ES2310165T3 - Determinacion de las estructuras complejas fosfolipidicas/lipidicas con ayuda de acilgliceridos sinteticos marcados fluorescentemente. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de un sustrato para la determinación la integridad de estructuras complejas de fosfolípido/lípido, caracterizado porque a) un ácido graso provisto de un marcador fluorescente se hace reaccionar con 2,3-epoxipropanol en solución alcohólica, a la temperatura ambiente, bajo la adición de una base, para dar un monoacilglicérido, b) este monoacilglicérido se somete a un tratamiento de ultrasonidos con fosfolípidos en la relación 1:10 hasta 10:1 mg/mL, a partir de lo cual resulta el sustrato, que es reconocible por un cambio de color de amarillo a rojo.
Description
Determinación de las estructuras complejas
fosfolipídicas/lipídicas con ayuda de acilglicéridos sintéticos
marcados fluorescentemente.
La invención se refiere a un sencillo ensayo
continuo, para la identificación de estructuras que favorecen la
disposición de compuestos aromáticos en los complejos de
transferencia de carga tales como, por ejemplo, las estructuras
complejas lipídicas/fosfolipídicas (bicapa, monocapa, agregados,
micelas), con ayuda de acilglicéridos sintéticos marcados
fluorescentemente, y a su aplicación para la determinación de la
actividad de las lipasas/inhibidores de
lipasas.
lipasas.
Las lipasas, fosfolipasas y otras enzimas
lipolíticas tienen gran importancia en el sector biotecnológico y
médico. En determinadas enfermedades metabólicas se puede detectar
una actividad incrementada de las lipasas en el tejido adiposo, la
cual se hace responsable de la patogénesis de esta enfermedad. La
mayor parte de las reservas energéticas del cuerpo se almacena en
las células del tejido adiposo en forma de ácidos grasos de los
triglicéridos. Los procesos anabólicos esenciales provocados por la
insulina abarcan la estimulación de la absorción de sustratos para
la síntesis de triglicéridos y el incremento de la lipogénesis. Otro
proceso importante provocado por la insulina es la inhibición de la
lipólisis, el proceso por el cual las hormonas catabólicas, en
primera línea las catecolaminas, estimulan la hidrólisis de los
triglicéridos e inducen, por ello la liberación de ácidos grasos.
Un problema esencial, relacionado con la diabetes melitus no
dependiente de insulina (NIDDM), tiene su origen en la lipólisis no
inhibida de las células adiposas, la cual conduce a niveles
incrementados de ácidos grasos no esterificados en el plasma. Según
se supone actualmente, los ácidos grasos estimulan la glucogénesis
en el hígado y disminuyen la utilización de glucosa en los músculos
del esqueleto a través de mecanismos moleculares aún poco
caracterizados. Efectivamente, se pudo demostrar que la represión
de la lipólisis en las células adiposas a través de sustancias
inhibidoras de la lipólisis, tales como los agonistas del receptor
de ácido nicotínico de la célula adiposa, reduce tanto las
concentraciones de ácidos grasos en el plasma como también un
incrementado azúcar en sangre, en animales y pacientes diabéticos.
Lamentablemente, estos efectos beneficiosos no se expresan de forma
particularmente acusada y son tan sólo de corta duración. Parece
ser que esto se basa en una contraregulación fisiológica, provocada
por intromisión en el mecanismo regulador de la enzima que
determina la velocidad de la lipólisis, la lipasa sensible a
hormonas (HSL). Existen buenos motivos para suponer que la
inhibición de la reacción lipolítica va a dar lugar a una terapia
del NIDDM mejorada, al menos en lo referente a la represión de la
liberación de ácidos grasos de las células adiposas. La inhibición
directa de la HSL por inhibidores adecuados debería paliar en este
caso las evidentes dificultades de una ingerencia en la compleja
regulación de la
HSL.
HSL.
La actividad de las enzimas lipolíticas se
examina tradicionalmente por métodos radiométricos, volumétricos,
enzimáticos o fluorimétricos/fotométricos. Los ensayos radiométricos
son los más sensibles, pero requieren sustratos radiomarcados
caros, son discontinuos y suponen la separación previa del sustrato
radiomarcado del producto radiomarcado. Tales separaciones son
frecuentemente pesadas y el evitar/reducir desechos radioactivos
tiene cada vez mayor importancia (relevante sobre todo en el caso de
un gran número de ensayos). Los ensayos volumétricos son continuos
y se pueden llevar a cabo tanto con sustratos naturales como también
sintéticos, pero adolecen frecuentemente de una sensibilidad
verdaderamente escasa y son vulnerables frente a las condiciones
que influyen sobre la cantidad de protones liberados.
Los métodos enzimáticos o cromatográficos para
la detección de uno de los productos de la reacción lipolítica (por
ejemplo glicerina) son muy sensibles y relativamente robustos, pero
también de complicada manipulación, puesto que antes de la propia
detección enzimática/cromatográfica presuponen la elaboración de la
tanda de incubación para la reacción de las lipasas. El
acoplamiento a un ensayo enzimático permite tan sólo mediciones de
punto final (mediciones "time-stop"). Además,
en el caso del examen de sustancias desconocidas (por ejemplo la
búsqueda de inhibidores potenciales) en principio no se puede
excluir un efecto sobre las enzimas de la reacción de detección y
requiere por lo tanto los controles correspondientes. Estas
consideraciones dieron pie para el desarrollo de procedimientos
fluorométricos/fotométricos. Éstos alcanzan en principio la
sensibilidad de los métodos radiométricos, pero requieren el empleo
de sustratos o muestras sintéticas modificadas con fluoróforos o
cromóforos. Los métodos fluorométricos/fotométricos tradicionales
son, como los procesos radiométricos, de transcurso discontinuo y
exigen la separación del producto a partir del sustrato.
Recientemente, se desarrollaron ensayos fluorométricos/fotométricos
continuos (S. Hendrickson, Analyt. Biochem 219 (1994)
1-8), los cuales se basan en un desplazamiento del
máximo de fluorescencia o, respectivamente, de extinción del
producto en comparación con el sustrato. Sin embargo, todos estos
procedimientos se limitan a la detección de fosfolipasas,
lipoproteinalipasas, colesterolesterasas, esfingomielinasas y
glucosil-ceramida-glucosidasas. No
se conocen hasta el momento sustratos con grupos
fluoróforos/cromóforos, adecuados para la medición continua de la
actividad de enzimas separadoras de triglicéridos (por ejemplo
lipasas sensibles a hormonas, monogliceridolipasas,
digliceridolipasas, trigliceridolipasas, lipoproteinalipasas,
lipasas pancreáticas, lipasas hepáticas, lipasas bacterianas,
PLA_{2}, PLC, colesterolesterasas).
La finalidad de la invención es, por lo tanto,
desarrollar un sencillo ensayo continuo para la identificación de
estructuras que favorezcan la disposición de compuestos aromáticos
en los complejos de transferencia de carga tales como, por ejemplo,
las estructuras complejas lipídicas/fosfolipídicas (bicapa,
monocapa, agregados, micelas), con ayuda de acilglicéridos
sintéticos marcados fluorescentemente, así como un procedimiento
para la determinación de la actividad de las proteínas ligadoras de
lípidos, tales como las lipasas.
Las transportadoras de lípidos son proteínas que
reconocen los lípidos y no los escinden como las lipasas, sino que
en lugar de ello las transportan a través de membranas biológicas.
Por lipasas se han de entender aquí las lipasas biológicamente
relevantes, propias del cuerpo, tal como se definen, por ejemplo, en
R. D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998)
1694-1720.
Por una enzima sensible a las hormonas se
entiende una enzima, la cual es influenciada en su actividad por la
fosforilización dependiente de sustancias mensajeras secundarias
(por ejemplo AMPc) o a través de otros mecanismos alostéricos (por
ejemplo interacción proteína-proteína), que se
encuentran bajo control hormonal. Las hormonas que regulan el nivel
de AMPc son, por ejemplo, adrenalina, noradrenalina, glucagón e
insulina.
Objeto de la invención es un procedimiento para
la preparación de un sustrato, el cual se caracteriza porque
- a)
- un ácido graso provisto con un marcador fluorescente se hace reaccionar con 2,3-epoxipropanol en solución alcohólica, a la temperatura ambiente, bajo la adición de una base tal como, por ejemplo, una base inorgánica no nucleófila, para dar un monoacilglicérido,
- b)
- este monoacilglicérido se somete a un tratamiento de ultrasonidos con fosfolípidos en la relación 1:10 hasta 10:1 mg/mL, a partir de lo cual resulta el sustrato, reconocible por un cambio de color de amarillo a rojo.
Un marcador de fluorescencia se define como un
grupo químico dentro de una molécula, el cual después de ser
excitado con luz está por sí mismo capacitado para la emisión de
luz. Estos grupos se emplean aquí para dar lugar a sustratos que
incluso en pequeñísimas concentraciones de aproximadamente 1 nM son
aún detectables. Se pueden citar, por ejemplo ácido
N,N-dimetilaminosulfónico (Dansyl) o NBD,
preferentemente NBD.
Por un ácido graso se entiende, por ejemplo, un
ácido carboxílico de cadena larga, saturada o insaturada, con una
longitud de cadena de C-8 a C-20,
preferentemente C-12, C-14,
C-16 y C-18 saturada o insaturada,
de modo particularmente preferido, C-12
saturada.
Un ácido graso provisto de un marcador de
fluorescencia se acopló con 2,3-epoxipropanol para
dar un monoacilglicérido. A partir de este sustrato sintético y de
fosfolípidos tales como, por ejemplo, fosfatidilinositol y
fosfatidilcolina, solos o conjuntamente, eventualmente en una
relación en peso de 10:1 a 1:10, preferentemente 3:1 a 1:3 y, de
modo particularmente preferido 2:1, se formaron por un tratamiento
con ultrasonidos que duraba, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10
minutos, preferentemente 1 a 6 minutos y, de modo particularmente
preferido 4 minutos, micelas o vesículas, las cuales sirven como
sustrato de las lipasas a examinar. Esta incorporación en micelas o
vesículas está relacionada con un cambio de color de amarillo a
rojo, basado en un complejo de transferencia de carga de las
sustancias aromáticas que en esta estructura se encuentran
espacialmente muy próximas. La incubación con lipasa provoca la
escisión de los ácidos grasos bajo la liberación de ácido graso
marcado y
glicerina.
glicerina.
Como fosfolípidos se disuelven, por ejemplo,
fosfatidilcolina (6 mg) y fosfatidilinositol (6 mg) en cloroformo
(en cada caso 1 ml). Para la preparación del sustrato se pipetean
conjuntamente dos partes de solución de fosfatidilinositol (por
ejemplo 83,5 \mul) y una parte de solución de fosfatidilcolina
(por ejemplo 41,5 \mul) y 100 \mul de solución de NAG (10 mg en
1 ml de cloroformo) (concentración final en el ensayo: 0,0375 mg de
fosfolípido/ml; 0,05 mg de NAG/ml). Después de separar el cloroformo
se añaden 20 ml de Tris/HCl 25 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM y se llevan
a cabo dos tratamientos por ultrasonidos con una varilla de
ultrasonidos (Branson Sonifier tipo II, micropunta estándar, 25 W):
Tratamiento 1.: ajuste 2, 2 x 1 min, entremedias respectivamente 1
min sobre hielo; Tratamiento 2.: ajuste 4, 2 x 1 min, entremedias
respectivamente 1 min sobre hielo. Durante este proceso el color de
la solución de sustrato cambia de amarillo (máximo de extinción 481
nm) a rojo (máximo de extinción 550 nm) por intercalado de NAG
entre las moléculas de los fosfolípidos de las
vesículas/micelas.
El ácido graso libre no forma micelas ni
vesículas. Por ello, en el caso de la separación del ácido graso de
las micelas/vesículas se observa un cambio de color de rojo a
amarillo. Así se puede medir la destrucción de las
micelas/vesículas y, con ello, la actividad enzimática de la lipasa,
bien sea visualmente (a 481 nm o, respectivamente, a 550 nm) a
través del cambio de color de rojo a amarillo con ayuda de un
fotómetro de cubeta (por ejemplo DU-640 de la razón
social Beckman (Munich)) o de un aparato de lectura de
microtitulaciones en placa (por ejemplo Microßeta de la razón
social Wallac (Turku, Finlandia) o alternativamente de forma
fluorométrica con ayuda de un Phosphoimagers (por ejemplo Storm 840
de la razón social Molecular Dynamics (Krefeld)), de un escáner de
fluorescencia (por ejemplo DA-2 de la razón social
Shimadzu (Osaka, Japón)) o de un procedimiento de evaluación de
imagen (por ejemplo ArrayScan de la razón social Molecular Devices
(EE.UU)) el cual se basa en una cámara CCD
(charge-coupled device), que tiene un circuito de
conexión integrado para la elaboración de señales eléctricas y
ópticas, en el cual la información se memoriza y se transfiere en
forma de cargas eléctri-
cas.
cas.
En el caso de un procedimiento preferido para la
preparación de un sustrato, el marcador de fluorescencia es Dansyl
o NBD.
\newpage
En el caso de un procedimiento particularmente
preferido para la preparación de un sustrato, el marcador de
fluorescencia es NBD.
En el caso de otro procedimiento preferido para
la preparación de un sustrato, el ácido graso es un ácido
carboxílico saturado o insaturado con una longitud de cadena de
C-8 a C-20.
En el caso de otro procedimiento para la
preparación de un sustrato, particularmente preferido, el ácido
graso es un ácido carboxílico C-12 saturado.
En el caso de otro procedimiento preferido para
la preparación de un sustrato, se emplean como fosfolípidos
fosfatidilcolina y fosfatidilinositol, solos o conjuntamente.
En el caso de otro procedimiento para la
preparación de un sustrato, particularmente preferido, como
fosfolípidos se emplean conjuntamente fosfatidilcolina y
fosfatidilinositol en la relación 10 : 1 hasta 1 : 10.
En el caso de otro procedimiento preferido para
la preparación de un sustrato, el monoacilglicérido es el
2,3-dihidroxipropiléster del ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico.
Todos estos métodos se emplean preferentemente
en combinación con un "screening" de alto flujo (HTS). Otros
procedimientos que se basan en este concepto, son la medición de la
citotoxicidad de los compuestos y el efecto de los detergentes.
La invención se refiere también a un sustrato,
preparado según los procedimientos anteriormente descritos y a un
sustrato para su aplicación en un procedimiento para la
identificación de estructuras lipídicas/fosfolipídicas, de modo
particularmente preferido de lipasas/inhibidores de lipasas, como el
descrito anteriormente. El procedimiento se puede emplear también
para la destrucción de estructuras monocapa o bicapa, curvadas (por
ejemplo micelas o vesículas) o planas (por ejemplo bicapas lineales
creadas artificialmente), la cual va acompañada por un cambio de
color. El cambio de color se puede seguir de forma medible
visual/ópticamente o, respectivamente, de forma fluorométrica, tal
como se describe más arriba.
Objeto de la invención es, además, un
procedimiento para la preparación del monoacilglicérido
2,3-dihidroxipropiléster del ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico,
haciendo reaccionar primeramente ácido
12-aminoláurico con
7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
y, a continuación, el producto intermedio obtenido, con
2,3-epoxipropanol en solución alcohólica, a la
temperatura ambiente, bajo la adición de una base, así como el
propio monoacilglicérido 2,3-dihidroxipropilester
del ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodeca-
noico.
noico.
La misión de la invención se soluciona por un
procedimiento para la identificación de lipasas/inhibidores de
lipasas, cuya presencia provoca un cambio de color, caracterizado
porque
- a)
- se prepara un sustrato tal como se describe más arriba,
- b)
- este sustrato se incuba con una lipasa, y
- c)
- se determina el cambio de color.
Es igualmente objeto de la invención un
procedimiento para la determinación de la actividad de
lipasas/inhibidores de lipasas, caracterizado porque
- a)
- se prepara un sustrato tal como se describe más arriba,
- b)
- este sustrato se incuba con una lipasa,
- c)
- se determina la velocidad de el cambio de color, y
- d)
- se calcula la actividad.
En el caso de un procedimiento para la
determinación de la actividad de lipasas/inhibidores de lipasas,
preferido, el sustrato se incuba con una lipasa sensible a
hormonas.
Una reacción típica se lleva a cabo, por
ejemplo, en recipientes Eppendorf de 1,5-ml o en
placas de 96-pocillos durante 60 min a 30ºC. 10
\mul de una sustancia de ensayo (por ejemplo inhibidores de la
HSL) se disponen previamente en tampón de ensayo (Tris/HC 25 mM, pH
7,4; NaCl 150 mM) en presencia de 16,6% de DMSO. Se añaden 180
\mul de la solución de sustrato (20 \mug/ml de fosfatidilcolina,
10 \mug/ml de fosfatidilinositol, 50 \mug/ml de NAG en tampón
de ensayo). Después de una incubación durante 15 min a 30ºC se
añaden con pipeta 20 \mul de HSL en tampón de ensayo y se mide
inmediatamente la extinción a 481 nm en un fotómetro de cubeta
(cubeta de 0,5 ml) o, respectivamente, en un aparato de lectura de
microtitulación en placa (véase más arriba). Tras un cierto tiempo
de incubación, el cual es variable y depende de la concentración
enzimática elegida y puede durar entre 2 y 240 minutos, aquí 60 min
de incubación a 30ºC, se vuelve a medir la extinción. El aumento de
la extinción en la zona amarilla, aquí a 481 nm, es una medida de la
actividad enzimática.
Pertenecen igualmente al objeto de la invención
los sistemas de ensayo para la identificación de un inhibidor de
lipasas o, respectivamente, para la determinación de la actividad de
una lipasa/inhibidor de lipasa. Contienen un sustrato como el
descrito anteriormente, un dispositivo de ultrasonidos y,
eventualmente, un dispositivo para la determinación visual/óptica
y/o fluorométrica del cambio de color de rojo a amarillo o,
respectivamente, junto a un sustrato como se describe anteriormente
y un dispositivo de ultrasonidos, un dispositivo para determinar la
velocidad del cambio de color y un dispositivo para medir la
absorción o la fluorescencia.
El sistema de ensayo también se puede presentar
en forma de un "kit", siendo el ensayo un ensayo de
lipasas.
El kit contiene un sustrato como el descrito
anteriormente, eventualmente en un tampón de ensayo y un recipiente
para llevar a cabo el ensayo tal como, por ejemplo, un recipiente
Eppendorf o una placa para microtitulaciones, preferentemente una
placa para microtitulaciones.
Otros objetos de la invención se refieren a los
procedimientos para la determinación de sistemas moleculares de
transporte/transferencia, para la medición del efecto detergente de
compuestos o para el examen de la citotoxicidad de compuestos
(medicamentos, entre otros), los cuales contienen un sustrato como
se describe anteriormente y una fosfolipasa, por ejemplo
fosfolipasas A_{2} (del veneno de serpiente) o C (bacillus
cereus).
Por proteínas de transporte/transferencia se
entienden proteínas que, por sí mismas, reconocen los nutrientes
fundamentales tales como hidratos de carbono, lípidos y proteínas y
las transportan a través de membranas biológicas o,
respectivamente, las transfieren desde una determinada membrana
biológica a otra. Las proteínas de transporte/transferencia,
aisladas por ejemplo del íleo de rata, se reconstruyen
funcionalmente (proteoliposomas) en vesículas de fosfolípidos
(liposomas) o, respectivamente, se incuban como polipéptidos
solubles junto con liposomas y, después, se añaden a una mezcla de
fosfolípidos y glicérido de NBD, como la descrita anteriormente, y
se tratan por ultrasonidos. El proceso de transporte o,
respectivamente, de transferencia del glicérido de NBD de las
micelas/vesículas que contienen glicérido de NBD en el lumen de las
proteoliposomas con ayuda de las transportadoras o,
respectivamente, en la membrana de los liposomas con ayuda de las
proteínas de transferencia provoca la disolución/destrucción de la
estructura de las micelas y de nuevo se puede seguir fotométrica o
fluorométricamente tal como se describe anteriormente.
El efecto detergente de compuestos químicos se
basa en la destrucción directa de las micelas/vesículas. Puesto que
también las membranas están construidas de esta manera, tales
compuestos son generalmente citotóxicos.
Un procedimiento para la determinación del
efecto detergente o de la citotoxicidad de compuestos se caracteriza
porque
- a)
- se prepara un sustrato tal como se describe más arriba,
- b)
- este sustrato se incuba con un compuesto de ensayo, y
- c)
- se determina visual/ópticamente o fluorométricamente el cambio de color de rojo a amarillo, que caracteriza a los compuestos citotóxicos y a los compuestos con efecto detergente.
Un procedimiento para la determinación de la
actividad de los transportadores de lípidos se caracteriza
porque
- a)
- se prepara un sustrato tal como se describe más arriba,
- b)
- las proteínas de transporte/transferencia se reconstruyen funcionalmente en liposomas, y
- c)
- los liposomas preparados según b) se añaden al sustrato según a) y se determina visual u ópticamente el cambio de color.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos ácidos grasos marcados con NBD como
también el ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico
(1) ciertamente se pueden obtener comercialmente, pero son caros.
Aunque los primeros experimentos todavía se llevaron a cabo con
material obtenible comercialmente, el compuesto (1) se pudo obtener
con buenos rendimientos por reacción de ácido
12-aminoláurico con
4-cloro-7-nitro-benzo[1,2,5]oxadiazol
en MeOH.
Por adición nucleófila de (1) a
2,3-epoxipropanol (2) se pudo obtener el
monoacilglicérido (3) con buenos rendimientos. El compuesto (3) fue
acilado a continuación para llegar a los triglicéridos (4) y (5).
Por esterificación de (1) con palmitina se obtuvo el
diacilglicérido (6). También este compuesto se transformó en el
correspondiente triacilglicérido (7). El mismo método se utilizó
par transformar el diéter de glicerina (8) en el
pseudotriacilglicérido (9), en el cual dos radicales acilo se han
reemplazado por éteres de cadena larga.
Todos los compuestos sintetizados se acreditaron
como sustratos de las lipasas, preferentemente de la HSL, pero
presentaban considerables diferencias de actividad. Como mejor
sustrato de las lipasas se acreditó el monoacilglicérido (3). La
introducción de más grupos acilo, como en los ejemplos (4), (5), (6)
y (7), provocó una reducción de la actividad.
Esto se puede aclarar fácilmente mediante una
competición de la separación del grupo acilo del NBD por los nuevos
radicales acilo introducidos. Para reforzar esta tesis, se sintetizó
un pseudotriacilglicerido (9), en el cual dos grupos acilo han sido
sustituidos por unidades de hexadeciléter. Éstas no pueden ser
separadas por las lipasas y, por lo tanto, no deberían competir con
el éster del ácido graso de NBD. En los ensayos biológicos, este
compuesto se acreditó ciertamente como sustrato, en cualquier caso
con poca actividad. Evidentemente, las lipasas poseen junto a la
zona catalítica una amplia zona de enlace, hidrófuga, accesible para
los grupos éter de cadena larga, de modo que se evita la anexión de
la unidad de ácido graso.
Puesto que el monoacilglicérido (3) se acreditó
como buen sustrato de las lipasas, se examinó si había una
preferencia regioselectiva de la posición 1 o 3. Para estos exámenes
se sintetizaron los regioisómeros enantiómeros (3a) y (3b).
La síntesis de los enantiómeros (3a,b) parte de
D- y
L-1,2-o-isopropiliden-glicerina,
la cual se esterifica por activación de la diciclohexilcarbodiimida
con el ácido graso (1) marcado con NBD. La separación del grupo
protector tuvo lugar con HCl metanólico 1 N. Los dos compuestos
mostraban la misma actividad biológica, de manera que el empleo del
compuesto enantioméricamente puro no ofrece ninguna ventaja.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
12-aminoláurico (18 g, 83,7 mmol) en MeOH (300 ml)
se añade bajo agitación solución al 30% de metanolato de sodio (14,
5 ml, 76 mmol). Al cabo de 5 minutos la mezcla de reacción se vuelve
transparente y se añade una solución de
7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
(15 g, 75 mmol) en MeOH (300 ml). Se agita la mezcla de reacción,
que se oscurece inmediatamente, durante 18 h a 25ºC. A continuación,
se añade HCl metanólico 1 M (100 ml, 100 mmol) y el disolvente se
separa por destilación a vacío. El residuo se recoge en MeOH, se
filtra sobre gel de sílice, el filtrado se concentra hasta la
sequedad y el residuo se purifica por cromatografía rápida (1 : 1
tolueno-EtOAc). Se obtiene (1) en forma de sólido
rojo (26,4 g, 93%);
R_{F}: 0,16 (1 :1
tolueno-EtOAc).
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}): \delta 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,35 (m, 1 H, NH), 6,18 (d,
1 H, ArH), 3,48 (dt, 2 H, CH_{2}NH_{2}), 2,36 (t, 2 H,
CH_{2}COOH), 1,9-1,2 (m, 18 H, 9 CH_{2}).
EM (ESI-EM) 379,2 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del compuesto (1) (12 g, 31,7 mmol)
y 2,3-epoxipropanol (50 ml) en isopropanol (50 ml)
se agita durante 16 h a 50ºC. El disolvente se separa por
destilación a vacío, el residuo se seca a 0,01 Torr y se purifica
por cromatografía rápida (diisopropiléter, éter, EtOAc). Se obtiene
el
\hbox{compuesto (3) en forma de aceite rojo (10,3 g,
71,8%);}
R_{F}: 0,18 (1:1
tolueno-EtOAc); R_{F}: 0,5 (30:5:1
CH_{2}Cl_{2}-MeOH-NH_{3}), que
cristaliza en EtOAc-dietiléter.
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}): \delta 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,35 (m, 1 H, NH), 6,18 (d,
1 H, ArH), 4,19 (dd, 2 H, H-1,
H-1'), 3,94 (m, 1 H, H-2), 3,65 (dd,
2 H, H-3, H-3'), 3,48 (dt, 2 H,
CH_{2}NH_{2}), 2,35 (t, 2 H, CH_{2}COOH), 1,8
(m, 2 H, CH_{2}), 1,6 (m, 2 H, CH_{2}),
1,27-1,15 (m, 14 H, 7 CH_{2}). EM
(ESI-EM) 453,4 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del compuesto (1) (60 mg, 159
\mumol) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) se hace reaccionar con
diciclohexilcarbodiimida (160 mg, 770 \mumol) y se agita durante
30 min a 25ºC. A continuación se añade una solución de
(R)-(2,2-dimetil-[1,3]dioxolan-4-il)-metanol
(100 mg, 760 \mumol) y dimetilaminopiridina (94 mg, 770 \mumol)
en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) y se agita la solución de reacción
durante 4 h más a 25ºC. El disolvente se separa por destilación a
vacío y el residuo se purifica por cromatografía rápida (15:1
tolueno-EtOAc). El compuesto (9a) se obtiene en
forma de aceite amarillo fluorescente (46 mg, 58%).
R_{F}: 0,29 (4:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (CDCl_{3}):
\delta 8,5 (d, 1 H, aromat.), 6,2 (m, 1 H, NH), 6,16 (d, 1 H,
aromat.), 4,31 (m, 1 H,), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1 H ), 3,48 (dt,
2 H, CH_{2}NH_{2}), 2,35 (t, 2 H,
CO-CH_{2}), 2,0-1,2 (m, 18
H, 9 CH_{2}), 1, 42 (s, 3 H, CMe_{2}), 1,37 (s, 3 H,
CMe_{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto (9b) se prepara como se describe
para el compuesto (9a). El compuesto (9b) se obtiene en forma de
aceite amarillo fluorescente (51,4 mg, 65%).
R_{F}: 0,29 (4:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (CDCl_{3}):
\delta 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,2 (m, 1 H, NH), 6,16 (d, 1 H, ArH),
4,31 (m, 1 H), 4,1 (m, 3 H), 3,73 (dd, 1 H ), 3,48 (dt, 2 H,
CH_{2}NH_{2}), 2,32 (t, 2 H,
CO-CH_{2}), 2,0-1,2 (m, 18
H, 9 CH_{2}), 1, 42 (s, 3 H, CMe_{2}), 1,37 (s, 3 H,
CMe_{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 13,9 mg ( 28,2 \mumol) del
compuesto (9a) o, respectivamente, 17,8 mg (36,1 \mumol) del
compuesto (9b) en 25 ml de metanol se añade HCl metanólico (1 M, 200
\mul) y se agita durante 1,5 h a 25ºC. El disolvente se separa
por destilación a vacío y el residuo se purifica por cromatografía
rápida (2:1, 1:1 tolueno-EtOAc). Se obtienen los
ésteres de los ácidos grasos (3a) y (3b) con un rendimiento de 10,5
mg (82%) o, respectivamente, 9,3 mg (57%).
Los datos ^{1}H-NMR
(CDCl_{3}) y los espectros másicos son idénticos a los del
compuesto (3).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto (3) (12 mg, 26,5 \mumol) se
acetila en piridina/anhídrido acético 2:1 (3 ml). Al cabo de 8 h se
concentra hasta la sequedad y el residuo se purifica por
cromatografía rápida (1:2 tolueno-EtOAc). El
compuesto (4) se obtiene en forma de aceite amarillo fluorescente
(13 mg, 91%).
R_{F}: 0,66 (1:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}): \delta 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,3 (m, 1 H, NH), 6,18 (d,
1 H, ArH), 5,24 (m, 1 H, ), 4,92 (m, 1H), 4,34 (m), 4,28, 4,16,
3,48 (dt, 2 H, CH_{2}NH_{2}), 2,32 (CH_{2} COO), 2,1 (2 s, 6
H, 2 OAc), 2,0 -1,0 (m, 18 H, 9 CH_{2}). EM
(ESI-EM): 537,4 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del compuesto (2) (5 mg, 11
\mumol) en piridina (300 \mul) se añade anhídrido de ácido
hexanoico (100 \mul) y la mezcla de reacción se deja reposar
durante 16 h a 25ºC. El disolvente se separa por destilación a
vacío y el residuo se purifica por cromatografía rápida (9:1
tolueno-EtOAc). El compuesto (5) se obtiene en
forma de aceite amarillo fluorescente (1,8 mg, 25%).
R_{F}: 0,73 (1:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}): \delta. 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,25 (m, 1 H, NH), 6,18
(d, 1 H, ArH), 5,26 (m, 1 H, H-2), 4,29 (dd, 2 H,
H-3, H-3'), 4,15 (dd, 2 H,
H-1, H-1'), 3,46 (dt, 2 H, CH_{2}
-NH), 2,34 (t, 6 H, 3 CH_{2}COO), 1,63 -1.2 (m, 12 H,
CH_{2}), 0,88 (m, 6 H, 2 CH_{3}).
EM (ESI-EM): 649,5 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del compuesto (1) (25 mg, 66
\mumol), 4-dimetilaminopiridina (9 ml, 73
\mumol) y 1,1-carbonildiimidazol (15 mg, 73
\mumol) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) se agita durante 30 min a 25ºC.
El disolvente se separa por destilación a vacío y el residuo se
purifica por cromatografía rápida (9:1
tolueno-EtOAc). El compuesto (6) se obtiene en
forma de aceite amarillo fluorescente (9,5 mg, 21%).
R_{F}: 0,25 (5:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}): \delta. 8,54 (d, 1 H ArH), 6,3 (m, 1 H, NH), 6,19 (d,
1 H, ArH), 4,20 (dd, 2 H, H-1,
H-1'), 4.15 (dd, 2 H, H-3,
H-3'), 4,12 (m, 1 H, H-2), 3,5 (dt,
2H, CH_{2}-NH), 2,36 (t, 4 H, 2
CH_{2}COO), 1,82 (m, 2 H,
CH_{2}-CH_{2}-NH), 1,63 (m, 4 H,
2 CH_{2}CH_{2}COO), 1,47 (m, 2 H,
CH_{2}-(CH_{2})_{2}-NH),
1,31-1,26 (m, 22 H, 11 CH_{2}), 1,287 (m, 2 H,
CH_{2}), 1,26 (m, 2 H, CH_{2}), (m, 4 H, 2
CH_{2}CH_{2}CH_{2}COO), 1,31-1,26 (m, 18 H, 9
CH_{2}), 1,3 (m, 2 H, CH_{2}), 1,26 (m, 2 H, CH_{2}), 0,89
(t, 3 H, CH_{3}). EM (ESI-EM): 649,5 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto (6) (6 mg, 8,7 \mumol) se acetila
y se elabora tal como se describe para el compuesto (4). El
producto bruto se purifica por cromatografía rápida (9:1
tolueno-EtOAc). El compuesto (7) se obtiene en
forma de aceite amarillo fluorescente (5,1 mg, 95%).
R_{F}: 0,71 (5:1
tolueno-EtOAc);
^{1}H-NMR (250 MHz,
CDCl_{3}):\delta 8,5 (d, 1 H, ArH), 6,25 (m, 1 H, NH), 6,17 (d,
1 H, ArH), 5,25 (m, 1 H, H-2), 4,27 (dd, 2 H,
H-1, H-3), 4,15 (dd, 2 H,
H-1', H-3'), 3,73 (dt, 4 H,
CH_{2}-NH), 2,3 (t, 2 H, CH_{2}COO), 2,08 (s, 3
H, OAc), 1,8 (m, 2 H,
CH_{2}-CH_{2}-NH), 1,6 (m, 8 H,
4 CH_{2}), 1,4-1 (m, 32 H, 16 CH_{2}), 0,85 (t,
3 H, CH_{3}).
EM (FAB-EM): 739 (M+L1).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del compuesto (1) (3 mg, 7,9
\mumol), dimetilaminopiridina (5 ml, 41 \mumol) y
diciclohexilcarbodiimida (5 mg, 24 \mumol) en CH_{2}Cl_{2} se
añade
2,3-bis-octadeciloxipropan-1-ol
(5 mg, 8,37 \mumol). La mezcla de reacción se agita durante 2 h a
25ºC, el disolvente se separa por destilación a vacío y el residuo
se purifica por cromatografía rápida (2:1 éter de
petróleo-dietiléter). El compuesto (8) se obtiene en
forma de aceite amarillo fluorescente (3,5 mg, 46%).
R_{F} 0,55 (3:7 dietiléter/éter de petróleo).
EM (FAB-EM): 957,8 (M+1).
\vskip1.000000\baselineskip
Células adiposas aisladas de la rata se obtienen
a partir del tejido adiposo del epidídimo de ratas macho, no
tratadas (Wistar, 220-250 g), por tratamiento con
colagenasa conforme a procedimientos publicados. Las células
adiposas de 10 ratas se lavan tres veces por flotación con
respectivamente 50 ml de tampón de homogeneización (25 ml Tris/HCl,
pH 7,4, sacarosa 0,25 M, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de
leupeptina, 10 \mug/ml de antipaína, 20 \mug/ml de pepstatina)
y finalmente se recogen en 10 ml de tampón de homogeneización. Las
células adiposas se homogeneizan en el homogeneizador de vaso de
teflón (Braun-Melsungen) por medio de diez impulsos
a 1500 rpm y 15ºC. El homogeneizado se centrifuga (tubitos SM24,
5000 rpm, 10 min, 4ºC). El material inferior situado entre la capa
de grasa situada arriba y el pellet se retira y se vuelve a repetir
la centrifugación. El material inferior resultante de esto se
vuelve a centrifugar (tubitos Sorvall SM24, 20000 rpm, 45 min,
4ºC). El material inferior se retira y se le añade 1 g de
heparina-sefarosa
(Pharmacia-Biotech, CL-6B, se lava
5 veces con Tris/HCl 25 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM). Después de la
incubación durante 60 min a 4ºC (agitar verticalmente en intervalos
de15 min) se centrifuga la tanda (tubitos Sorvall SM24, 3000 rpm, 10
min, 4ºC). El material superior se lleva a pH 5,2 por adición de
ácido acético glacial y se incuba durante 30 min a 4ºC. Los
precipitados se reúnen por centrifugación (Sorvall SS34, 12000 rpm,
10 min, 4ºC) y se suspenden en 2,5 ml de Tris/HCl 20 mM, pH 7,0,
EDTA 1 mM, NaCl 65 mM, 13% de sacarosa, DTT 1 mM, 10 \mug/ml de
leupeptina/pepstatina/antipaína. La suspensión se dializa durante
la noche a 4ºC frente a Tris/HCl 25 mM, pH 7,4, 50% de glicerina,
DTT 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, pepstatina, antipaína y,
después, se aplica sobre una columna de hidroxiapatita (0,1 g por 1
ml de suspensión, equilibrada con fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0,
30% de glicerina, DTT 1 mM). La columna se lava con cuatro
volúmenes de tampón de equilibrado con un caudal de 20 a 30 ml/h. La
HSL se eluye con un volumen de tampón de equilibrado, el cual
contiene fosfato de potasio 0,5 M, acto seguido se dializa (véase
más arriba) y se concentra 5 a 10 veces por ultracentrifugación
(Amicon Diaflo PM 10 filtros) a 4ºC. La HSL parcialmente purificada
se puede conservar durante 4 a 6 semanas a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
6 mg de fosfatidilcolina y 6 mg de
fosfatidilinositol se disuelven respectivamente en 1 ml de
cloroformo.10 mg de NAG se disuelven en 1 ml de cloroformo. Se
pipetean conjuntamente dos partes de solución de fosfatidilinositol
(por ejemplo 83,5 \mul) y una parte de solución de
fosfatidilcolina (por ejemplo 41,5 \mul) y 100 \mul de solución
de NAG en recipientes de plástico para centelleo (concentración
final en el ensayo: 0,0375 mg de fosfolípidos/ml; 0,05 mg de
NAG/ml). El cloroformo (225 \mul de volumen total) se separa
completamente por barrido con una corriente de N_{2}. El sustrato
secado se puede conservar hasta 3 días a 4ºC. Para la preparación
de las vesículas/micelas de fosfolípidos con NAG intercalado (el día
del ensayo) se recoge el sustrato secado en 20 ml de tampón de
ensayo (Tris/HCl 25 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM) y se llevan a cabo dos
tratamientos por ultrasonidos con una varilla de ultrasonidos
(Branson Sonifier tipo II, micropunta estándar): tratamiento 1.:
ajuste 2, 2 x 1 min, entremedias respectivamente 1 min sobre hielo;
tratamiento 2.: ajuste 4, 2 x 1 min, entremedias respectivamente 1
min sobre hielo. Durante este proceso cambia el color de la solución
de sustrato de amarillo (máximo de extinción 481 nm) a rojo (máximo
de extinción 550 nm) por intercalado de NAG entre las moléculas de
fosfolípido de las vesículas/micelas. Antes de su utilización como
sustrato (dentro de las siguientes 2 h) se incuba todavía la
solución durante 15 min sobre hielo.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se lleva a cabo en recipientes
Eppendorf de 1,5 ml o en placas de 96 pocillos durante 60 min a
30ºC. Para la búsqueda de inhibidores de la HSL se disponen
previamente 10 \mul de la sustancia de ensayo en tampón de ensayo
(Tris/HC 25 mMl, pH 7,4; NaCl 150 mM) en presencia de 16,6% de DMSO.
Se añaden 180 \mul de la solución de sustrato (20 \mug/ml de
fosfatidilcolina, 10 \mug/ml de fosfatidilinositol, 50 \mug/ml
de NAG en tampón de ensayo). Después de una incubación previa
durante 15 min a 30ºC se añaden con pipeta 20 \mul de la solución
enzimática en tampón de ensayo (diluida 1 a 4 veces) y se mide
inmediatamente la extinción a 480 nm en un fotómetro de cubeta
(cubeta de 0,5 ml) o, respectivamente, en un aparato de lectura de
microtitulación en placa (Microsseta, Wallace). Tras 60 min de
incubación a 30ºC se mide nuevamente la extinción. El incremento de
la extinción a 480 nm es una medida de la actividad enzimática. Bajo
condiciones estándar, 20 \mug de HSL purificada parcialmente
provocan una variación de la extinción de 4000 unidades
arbitrarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Alternativamente a la medición de la variación
de la extinción de la solución sustrato se examinan los productos
de la reacción con la HSL por separación de fases/cromatografía de
capa fina. Para ello, la tanda de incubación (200 \mul de volumen
total, véase ensayo indirecto de NAG) se mezclan en recipientes
Eppendorf de 2 ml con 1,3 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7)
y, a continuación, con 0,4 ml de NaOH 0,1 M. Tras una intensa
agitación (10 segundos) se inicia la separación de fases por
centrifugación (800xg, 20 min, temperatura ambiente). De la fase
acuosa superior se retiran volúmenes equivalentes (por ejemplo 0,4
ml) y se determina fotométricamente la extinción a 481 nm. Para la
cromatografía de capa fina, se seca la fase acuosa (SpeedVac) y
después se recoge en 50 \mul de tetrahidrofurano. Sobre placas de
gel de sílice Si-60 (Merck, Darmstadt) se aplican
muestras de 5 \mul. La cromatografía se lleva a cabo con 78 ml de
dietiléter/22 ml de éter de petróleo/1 ml de ácido acético glacial
como eluyente. La cantidad de ácido graso de NBD fluorescente,
liberado, se determina por Phosphorimaging (Molecular Dynamics,
Storm 840 e ImageQuant Software) en una longitud de onda de
excitación de 460 nm y una longitud de onda de emisión de
540-560 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la preparación del sustrato se mezclan
25-50 \muCi [^{3}H]trioleoilglicerina (en
tolueno), 6,.8 \muMol de trioleoilglicerina no marcada y 0,6 mg
de fosfolípidos (fosfatidilcolina/fosfatidilinositol 3:1 p/v), se
secan por N_{2} y, después, se recogen en 2 ml de KP_{i} 0,1 M
(pH 7,0) por tratamiento con ultrasonidos (Branson 250, micropunta,
ajuste 1-2, 2 x 1 min en intervalos de 1 min).
Después de la adición de 1 ml de KP_{i} y nuevo tratamiento con
ultrasonidos (4 x 30 segundos sobre hielo en intervalos de 30
segundos) se añade 1 ml de BSA al 20% (en KP_{i}) (concentración
final de la trioleoilglicerina 1,7 mM). Para la reacción se añaden
con pipeta 100 \mul de solución del sustrato a 100 \mul de
solución de HSL (HSL preparada como anteriormente, diluida en
KP_{i} 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, BSA al 0.02%, 20
\mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de leupeptina) y se incuba
durante 30 min a 37ºC. Después de la adición de 3,25 ml de
metanolcloroformo/heptano (10:9:7) y de 1,05 ml de K_{2}CO_{3}
0,1 M, ácido bórico 0,1 M (pH 10,5) se agita bien y finalmente se
centrifuga (800xg, 20 min). Después de la separación de las fases se
retira un equivalente de la fase superior (1 ml) y se determina la
radioactividad por medición del centelleo en líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
10 \mul de
p-nitrofenilbutirato (PNPB)(2 mM en acetonitrilo),
890 \mul de KP_{i} 0,1 M (pH 7,25), NaCl al 0,9%, DTT 1 mM y
100 \mul de HSL (preparada como anteriormente, diluida en este
tampón) se incuban durante 10 min a 37ºC. Después de la adición de
3,25 ml de metanol/cloroformo/heptano (10:9:7, p/v) y fuerte
agitación, se centrifuga (800xg, 20 min) y se incuba durante 3 min
a 42ºC. A continuación se retira un volumen equivalente de la fase
superior y se determina la absorción a 400 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la preparación del sustrato se añaden 5
\muCi de [1-^{14}C]tributirina (en
tolueno) a 1 ml de tributirina 20 mM no marcada (en acetonitrilo).
10 \mul de esta solución de sustrato se incuban con 390 \mul de
KP_{i} 0,1 M (pH 7,25), NaCl al 0,9%, DTT 1 mM, 2% de BSA y 100
\mul de HSL (preparada como anteriormente, diluida en este
tampón) durante 30 min a 37ºC. Después de la adición de 3,25 ml de
metanol/cloroformo/heptano (10:9:7 p/v) y de 1 ml de NaOH 0,1 M se
agita fuertemente y finalmente se centrifuga (800xg, 20 min). Se
retira un volumen equivalente de la fase superior (1 ml) y se
determina la radioactividad por medición del centelleo en
líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustancias se analizan habitualmente en
cuatro tandas individuales. La inhibición de la actividad enzimática
de la HSL por una sustancia de ensayo, se determina por la
comparación con una reacción de control, no inhibida. El cálculo
del valor de CI_{50} se efectúa a través de una curva de
inhibición con al menos 10 concentraciones de la sustancia de
ensayo. Para el análisis de los datos se utiliza el programa de
Software GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT (versión
3.0).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
NAG (0,05 mg/ml) se incuba con las cantidades de
proteína indicadas en HSL parcialmente purificada (fotómetro
atemperado) y a determinados tiempos se determina la extinción a 481
nm. Para la inactivación, la HSL se incuba durante 15 min a 100ºC.
(n = 8, media \pm SD).
Resultado: hasta una cantidad de proteína de 20
\mug la reacción transcurre de forma lineal durante 60 min. La
diferencia de extinción es en este caso 0,8-0,9 DO.
En el caso de menores cantidades de proteína, la linealidad se
mantiene hasta 180 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Aumento de la absorción a 481 nm
(unidades
arbitrarias)
\newpage
Ejemplo
2
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 60 min. en
HSL parcialmente purificada con las cantidades de proteína
indicadas. En partes alícuotas de las tandas de reacción se
determina el aumento de la extinción a 481 nm (aparición del ácido
graso de NBD, libre, como producto de la reacción de la HSL = ensayo
indirecto de NAG) o la disminución de la extinción a 550 nm
(consumo de NAG como sustrato de la reacción de la HSL.
Alternativamente, se extraen otras partes alícuotas con
metanol/cloroformo y se determina el ácido graso de NBD, liberado,
contenido en la fase orgánica por análisis TLC y fluorometría
(Phosphorlmager Storm 840, Molecular Dynamics) (= análisis directo
de NAG (n = 6, media \pm SD).
Resultado: hasta una cantidad de proteína de 20
\mug la reacción transcurre de forma lineal tanto en lo que se
refiere a la aparición del producto (aumento de la extinción a 481
nm o la aparición del ácido graso de NBD, libre, conforme al
análisis TLC) como también al consumo de sustrato (disminución de la
extinción a 550 nm). La coincidencia entre el ensayo directo o
indirecto de NAG confirma el análisis de la escición de NAG en el
ensayo indirecto.
\vskip1.000000\baselineskip
Variación de la absorción
[unidades
arbitrarias]
Ejemplo
3
Diferentes cantidades de NAG (en relación
constante con los fosfolípidos) se incuban durante 60 min. con las
cantidades indicadas de HSL parcialmente purificada y, después, se
determina la extinción a 481 nm (n = 5, media \pm SD).
Resultado: la velocidad de la escición, para las
tres cantidades de enzima, muestra el transcurso de una típica
curva de saturación. Sin embargo, en virtud de la particularidad
enzimática de la reacción de la HSL (presentación
"bidimensional" del sustrato, "activación interfacial")
sólo en el caso de 5 \mug de proteína y las concentraciones más
bajas de sustrato se puede constatar una dependencia aproximadamente
lineal. Un compromiso razonable entre dependencia del sustrato y
potencia de señal (OD 0,6 bis 0,7) representa la
\hbox{combinación de 20 \mu g de proteína y 0,05 mg/ml de
NAG.}
Aumento de la absorción a 481 nm
(unidades
arbitrarias)
Ejemplo
4
NAG (0,05 mg/ml) se prepara como sustrato por
tratamiento con ultrasonidos con diferentes cantidades de
fosfolípidos (cantidad total) bajo las relaciones de
fosfatidilinositol a fosfatidilcolina indicadas, y después se incuba
con HSL (20 \mug) parcialmente purificada durante 60 min. Se
determina el aumento de la extinción a 481 nm (n = 4, media \pm
SD).
Resultado: la velocidad enzimática es la máxima
en el caso de relación PI/PC (en peso) de 3:1 y 0,0375 a 0,075 de
fosfolípido total. El acusado transcurso del óptimo de la
concentración total de los fosfolípidos, así como también de su
composición, confirma el significado de la presentación de los
sustratos de la HSL (aquí NAG) en vesículas y/o micelas de
fosfolípidos o, respectivamente, para la formación de una estructura
monocapa de fosfolípidos sobre el núcleo (neutro) del sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
Aumento de la absorción a 481 nm
(unidades
arbitrarias)
Ejemplo
5
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 60 min. con
20 \mug de HSL parcialmente purificada en presencia de diferentes
concentraciones (0,1 a 100 \muM) de diferentes sustancias. En
partes alícuotas de las tandas se determina la extinción a 481 nm
(ensayo indirecto) o el ácido graso de NBD (FA-NBD)
liberado, extraído con cloroformo/metanol y determinado por
análisis TLC y fluorometría (ensayo directo). Alternativamente,
[^{3}H]trioleoilglicerol se incuba con HSL parcialmente
purificada conforme las condiciones publicadas, y el oleato
radiomarcado liberado después de su extracción con
cloroformo/metanol se determina por medición del centelleo en
líquidos. A partir de las curvas de inhibición se determinan los
valores CI50 (n = 6, media \pm SD).
Resultado: para todas las sustancias ensayadas,
con los tres procedimientos se obtuvieron curvas de incubación
sigmoidales típicas. Los valores IC_{50} en el ensayo
indirecto/directo de NAG (aumento de la extinción a 481
nm/liberación del ácido graso de NBD) se situaban en general en un
factor 4 a 10 más bajo frente a la escisión de la trioleilglicerina
por HSL, sin embargo el orden de rango de los inhibidores (conforme
a sus valores IC_{50}) es idéntico para los tres procedimientos.
Esto confirma los descubrimientos publicados, de que el efecto de
los inhibidores de la HSL depende de la clase de sustrato y de la
presentación del sustrato. Además de esto, las concentraciones
efectivas del sustrato (NAG y trioleoilglicérido) se pueden
diferenciar también entre los dos ensayos (apenas determinables en
virtud de la presentación del sustrato en forma de vesículas o de
micelas) y, con ello, explicar estas diferencias en el caso de
inhibidores competitivos. Los valores de CI_{50}, casi idénticos,
los cuales se obtuvieron conforme a el cambio de la extinción y la
liberación del ácido graso de NBD, hablan en favor de la escisión
de NAG por HSL y, con ello, de la liberación del ácido graso de NBD
como causa del aumento de la extinción a 481 nm, es decir que el
ensayo de NAG abarca la escisión lipolítica de lípidos.
\vskip1.000000\baselineskip
CI_{50}
[\muM]
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 60 min. con
20 \mug de HSL parcialmente purificada en presencia de diferentes
concentraciones (0,1 a 100 \muM) de diferentes sustancias. En
partes alícuotas de las tandas se determina la extinción a 481 nm
(ensayo indirecto). Alternativamente,
[^{3}H]trioleoilglicerol (TAG),
p-nitrofenilbutirato (PNPB) o
[^{14}C]tributirina se incuba con HSL parcialmente
purificada, y el oleato radiomarcado liberado,
p-nitrofenol o, respectivamente, butirato, después
de su extracción con cloroformo/metanol se determina por medición
de centelleo en líquido o, respectivamente, por fotometría. A partir
de las curvas de inhibición se determinan los valores CI_{50} (n
= 5, media \pm SD).
Resultado: el orden de rango relativo de los
inhibidores, puesto de manifiesto en los valores de CI_{50}, es
idéntico para los dos ensayos con sustrato lipídico (NAG y TAG).
Fundamentalmente, esto vale también para lo sustratos solubles en
agua, tributirina y PNPB, pero algunos de los principios activos que
reducen significativamente la actividad de la HSL frente a NAG y
TAG, son inactivos en la inhibición de la HSL frente a tributirina y
PNPB. Esto se puede explicar por una interferencia de estas
sustancias inhibidoras con la unión lipídica de la HSL (por los
dominios de la unión lipídica), mientras que no afecta el mecanismo
catalítico. Por ello, los sustratos solubles en agua también son
escindidos por la HSL en presencia de estas sustancias inhibidoras.
Los valores de CI_{50} de los inhibidores que también actúan en el
caso de sustratos solubles en agua, se encuentran generalmente
entre los de NAG y TAG como sustrato. Esto demuestra que NAG se
comporta como sustrato de "tipo lipídico" para la HSL, de
manera parecida a los auténticos triglicéridos, y que el ensayo de
NAG se puede emplear para la búsqueda de sustancias inhibidoras,
que bloqueen la unión lipídica (como también el mecanismo
catalítico) de la HSL.
\vskip1.000000\baselineskip
CI_{50}
[\muM]
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 180 min a
37ºC en presencia de concentraciones crecientes de diferentes
detergentes y disolventes y, después se determina la disminución de
la extinción a 550 nm (disolución de la estructura específica del
sustrato) (n = 4, media \pm SD).
Resultado: el sustrato (vesículas o,
respectivamente, micelas de fosfolípido) manifestaba diferente
sensibilidad frente a los agentes empleados. La extinción, es decir
la cantidad de sustrato, disminuía en presencia de 1% de DMSO en el
10%, en el caso de etanol o metanol en max. 20% y, en el caso de 1%
TX-100 o SDS en max. 30%. DMF era el más eficiente
en la disolución de las vesículas/micelas, con el 1% se liberaron
más del 80% de NAG de las estructuras de las vesículas de
fosfolípido. El orden de rango en la eficiencia de los disolventes
y detergentes empleados en la disolución de la estructura del
estrato es compatible con un desplazamiento del máximo de extinción
(de 481 nm a 550 nm) de NAG o, respectivamente del grupo cromóforo
(NBD) por introducción en el entorno apolar de vesículas/micelas de
fosfolípido y el alejamiento del entorno acuoso, condicionado por
ello. La liberación de NAG de estas estructuras en medio acuoso por
disolución de las vesículas/micelas (por ejemplo mediante
detergentes) o la liberación del grupo cromóforo en forma de ácido
graso de NBD por escisión lipolítica (por HSL) de NAG provoca una
reducción de la extinción a 550 nm y a un aumento de la extinción a
481 nm. Con la estabilidad en el caso de 1% de DMSO el sustrato de
NAG cumple una de las premisas básicas para un robusto ensayo de
HTS.
\vskip1.000000\baselineskip
Absorción a 550 nm (unidades
arbitrarias)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 60 min. con
HSL (20 \mug) en presencia de concentraciones crecientes de
diferentes agentes. Se determina la extinción a 481 nm (n = 4, media
\pm SD).
Resultado: hasta un 1% de DMSO reducía la
cantidad de FA-NBD liberado en aproximadamente 10%.
Puesto que a esta concentración de DMSO se liberan hasta 10% de NAG
de las vesículas/micelas de fosfolípidos por disolución de las
estructuras, por cálculo resulta una disminución de la actividad
enzimática de aproximadamente 20%. En el caso de 0,5% de DMSO la
reducción es aún del 10%. TX-100, acetona, etanol y
metanol causan, entre 0 y 1%, un aumento de la actividad de la HSL,
provocada posiblemente por una presentación más eficiente del
sustrato. En el caso de concentraciones elevadas, interfieren con la
actividad. En concentraciones a partir de 0,1%, el DMF provoca ya
una significativa pérdida de actividad de la HSL.
\vskip1.000000\baselineskip
Absorción a 481 nm (unidades
arbitrarias)
Ejemplo
9
NAG (0,5 mg/ml) se incuba durante 60 min. con 20
\mug de HSL parcialmente purificada, 75 \mug de LPL de
adipocitos de rata parcialmente purificada, 20 Um de lipasa
bacteriana, 50 Um de lipasa pancreática, 100 Um de PLA_{2} de
veneno de serpiente y 0,5 U de fosfolipasa específica de PC de
Bacillus cereus. Se determina el aumento de la extinción a
481 nm (n = 5, media \pm SD).
Resultado: bajo las condiciones optimizadas para
la HSL indicadas, HSL (100%) y LPL (aproximadamente 70%) mostraban
la actividad máxima. La lipasa bacteriana y pancreática es
claramente menos activa (25 o, respectivamente, 1%), mientras que
la fosfolipasa bacteriana, específica de PC, era prácticamente
inactiva. Estas actividades fuertemente diferentes muestran la
especificidad de las condiciones del ensayo indirecto de NAG
elegidas para la HSL, así por ejemplo, en extractos celulares
gruesos no se detectan las fosfolipasas eventualmente contenidas.
Pero, en principio, estos datos muestran también la posibilidad de
aplicar el principio del ensayo a otras
lipasas.
lipasas.
\vskip1.000000\baselineskip
Aumento de la absorción a 481 nm
[unidades
arbitrarias]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
NAG (0,05 mg/ml) o diferentes lípidos
modificados con el ácido graso de NBD en diferentes concentraciones
se incuban con 20 \mug de HSL parcialmente purificada. A
determinados tiempos se determina la extinción a 481 nm (n = 5,
media \pm SD).
Resultado:
\newpage
Aumento de la absorción a 481 nm
(unidades
arbitrarias)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
NAG (0,05 mg/ml) se incuba durante 60 min. con
20 \mug de HSL parcialmente purificada en presencia de
concentraciones crecientes de diisopropilfosfofluoridato. En partes
alícuotas de las tandas de reacción se determina el aumento de la
extinción a 481 nm (ensayo indirecto de NAG) o, después de la
extracción con cloroformo/metanol, se calcula por fluorometría la
cantidad de FA-NBD liberado en la fase orgánica
(ensayo directo de NAG). Alternativamente, se llevan a cabo
incubaciones de la HSL con [^{3}H]trioleoilglicerina como
sustrato (véase más arriba) y, después de la extracción con
cloroformo/metanol, se determina la cantidad de ácido oleico
radiomarcado, liberado. La actividad de escisión en ausencia de
inhibidor se fija para cada ensayo en 100% (n = 7, media \pm
SD).
Resultado: en los tres ensayos, para el
diisopropilfosfofluoridato se obtuvieron curvas de inhibición
típicamente sigmoidales. Los valores de CI_{50} calculados a
partir de ello para el ensayo indirecto de NAG (0,8 mM) o el ensayo
directo de NAG (1,1 mM) no se diferencian significativamente entre
sí. Para la escisión del trioleilglicérido, con 2,1 mM, se obtuvo
un valor de CI_{50} algo mayor. Esto está en consonancia con las
diferencias de los efectos inhibidores de diferentes inhibidores,
comprobadas más arriba, que se observan en estos ensayos (para
posibles explicaciones, véase el Ejemplo 6). Independientemente de
esto, los valores de CI_{50} calculados para la inhibición de la
HSL por diisopropilfosfofluoridato por el ensayo indirecto de NAG
están en buena consonancia con los datos publicados (P. Stralfors,
H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987,
147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol. Chem.
258, 1983, 15146-15151; P. Belfrage, B. Jergil, P.
Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75, 1977,
259-263).
\newpage
% de actividad máxima de
HSL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
NAG se incuba durante diferentes tiempos en HSL
parcialmente purificado en un volumen de ensayo de 200 \mul en
placas para microtitulación con 96 pocillos. La extinción a 481 nm
se obtiene por medio de un dispositivo de lectura de placas de
microtitulación.
Resultado: bajo las condiciones elegidas, la
reacción es aproximadamente lineal durante 60 min. La varianza (SD)
se sitúa en este caso entre 4 y 7%. Por consiguiente, el ensayo
indirecto de NAG es adecuado para su empleo en el "screening"
de HT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Aumento de la absorción a 481 nm
[unidades
arbitrarias]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- arb. units
- unidades arbitrarias
- BSA
- albúmina de suero bovino
- AMPc
- adenosinmonofosfato cíclico
- DCC
- diciclohexilcarbodiimida
- DMF
- N,N-dimetilformamida
- DMSO
- dimetilsulfóxido
- DTT
- ditiotreitol
- EDTA
- ácido etilendiamin-N,N,N',N'-tetraacético
- FAB-EM
- espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos
- HSL
- lipasa sensible a hormonas
- Kp_{i}
- tampón dihidrogenofosfato de potasio/fosfato de potasio
- LPL
- lipoproteinlipasa
- NAG
- monoacilglicérido de NBD: 2,3-dihidroxipropiléster del ácido 12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico
- NBD
- 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
- NBD-FA
- ácido graso de NBD: ácido 12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico
- NIDDM
- diabetes melitus no dependiente de insulina
- PLA_{2}
- fosfolipasa A_{2}
- PLC
- fosfolipasa C
- PNPB
- p-nitrofenibutirato
- SD
- desviación estándar
- SDS
- dodecilsulfato de sodio
- TAG
- [^{3}H]-trioleoilglicerol
- Tris
- Tris(hidroximetil)aminometano
- TLC
- cromatografía de capa fina
- TX-100
- Triton® X-100
Claims (18)
1. Procedimiento para la preparación de un
sustrato para la determinación la integridad de estructuras
complejas de fosfolípido/lípido, caracterizado porque
- a)
- un ácido graso provisto de un marcador fluorescente se hace reaccionar con 2,3-epoxipropanol en solución alcohólica, a la temperatura ambiente, bajo la adición de una base, para dar un monoacilglicérido,
- b)
- este monoacilglicérido se somete a un tratamiento de ultrasonidos con fosfolípidos en la relación 1:10 hasta 10:1 mg/mL, a partir de lo cual resulta el sustrato, que es reconocible por un cambio de color de amarillo a rojo.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en donde el marcador fluorescente es Dansyl o NBD.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 3,
en donde el marcador fluorescente es NBD.
4. Procedimiento conforme a las reivindicaciones
1 a 3, en donde el ácido graso es un ácido carboxílico saturado o
insaturado con una longitud de cadena de C-8 a
C-20.
5. Procedimiento conforme a la reivindicación 4,
en donde el ácido graso es un ácido carboxílico saturado de
C-12.
6. Procedimiento conforme a las reivindicaciones
1 a 5, en donde como fosfolípidos se emplean fosfatidilcolina y
fosfatidilinositol solos o conjuntamente.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
en donde fosfatidilcolina y fosfatidilinositol se emplean
conjuntamente en la relación 10 : 1 hasta 1 : 10.
8. Procedimiento conforme a las reivindicaciones
1 a 7, en donde el monoacilglicérido es el
2,3-dihidroxipropiléster del ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]-oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico.
9. Sustrato preparado según un procedimiento de
las reivindicaciones 1 a 8.
10. Sustrato conforme a la reivindicación 9 para
su aplicación en un procedimiento para la identificación de
estructuras lipídicas/fosfolipídicas.
11. Sustrato conforme a la reivindicación 9 para
su aplicación en un procedimiento para la identificación de lipasas
e inhibidores de lipasas.
12. Procedimiento para la preparación del
monoacilglicérido 2,3-dihidroxipropiléster del ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico,
caracterizado porque
el ácido 12-aminoláurico se hace
reaccionar primeramente con
7-cloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
y, a continuación, el producto intermedio obtenido se hace
reaccionar con 2,3-epoxipropanol en solución
alcohólica, a la temperatura ambiente bajo la adición de una
base.
13. 2,3-dihidroxipropiléster del
ácido
12-(7-nitro-benzo[1,2,3]oxadiazol-4-ilamino)-dodecanoico.
14. Procedimiento para la identificación de
lipasas e inhibidores de lipasas, caracterizado porque
- a)
- se prepara un sustrato conforme a la reivindicación 9,
- b)
- este sustrato se incuba con una lipasa, y
- c)
- se determina el cambio de color.
15. Procedimiento para la determinación de la
actividad de lipasas/inhibidores de lipasas, caracterizado
porque
- a)
- se prepara un sustrato conforme a la reivindicación 9,
- b)
- este sustrato se incuba con una lipasa,
- c)
- se determina la velocidad del cambio de color, y
- d)
- se calcula la actividad.
\newpage
16. Procedimiento conforme a la reivindicación
15, caracterizado porque el sustrato se incuba con una lipasa
sensible a hormonas.
17. Procedimiento para la determinación del
efecto detergente o de la citotoxicidad de compuestos,
caracterizado porque
- a)
- se prepara un sustrato conforme a la reivindicación 9,
- b)
- este sustrato se incuba con un compuesto de ensayo, y
- c)
- se determina visual/ópticamente o fluorométricamente el cambio de color de rojo a amarillo, que caracteriza los compuestos citotóxicos y los compuestos con efecto detergente.
18. Procedimiento para la determinación de la
actividad de los transportadores de lípidos, caracterizado
porque
- a)
- se prepara un sustrato conforme a la reivindicación 9,
- b)
- las proteínas de transporte/transferencia se reconstruyen funcionalmente en liposomas, y
- c)
- los liposomas preparados según b) se añaden al sustrato según a) y se determina visual u ópticamente el cambio de color.
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