MXPA01009393A - Determinacion de estructura compleja de fosfolipidos/lipidos con la ayuda de acilgliceridos sinteticos etiquetados con fluorescencia. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una prueba continua, simple, para identificar las estructuras que favorecen el arreglo de los aromaticos para complejos que transfieren la carga, por ejemplo, estructuras complejas de fosfolipido/lipido (bicapas, monocapas, agregados, micelas), usando acilgliceridos marcados con fluorescencia, sinteticos, y a su uso en la determinacion de la actividad de las lipasas/inhibidores de lipasa, a un monoacilglicerido para usarse en esta prueba y a un metodo para producir el mismo, substrato obtenido y a un metodo para producir dicho substrato.

Description

DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURAS COMPLEJAS DE FOSFOLÍPIDOS/LÍPIDOS CON LA AYUDA DE ACILGLICÉRIDOS SINTÉTICOS ETIQUETADOS CON FLUORESCENCIA f 5 La invención se refiere a una prueba continua, simple para la identificación de las estructuras que favorecen el arreglo de los aromáticos para dar complejos de transferencia de carga tales como por ejemplo, estructuras complejas de fosfolípidos/lípidos (de dos capas, una capa, agregados, 10 micelas) , con la ayuda de acilglicéridos sintéticos 4 etiquetados con fluorescencia, y su uso para la determinación de la actividad de las lipasas/inhibidores de lipasas. Las lipasas, fosfolipasas y otras enzimas lipolíticas tienen gran importancia en el campo de la medicina y la 15 biotecnología. En ciertos padecimientos metabólicos, se puede detectar la actividad elevada de lipasa en el tejido graso, la cual se mantiene en parte responsable de la patogénesis de O este padecimiento. La mayor parte de las reservas de energía del cuerpo se almacenan en las células del tejido graso como 20 los ácidos grasos de los triglicéridos. Los procesos anabólicos esenciales causados por la insulina incluyen la estimulación de la absorción de substratos para la síntesis de triglicéridos y el aumento en la lipogénesis. Un proceso importante adicional causado por la insulina es la inhibición de la lipólisis, el proceso por medio del cual las hormonas catabólicas, principalmente las catecola inas, estimulan la hidrólisis de los triglicéridos y consecuentemente inducen la f? liberación de ácidos grasos. Un problema importante que se 5 relaciona con la diabetes no dependiente de la insulina (NIDDM) tiene su causa en la lipólisis no inhibida de las células grasas, que llevan a niveles incrementados de ácidos grasos no esterificados en el plasma. De acuerdo a un pensamiento actual, los ácidos grasos estimulan la 10 gluconeogénesis en el hígado y disminuyen la utilización de » la glucosa en el músculo esquelético por medio de mecanismos moleculares aún caracterizados deficientemente. De hecho, fue posible demostrar que la supresión de la lipólisis en las células grasas mediante inhibidores de la lipólisis, tales 15 como agonistas del receptor del ácido nicotínico de la célula grasa, disminuye tanto las concentraciones de ácidos grasos en el plasma como eleva -el azúcar en la sangren en los animales y en los pacientes diabéticos. Desafortunadamente, estos efectos benéficos no son particularmente fuertemente 20 pronunciados y solo son de duración relativamente corta. Esto puede basarse en una contrarregulación causada por la intervención en el mecanismo regulador de la enzima que determina la velocidad de la lipólisis, la lipasa sensible a las hormonas (HSL) . Hay buenas razones para suponer que la inhibición de la reacción lipolítica llevará a una terapia perfeccionada de NIDMM, al menos con respecto a la supresión de la liberación del ácido graso de las células grasas. La w? inhibición directa de HSL mediante adecuados inhibidores 5 debería evitar en este caso las dificultades obvias de una intervención en la regulación compleja de HSL. La actividad de las enzimas lipolíticas se investiga tradicionalmente usando métodos radiométricos, titulométricos, enzimáticos o fluorimétricos/fotométricos . 10 Los ensayos radiométricos son las más sensibles, pero estos • requieren substratos radioetiquetados caros, son discontinuos y requieren la separación del substrato radioetiquetado del producto radioetiquetado. Tales separaciones son frecuentemente problemáticas y la evasión/reducción de 15 residuos radioactivos es de gran importancia (especialmente relevante si estas son un gran número de pruebas) . Las pruebas titulométricas son continuas y se pueden 1 llevar a cabo tanto con substratos sintéticos como naturales, pero estas frecuentemente sufren de una sensibilidad 20 claramente baja y son susceptibles a condiciones que influyen en la cantidad de protones liberados. Los métodos cromatográficos o enzimáticos para la detección de uno de los productos de la reacción lipolítica (por ejemplo, el glicerol) son muy sensibles y relativamente fuertes, pero están también implicados en términos de manipulación, pues estos demandan el desarrollo del lote de incubación de la reacción de la lipasa antes de la detección B real enzimática/cromatográfica . La prueba de acoplamiento de 5 una enzima permite solo las mediciones en el punto final (medición del "tiempo de detención"). Adicionalmente, en la investigación de substancias no conocidas (por ejemplo, la búsqueda de inhibidores potenciales) , un efecto en las enzimas de la reacción de detección no puede ser excluido en 10 principio y por lo tanto necesita de controles apropiados. Estas consideraciones dan el impulso al desarrollo de los procesos fluorimétricos/foto étricos . En principio, estos logra la sensibilidad de métodos radiométricos pero necesitan el uso de substratos sintéticos o muestras modificadas con 15 fluoróforos o cromóforos. Los métodos tradicionales fluorimétricos/fotométricos, como los procedimientos radiométricos, son discontinuos en su curso y necesitan la separación del substrato del producto. Recientemente, han sido desarrolladas las pruebas fluorimétricas/fotométricas 20 continuas (S. Hendrickson, Analyt. Biochem 219 (1994) 1-8), las cuales están basadas en un cambio o desviación en la fluorescencia o extinción máxima del producto en comparación con el substrato. Sin embargo, todos estos procesos están restringidos a la detección de fosfolipasas, lipoproteína lipasas, esterasa de colesterol, esfingomielinasa y glucosidasa de glucosilceramida . Los substratos que tienen grupos fluorofóricos/cromofóricos adecuados para la medición >(? de la actividad continua de las enzimas de escisión o 5 desdoblamiento de los triglicéridos (por ejemplo, lipasa sensible a las hormonas, lipasa de monoglicérido, lipasa de diglicérido, lipasa de triglicérido, lipasa de lipoproteína, lipasa pancreática, lipasa hepática, lipasa bacteriana, PLA2, PLC, esterasa de colesterol) son aun desconocidas. 10 Por lo tanto, el propósito de la invención es • desarrollar una prueba continua, simple, para la identificación de estructuras que favorezcan el arreglo de los aromáticos para dar complejos de transferencia de carga, tales como, por ejemplo, estructuras complejas de 15 fosfolípidos/lípidos (bicapas, monocapas, agregados, micelas) , con la ayuda de acilglicéridos sintéticos etiquetados con florescencia, y un proceso para la • determinación de la actividad de las proteínas enlazadas a los lípidos, tales como las lipasas. 20 Los transportadores de lípidos son proteínas que reconocen los lípidos y no se escinden de la misma forma que las lipasas, pero en cambio se transportan a través de las membranas biológicas.

Las lipasas como se sobreentiende aquí indican lipasas endógenas, relevantes biológicamente, tales como se definieron, por ejemplo en R.D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998) 1694-1720. 5 Una enzima sensible a las hormonas se entiende como la acepción de una enzima que se influencia en su actividad por mensajeros secundarios (por ejemplo, cAMP) de fosforilación dependiente o por medio de otros mecanismos alostéricos (por ejemplo, interacción proteína-proteína) que están bajo el 0 control de las hormonas. Las hormonas que regulan el nivel de cAMP son por ejemplo, la adrenalina, noradrenalina, glucagon e insulina. La invención se refiere a un proceso para la preparación de un substrato, que comprende 5 a) hacer reaccionar un ácido graso suministrado con una etiqueta fluorescente con 2, 3-epoxipropanol para dar un monoacilglicérido en una solución alcohólica, tal como por ejemplo, alcanol C?-C4, preferiblemente metanol, a la temperatura ambiente con la adición de una base tal 0 como por ejemplo, una base inorgánica que no es nucleofílica, preferiblemente carbonatos de metales alcalinos y alcanolatos Cx-C4 de metales alcalinos, en particular preferiblemente metanolatos tales como metanolato de sodio o metanolato de potasio, b) someter este monoacilglicérido a tratamiento ultrasónico con fosfolípidos en la relación de 1:10 a 10:1 (mg/ml) preferiblemente 1:2 a 3:1 y • particularmente preferible de 1:1 a 1.5:1 a partir de 5 lo cual resulta el substrato, que se reconoce por un cambio de color de amarillo a rojo. Una etiqueta fluorescente se define como un grupo químico dentro de una molécula que, después de la excitación mediante la luz, es capaz por si mismo de emitir luz. Tales <4**fcl0 grupos son empleados aquí para preparar substancias que por sí mismas son detectables en bajas concentraciones de aproximadamente InM. Puede mencionarse por ejemplo, el ácido de N, N-dimetilaminosulfónico (dansilo) o NBD, preferiblemente NBD. 15 Un ácido graso se entiende, por ejemplo, que indica un ácido carboxílico de cadena larga el cual es saturado o insaturado y tiene una longitud de cadena de 8 átomos de carbono a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 12 átomos de carbono, 14 átomos de carbono, 16 átomos de carbono y 18 20 átomos de carbono los cuales son saturados o insaturados, particularmente se prefiere de 12 átomos de carbono y saturados . Un ácido graso suministrado con una etiqueta fluorescente se acopla a un monoacilglicérido usando 2,3- epoxipropanol . De este substrato sintético y los fosfolípidos tales como por ejemplo, fosfatidilinositol y fosfatidilcolina por sí mismos o conjuntamente, de manera opcional en una IB relación por peso de 10:1 a 1:10 preferiblemente de 3:1 a 5 1:3, particularmente preferiblemente de 2:1, las micelas o vesículas que sirven como substrato de la lipasa a ser investigadas formadas por un tratamiento ultrasónico final por ejemplo, aproximadamente de 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 6 minutos, particularmente preferibles 10 de 4 minutos. Esta incorporación en las micelas o vesículas • se asocia con un cambio de color del amarillo a rojo, basados en un complejo que transfiere una carga de los aromáticos que están espacialmente adyacentes de manera cercana en esta estructura. La incubación con la lipasa lleva a la remoción 15 de los ácidos con liberación del ácido graso etiquetado y glicerol . Como los fosfolípidos ' por ejemplo, la fosfatidilcolina 1 (6 mg) y el fosfatidilinositol (6 mg) se disuelven en cloroformo (1 ml cada uno) . Para la preparación del 20 substrato, las dos partes de la solución de fosfatidilinositol (por ejemplo, 83.5 µl) y una parte de la solución de fosfatidilcolina (por ejemplo, 41.5 µl) y 100 µl de solución NAG (10 mg en 1 ml de cloroformo) son medidos con una pipeta conjuntamente (la concentración final en la prueba: 0.0375 mg de fosfolípido/ml; 0.05 mg/NAG/ml). Después de eliminar el cloroformo, se agregan 20 ml de 25 M tris/HCl, pH 7.4; 150 mM de NaCl y dos tratamientos i untrasónicos se llevan a cabo usando una sonda ultrasónica 5 (Brandon Sonifier tipo II, microtip estándar, 25 W) : primer tratamiento: ajustar 2, 2 x 1 minuto entre 1 minuto cada uno en hielo; el segundo tratamiento: ajustar 4, 2 x 1 minuto, entre 1 minuto cada uno en hielo. Durante este procedimiento, el color de la solución del substrato cambia de amarillo 10 (extinción máxima de 481 nm) a rojo (extinción máxima de 550 • nm) debido a la intercalación de NAG entre las moléculas de fosfolípido de las vesículas/micelas . El ácido graso libre no forma micelas o vesículas. Por lo tanto se observa un cambio de color de rojo a amarillo 15 durante la eliminación del ácido graso de las micelas/vesículas. Así, la destrucción de las micelas/vesículas y por lo tanto la actividad de la enzima de • la lipasa es medible, ya sea visualmente (a 481 nm, o a 550 nm) por medio del cambio de color del rojo al amarillo, con 20 la ayuda de un fotómetro de cubeta (por ejemplo, DU-640 de Beckman (Munich) ) o de un lector de placa microtitulador (por ejemplo, MicroBeta de Wallac (Turku, Finlandia) o de manera alternativa fluorimétricamente con la ayuda de un formador de fosfo-imágenes (por ejemplo, Storm 840 de Molecular Dynamics (Krefeld) ) , de un explorador de fluorescencia (por ejemplo, DA-2 de Shimadzu (Osaka, Japan) ) o de un proceso de análisis de imágenes (por ejemplo, ArrayScan de Molecular Devices |fl (USA)) que se basan en una cámara CCD (dispositivo acoplado a 5 una carga) , que tiene un circuito integrado para procesar señales ópticas y eléctricas en las cuales la información se almacena y se transmite en la forma de cargas eléctricas. Todos estos métodos son empleados preferiblemente en combinación con filtrador de elevado rendimiento (HTS) . 10 Procesos adicionales que se basan en este concepto, son la • medición de la citotoxicidad de los compuestos y la acción de los detergentes. La invención también se refiere a un substrato preparado mediante el proceso descrito arriba y a un substrato para 15 usar en un proceso para la identificación de estructuras que favorecen el arreglo de aromáticos para dar complejos de transferencia de carga, preferiblemente para la « identificación de estructuras fosfolipido/lípido, particularmente preferiblemente de lipasas/inhibidores de 20 lipasas como se describe arriba. El proceso puede también ser empleado para la destrucción de estructuras de monocapas o bicapas que son arqueadas (por ejemplo, micelas o vesículas) o planas ( por ejemplo, bicapas rectas producidas de manera artificial), que son acompañadas por un cambio de color. El II cambio de color puede ser monitoreado visual ente/ópticamente o en una forma fluorométricamente medible como se describe arriba. (Bk La invención además se refiere a un proceso para la 5 preparación del monoacilglicerido 2, 3-dihidroxipropil 12- (7- nitrobenzo [1, 2, 3] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato, en donde el ácido 12-aminolaurico se hace reaccionar primero con 7-cloro- 4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol y el intermediario obtenido después se hace reaccionar con 2, 3-epoxipropanol en una 10 solución alcohólica a temperatura ambiente con la adición de una base, tal como carbonato de metal alcalino y alcanolato C1-C4 de metal alcalino, preferiblemente metanolato, tal como metanolato de sodio o metanolato de potasio, y el monoacilglicérido 12- (7-nitrobenzo [1,2,3] oxadiazol- - 15 ilamino) dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo mismo. El objetivo de la invención se logra mediante un proceso para la identificación de lipasas/inhibidores de lipasas cuya 1 presencia produce un cambio de color, que comprende a) preparar un substrato como se describió arriba, 20 b) incubar este substrato con una lipasa (tal como, por ejemplo, una lipasa sensible a las hormonas, lipasa monoglicérida, lipasa diglicérida, lipasa triglicérida, lipasa de lipoproteína, lipasa pancreática, lipasa hepática, lipasa bacteriana, PLA2, PLC, esterasa de colesterol, preferiblemente una lipasa sensible a las hormonas y una lipasa pancreática, particularmente preferiblemente una lipasa sensible a las hormonas) , y c) determinar el cambio de color, por ejemplo, visualmente/ópticalmente o fluirimétricamente . La invención además se relaciona a las lipasas e inhibidores de lipasas que han siso identificados mediante el proceso descrito arriba. La invención se relaciona además a un proceso para la determinación de la actividad de las lipasas/inhibidores de lipasas, en donde se prepara un substrato tal como se describió arriba, este substrato se incuba con una lipasa, y se determina la proporción del cambio de color de rojo a amarillo o inversamente de amarillo a rojo y la actividad se determina, por ejemplo, por medio de una medición de absorción con un fotómetro o una medición de la fluorescencia con un fluorímetro. Una reacción típica se lleva a cabo a 30°C durante 60 minutos, por ejemplo en vasos Eppendorf de 1.5 ml o placas de 96 huecos. 10 µl de una substancia de prueba (por ejemplo, los inhibidores de HSL) son introducidos en amortiguador de ensayo (25 mM tris/HCl, pH 7.4; 150 mM de NaCl) en la presencia de 16.6% de DMSO. Se añadieron 180 µl de la solución de substrato (20 µg/ml de fosfatidilcolina, 10 µg/ml de fosfatidilinositol, 50 µg/ml de NAG en amortiguador de ensayo) . Después de una preincubación de 15 minutos a 30°C, 20 µl de HSL en amortiguador de ensayo se to an con una |*H pipeta y la extinción se mide inmediatamente (ver arriba) a 5 481 nm en un fotómetro de cubeta (una cubeta de 0.5 ml) o un lector de placa microtituladora. Después de una cierto tiempo de incubación, el cual es variable y depende de la concentración de la enzima seleccionada y el cual puede ser de entre 2 y 240 minutos, en este caso la incubación a 30°C 10 durante 60 minutos, la extinción se mide nuevamente. El aumento en la extinción en la región amarilla, en este caso a 481 nm, es una medida de la actividad de la enzima. Los sistemas de prueba para la identificación de un inhibidor de lipasa o para la determinación de la actividad 15 de una lipasa/de un inhibidor de lipasa, son de manera similar un objetivo de la invención. Estos comprenden un substrato tal como se describe arriba, un dispositivo ultrasónico y opcionalmente un dispositivo para la determinación visual/óptica y/o fluorimétrica del cambio de 20 color de rojo a amarillo o, además de un substrato como se describe arriba y un dispositivo ultrasónico, un dispositivo para la determinación de la proporción del cambio de color y un dispositivo para la absorción o medición de la fluorescencia .

El sistema de prueba puede también estar presente en la forma de un kit o equipo, la prueba es una prueba de lipasa.

El equipo contiene un substrato como se describe arriba, i opcionalmente en un amortiguador de prueba, y un recipiente 5 para llevar a cabo la prueba, tal como por ejemplo un vaso Eppendorf o una placa de microtitulación, preferiblemente una placa de microtitulación. Los objetivos adicionales de la invención se refieren a procesos para la determinación de sistemas de 10 transporte/transferencia moleculares, para medir la acción detergente de los compuestos o para la investigación de la citotoxicidad de los compuestos (medicamentos y similares) , que comprenden un substrato como se describe arriba y una fosfolipasa, por ejemplo fosfolipasa A2 (de veneno de 15 serpiente) o C (Bacillus cereus) . Las proteínas transportadoras/transferencia se entienden como proteínas que por sí' mismas reconocen los nutrientes principales tales como carbohidratos, lípidos y proteínas y los transportan a través de membranas biológicas o los 20 transfieren a partir desde una cierta membrana biológica a otra. Las proteínas transportadoras/transferencia por ejemplo aisladas del íleo de rata, son reconstituidas funcionalmente (proteoliposomas) en vesículas de fosfolípidos (liposomas) o incubadas junto con los liposomas como polipéptidos solubles y después añadidos a una mezcla de fosfolípidos y NBD- glicérido como se describe arriba y tratados con ultrasonido. Los procesos de transporte o procesos de transferencia del ? NBD-glicérido de las micelas/vesículas que contienen NBD- 5 glicérido en el lumen de los proteoliposomas con la ayuda de transportadores o en la membrana de los liposomas con la ayuda de las proteínas de transferencia llevan a la disolución/destrucción de la estructura de las micelas y pueden a su vez ser monitoreadas fotométricamente o 10 fluorimétricamente como se describe arriba. F La acción detergente de los compuestos químicos se basa en la destrucción de las micelas/vesículas. Como las membranas biológicas están también construidas de esta forma, tales compuestos son usualmente citotóxicos. La destrucción de las 15 micelas puede ser fácilmente detectada usando el proceso presente por medio del cambio de color descrito.

F Síntesis : Unos pocos ácidos grasos etiquetados con NBD tales como 20 el ácido 12- (7-nitrobenzo [1, 2 , 3] oxadiazol-4- ilamino) dodecanoico (1) están de hecho comercialmente disponibles, pero son costosos. Aunque los primeros experimentos fueron llevados a cabo con material comercialmente obtenible, fue posible obtener el compuesto (1) en buenos rendimientos mediante la reacción del ácido 12- aminolaúrico con 4-cloro-7-nitrobenzo [ 1, 2, 5] oxadiazol en MeOH. F Lista de los compuestos 1-9: (i) ácido 12- (7-nitrobenzo [l,2,3]oxadiazol-4- ilamino) dodecanoico. 2 2, 3-epoxipropanol 10 3 Ri = OH R2 = OH 4 Ri = OAc R2 = Oac 5 Rx = OOC(CH2)3CH3 R2 = OOC(CH2)3CH3 6 Rl = OOC('CH2)?4CH3 R2 = OH 7 Rl = OOC(CH2)14CH3 R2 = Oac 15 Ri = 0(CH2)?7CH3 R2 = 0(CH2)?7CH3 (la) 9a Ri, R2 = isopropilideno 3a Ri, R2 = OH (Ib) 9b Ri, R2 = isopropilideno 3b Ri, R2 = OH Mediante la adición nucleofílica de (1) a 2,3- epoxipropanol (2) , fue posible obtener el monoacilglicérido 10 (3) en aceptables rendimientos. El compuesto (3) después fue acilado para alcanzar los triglicéridos (4) y (5). El diacilglicérido (6) se obtuvo por esterificación de (1) con palmitina. Este compuesto también se hizo reaccionar para dar el correspondiente triacilglicérido (7) . El mismo método se 15 usó para hacer reaccionar el diéter de glicerol (8) para dar el pseusotriacilglicérido (9), en el cual dos radicales de acilo son reemplazados por éteres de cadena larga. Todos los compuestos sintetizados comprobaron ser i substratos de lipasas, preferiblemente de HSL, pero mostraron 5 considerables diferencias de actividad. El "mejor" substrato de las lipasas probó ser el monoacilglicérido (3). La introducción de los grupos acilo adicionales como en los compuestos (4), (5), (6) y (7), llevan a una disminución en la actividad. 10 Esto se puede explicar fácilmente mediante la f competencia en la eliminación del grupo acilo NBD por los radicales de acilo recientemente introducidos. Para conformar esta hipótesis, se sintetizó un pseudotriacilglicérido (9) en el cual dos grupos de acilo son reemplazados mediante 15 unidades de éter de hexadecilo. Estas no pueden ser eliminadas de las lipasas y deberán por lo tanto no competir con el éster de ácido graso NBD. En pruebas biológicas, este f compuesto en efecto comprobó ser un substrato, pero con actividad baja. Obviamente, además de la región catalítica, 20 las lipasas tienen una región de enlace hidrofóbica extendida, accesible a los grupos éter de cadena larga, tales como la adición de la unidad de ácido graso. Como el monoacilglicérido (3) probó ser un adecuado substrato de las lipasas, se investigó si hay una preferencia regioselectiva para la posición 1 o 3. Para estas investigaciones, se sintetizaron los regioisómeros enantioméricos (3a) y (3b). B La síntesis de los enantiómeros (3a, b) inician desde D- 5 y L-1, 2-0-isopropilidenoglicerol, el cual es esterificado con el ácido graso etiquetado con NBD (1) mediante la activación de diciclohexilcarbodiimida . El grupo protector se eliminó usando HCl metanólico ÍN. Ambos compuestos mostraron actividad biológica idéntica, tal que el uso del compuesto 10 enantiomérico puro no promete ventajas. F 1.- Acido 12- (7-Nitrobenzo[l,2, 3] oxadiazol-4- ilamino) dodecanoico (1): Se añadió 30% de una solución de metanolato de sodio 15 fuerte (14.5 ml, 76 mmol) con agitación a una solución de ácido 12-aminolaúrico (18 g, 83.7 mmol) en MeOH (300 ml) . Después de 5 minutos, la mezcla de reacción se aclaró y se F añadió una solución de 7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol (15 g, 75 mmol) en MeOH (300 ml) . La mezcla de reacción que 20 inmediatamente se vuelve obscura, se agitó durante 18 horas a 25°C. Después se añadió HCl metanólico 1M (100, 100 mmol) y el solvente se destiló a vacío. El residuo se tomó en MeOH, la mezcla se filtró a través de gel de sílice, el filtrado se concentró a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (1:1 tolueno/EtOAc) . (1) se obtuvo como un sólido rojo (26.4 g, 93%); RF: 0.16 (1:1 tolueno/EtOAc) . A XH-NMR (250 MHz, CDCI3) : d 8.5 (d, 1 H, ArH), 6.35 (m, 1 H, 5 NH) , 6.18 (d, 1 H, ArH), 3.48 (dt, 2 H, CH2NH2) , 2.36 (t, 2 H, CH2COQH), 1.9-1.2 (m, 18 H, 9 CH2) . MS (ESI-MS) 379.2 (M+l). 2. - 12- (7-nitrobenzo [1,2,3] oxadiazol-4-ilamino) - dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo (3): 10 Una solución del compuesto (1) (12 g, 31.7 mmol) y 2,3- F epoxipropanol (50 ml) in isopropanol (50 ml) se agitó a 50°C durante 16 horas. El solvente se destiló al vacío, y el residuo se secó a 0.01 torr y se purificó mediante cromatografía instantánea (diisopropil éter, éter, EtOAc) . El 15 compuesto (3) se obtuvo como un aceite rojo (10.3 g, 71.8%); RF: 0.18 (1:1 tolueno/EtOAc) ; RF: 0.5 (30:5:1 CH2Cl2-MeOH-NH3) , el cual cristalizó a partir- de EtOAc/dietil éter. XH-NMR (250 MHz, CDCI3) : d 8.5 (d, 1H, ArH), 6.35 (m, 1 H, NH), 6.18 (d, 1 H, ArH), 4.19 (dd, 2 H, H-l, H-l1)/ 3.94 (m, 20 1 H, H-2), 3.65 (dd, 2 H, H-3, H-3'), 3.48 (dt, 2 H, CH2NH2) , 2.35 (t, 2 H, CH2COOH), 1.8 (m, 2 H, CH2) , 1.6 (m, 2 H, CH2) , 1.27-1.15 (m, 14 H, 7CH2) . MS (ESI-MS) 453.4 (M+l). 3.- 12- (7-nitrobenzo [1, 2, 5] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de (S) -2,2-Dimetil [1, 3] dioxolan-4-ilmetilo (9a) : Una solución del compuesto (1) (60 mg, 159 µmol) en CH2C12 (2 ml) se trató con diciclohexilcarbodiimida (160 mg, á 770 µmol) y se agitó a 25°C durante 30 minutos. Una solución 5 de (R)-(2, 2-dimetil [1, 3] dioxolan-4-il) metanol (100 mg, 760 µmol) y dimetilaminopiridina (94 mg, 770 µmol) en CH2C12 (2 ml) después se añadió y la solución de reacción se agitó durante 4 h adicionales a 25°C. El solvente se destiló a vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía 10 instantánea (15:1 tolueno/EtOAc) . El compuesto (9a) se obtuvo F como un aceite amarillo fluorescente (46 mg, 58%). RF 0.29 (4:1 tolueno/EtOAc) . XH-NMR (CDCI3) : d 8.5 (d, 1 H, aro at.), 6.2 (m, 1 H, NH) , 6.16 (d, 1 H, aromat.), 4.31 (m, 1 H) , 4.1 (m, 3 H) , 3.73 15 (dd, 1 H), 3.48 (dt, 2 H, CH2NH2) , 2.35 (t, 2 H, CO-CH2) , 2.0- 1.2 (m, 18 H, 9 CH2) , 1.42 (s, 3 H, CMe2) , 1.37 (s, 3 H, CMe2) . F 4. - 12- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato 20 de (R)-2,2-Dimetil[l, 3] dioxolan-4-ilmetilo (9b): El compuesto (9b) se prepara como se describe en el compuesto (9a). El compuesto (9b) se obtuvo como un aceite amarillo fluorescente (51.4 mg, 65%). RF 0.29 (4:1 tolueno/EtOAc) .

XH-NMR (CDCI3) : d 8.5 (d, 1 H, ArH), 6.2 (m, 1 H, NH) , 6.16 (d, 1 H, ArH), 4.31 (m, 1 H) , 4.1 (m, 3 H) , 3.73 (dd, 1 H) , 3.48 (dt, 2 H, CH2NH2), 2.32 (t, 2 H, CO-CH2) , 2.0-1.2 (m, 18 f H, 9 CH2), 1.42 (s, 3 H, CMe2) , 1.37 (s, 3 H, CMe2). 5 5. - 12- (7-nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de (S) -2, 3-dihidroxipropilo y 12- (7-nitrobenzo [1, 2, 5] - oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de (R) -2, 3-dihidroxipropilo (3b) : 10 Se añade HCl metanólico (1 M, 200 µmol) a una solución de 13.9 mg (28.2 µmol) del compuesto (9a) o 17.8 mg (36.1 µmol) del compuesto (9b) en 25 ml de metanol y la mezcla se agitó durante 1.5 horas a 25°C. El solvente se destiló a vació y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea 15 (2:1,1:1 tolueno/EtOAc) . Los esteres de ácidos grasos (3a) y (3b) se obtuvieron con un rendimiento de 10.5 mg (82%), y 9.3 mg (57%) respectivamente. Los datos de XH-NMR (CDC13) y la masa espectral son idénticos al compuesto (3). 20 6.- Acetato de 2-Acetoxi-3- [ 12- (7-ni.trobenzo [ 1 , 2, 5] - oxadiazol-4-ilamino) -dodecanoiloxi] propilo (4) : El compuesto (3) (12 mg, 26.5 µmol) se hizo acetilar en 2:1 piridina/anhidrido acético (3 ml). Después de 8 horas, la mezcla se concentra a sequedad y el residuo se purifica mediante cromatografía instantánea (1:2 tolueno/EtOAc) . El compuesto (4) se obtiene como un aceite flourescente ( amarillo (13 mg, 91%) . 5 RF0.66 (1:1 tolueno/EtOAc) . ^-N R (250 MHz, CDCI3) : d 8.5 (d, 1 H, ArH), 6.3 (m, 1 H, NH) , 6.18 (d, 1 H, ArH), 5.24 (m, 1 H) , 4.92 (m, 1H) , 4.34 (m) 4.28, 4.16, 3.48 (dt, 2 H, CH2NH2) , 2.32 (CH2COO) , 2.1(2s, 6 H, 2 OAc) 2.0-1.0 (m, 18 H, 9 CH2) . 10 MS (ESI-MS) : 537.4 (M+l). F 1.- Hexanoato de 2-Hexanoiloxi-3- [12- (7-nitrobenzo [1 , 2, 5] - oxadiazol-4-ilamino) -dodecanoiloxi] propilo (5) : Se añade anhídrido hexanoico (100 µl) a una solución del 15 compuesto (2) (5 mg, 11 µmol) en piridina (300 µl) y la mezcla de reacción se deja reposar a 25 °C durante 16 horas.

El solvente se destila a vacío y el residuo se purifica ^ mediante cromatografía instantánea (9:1 tolueno/EtOAc) . El compuesto (5) se obtiene como un aceite amarillo fluorescente 20 (1.8 mg, 25%) . RF: 0.73 (1:1 tolueno/EtOAc) . XH-NMR (250 MHz, CDC13) : d 8.5 (d, 1H ArH), 6.25 (m, 1 H, NH) , 6.18 (d, 1 H, ArH) , 5.26 (m, 1 H, H-2) , 4.29 (dd, 2 H, H-3, H-3*), 4.15 (dd, 2 H, H-l, H-l1) , 3.46 (dt, 2H, CH2-NH) , 2.34 (t, 6 H, 3 CH2COO) , 1.63-1.2 (m, 12 H, 6 CH2) , 0.88 (m, 6 H, 2 CH3) . MS (ESI-MS) : 649.5 (M+l). |ßfc 8.- Hexadecanoato de 2-Hidroxi-3- [ 12- (7- 5 nitrobenzo [1,2,5] oxadiazol-4-ilamino) -dodecanoiloxi] - propilo (6) : Una solución del compuesto (1) (25 mg, 66 µmol), 4- dimetilaminopiridina (9 mg, 73 µmol) y 1, 1-carbonildiimidazol (15 mg, 73 µmol) en CH2C12 (5 ml) se agita a 25°C durante 30 10 minutos. El solvente se destiló al vacío y el residuo se f purificó mediante cromatografía instantánea (9:1 tolueno/EtOAc) . El compuesto (6) se obtuvo como un aceite amarillo fluorescente (9.5 mg, 21%). RF 0.25 (5:1 tolueno/EtOAc) . 15 XH-NMR (250 MHz, CDC13) : d 8.54 (d, 1 H ArH), 6.3 ( , 1 H, NH) , 6.19 (d, 1 H, ArH), 4.20 (dd, 2 H, H-l, H-l1), 4.15 (dd, 2 H, H-3, H-3'), 4.12 (m, - 1 H, H-2), 3.5 (dt, 2H, CH2-NH) , 2,36 (t, 4 H, 2 CH2COO) , 1.82 (m, 2 H, CH2-CH2-NH) , 1.63 (m, 4 H, 2 CH2CH2COO) , 1.47 (m, 2 H, CH2- (CH2) 2-NH) , 1.31-1.26 (m, 22 20 H, 11 CH2) , 1.287 ( , 2 H, CH2) , 1.26 (m, 2 H, CH2) , (m, 4 H, 2 CH2CH2CH2COO) , 1.31-1.26 (m, 18 H, 9 CH2) , 1.3 (m, 2 H, CH2) , 1.26 (m, 2 H, CH2) , 0.89 (t, 3 H, CH3) . MS (ESI-MS) : 649.5 (M+l) . 9.- Hexadecanoato de 2-Acetiloxi-3- [12- (7-nitrobenzo- [1, 2, 5] -oxadiazol-4-ilamino) -dodecanoiloxi] propilo (7) : El compuesto (6) (6 mg, 8.7 µmol) se acetiló y se l*B desarrolló como se describió en el compuesto (4). El producto 5 crudo se purificó mediante cromatografía instantánea (9:1 tolueno/EtOAc) . El compuesto (7) se obtuvo como un aceite amarillo flourescente (5.1 mg, 95%). RF 0.71(5:1 tolueno/EtOAc) . XH-NMR (250 MHz, CDC13) : d 8.5 (d, 1 H, ArH), 6.25 (m, 1H, 0 NH) , 6.17 (d, 1 H, ArH), 5.25 (m, 1 H, H-2), 4.27 (dd, 2 H, H-l, H-3), 4.15 ,(dd, 2 H, H-l' H-3'), 3.73 (dt, 4 H, CH2-NH) , 2.3 (t, 2 H, CH2COO) , 2.08 (s, 3 H, OAc), 1.8 (m, 2 H, CH2- CH2-NH) , 1.6 (m, 8 H, 4 CH2) , 1.4-1 (m, 32 H, 16 CH2) , 0.85 (t, 3 H, CH3) . 15 MS (FAB-MS) : 739 (M+Li) . 10. - 12- (7-nitrobenzo [1, 2-, 5] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de 2, 3-bis-octadeciloxi-propilo (8): Se añadió 2, 3-bis-octadeciloxipropan-l-ol (5 mg, 8.37 20 µmol) a una solución del compuesto (1) (3 mg, 7.9 µmol), dimetilaminopiridina (5 mg, 41 µmol) y diciclohexilcarbodiimida (5 mg, 24 µmol) en CH2CI2. La mezcla de reacción se agitó a 25°C durante 2 horas, el solvente se destiló al vació y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (2:1 éter de petróleo/ éter dietílico) . El compuesto (8) se obtuvo como un aceite amarillo fluorescente (3.5 mg, 46%). RF 0.55 (3:7 éter dietílico/ éter de petróleo). MS (FAB-MS): 957.8 (M+l).

Preparación de la Enzima: Preparation de HSL purificado parcialmente: Las células grasas de rata se obtienen a partir del tejido de graso epididímico de ratas machos no tratados (Wistar, 220-250 g) mediante tratamiento de colagenasa de acuerdo a los procesos publicados. Las células grasas de 10 ratas se lavan tres veces mediante flotación con 50 ml cada una de amortiguador de homogeneización (25 ml tris/HCl, pH 7.4, 0.25 M sucrosa, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 µg/ml de leupeptina, 10 µg de antipaina, 20 µg/ml de pepstatina) y finalmente se toma en 10 ml de amortiguador de homogeneización. Las células grasas son homogeneizadas en un homogeneizador de vaso de Teflón (Braun-Melsungen) mediante 10 golpes a 1500 rpm y 15°C. El homogeneizador se centrifugó (tubos Sorvall SM24, 5000 rpm, 10 minutos, 4°C) . La capa del fondo que yace entre la capa grasa superpuesta y la pelotilla o pelet se elimina y la centrifugación se repite. La capa del fondo resultante de esta, se centrifugó nuevamente (tubos Sorvall 5M24, 20,000 rpm, 45 minutos, 4°C) . La capa del fondo se eliminó y se trató con 1 g de heparina-Sefarosa (Pharmacia Biotech, CL-6B, se lavó 5 x con 25 mM de tris/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) . Después de la incubación durante 60 minutos a 4°C (agitándose a intervalos de 15 minutos) , el lote se 5 centrifugó (tubos Sorvall SM24, 3000 rpm, 10 minutos, 4°C) . El sobrenadante se llevó a un pH de 5.2 mediante la adición de ácido acético glacial y se incubó a 4°C durante 30 minutos. Los precipitados se recolectaron mediante centrifugación ( Sorvall SS34, 12,000 rpm, 10 minutos, 4°C) y se suspendió en 2.5 ml de tris/HCl 20 mM, pH 7.0, EDTA 1 mM, NaCl 65 mM, 13% de sucrosa, DTT 1 mM, 10 µg/ml de leupeptina/pepstatina/antipaina . La suspensión se dializó durante toda la noche a 4°C contra tris/HCl 25 mM, pH 7.4, 50% de glicerol, DTT 1 mM, 10 µg/ml de leupeptina, 15 pepstatina, antipaina y después ' se aplicó a una columna de hidroxilapatita (0.1 g por 1 ml de suspensión, equilibrada con fosfato de potasio 10 -mM, pH 7.0, 30% de glicerol, DTT F 1 mM) . La columna se lavó con cuatro volúmenes de amortiguador de equilibrio a una velocidad de flujo de 20 a 20 30 ml/h. El HSL se eluyó con un volumen de amortiguador de equilibrio que contiene fosfato de potasio 0.5 M, después se dializó (ver arriba) y se concentró de 5 a 10 veces mediante la ultrafiltración (Amicon Diaflo PM 10 filtro) a 4°C. El HSL purificado parcialmente puede ser almacenado a -70°C durante 4 a 6 semanas.

Preparation del substrato NAG (NBD-monoacilglicerido) : Se disuelven 6 mg de fosfatidilcolina y 6 mg de 5 fosfatidilinositol en 1 ml de cloroformo cada uno. Se disuelven 10 mg de NAG en 1 ml de cloroformo. Dos partes de solución de fosfatidilinositol (por ejemplo, 83.5 µl) y una parte de solución de fosfatidilcolina (por ejemplo, 41.5 µl) y 100 µl de solución NAG son medidos con una pipeta 10 conjuntamente en los recipientes plásticos de centelleo (concentración final en la prueba: 0.0375 mg de fosfolípidos/ml; 0.05 mg/ NAG/ l) . El cloroformo (volumen total 225 µl) se eliminó completamente mediante sobresoplado con una corriente de N2. El substrato seco puede ser 15 almacenado a 4°C durante hasta tres días. Para la preparación de las vesículas/micelas de fosfolípido que tengan NAG intercalado (en el día de prueba) , se tomó el substrato seco fc en 20 ml de amortiguador de prueba (tris/HCl 25 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM) y dos tratamientos ultrasónicos con una sonda 20 ultrasónica (Branson Sonifier tipo II, microtip estándar): primer tratamiento: ajustar 2 , 2 x 1 minuto entre cada caso un minuto en hielo; segundo tratamiento: ajustar 4, 2 x 1 minuto, entre cada caso 1 minuto en hielo. Durante este procedimiento, el color de la solución del substrato cambia de amarillo (extinción máxima 481 nm) a rojo (extinción máxima 550 nm) , debido a la intercalación de NAG entre las moléculas de fosfolípido de las vesículas/micelas. Antes de <*M usarse como un substrato (dentro de las siguientes 2 horas) , 5 la solución se incubó adicionalmente en hielo durante 15 minutos .

Ensayo de NAG indirecto: El ensayo se lleva a cabo a 30°C durante 60 minutos en ^10 vasos Eppendorf de 1.5 ml o placas de 96 huecos. Para encontrar los inhibidores de HSL, se introducen 10 µl de la substancia de prueba en el amortiguador de ensayo (tris/HCl 25 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM) en presencia de DMSO al 16.6%. Se añaden 180 µl de la solución del substrato (20 µg/ml de 15 fosfatidilinositol, 50 µg/ml de NAG en amortiguador de ensayo) . Después de una preincubación durante 15 minutos a 30°C, 20 µl de la solución de -la enzima en el amortiguador de ensayo (diluida de 1 a 4 veces) se toman con una pipeta y la extinción se mide inmediatamente a 480 nm en un fotómetro de 20 cubeta (cubeta de 0.5 ml) o un lector de placa de microtitulación (microBeta, Wallac) . Después de la incubación a 30°C durante 60 minutos, la extinción se midió nuevamente. El incremento en la extinción a 480 nm es una medida de la actividad enzimática. Bajo condiciones estándar, 20 µg de HSL purificado parcialmente llevan a un cambio de extinción de 4000 unidades arb.

^^ Ensayo de NAG Directo: 5 Alternativamente a la medición del cambio de extinción de la solución del substrato, los productos de HSL son investigados mediante la separación de fase/cromatografía de capa delgada. Para esto, el lote de incubación (volumen total 200 µl, ver ensayo de NAG indirecto) se mezcló en vasos 10 Eppendorf de 2 ml con 1.3 ml de metanol/cloroformo/heptano *W (10:9:7) y después con 0.4 ml de NaOH 0.1 M. Después de mezclar intensivamente (10 segundos), la separación de fase se inició mediante la centrifugación (800xg, 20 minutos, a la temperatura ambiente) . Los volúmenes equivalentes (por 15 ejemplo, 0.4 ml) se toman de la fase superior acuosa y la extinción se determina fotométricamente a 481 nm. Para la cromatografía de capa delgada, la fase acuosa se seca IB (SpeedVac) y después se toman en 50 µl de tetrahidrofurano.

Muestras de 5 µl se aplicaron a las placas de gel de sílice 20 Si-60 (Merck, Darmstadt) . La cromatografía se lleva a cabo usando 78 ml de éter dietílico/ 22 ml de éter petróleo/1 ml de ácido acético glacial como un eluyente. La cantidad de ácido graso NBD fluorescente, liberado, se determinó mediante la formación de imágenes con fósforo (Molecular Dynamics, Storm 840 y programas ImageQuant) a una longitud de onda de excitación de 460 nm y una longitud de onda de emisión de 540-560 nm.

Ensayo TAG: Para la preparación del substrato, se mezclan 25-50 µCi de [3H] trioleoilglicerol (en tolueno), 6.8 µMol de trioleoilglicerol no etiquetado y 0.6 mg de fosfolípidos (fosfatidilcolina/fosfatidilinositol 3:1 peso/volumen), se secaron en N2 y después se toman en 2 ml de 0.1 M de KPi (pH 7.0) mediante tratamiento ultrasónico (Branson 250, microtip, ajustar 1-2, 2 x 1 minuto en un intervalo de 1 minuto) . Después de la adición de 1 ml de KPi y tratamiento untrasónico fresco ( 4 x 30 segundos en hielo a intervalos de 30 segundos), se añadió 1 ml de BSA al 20% (en KPi) (concentración final de trioleoilglicerol 1.7 mM) . Para la reacción, 100 µl de la solución de substrato son colocados con una pipeta en 100 µl de solución de HSL (El HSL se preparó como arriba, se diluyó en 20 mM KPi, pH 7.0, EDTA 1 M, DTT 1 mM, BSA 0.02%, 20 µg/ml de pepstatina, 10 µg/ml de leupeptina) y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de la adición de 3.25 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7) y de 1.05 ml de K2C03 0.1 M, ácido bórico 0.1 M (pH 10.5), el lote se mezcló bien y finalmente se centrifugó (800xg, 20 minutos) . Después de la separación de fase, un equivalente de la fase superior (1 ml) se toma y se determina la radioactividad mediante la medición por centelleo líquido.

Ensayo PNPB: 10 µl de butirato de p-nitrofenilo (PNPB) (2 mM en acetonitrilo), 890 µl de KPi 0.1M (pH 7.25) NaCl al 0.9%, DTT 1 mM y 100 µl de HSL (preparado como arriba, diluido en este amortiguador) se incuban a 37°C durante 10 minutos. Después de la adición de 3.25 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7, peso/volumen) y agitación vigorosa, el lote se centrifugó (800xg, 20 minutos) y se incubó a 42°C durante 3 minutos. Se toma un volumen equivalente de la fase superior y después se determina la absorción a 400 nm.

Ensayo de Tributirina : • Para la preparación del substrato, se añadió 5 µCi de [l-14 C] tributirina (en tolueno) a 1 ml de tributirina no etiquetada 20 mM (en acetonitrilo) . 10 µl de esta solución del substrato se incubó a 37°C durante 30 minutos con 390 µl de KPi 0.1 M (pH 7.25), NaCl 0.9%, DTT 1 mM, BSA 2% y 100 µl de HSL (preparado como arriba, diluido en este amortiguador) . Después de la adición de 3.25 ml de metanol/chloroforo/heptano (10:9:7, peso/volumen) y de 1 ml de NaOH 0.1 M, el lote se mezcló vigorosamente y se centrífugo finalmente (800xg, 20 minutos). Un volumen á equivalente (1 ml) de la fase superior se toma y la 5 radioactividad se determina mediante la medición por centelleo líquido.

Análisis : Las substancias son probadas usualmente en cuatro lotes 10 independientes. La inhibición de la actividad enzimática de F la HSL mediante una substancia de prueba se determina mediante la comparación con una reacción de control no inhibida. El valor IC50 se calculó por medio de una curva de inhibición usando al menos 10 concentraciones de la 15 substancia de prueba. Para el análisis de los datos, se usaron los paquetes de programas de cómputo GARPHIT, Elsevier-BIOSOFT (versión 3.0). F Ejemplos : 20 Ejemplo 1: Cinética de la escisión de NAG mediante HSL Se incubó NAG (0.05 mg/ml) con las cantidades indicadas de proteína HSL purificada parcialmente (fotómetro controlado por la temperatura) y la extinción a 481 nm se determinó en tiempos específicos. Para la inactivación, el HSL se incubó a 100°C durante 15 minutos (n= 8, media ± SD) . Resultados: Hasta una cantidad de la proteína de 20 µg, la reacción procede linealmente hasta 60 minutos. La diferencia de extinción es en este caso de 0.8 - 0.9 OD. En el caso de 5 pequeñas cantidades de proteína, se proporciona línealidad hasta 180 minutos.

Incremento en la absorción a 481 nm (unidades arbitrarias) 10 F 15 20 Ejemplo 2: Dependencia de la escisión de NAG en la cantidad de HSL El NAG (0.05 mg/ml) se incubó con las cantidades indicadas de la proteína HSL purificada parcialmente durante 60 minutos. Este incremento en la extinción a 481 nm (formación del ácido graso NBD libre como un producto de la reacción HSL = ensayo de NAG indirecto) o la disminución en 5 la extinción a 550 nm (consumo de NAG como un substrato de la reacción de HSL) se determinó en alícuotas de los lotes de reacción. Alternativamente, las alícuotas son extraídas adicionalmente con metanol/cloroformo y se determina el ácido graso NBD liberado contenido en la fase orgánica (= ensayo de 10 NAG directa) (n = 6, media ± SD) por análisis TLC y f fluorimetria (formador de fosfo-imágenes Storm 840, Molecular Dynamics) . Resultados: Hasta una cantidad de proteína de 20 µg la reacción procede linealmente con respecto a la formación del 15 producto (incremento de la extinción 481 nm o la aparición del ácido graso NBD libre de acuerdo al análisis de TLC) y con respecto al consumo del substrato (disminución de la f extinción a 550 nm) . El acuerdo entre el ensayo de NAG directo e indirecto soportan el análisis de la escisión o 20 desdoblamiento de NAG en el ensayo indirecto.

Cambio de absorción [unidades arbitrarias ] F F 10 15 Ejemplo 3: Dependencia de la escisión de NAG mediante HSL en la concentración del substrato. Diferentes cantidades de NAG (con una relación constante para los fosfolípidos) son incubados durante 60 minutos con las cantidades indicadas de HSL purificadas parcialmente y la 20 extinción se determinó entonces a 481 nm (n = 5, media ± SD) . Resultado: Con todas las tres cantidades de la enzima, la proporción de escisión o desdoblamiento exhibe el curso de una curva de saturación típica. A cuenta de la peculiaridad enzimática de la reacción HSL (presentación del substrato en "dos dimensiones", activación interfacial"), sin embargo, se puede determinar una dependencia lineal aproximadamente solo con 5 µg de proteína y las concentraciones del substrato mas bajas. La combinación de 20 µg de la proteína y 0.05 mg/ml de NAG representa un compromiso racional entre la dependencia del substrato y la fuerza de la señal (OD 0.6 a 0.7).

Incremento en la absorción a 481 nm (unidades arbitrarias) Ejemplo 4: Dependencia de la escisión de NAG por HSL en la proporción de NAG y fosfolípidos. El NAG (0.05 mg/ml) se preparó como un substrato mediante tratamiento ultrasónico usando diferentes cantidades de fosfolípidos (cantidades totales) con las proporciones indicadas de fosfatidilinositol a fosfatidilcholina y después se incubó con HSL purificado parcialmente (20 µg) durante 60 minutos. Se determinó el incremento en la extinción a 481 nm (n = 4, media + SD) . Resultados: La proporción de la enzima fue mayor con una relación PI/PC (de acuerdo al peso) de 3:1 y 0.0375 a 0.075 del fosfolípido total. El curso óptimo pronunciado para la concentración total de los fosfolípidos y para su composición soporta la importancia de la presentación de los substratos 10 de HSL ( en este caso NAG) en las vesículas y/o micelas de F fosfolípidos o la formación de una monocapa de fosfolípidos en el centro (neutro) del substrato.

Incremento en la absorción a 481 nm (unidades arbitrarias) 15 20 Ejemplo 5: Comparación del ensayo NAG directo/indirecto con un ensayo HSL convencional por medio de la determinación de los valores IC50 para varios inhibidores, El NAG (0.05 mg/ml) se incubó con 20 µg de HSL purificado parcialmente durante 60 minutos en la presencia de diferentes concentraciones (0.1 a 100 µM) de varias substancias. La extinción se determinó a 481 nm en alícuotas de los lotes (ensayo indirecto) o el NBD-FA liberado se extrajo por cloroformo/metanol y se determinó mediante análisis por TLC y fluorimetría (ensayo directo) . Alternativamente, se incubó [3H] trioleoilglicerol con HSL purificado parcialmente de acuerdo a las condiciones publicadas y el oletao radioetiquetado liberado se determinó mediante la medición del centelleo líquido después de la extracción con cloroformo/metanol . Los valores de I o son determinados a partir de las curvas de inhibición (n = 6, media ± SD) . Resultados: Para todas las substancias probadas, las curvas de inhibición sigmoidal típicas se determinaron usando los tres procesos. En el ensayo NAG directo/indirecto (incremento de la extinción a 481 nm/liberación del ácido graso NBD) , los valores IC50 son generalmente inferiores por un factor 4 a 10 comparado con la escisión de trioleoilglicerol mediante HSL; el orden de los inhibidores (de acuerdo a sus valores C50) , sin embargo, es idéntico para todos los tres procesos. Esto confirma los descubrimientos publicados que la acción de los inhibidores de HSL depende de la naturaleza del substrato y la presentación del substrato. Mas aún, las concentraciones 5 del substrato efectivo (NAG y trioleoilglicérido) pueden también diferir entre los dos ensayos (casi determinable a cuenta de la preparación del substrato como vesículas o micelas) y así explicar estas diferencias en el caso de inhibidores competitivos. Los valores de IC50 mas o menos idénticos que son determinados de acuerdo al cambio en la extinción y la liberación de ácido graso NBD, propone la escisión de NAG por HSL y así la liberación del ácido graso NBD como una causa del incremento en la extinción a 481 nm, es decir, el ensayo de NAG detecta la escisión o 15 desdoblamiento lipolítico de los lípidos.

F 20 IC50 [ µM] <r Ejemplo 6: La comparación del ensayo de NAG indirecto con los ensayos para tAG, PNPB y tributirina. 15 El NAG (0.05 µg/ml) se incubó con 20 µg de HSL purificado parcialmente durante 60 minutos en presencia de | concentraciones diferentes (0.1 a 100 µM) de varias substancias. La extinción a 481 nm se determinó en alícuotas de lotes (ensayo indirecto) . Alternativamente, el 20 [3H] trioleoilglicerol (TAG), el p-nitrofenil butirato (PNPB) o la [14C] tributirina se incubaron con HSL purificado parcialmente y el oleato radioetiquetado, p-nitrofenil o butirato liberado se determinó mediante la medición por centelleo líquido o fotometría después de la extracción con cloroformo/metanol. Los valores de I o son determinados a partir de las curvas de inhibición (n = 5, media ± SD) . Resultados: El orden relativo de los inhibidores, demostrados en los valores IC5o , es idéntico para ambas pruebas con substratos lípidos (NAG y TAG) . Esto aplica también fundamentalmente a los substratos solubles en agua, tributirina y PNPB, pero algunos compuestos activos, que reducen significativamente la actividad HSL comparada con NAG y TAG, son inactivas en la inhibición de HSL comparada con tributirina y PNPB. Esto puede ser explicado por una interferencia de estos inhibidores con el enlace del lípido de la HSL (a través de los dominios de enlaces de lípidos), mientras el mecanismo catalítico no se afecta adversamente. Los substratos solubles en agua son por lo tanto escindidos a partir de HSL aún en la presencia de estos inhibidores. Los valores I o para los inhibidores que actúan aún en el caso de los substratos solubles en agua generalmente yacen entre aquellos para NAG y TAG como un substrato. Esto muestra que el NAG se comporta como un substrato "similar al lípido" para la similaridad de HSL para los triglicéridos auténticos y el ensayo de NAG pueda ser empleado para encontrar inhibidores que enlazan lípidos de bloques ( y el mecanismo catalítico) del HSL.

IC5o [µM; Ejemplo 7: Influencia de varios detergentes y solventes en la 15 estabilidad del substrato. El NAG (0.05 mg/ml) se incubó a 37 °C durante 180 minutos 1 en presencia de concentraciones aumentadas de varios detergentes y solventes y se determinó entonces la disminución de la extinción a 550 nm (disolución de la 20 estructura del substrato espectral) (n = 4, media ± SD) . Resultados: El substrato (vesículas o micelas de fosfolípido) exhibieron diferente sensibilidad comparada con los agentes empleados. La extinción, (es decir, la cantidad de substrato, disminuyó en presencia de 1% de DMSO por 10%, en el caso de etanol o metanol por cuando mucho el 20%, en el caso de 1% TX-100 o SDS por cuando mucho el 30%. El DMF fue el mas eficiente en la disolución de las vesículas/micelas, y al 1% sobre el 80% de NAG fue liberado a partir de las estructuras fosfolípido/vesículas . El orden en la eficiencia de los solventes y detergentes empleados en la disolución de la estructura del substrato es compatible con un cambio en la extinción máxima (de 481 nm a 550 nm) por NAG, o del grupo cromofórico (NBD) mediante la incorporación en el ambiente apolar de las vesículas/micelas de fosfolípido y la remoción del medio acuoso causado por esa razón. La liberación de NAG de estas estructuras en el medio acuoso mediante la disolución de las vesículas/micelas (por ejemplo, por 15 detergentes) o la liberación del grupo cromofórico como el ácido graso NBD por escisión lipolítica (por HSL) de NAG lleva a una disminución de la extinción a 550 nm y un incremento en la extinción a 481 nm. Con la estabilidad a 1% de DMSO, el substrato NAG cumple uno de los requerimientos 20 básicos para un ensayo fuerte de HTS: Absorción a 550 nm (unidades arb.) F F 10 Ejemplo 8: La influencia de varios detergentes y solventes en la actividad del HSL. 15 La NAG (0.05 mg/ml) se incubó durante 60 minutos con HSL (20 µg) en la presencia de concentraciones incrementadas de varios agentes. Se determinó la extinción a 481 nm (n = 4, media ± SD) . Resultados: El DMSO hasta 1% redujo la cantidad de NBD-FA 20 liberado por aproximadamente 10%. Como a esta concentración de DMSO hasta el 10% de NAG se liberó a partir de las vesículas/micelas de fosfolípido mediante la disolución de las estructuras, resulta aritméticamente una disminución en la actividad de la enzima por 20%. En el caso de 0.5% de DMSO, la reducción es aún de 10%. El TX-100, la acetona, el etanol y el metanol entre 0.1 y 1% causa un incremento en la actividad de HSL, posiblemente producida por una presentación del substrato más eficiente. A elevadas concentraciones, estas interfieren con la actividad. El DMF lleva a una pérdida significante en la actividad de HSL, aún a concentraciones de 0.1%.

F 10 Absorción a 481 nm (unidades arb. 15 F 20 Ejemplo 9: Escisión o desdoblamiento de NAG mediante lipasas de especificidad diferente. La NAG (0.05 mg/ml) se incubó durante 60 minutos con 20 µg de HSL purificado parcialmente, 75 µg de LPL purificado parcialmente a partir de adipocitos de rata, 20 mU de lipasa bacteriana, 50 mU de lipasa pancreática, 100 mU de PLA2 de M veneno serpiente y 0.5 U de fosfolipasa específica de PC de 5 Bacill us cereus . Se determinó el incremento en la extinción a 481 nm (n = 5, media ± SD) . Resultados: Bajo condiciones optimizadas dadas por HSL, como se esperaba el HSL (100%) y LPL (aproximadamente 70%) exhibió la actividad más grande. La lipasa bacteriana y pancreática p lO es marcadamente menos activa (25 o 1%), mientras que la fosfolipasa específica de PC bacteriana fue virtualmente inactiva. Estas actividades fuertemente diferentes muestran la especificidad de la elección de las condiciones del ensayo NAG indirecto para la HSL, así por ejemplo, 15 posiblemente no son detectadas las fosfolipasas contenidas en los extractos gruesos de la célula. Estos datos, sin embargo, también muestran la aplicabilidad en principio del principio del ensayo a otras lipasas. 20 Incremento en la absorción a 481 nm [unidades arb.] F 10 Ejemplo 10: Escisión o desdoblamiento de varios acilglicéridos modificados con el ácido graso NBD por HSL. 15 La NAG (0.05. mg/ml) o varios lípidos modificados con ácido graso NBD en diferentes concentraciones son incubados con 20 µg de HSL purificado parcialmente. La extinción a 481 nm se determinó a tiempos específicos (n = 5, media ± SD) . 20 Resultados: Incremento en la absorción a 481 nm (unidades arb. ) F ,10 Ejemplo 11: Inhibición de HSL por fosfofluoridato de 15 diisopropilo. El NAG (0.05 mg/ml) se incubó durante 60 minutos con 20 F µg de HSL purificado parcialmente en la presencia de concentraciones aumentadas de fosfofluoridato de diisopropilo. El incremento en la extinción a 481 nm se 20 determinó en alícuotas de los lotes de reacción (ensayo de NAG indirecto) , o después de la extracción con cloroformo/metanol la cantidad de NBD-FA liberado en la fase inorgánica se determinó por fluorimetría (ensayo de NAG directo) . Alternativamente, se llevan a cabo las incubaciones de la HSL con [3H] trioleoilglicerol como substrato (ver arriba) y la cantidad de ácido oleico radioetiquetado 4J liberado se determinó después de la extracción con 5 cloroformo/metanol. La actividad de escisión o desdoblamiento en la ausencia del inhibidor se ajustó al 100% para cada ensayo (n = 7, media ± SD) . Resultado: En todos los tres ensayos, típicamente las curvas de inhibición sigmoidales resultaron para el fosfofluoridato f 10 de diisopropilo. Los valores I o calculados de los mismos, no difieren significativamente uno de otro para el ensayo NAG indirecto (0.8 nM) o directo (1.1 mM) . Un valor IC50 algo más elevado de 2.1 mM se calculó para la escisión o desdoblamiento del trioleoilglicérido. Esto es de acuerdo con 15 las diferencias encontradas arriba en las acciones inhibidoras de varios inhibidores que son observados con estos ensayos (ver el " Ejemplo 6 para las posibles explicaciones) . Independientemente de esto, los valores IC50 determinados para la inhibición de HSL mediante 20 fosfofluoridato de diisopropilo mediante el ensayo de NAG indirecto son muchos de acuerdo con los datos publicados (P. Stralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987, 147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol. Chem. 258, 1983, 15146-15151; P. Belfrage, B. Jergil, P. Stralfors, H.

Tornquist, FEBS Lett. 75, 1977, 259-263) de Actividad HSL máxima Ejemplo 12: Factibilidad del ensayo de NAG indirecto en el formato de placa de microtitulación. La NAG se incubó diferentes veces con HSL purificado parcialmente en un volumen de ensayo de 200 µl en placas de microtitulación de 96 pozos. La extinción a 481 nm se determinó en un lector de placas de microtitulación. Resultado: Bajó las condiciones elegidas, la reacción es lineal debajo de aproximadamente 60 minutos. La varianza (SD) es en este caso entre 4 y 7%. El ensayo NAG indirecto así, es adecuado para usarse en un filtrado HT.

Incremento en la absorción a 481 nm [unidades arb.] 15 Abreviaciones usadas: Unidades arb. Unidades arbitrarias 20 BSA Albúmina de suero de bovino cAMP monofosfato de adenosina cíclico DCC Diciclohexilcarbodiimida DMF N, N-Dimetilformamida DMSO Dimetil sulfóxido DTT Ditiotreitol EDTA Acido Etilendiamino-N,N,N' ,N' -tetraacético FAB-MS Espectrometría de masa con bombardeo rápido de átomos 5 HSL Lipasa sensible a las hormonas Kpi Amortiguador de dihidrogenofosfato de potasio/fosfato potasio LPL Lipasa de lipoproteína NAG NBD-monoacilglicérido: 12- (7-nitrobenzo-f 10 [1,2,3] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo NBD 4-Cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol NBD-FA ácido graso NBD: ácido 12- (7- nitrobenzo [1,2,3] oxadiazol-4-ilamino) - 15 dodecanoico NIDDM diabetes mellitus no dependiente de la insulina" PLA2 Fosfolipasa A2 PLC Fosfolipasa C 20 PNPB Butirato de p-Nitrofenilo SD Desviación estándar SDS Dodecil sulfato de sodio TAG [3H] -Trioleoilglicerol Tris Tris (hidroximetil) aminometano TLC Cromatografía de capa delgada TX-100 Tritón® X-100. F ao 15 20

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la determinación de la integridad de las estructuras complejas de fosfolípido/lípido, caracterizado porque comprende: 5 a) hacer reaccionar un ácido graso suministrado con una etiqueta fluorescente con 2 , 3-epoxipropanol para dar un monoglicérido en una solución alcohólica a la temperatura ambiente con la adición de una base, b) someter este monoacilglicérido a un tratamiento 10 ultrasónico con fosfolípidos en una relación desde 1:10 hasta 10:1 mg/ml, del cual resulta el substrato, el cual se reconoce por un cambio de color de amarillo a rojo basado en un complejo de transferencia de carga. 2L5 2. El proceso como se reivindicó en la reivindicación 1, caracterizado en que la etiqueta fluorescente es dansilo o NBD. 3. El proceso como se reivindicó en la reivindicación 2, caracterizado en que la etiqueta fluorescente es NBD. 20 4. El proceso como se reivindicó en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que el ácido graso es un ácido carboxílico saturado o insaturado que tiene una longitud de cadena de 8 átomos de carbono a 20 átomos de carbono . 5. El proceso como se reivindicó en la reivindicación 4, caracterizado en que el ácido graso es un ácido carboxílico saturado de 12 átomos de carbono. 6. El proceso como se reivindicó en cualesquiera de las f 5 reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que los fosfolípidos empleados son fosfatidilcolina y fosfofatidilinositol por sí mismos o con untamente. 7. El proceso como se reivindicó en la reivindicación 6, caracterizado en que la fosfatidilcolina y el 10 fosfofatidilinositol son empleados conjuntamente en la f proporción de 10:1 a 1:10. 8. El proceso como se reivindicó en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que el monoacilglicérido es 12- (7-nitrobenzo- [1, 2, 3] oxadiazol-4- 15 ilamino) -dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo . 9. Un substrato preparado mediante un proceso de las reivindicaciones 1 a 8. f 10. El substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, para usarse en un proceso para la identificación de 20 estructuras que favorecen el arreglo de aromáticos para dar complejos de transferencia de carga. 11. El substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, para usarse en un proceso para la identificación de estructuras de fosfolípido/lípido . 12. El substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, para usarse en un proceso para la identificación de lipasas e inhibidores de lipasas. ^^ 13. Un proceso para la preparación del monoacilglicérido 5 12- (7-nitrobenzo [1, 2, 3] oxadiazol-4-ilamino) dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo, caracterizado en que comprende hacer reaccionar el ácido 12-aminoláurico primero con 7-cloro-4- nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol y después hacer reaccionar el intermediario obtenido con 2, 3-epoxipropanol en una solución 10 alcohólica a la temperatura ambiente con la adición de una base. 14. El 12- (7-nitrobenzo [1, 2, 3] oxadiazol-4-ilamino) - dodecanoato de 2, 3-dihidroxipropilo. 15. Un proceso para la identificación de lipasas e 15 inhibidores de lipasas, caracterizado en que comprende a) preparar un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, F b) incubar este substrato con una lipasa, y c) determinar el cambio de color. 20 16. Una lipasa/inhibidor de lipasa, identificados mediante un proceso como se reivindica en la reivindicación 15. 17. Un filtrado o selección de alto rendimiento (HTS) para el uso en un proceso para la identificación de lipasas/inhibidores de lipasas, como se reivindicó en la reivindicación 15. 18. Un proceso para la determinación de la actividad de lipasas/inhibidores de lipasa, caracterizado en que comprende 5 a) preparar un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, b) incubar este substrato con una lipasa, c) determinar el valor o proporción del cambio de color y 10 d) verificar la actividad. 19. El proceso como se reivindicó en la reivindicación 18, caracterizado en que el substrato se incuba con una lipasa sensible a las hormonas. 20. Un sistema de ensayos o pruebas para la identificación 15 de una lipasa/inhibidor de lipasa, caracterizado en que comprende : a) un substrato como se reivindicó en la reivindicación b) un dispositivo ultrasónico y, opcionalmente 20 c) un dispositivo para la determinación visual/óptica y/o fluorimétrica del cambio de color. 21. Un sistema de ensayos o pruebas para la determinación de la actividad de una lipasa/ inhibidor de lipasa, caracterizado en que comprende: a) un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, b) un dispositivo ultrasónico, c) un dispositivo para la determinación del valor del 5 cambio de color, y d) un dispositivo para la absorción o medición de la fluorescencia . 22. El sistema de ensayo como se reivindicó en la reivindicación 20 o 21 en la forma de un equipo o kit. 10 23. El equipo o kit como se reivindicó en la reivindicación 22, caracterizado en que el ensayo es un ensayo de la lipasa. 24. El equipo o kit como se reivindicó en la reivindicación 22, caracterizado en que comprende 15 a) un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, y b) un recipiente. 25. Un proceso para la determinación de la acción detergente o la citotoxicidad de los compuestos, 20 caracterizado en que comprende: a) preparar un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, b) incubar este substrato con un compuesto de prueba, y c) determinar visualmente/ópticamente o fluorimétricamente el cambio de color de rojo a amarillo, que identifica los compuestos citotóxicos y los compuestos con una acción detergente. 26. Un proceso para la determinación de la actividad de los transportadores de lípidos, caracterizado en que comprende : a) preparar un substrato como se reivindicó en la reivindicación 9, b) reconstruir funcionalmente los transportadores / proteínas transportadoras en los liposomas, y c) añadir los liposomas preparados de acuerdo a b) al substrato de acuerdo a a) y determinar el cambio de color visualmente u ópticamente.