した（ｎ＝４、
平均±ＳＤ）。

【００６２】結果：酵素速度は３：１のＰＩ／ＰＣ比（重量による）および０.０３７５〜
０.０７５の全リン脂質で最大であった。リン脂質の全濃度およびそれらの組成
に関して顕著な最適経路は、リン脂質小嚢および／またはミセル中のＨＳＬの基
質（この場合はＮＡＧ）の現出、または基質の（天然）コア上でのリン脂質単層
の形成が重要であることを支持していた。

【００６３】

【表４】

【００６４】実施例５：種々の阻害剤に関するＩＣ₅₀値の測定による、間接的／直接的ＮＡＧ
アッセイと従来のＨＳＬアッセイとの比較ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｌの部分精製ＨＳＬと共に、異なる濃度（
０.１〜１００μＭ）の種々の基質の存在下に６０分間インキュベートした。４
８１nmにおける吸光度をバッチのアリコートにおいて測定した（間接的アッセイ
）か、または遊離したＮＢＤ-ＦＡをクロロホルム／メタノールで抽出し、ＴＬ
Ｃ分析および蛍光測定法により測定した（直接的アッセイ）。その代わりに、［ ³ Ｈ］トリオレイルグリセロールを部分精製ＨＳＬと共に刊行された条件に従っ
てインキュベートし、遊離した放射標識オレイン酸エステルをクロロホルム／メ
タノールで抽出した後に液体シンチレーション測定により決定した。ＩＣ₅₀値を
阻害曲線から決定した（ｎ＝６、平均±ＳＤ）。

【００６５】結果：試験した全ての基質について、三つの方法を用いてＳ字状阻害曲線を測
定した。間接的／直接的ＮＡＧアッセイ（４８１nmにおける吸光度の増加／ＮＢ
Ｄ脂肪酸の遊離化）において、ＩＣ₅₀値は、ＨＳＬによるトリオレイルグリセリ
ドの切断と比較して一般的に係数４〜１０だけ低かったが；阻害剤の順位（それ
らのＩＣ₅₀値による）は三つの全ての方法において同一であった。これは、ＨＳ
Ｌの阻害作用が基質の性質および基質現出に依存するという刊行された知見を確
認するものであった。さらに有効基質濃度（ＮＡＧおよびトリオレイルグリセリ
ド）は二つのアッセイ（小嚢またはミセルとしての基質調製物のために殆ど測定
できない）間で異なることもあり、従って競争的阻害剤の場合におけるこれらの
差異を説明していた。吸光度およびＮＢＤ脂肪酸の遊離化により測定した、ほぼ
一致するＩＣ₅₀値はＨＳＬによりＮＡＧが切断されること、従って４８１nmにお
ける吸光度の増加に起因してＮＢＤ脂肪酸が遊離することを提案しており、すな
わちＮＡＧアッセイにより脂質の脂肪分解的切断が検出された。

【００６６】

【表５】

【００６７】実施例６：間接的ＮＡＧアッセイと、ＴＡＧ、ＰＮＰＢおよびトリブチリンに関
するアッセイとの比較ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬと共に、異なる濃度（
０.１〜１００μＭ）の種々の基質の存在下に６０分間インキュベートする。４
８１nmにおける吸光度をバッチのアリコートにおいて測定した（間接的アッセイ
）。その代わりに、［³Ｈ］トリオレイルグリセロール（ＴＡＧ）、ｐ−ニトロ
フェニル酪酸（ＰＮＰＢ）または［¹⁴Ｃ］トリブチリンを部分精製ＨＳＬと共に
インキュベートし、遊離した放射標識オレイン酸エステル、ｐ−ニトロフェノー
ルまたは酪酸エステルをクロロホルム／メタノールで抽出した後に液体シンチレ
ーション測定または分光測定により決定した。ＩＣ₅₀値を阻害曲線から決定した
（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。

【００６８】結果：ＩＣ₅₀値で示された阻害剤の相対的順位は脂質基質（ＮＡＧおよびＴＡ
Ｇ）を用いた両方のアッセイで同一であった。これは基本的に、水溶性基質であ
るトリブチリンおよびＰＮＰＢにも当てはまるが、ＮＡＧおよびＴＡＧと比較し
てＨＳＬ活性を有意に低下させる幾つかの活性化合物は、トリブチリンおよびＰ
ＮＰＢと比較してＨＳＬの阻害において不活性であった。これは、これらの阻害
剤がＨＳＬの脂質結合（脂質結合ドメインによる）で干渉されることによって説
明できるが、触媒機構は不利な影響を受けない。それ故に水溶性基質は、これら
の阻害剤の存在下でさえもＨＳＬから切断される。水溶性基質の場合でも作用す
る阻害剤に関するＩＣ₅₀値は、一般的に基質としてのＮＡＧおよびＴＡＧに関す
るＩＣ₅₀値の間にあった。これは、ＮＡＧが標品トリグリセリドと同様にＨＳＬ
に対する「脂質様」基質として挙動すること、およびＨＳＬの脂質結合（および
触媒機構）をブロックする阻害剤を見出すためにＮＡＧアッセイを採用できるこ
とを示していた。

【００６９】

【表６】

【００７０】実施例７：基質安定性に対する種々の界面活性剤および溶剤の影響ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を上昇する濃度の種々の界面活性剤および溶剤の存
在下に３７℃で１８０分間インキュベートし、次いで５５０nmにおける吸光度の
減少（特異的基質構造の溶解）を測定した（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。

【００７１】結果：基質（リン脂質小嚢またはミセル）は使用した物質と比較して異なる感
度を示した。吸光度（すなわち基質の量）は、１％のＤＭＳＯの存在下で１０％
だけ、エタノールまたはメタノールの場合は多くても２０％だけ、１％のＴＸ−
100 またはＳＤＳの場合は多くても３０％だけ減少した。ＤＭＦが小嚢／ミセル
を溶解するのに最も効果的で、１％で８０％を超えるＮＡＧがリン脂質／小嚢構
造から遊離した。基質構造の溶解に用いた溶剤および界面活性剤の効力の順位は
、ＮＡＧによるか、あるいは発色団基（ＮＢＤ）がリン脂質小嚢／ミセルの非極
性環境中に導入されること、およびこれにより生じる水性環境から該発色団基が
除去されることによる吸光極大のシフト（４８１nmから５５０nmへ）と適合した
。小嚢／ミセルの溶解（例えば界面活性剤による）によって、水性媒体中でこれ
らの構造からＮＡＧが遊離するか、またはＮＡＧの脂肪分解的切断（ＨＳＬによ
る）によってＮＢＤ脂肪酸としての発色団基が遊離すると、５５０nmにおける吸
光度の低下、および４８１nmにおける吸光度の上昇を生じさせた。１％のＤＭＳ
Ｏにおける安定性について、ＮＡＧ基質はしっかりしたＨＴＳアッセイに対する
基本的必要条件の一つを満たした。

【００７２】

【表７】

【００７３】実施例８：ＨＳＬの活性に対する種々の界面活性剤および溶剤の影響ＮＡＧ（０.０５mg／ml）をＨＳＬ（２０μｇ）と共に、上昇する濃度の種々
の物質の存在下に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度を測定
した（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。

【００７４】結果：１％までのＤＭＳＯは遊離したＮＢＤ−ＦＡ量を約１０％だけ減少させ
た。このＤＭＳＯ濃度において１０％までのＮＡＧがこれら構造の溶解によりリ
ン脂質小嚢／ミセルから遊離するので、酵素活性の低下は算術的に２０％となっ
た。０.５％のＤＭＳＯの場合、活性低下はまだ１０％であった。０.１〜１０％
のＴＸ−100、アセトン、エタノールおよびメタノールはＨＳＬ活性の上昇を引
き起こし、これは多分、より効果的な基質現出により生じたものであった。高濃
度においては、これらは活性を干渉した。ＤＭＦは０.１％からの濃度において
さえもＨＳＬ活性の有意な損失をもたらした。

【００７５】

【表８】

【００７６】実施例９：特異性の異なるリパーゼによるＮＡＧの切断ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬ、ラット脂肪細胞から
の７５μｌの部分精製ＬＰＬ、２０mUの細菌リパーゼ、５０mUの膵臓リパーゼ、
ヘビ毒からの１００mUのＰＬＡ₂およびバチルス・セレウスからの０.５ＵのＰＣ
特異的リン脂質と共に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度の
増加を測定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。

【００７７】結果：ＨＳＬに対して与えられた最適化条件において、予想されたように、Ｈ
ＳＬ（１００％）およびＬＰＬ（約７０％）が最大活性を示した。細菌および肝
臓リパーゼの活性は著しく低い（２５または１％）が、細菌ＰＣ特異的ホスホリ
パーゼは実際上不活性であった。これらの極めて異なる活性は、ＨＳＬの間接的
ＮＡＧアッセイに選択された条件が特異的であることを示しており、従って例え
ば、おそらく粗製細胞抽出物中に含まれるホスホリパーゼは検出されない。しか
しながらこれらのデータは、このアッセイ原理が他のリパーゼに原則的に適用で
きることも示していた。

【００７８】

【表９】

【００７９】実施例１０：ＮＢＤ脂肪酸で変性された種々のアシルグリセリドのＨＳＬによる
切断ＮＡＧ（０.０５mg／ml）または異なる濃度の種々のＮＢＤ脂肪酸変性脂質を
２０μｇの部分精製ＨＳＬと共にインキュベートした。４８１nmにおける吸光度
を特定の時点で測定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。

【００８０】結果：

【表１０】

【００８１】実施例１１：ジイソプロピルホスホ弗素化物によるＨＳＬの阻害ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬと共に、増加する濃度
のジイソプロピルホスホ弗素化物の存在下６０分間にインキュベートした。４８
１nmにおける吸光度の増加を反応バッチのアリコートで測定した（間接的ＮＡＧ
アッセイ）か、またはクロロホルム／メタノールで抽出した後に有機相中の遊離
したＮＢＤ−ＦＡ量を蛍光測定により測定した（直接的ＮＡＧアッセイ）。その
代わりとしては、基質としての［³Ｈ］トリオレイルグリセロールと一緒にＨＳ
Ｌのインキュベーションを行い（上記参照）、遊離した放射標識オレイン酸量を
クロロホルム／メタノールで抽出した後に測定した。阻害剤の不在における切断
活性を、各アッセイについて１００％とした（ｎ＝７、平均±ＳＤ）。

【００８２】結果：三つの全てのアッセイにおいて、ジイソプロピルホスホ弗素化物に関し
て典型的なＳ字状阻害曲線が得られた。これから計算したＩＣ₅₀値は、間接的（
０.８mM）または直接的ＮＡＧアッセイ（１.１mM）に関する値とは互いに有意差
がなかった。２.１mMという若干高いＩＣ₅₀値がトリオレイルグリセリド切断に
ついて計算された。これは、これらのアッセイで観察された種々の阻害剤の阻害
活性において上記で見出された相違（説明するとすれば実施例６参照）と一致し
ていた。これとは無関係に、ジイソプロピルホスホ弗素化物によるＨＳＬの阻害
に関して間接的ＮＡＧアッセイで測定されたＩＣ₅₀値は刊行されたデータ (P. S
tralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987, 147-177; P. S
tralfors, P. Belfrage, J. Biol. Chem. 258, 1983, 15146-15151; P. Belfrag
e, B. Jergil, P. Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75, 1977, 259-263)
と非常に一致していた。

【００８３】

【表１１】

【００８４】実施例１２：マイクロタイタープレートフォーマットにおける間接的ＮＡＧアッ
セイの実行可能性ＮＡＧを部分精製ＨＳＬと共に、９６穴マイクロタイタープレートのウェル中
で２００μｌのアッセイ体積において種々の時間インキュベートした。４８１nm
における吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。

【００８５】結果：選択された条件において、反応は約６０分まで線形である。この場合の
分散（ＳＤ）は４〜７％である。このように間接的ＮＡＧアッセイはＨＴスクリ
ーニングに使用するのに適している。

【００８６】

【表１２】

【００８７】使用した略語： arb. Units 任意単位ＢＳＡウシ血清アルブミンｃＡＭＰサイクリックアデノシン一リン酸ＤＣＣジシクロヘキシルカルボジイミドＤＭＦ N,N-ジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＤＴＴジチオスレイトールＥＤＴＡエチレンジアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラ酢酸ＦＡＢ−ＭＳ高速原子衝突質量分析ＨＳＬホルモン感受性リパーゼＫＰｉリン酸二水素カリウム／リン酸カリウム緩衝液ＬＰＬリポタンパク質リパーゼＮＡＧＮＢＤ-モノアシルグリセリド：12-(7-ニトロベンゾ[1,2,3] オキサジアゾール-4-イルアミノ)ドデカン酸 2,3-ジヒドロキシプロピルＮＢＤ 4-クロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールＮＢＤ−ＦＡＮＢＤ脂肪酸：12-(7-ニトロベンゾ[1,2,3]オキサジアゾール -4-イルアミノ)ドデカン酸ＮＩＤＤＭインスリン非依存型糖尿病ＰＬＡ２ホスホリパーゼＡ２ＰＬＣホスホリパーゼＣＰＮＰＢ酪酸ｐ−ニトロフェニルＳＤ標準偏差ＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムＴＡＧ [³Ｈ] トリオレイルグリセロール Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＴＬＣ薄層クロマトグラフィーＴＸ-100 Triton (登録商標) Ｘ-100

【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月１日（２００２．５．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/44 1/44 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ 33/15 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/58 33/58 Ｚ 33/68 33/68 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ホルガー・ヨルダンドイツ連邦共和国デー−61276ヴァイルロート．マーガレテンホーフ１ (72)発明者ホルスト・クライネドイツ連邦共和国デー−65795ハッテルスハイム．レシングリング11 (72)発明者ホルスト・ヴェンツェルドイツ連邦共和国デー−60331フランクフルト．ランゲシュトラーセ23 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 DA20 DA60 DA61 DA80 FA11 FA18 FA26 FA32 FB01 FB07 FB12 GC12 GC15 2G054 AB03 BB20 CA30 CE02 EA03 FB07 GA03 GA04 GB04 4B050 CC01 LL03 LL05 4B063 QA05 QA18 QQ32 QQ41 QQ61 QQ89 QR45 QR58 QR77 QS36 QX02 QX10 4C056 AA01 AB02 AC06 AD03 AE03 AF05

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】ａ) 蛍光標識を備えた脂肪酸を、アルコール溶液中で室温に
おいて塩基を添加して、2,3-エポキシプロパノールと反応させてモノアシルグリ
セリドを生成させ、ｂ) このモノアシルグリセリドをリン脂質と共に１：１０〜１０：１mg／mlの
比で超音波処理に供し、これから、電荷転移複合体に基づく黄色から赤色への変
色により認識可能な基質を生成させることを含む、複合リン脂質／脂質構造の完全性の決定方法。【請求項２】蛍光標識がダンシルまたはＮＢＤである、請求項１に記載の
方法。【請求項３】蛍光標識がＮＢＤである、請求項２に記載の方法。【請求項４】脂肪酸がＣ-８〜Ｃ-20の鎖長を有する飽和または不飽和のカ
ルボン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。【請求項５】脂肪酸が飽和Ｃ-12カルボン酸である、請求項４に記載の方
法。【請求項６】リン脂質としてホスファチジルコリンおよびホスファチジル
イノシトールをそれぞれ単独でまたは一緒に使用する、請求項１〜５のいずれか
に記載の方法。【請求項７】ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトールを
１０：１〜１：１０の比で一緒に使用する、請求項６に記載の方法。【請求項８】モノアシルグリセリドが１２−（７−ニトロベンゾ−［１,
２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカン酸２,３−ジヒドロキ
シプロピルである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。【請求項９】請求項１〜８に記載の方法により製造された基質。【請求項１１】リン脂質／脂質構造の同定方法に使用するための請求項９
に記載の基質。【請求項１２】リパーゼおよびリパーゼ阻害剤の同定方法に使用するため
の請求項９に記載の基質。【請求項１３】１２−アミノラウリン酸を、アルコール溶液中で室温にお
いて塩基を添加して、最初に７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,
３−ジアゾールと反応させ、次いで得られた中間体を２,３−エポキシプロパノ
ールと反応させることを含む、モノアシルグリセリドである１２−（７−ニトロ
ベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカン酸２,３
−ジヒドロキシプロピルの製造方法。【請求項１４】１２−（７−ニトロベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾー
ル−４−イルアミノ）−ドデカン酸２,３−ジヒドロキシプロピル。【請求項１５】ａ) 請求項９に記載の基質を製造し、ｂ) この基質をリパーゼと共にインキュベートし、ｃ) 変色を測定することを含む、リパーゼおよびリパーゼ阻害剤の同定方法。【請求項１６】請求項１５に記載の方法により同定されたリパーゼ／リパ
ーゼ阻害剤。【請求項１７】請求項１５に記載のリパーゼ／リパーゼ阻害剤の同定方法
に使用するための高速処理スクリーニング（ＨＴＳ）。【請求項１８】ａ) 請求項９に記載の基質を製造し、ｂ) この基質をリパーゼと共にインキュベートし、ｃ) 変色度を測定し、ｄ) 活性を確認することを含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性の決定方法。【請求項１９】上記基質をホルモン感受性リパーゼと共にインキュベート
する、請求項１８に記載の方法。【請求項２０】ａ) 請求項９に記載の基質、ｂ) 超音波装置、および場合により、ｃ) 変色を肉眼的／光学的および／または蛍光測定的に測定するための装置を含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤を同定するためのアッセイ系。【請求項２１】ａ) 請求項９に記載の基質、ｂ) 超音波装置、ｃ) 変色度を測定するための装置、およびｄ) 吸収または蛍光を測定するための装置を含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性を測定するためのアッセイ系。【請求項２２】キットの形態にある、請求項２０または２１に記載のアッ
セイ系。【請求項２３】上記アッセイがリパーゼアッセイである、請求項２２に記
載のキット。【請求項２４】ａ) 請求項９に記載の基質、およびｂ) 容器を含む、請求項２２に記載のキット。【請求項２５】ａ) 請求項９に記載の基質を製造し、ｂ) この基質を試験化合物共にインキュベートし、ｃ) 細胞毒性化合物および界面活性作用を有する化合物を同定する、赤色から
黄色への変色を視覚的／光学的または蛍光測定的に測定することを含む、化合物の界面活性作用または細胞毒性の決定方法。【請求項２６】ａ) 請求項９に記載の基質を製造し、ｂ) 輸送体／輸送体タンパク質をリポソーム中で機能的に再構築し、ｃ) b)により製造されたリポソームをa)により製造された基質に添加し、変色
を肉眼的または光学的に測定することを含む、脂質輸送体の活性の決定方法。