NO329003B1 - Anvendelse av minst en forbindelse ved fremstilling av et medikament for undertrykkelse av en immunrespons - Google Patents

Description

Teknisk område

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av minst én forbindelse ved fremstilling av et medikament for undertrykkelse av en immunrespons.

Kjent teknikk

I klinisk behandling som utføres nå for tiden, kan transplantasjon anvendes for å behandle sykdommer som ikke lar seg behandle med kjemoterapi. Transplantasjon er den teknikk for behandling av en sykdom, der et delvis eller fullstendig sykt organ erstattes med et friskt organ tatt fra et annet individ. Organtransplantasjon har blitt utført med hensyn til mange forskjellige organer, slik som nyre, lever, lunge, tarm, hjerte, bukspytt-kjertel og hornhinne. Antallet organtransplantasjoner har vært økende.

Hudens immunrespons er naturlig høy. Imidlertid kan hudtransplantasjon være vellykket dersom et hudtransplantat fra en person til en annen kan holdes i live i det minste i noen få uker. Dette er fordi nytt hudvev, dersom et transplantert epidermis holdes i live i noen få uker, kan regenerere seg selv og derigjennom gjenopprette en dermal vevsskade. Derfor er det mulig å lage fysisk restitusjon av alvorlige og omfattende forbrenninger eller rifter ved transplantering av dermalt vev fra en annen person.

Det mest fryktsomme problemet ved vevs- eller organtransplantasjon er en avstøtning som skyldes mottakerens immunrespons.

For å kunne utvikle et immunoundertrykkende middel i stand til å forebygge avstøtning i en mottaker, for derigjennom å oppnå permanent fiksering av et transplantert organ, er det under disse forhold blitt utført intensive undersøkelser siden 1970-tallet, spesielt i europeiske land og USA.

På den annen side kan et immunoundertrykkende middel også være viktig ved behandling av autoimmune sykdommer, slik som reumatisme eller kollagensykdom, siden det til en viss grad kan dempe symptomene.

Inntil nylig har syklosporin A og FK506 osv., blitt utviklet som immunoundertrykkende midler. Imidlertid ligner virkningsmekanismene til disse immunoundertrykkende midlene på hverandre, og deres kroniske toksisitet gir grunn til bekymring. For å oppnå lengre levetid for neste generasjons organtransplantasjon, er det derfor ønskelig med en annen type undertrykkende midler som har en lavere toksisitet basert på en ulik kjemisk struktur, og som derfor kan forventes å ha en ulik virkningsmekanisme.

Det har blitt funnet at naturlig forekommende svovelinneholdende glykolipider har farmasøytiske virkninger, slik som en antikreftvirkning (Sahara et al., British Journal of Cancer, 75(3), 324-332, (1997)); inhibitoriske aktiviteter mot DNA-polymerase (Mizushina et al., Biochemical Pharmacology, 55, 537-541 (1998), Ohta et al., Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 46(4), (1998)); og HIV-undertrykkende virkning (japansk oversettelsespublikasjon nr. 5-501105 av PCT-søknad nr. PCT/US90/04270 (WO 91/02521)). Imidlertid er det ennå ikke blitt funnet at et svovelinneholdende glykolipid, spesielt et sulfokinovosyldiacylglyserolderivat, har en immunoundertrykkende aktivitet.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe anvendelse av minst én forbindelse ved fremstilling av et medikament for undertrykkelse av en immunrespons. Nærmere bestemt er det et formål med den foreliggende oppfinnelse på denne måte å tilveiebringe et immunoundertrykkende medikament som viser lav toksisitet og er anvendelig for langtidsadministrering, og som også har høy immunoundertrykkende aktivitet.

De foreliggende oppfinnere har utført studier for å oppnå det tidligere nevnte formål. Som et resultat fant de at spesifikke sulfokinovosyldiacylglyserolderivater har en bemerkelsesverdig immunoundertrykkende aktivitet, og oppnådde den foreliggende oppfinnelse. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av i det minste én forbindelse valgt fra gruppen bestående av:

forbindelser representert ved formel (1):

hvor Ri oi og R|02 uavhengig av hverandre er en acylrest av en høyere fettsyre representert ved R-C(=0), hvor R er en alkyl- eller alkenylgruppe med 13 eller flere karbonatomer, og

et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

ved fremstilling av et medikament for undertrykkelse av en immunrespons.

Kort beskrivelse av tegninger

FIG. 1 viser forholdet mellom konsentrasjonen av forbindelsen (SQAG 3), representert ved formel (1), og den immunoundertrykkende aktivitet; FIG. 2 viser forholdet mellom konsentrasjonen av forbindelsen (SQAG 5), representert ved formel (1), og den immunoundertrykkende aktivitet; FIG. 3 viser forholdet mellom konsentrasjonen av forbindelsen (SQAG 7), representert ved formel (1), og den immunoundertrykkende aktivitet; og FIG. 4 viser forholdet mellom konsentrasjonen av forbindelsen (SQAG 9), representert ved formel (1), og den immunoundertrykkende aktivitet.

Beste metode for utførelse av oppfinnelsen

I beskrivelsen henviser uttrykket "karbonatomer" i en beskyttelsesgruppe til antallet karbonatomer ved å anta at beskyttelsesgruppen er usubstituert. For å være mer spesifikk er antallet karbonatomer slik som for alkylgruppen selv, når gruppen som representeres av R<6> er en substituert alkylgruppe, og antallet karbonatomer på substituenten på alkylgruppen ikke telles. De samme betingelser kan anvendes i tilfeller hvor beskyttelsesgruppen er andre enn alkylgruppen.

For det første vil vi nærmere bestemt forklare den aktive ingrediensen inneholdt i det immunoundertrykkende midlet fremstilt ved anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, som er et sulfokinovosyldiacylglyserolderivat, representert ved formel (1):

hvor Rioi og R102 uavhengig av hverandre er en acylrest av en høyere fettsyre representert ved R-C(=0), hvor R er en alkyl- eller alkenylgruppe med 13 eller flere karbonatomer. Antallet karbonatomer i alkyl- og alkenylgruppene representert ved R i R-C(=0) er fortrinnsvis 13 eller flere, og 25 eller færre, og mer foretrukket et oddetall innenfor 15-25. Dette er fordi fremstillingskostnadene øker dersom antallet karbonatomer i R overskrider 25.

I formel (1) har Ri02 den samme betydning som R!0|.

R101 og R102 kan være like eller forskjellige. Imidlertid er de fortrinnsvis like av hensyn til fremstillingsutstyr.

Sukkerskjellettet til sulfokinovosyldiacylglyserol i formel (1) kan ta enten båt-eller stolkonformasjon. Imidlertid er stolkonformasjonen foretrukket av hensyn til stabilitet. Den absolutte konfigurasjonen til karbonet (asymmetrisk karbon) i 2-posisjon til glyserolenheten kan være enten i S- eller R-konfigurasjon.

Bindingen mellom sulfokinovosid og glyserol er enten a- eller P-binding. Imidlertid er p-binding foretrukket ved bedømmelse av resultatene fra den immunoundertrykkende aktivitetsanalysen ved anvendelse av dyrkede celler.

Sulfokinovosyldiacylglyserolderivatene anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles via (trinn A) til (trinn J) i samsvar med de følgende reaksjonsprosedyrer.

(Trinn A) Hydroksylgruppen bundet til Cl-karbonet i D-glukose omdannes til en 2-propenylgruppe. (Trinn B) Hydroksylgruppen i C6-karbonet til glukosen beskyttes.

(Trinn C) Hydroksylgruppene bundet til C2-, C3- og C4-karbonene i glukosen beskyttes.

(Trinn D) Beskyttelsesgruppen på C6-karbonet som tidligere ble beskyttet, fjernes. (Trinn E) Hydroksylgruppen bundet til C6-karbonet substitueres med en gruppe (f eks en alkylsulfonyloksygruppe eller arylsulfonyloksygruppe) som kan omdannes til en karbonyltiogruppe. (Trinn F) C6-karbonet omdannes til en karbonyltiogruppe. (Trinn G) 2-propenylgruppen bundet til Cl-karbonet omdannes til et diol. (Trinn H) Hver av hydroksylgruppene på diolet oppnådd på denne måten, forestres med en ønsket høyere fettsyre. (Trinn I) Karbonyltiogruppen på C6-karbonet omdannes til et sulfonatsalt.

(Trinn J) Beskyttelsesgruppene på C2-, C3- og C4-karbonene på det oppnådde sulfonat-saltet fjernes. Som et resultat kan et salt av et sulfokinovosyldiacylglyserolderivat ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles. Saltet som oppnås på denne måten, utsettes for titrering med en syre slik som saltsyre, for å gi sulfokinovosyldiacylglyserolderivat ifølge foreliggende oppfinnelse.

De tidligere nevnte trinnene A-J vil bli ytterligere forklart i detalj.

I trinn A utføres 2-propenyleringen ved omsetning av glukose med allylalkohol i nærvær av en sterk syre, slik som trifluormetansulfonsyre, vanligvis ved romtemperatur til 100 °C, fortrinnsvis fra 80 til 90 °C, i en halv til to dager. Imidlertid kan reaksjonstiden variere avhengig av reaksjonsbetingelsene.

I trinn B beskyttes hydroksylgruppen bundet til C6-karbonet for å oppnå forbindelsen hvortil -OR6 er bundet ved C6-karbonet (hvor R<6> representerer en alkyl-eller substituert silylgruppe).

Som forbindelse i stand til å beskytte hydroksylgruppen kan det anvendes en forbindelse som tilveiebringer en alkyl- eller substituert silylgruppe som R6 -gruppen.

Eksempler på alkylgruppen representert ved R<6> inkluderer fortrinnsvis store og substituerte lavere alkylgrupper. Substituentene på de store og substituerte alkylgruppene inkluderer metyl- og fenylgrupper. Spesifikke eksempler på den substituerte alkylgruppen inkluderer t-butyl- og tritylgrupper.

Når gruppen representert ved R<6> representerer en substituert silylgruppe, inkluderer eksempler på substituenter av den substituerte silylgruppen lavere alkylgrupper, fortrinnsvis alkylgrupper med 1-4 karbonatomer (f eks metyl-, etyl-, isopropyl-og t-butylgrupper); og arylgrupper, fortrinnsvis arylgrupper med 6 karbonatomer (f eks en fenylgruppe). Den substituerte silylgruppen representert ved R<6>, inkluderer fortrinnsvis trisubstituerte silylgrupper, mer foretrukket en t-butyldifenylsilylgruppe.

Når forbindelse 3 skal oppnås, hvor R<6> representerer en alkylgruppe, kan beskyttelsen av hydroksylgruppen i trinn B utføres ved tilsetning av en forbindelse representert ved R<6->X (hvor R<6> representerer alkylgruppen definert ovenfor, og X representerer et halogenatom slik som kloratom) til en løsning av forbindelse 2 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, slik som vannfritt pyridin, og omsette oppløsnings-blandingen ved romtemperatur i nærvær av en katalysator, slik som p-dimetylamino-pyridin (DMAP). Som forbindelsen R<6->X anvendes fortrinnsvis tritylklorid av hensyn til fremstillingskostnader og reaksjonsutstyr.

Når forbindelsen 3 skal oppnås, hvor R<6> representerer en substituert silylgruppe, anvendes f eks t-butyldifenylsilylklorid som forbindelsen R<6->X, og reaksjonen utføres i nærvær av en katalysator, slik som imidazol, ved romtemperatur i en halv til to dager. Det er å bemerke at reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

I trinn C beskyttes hydroksylgruppen bundet til C2-, C3- og C4-karbonene, og omdannes til hhv. -OR<1>, -OR<2> og -OR<3>, hvor R<1> til R<3> uavhengig av hverandre representerer en alkyl- eller substituert silylgruppe. Beskyttelsen av disse hydroksylgruppene kan utføres ved aktivering med natriumhydrid, hydroksylgruppene bundet til C2-, C3- og C4-karbonene på forbindelse 3 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, slik som N, N-dimetylformamid (DMF), og omsette med forbindelsen som er i stand til å beskytte disse hydroksylgruppene ved romtemperatur.

Som forbindelsen i stand til å beskytte hydroksylgruppene, kan benzylbromid, p-metoksybenzylbromid, t-butyldimetylsilylklorid eller trietylsilylklorid anvendes. Omsetningen ved anvendelse av forbindelsen i stand til å beskytte hydroksylgruppene kan utføres under egnede reaksjonsbetingelser for hver av beskyttelsesgruppene.

Fjerning av beskyttelsesgruppen bundet til C6-karbonet i trinn D, kan utføres ved å omsette en løsning av forbindelsen 4 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, slik som metanol, i nærvær av en katalysator, slik som p-toluensulfonsyre, i en halv til én dag ved romtemperatur. Reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

I trinn E er R<4>, dvs. en alkylsulfonyl- eller arylsulfonylgruppe, bundet til hydroksylgruppen ved C6-karbonet av forbindelsen 5, slik at hydroksylgruppen omdannes til -OR4 for å gi forbindelsen 6.

Reaksjonen som gir -OR<4>-gruppen, utføres ved tilsetning av en forbindelse som har alkylsulfonylgruppen eller en forbindelse som har sulfonylgruppen, til en løsning av forbindelsen 5 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, og omsette disse. Alkylgruppene på forbindelsen som har alkylsulfonylgruppen, inkluderer fortrinnsvis usubstituerte alkylgrupper, mer foretrukket lavere alkylgrupper, mye mer foretrukket alkylgrupper med 1-2 karbonatomer (metyl- og etylgrupper). Forbindelsen som har en alkylsulfonylgruppe, kan være representert ved R4 -X, hvor R<4> representerer en alkylsulfonylgruppe, og X representerer et halogenatom. Spesifikke eksempler inkluderer metansulfonylklorid og etansulfonylklorid.

På den annen side kan arylguppen på forbindelsen som har arylsulfonylgruppen, inkludere usubstituerte og substituerte arylgrupper, fortrinnsvis arylgrupper med 6 karbonatomer (f eks en fenylgruppe). I tilfelle av de substituerte arylgruppene kan eksempler på substituenter derav inkludere p-metyl- og p-metoksygrupper. Eksempler på forbindelsen som har en arylsulfonylgruppe, inkluderer forbindelser representert ved R4 -X hvor R<4> representerer en arylsulfonylgruppe, og X representerer et halogenatom. Spesifikke eksempler inkluderer p-toluensulfonylklorid, p-metoksybenzensulfonylklorid og benzensulfonylklorid.

Blant forbindelsene med en alkylsulfonyl- eller arylsulfonylgruppe er en forbindelse med en tosylgruppe foretrukket anvendt med hensyn til reaksjonsutstyr.

I reaksjonen i trinn E kan f eks pyridin eller diklormetan anvendes som et organisk oppløsningsmiddel.

Reaksjonen nevnt ovenfor kan, i tilfelle av nærvær av en katalysator, slik som DMAP, utføres ved romtemperatur i 2 timer til én dag. Reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

I trinn F erstattes sulfonyloksygruppen (-OR<4>) på forbindelse 6 med en karbonyltiogruppe representert ved -SC (=0)R<5>, hvor R<5> representerer et hydrogenatom, en alkyl-eller arylgruppe.

I reaksjonen tillates en forbindelse som er i stand til å substituere alkylsulfonyl-oksy- eller arylsulfonyloksygruppen på forbindelse 6 med karbonyltiogruppen, og omsettes i et organisk oppløsningsmiddel for å gi en forbindelse 7. Heretter vil denne forbindelsen refereres til som "O-substituert —► S-substituert forbindelse".

Eksempler på O-substituert —> S-substituert forbindelse inkluderer alkalimetall-salter og jordalkalimetallsalter av en tiokarboksylsyre. Eksempler på tiokarboksylsyren inkluderer tiomaursyre, lavere tiokarboksylsyrer, fortrinnsvis alifatiske tiokarboksylsyrer som hver har 1 -5 karbonatomer i dets alifatiske hydrokarbonenhet (f eks tioeddiksyre eller tiopropionsyre), og aromatiske tiokarboksylsyrer som hver har 6-10 karbonatomer i dets aromatiske hydrokarbonenhet (f eks tiobenzosyre).

Alkalimetallet som danner et salt med tiokarboksylsyren, inkluderer kalium og natrium. Jordalkalimetallet inkluderer magnesium og kalsium.

Blant de ovenfor nevnte O-substituerte —► S-substituerte forbindelser kan fortrinnsvis salter av tioeddiksyre anvendes, siden en reaksjon kan gjennomføres stabilt og fordi svovelatomet lett kan oksideres i et senere trinn.

Eksempler på et organisk oppløsningsmiddel anvendt i reaksjonen inkluderer alkohol, f eks metanol, etanol og propanol, N,N-dimetylformamid og dimetylsulfoksid.

Den tidligere nevnte reaksjonen kan utføres under røring i en time til en dag, vanligvis ved romtemperatur til kokepunktet til oppløsningsmiddelet som anvendes. Det er å bemerke at reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

Dihydroksyleringen i trinn G kan utføres ved tilsetting av et oksiderende middel, slik som osmiumtetraoksid, til en løsning av forbindelse 7 løst i en oppløsningsmiddel-blanding, slik som en blanding av t-butanol og vann, og deretter omsette den resulterende blanding i nærvær av et reoksideringsmiddel, slik som trimetylamin-N-oksid, ved romtemperatur i en time til tre dager. Det er å bemerke at reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

Ved forestringen i trinn H kan et sulfokinovosyldiacylglyserolderivat oppnås som har bundet hver enkelt høyere fettsyre, gjennom en esterbinding til dets glyserolenhet.

Denne reaksjonen kan utføres ved tilsetting av en høyere fettsyre, tilsvarende et endelig produkt, til en løsning av forbindelsen 8 løst i et egnet organisk oppløsnings-middel, slik som diklormetan, og deretter omsette den resulterende blandingen, om nødvendig, i nærvær av en egnet katalysator, slik som etyldimetylaminopropylkarbodi-imid (EDCl)-DMAP.

I reaksjonen i trinn H kan det, mens fettsyren tilsettes, anvendes en høyere fettsyre hvis acylgruppe er den representert ved R!0| av formel (1), dvs. en rettkjedet eller forgrenet kjede, umettet eller mettet høyere fettsyre.

I reaksjonen i trinn H oppnås forbindelsen 9 i form av en blanding av en diacylester og en monoacylester. Diacylesteren heri er representert ved formel (1) ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor hver av R!0i og R|02 er en acylrest av den tilsatte høyere fettsyren. Monoacylesteren heri har kun acylresten til den tilsatte høyere fettsyren som er Rioi. To eller flere høyere fettsyrer kan tilsettes til reaksjonen i trinn H om ønskelig. I dette tilfellet inneholder den resulterende blandingen diacetylsyre representert ved formel (1) hvor Rioi og R102 er like eller forskjellige acylrester, og monoestere med ulike acylrester som er Rj0i.

Om nødvendig kan blandingen av monoestrene og diestrene isoleres fra hverandre, f eks ved kromatografi, og utsettes for et neste reaksjonstrinn I. Videre undertrykkes produksjonen av monoestere så mye som mulig ved å sette tilsetnings-mengden av fettsyrene til 2-3 ganger større enn den for forbindelsen 8, i betydningen mol, derigjennom kan diesteren fortrinnsvis oppnås.

I trinn I kan omdanningen til et sulfonatsalt utføres ved tilsetning av et oksiderende middel, f eks OKSON (2KHS05, KHS04 og K2S04) til en løsning av forbindelsen 9 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel som er bufret med eddiksyre og kaliumacetat, og deretter tillate den resulterende blandingen å omsettes ved romtemperatur i en halv dag til to dager. Det er å bemerke at reaksjonstiden varierer avhengig av reaksjonsbetingelsene.

Fjerning av beskyttelsesgruppene bundet til karbonene ved C2- til C4-karbonene i trinn J kan utføres ved en fremgangsmåte egnet for beskyttelsesgruppen som anvendes, og en acylrest av den bundne høyere fettsyren. For eksempel kan fjerning av beskyttelsesgruppen utføres ved omsetning av en løsning av en forbindelse 10 oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, slik som etanol, i nærvær en katalysator, slik som palladiumaktivert karbon, under en hydrogengassatmosfære ved romtemperatur, når beskyttelsesgruppen er en benzylgruppe og hver av RIOi og R102 er en acylrest av en mettet høyere fettsyre. Når i det minste acylrestene av de høyere fettsyrene representert ved Rioi og R102 er en acylrest av en umettet høyere fettsyre, kan videre fjerning av beskyttelsesgruppen utføres ved en fremgangsmåte egnet for beskyttelsesgruppen som anvendes, og i stand til å bibeholde dobbeltbindingen i den umettede fettsyren som anvendes. Når beskyttelsesgruppen er en silylgruppe, kan f eks fjerningen av beskyttelsesgruppen utføres ved anvendelse av en syrekatalysator (f eks trifluor-eddiksyre).

Det er å bemerke at glukose i et utgangsmateriale vanligvis tar a- og P-anomer-konfigurasjon i en løsning. Derfor resulterer produktet i hvert trinn i en blanding av a- og P-anomerer. Blandingen kan separeres til a- og P-anomerer ved kromatografi.

Forut for trinn B er det mulig selektivt å krystallisere a-anomeren, og derigjennom separere denne dersom et reaksjonstrinn med forbindelse 2 med benzen-aldehyd utføres for å danne benzyliden. Dersom halogen, slik som brom, er bundet til Cl-karbon før 2-propenyleringen i trinn A, kan videre propenylgruppen introduseres til en P-konfigurasjon i en senere reaksjon. På denne måten kan en p-anomer syntetiseres selektivt.

Det immunoundertrykkende midlet fremstilt ved anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder i det minste én forbindelse valgt fra gruppen bestående av sulfokinovosyldiacylglyserolderivater representert ved formel (1) og farmasøytisk akseptable salter derav som en aktiv ingrediens. Eksempler på farmasøytisk akseptable salter anvendt i det immunoundertrykkende midlet inkluderer, men er ikke begrenset til, et salt av et monovalent kation, slik som et natrium- eller kaliumion. Forbindelsene i gruppen bestående av sulfokinovosyldiacylglyserolderivater og farmasøytisk akseptable salter derav, blir heretter noen ganger referert til som "immunoundertrykkende substans ifølge den foreliggende oppfinnelse".

Eksempler på sulfokinovosylacylglyserolderivatene inneholdt i den immunoundertrykkende substansen som en aktiv ingrediens, inkluderer en isomer hvori kinovose er bundet til glyserol med en a- eller P-konfigurasjon, og en isomer som har et asymmetrisk karbon ved C2-karbonet i glyserolenheten. Den immunoundertrykkende substansen kan inkludere disse isomerene alene eller i kombinasjon med to eller flere isomerer, så lenge de ikke negativt påvirker aktiviteten til den immunoundertrykkende

substansen.

Den immunoundertrykkende substansen kan administreres oralt eller parenteralt.

Immunoundertrykkende forbindelse kan kombineres med f eks en farmasøytisk akseptabel eksipiens eller fortynningsmiddel for derved å danne et medisinsk preparat, avhengig av administreringsruten.

Formene av midler egnet for oral administrering inkluderer faste, semifaste, flytende former og gassformer. Spesifikke eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til, tabletter, kapsler, pulver, granulat, løsninger, suspensjoner, sirup- og eliksirmidler. For å formulere den immunoundertrykkende substansen ifølge foreliggende oppfinnelse til tabletter, kapsler, pulvere, granulater, løsninger eller suspensjoner, blandes forbindelsen med et bindemiddel, et nedbrytningsmiddel og/eller et smøremiddel, og om nødvendig blandes den resulterende blandingen med et fortynningsmiddel, en buffer, et fuktemiddel, konserveringsmiddel og/eller et smakstilsetningsmiddel ved en kjent fremgangsmåte. Eksempler på bindemidlet inkluderer krystallinsk cellulose, cellulose-derivater, maisstivelse og gelatin. Eksempler på nedbrytningsmidlet inkluderer maisstivelse, potetstivelse og natriumkarboksymetylcellulose. Eksempler på smøremidlet inkluderer talkum og magnesiumstearat. Videre kan additiver slik som laktose og mannitol også anvendes, så lenge de anvendes konvensjonelt.

Dessuten kan den immunoundertrykkende substansen administreres i form av en aerosol eller ved innånding, som fremstilles ved å lade den aktive forbindelsen, i væske-eller finpulverform, sammen med en gass eller et flytende sprøytemiddel, og om nødvendig med et kjent hjelpestoff, slik som et fuktemiddel, over i en ikke-trykksatt beholder, slik som en aerosolbeholder eller et forstøvningsapparat. Som sprøytemiddel kan det anvendes en komprimert gass, f eks diklorfluormetan, propan eller nitrogen.

For parenteral administrering kan den immunoundertrykkende substansen administreres ved injeksjon; perkutant, rektalt eller intraokulært.

For administrering ved injeksjon kan den immunoundertrykkende substansen injiseres, f eks hypodermikalt, intrakutant, intravenøst eller intramuskulært. Et injeksjons-preparat kan formuleres ved oppløsning, oppslemming eller emulgering av den immunoundertrykkende substansen i et vandig eller ikke-vandig oppløsningsmiddel, slik som en vegetabilsk olje, et syntetisk glyserid med en fettsyre, en ester av en høyere fettsyre eller propylenglykol, ved en kjent fremgangsmåte. Om ønskelig kan et konvensjonelt additiv, slik som et oppløsningsmiddel, et osmoregulerende middel, et emulgeringsmiddel, et stabiliserende middel eller et konserveringmiddel tilsettes til preparatet.

Ved formulering av den immunoundertrykkende substansen til løsninger, suspensjoner, siruper eller eliksirer, kan et farmasøytisk akseptabelt oppløsningsmiddel, slik som sterilisert vann, for injeksjon eller en normalisert fysiologisk saltholdig opp-løsning anvendes.

For perkutan administrering kan den immunoundertrykkende forbindelsen administreres i form av salver, emulgeringer, pastaer, plastre, salver, kremer, suspensjoner i henhold til tilstanden til huden som skal behandles.

Salvene kan formuleres ved kjente fremgangsmåter ved elting av den immunoundertrykkende substansen med en hydrofob base, slik som vaselin eller parafin, eller hydrofil base, slik som hydrofil vaselin eller makrogol. Emulgeringsmidlene og andre perkutane midler kan formuleres ved en fremgangsmåte som anvendes konvensjonelt.

For rektal administrering kan en stikkpille anvendes. Stikkpillen kan fremstilles ved blanding av den immunoundertrykkende forbindelsen med en eksipiens som kan smeltes ved kroppstemperatur, men som er fast ved romtemperatur, slik som kakaosmør, karbonvoks eller polyetylenglykol, og male det resulterende materialet ved en kjent fremgangsmåte.

For intraokulær administrering kan øyepreparater administreres, slik som øyedråper eller øyesalver. Øyedråpene formuleres ved oppløsning eller oppslemming av den immunosuppressive substansen i et vandig oppløsningsmiddel, slik som sterilisert vann, og om nødvendig ved tilsetting av et konserveringsmiddel, en buffer, og et overflateaktivt middel.

Doseringen av den immunoundertrykkende substansen kan hensiktsmessig settes eller tilpasses i henhold til en administreringsform, en administreringsrute, graden eller stadiet av en målsykdom, og lignende. I tilfelle av oral administrering kan f eks en dosering av den immunoundertrykkende substansen settes til 1-100 mg/kg kroppsvekt/ dag, fortrinnsvis 1-10 mg/kg kroppsvekt/dag. I tilfellet av administrering ved injeksjon kan en dosering av den immunoundertrykkende substansen settes til 1-50 mg/kg kroppsvekt/dag, mer foretrukket 1-5 mg/kg kroppsvekt/dag. I tilfelle av perkutan administrering kan en dosering av den immunoundertrykkende substansen settes til 1-100 mg/kg kroppsvekt/dag, mer foretrukket 1-10 mg/kg kroppsvekt/dag. I tilfelle av rektal administrering kan en dosering av den immunoundertrykkende substansen settes til 1-50 mg/kg kroppsvekt/dag, mer foretrukket 1-5 mg/kg kroppsvekt/dag. I tilfelle av intraokulær administrering kan omtrent en 0,01-3 % oppløsning av den immunoundertrykkende substansen påføres dråpevis til et øye flere ganger per dag. Imidlertid er doseringene ikke begrenset til disse.

Eksempler

Den foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives i form av dens eksempler.

Eksempel på syntetisering av et sulfokinovosyldiacylglyserol-(3-derivat beskrives nedenfor, som et eksempel på den aktive ingrediensen anvendt i den immunoundertrykkende substansen.

Eksempel 1

Rute a: 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glukopyranosylbromid (II)

Til 400 ml eddiksyreanhydrid tilsettes 2,4 ml 60 % perklorsyre dråpevis ved 0 °C. Etter at løsningen ble returnert til romtemperatur, ble 100 g (0,56 mol) D-glukose tilsatt til løsningen under røring i omtrent 30 minutter, mens løsningstemperaturen ble holdt ved 30-40 °C. Etter at reaksjonsløsningen var blitt kjølt til 20 °C, ble 30 g (1,0 mol) rødt fosfor tilsatt. Mens løsningstemperaturen ble opprettholdt ved 20 °C eller mindre, ble 180 g (2,3 mol) brom og deretter 36 ml vann tilsatt dråpevis. Den resulterende blandingen ble tillatt oppbevart ved romtemperatur i 2 timer, og deretter ble 300 ml kald kloroform tilsatt til blandingen. Reaksjonsløsningen ble filtrert gjennom en trakt med glassvatt plassert i bunnen. Filtratet ble helt over i kaldt vann (800 ml), og et kloroform-lag ble separert ved hjelp av en skilletrakt. Vannlaget ble ekstrahert med 50 ml kloroform. Kloroformlagene ble kombinert og vasket med kaldt vann (300 ml). Det resulterende kloroformlaget ble helt over i 500 ml mettet natriumhydrogenkarbonat-løsning, ristet tilstrekkelig i en skilletrakt. Det resulterende kloroformlaget ble samlet, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum hvilket ga en krystallinsk forbindelse. Den oppnådde krystallinske forbindelsen ble pulverisert i en morter sammen med en oppløsning av petroleter (2:1) og filtrert fra. Den uforedlede krystallinske forbindelsen ble tørket under vakuum og rekrystallisert med kald diisopropyleter. Som et resultat ble et rent krystall oppnådd (utbytte: 152,6 g, 0,37 mol, gjenvinning: 66,7 %).

Smeltepunkt: 88-90 °C. Rf-verdi: 0,338 (heksametylacetat = 4:1)

Rute: b: 2,3,4,6-tetra-O-aceryl-1-0-(2-propenyl)-p-D-glukose (III)

I 100 ml allylalkohol ble 16,7 g (40,6 mmol) av forbindelsen (II) løst, og 10,0 g (39,6 mmol) kvikksølvcyanid ble tilsatt dertil. Den resulterende blandingen ble rørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonsløsningen ble konsentrert under vakuum, ristet sammen med 100 ml kloroform og kaldt vann i en skilletrakt for å tillate kloroformlaget å separere. Etter at kloroformlaget var tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum, ble den resulterende sirupen løst i kald diisopropyleter. Til den resulterende løsningen ble en liten mengde kimkrystall tilsatt og plassert under iskjølte betingelser. Som et resultat ble det oppnådd et krystall (utbytte: 12,6 g, 32,5 mmol, gjenvinning: 80 %).

Smeltepunkt: 77-81 °C, Rf-verdi: 0,282 (benzemetylacetat = 4:1)

Rute c: l-0-(2-propenyl)-p-D-glukose (IV)

Forbindelsen (III) (30,3 g, 78,1 mmol) ble løst i 120 ml metanol. Til løsningsblandingen ble en liten mengde 28 % natriummetoksid i metanol tilsatt dråpevis under røring. Reaksjonsblandingen ble omsatt ved romtemperatur i 4 timer, nøytralisert med 0,1 N saltsyre, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum og renset ved hurtig silikagelkromatografi (kloroform:metanol = 4:1). Som et resultat ble en fargeløs og gjennomskinnelig oljeaktig forbindelse oppnådd (utbytte: 15,8 g, 71,8 mmol, gjenvinning: 91,9 %). Rf-verdi: 0,407 (kloroform:metanol = 4:1)

Rute d: l-0-(2-propenyl)-6-0-tirfenylmetyl-P-D-glukose (V)

Forbindelse (IV) (15,8 g, 71,8 mmol) ble løst i 120 ml vannfri pyridin. Til løsningen ble 23,4 g (83,9 mmol) tritylklorid og 0,1 g (0,82 mmol) p-dimetylamino-pyridin (DMAP) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omsatt i 36 timer ved romtemperatur under omrøring. Deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 300 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (3 x 300 ml). De resulterende organiske lagene ble kombinert, nøytralisert med 1,0 N saltsyre til pH 4, vasket med saltoppløsning (2 x 300 ml), tørket over vannfritt natriumfosfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset ved hurtig silikagelkromatografi (diklormetammetanol = 20:1). Som et resultat ble en blek, gulaktig, oljeaktig forbindelse oppnådd (utbytte: 28,7 g, 62,1 mmol, gjenvinning: 86,5 %). Rf-verdi: 0,306 (kloroform:metanol = 19:1).

Rute e: 2,3,4-tri-O-benzyl-l-0-(2-propenyI)-6-0-trifenylmetyl-p-D-glukose (VI)

80 % natriumhydrid (3,2 g, 133 mmol), dispergert i en mineralolje, ble overført til et reaksjonsrør, og tilstrekkelig vasket med vannfritt heksan (50 ml). Etter at heksanet var fjernet ble 14,2 g (30,7 mmol) som var oppløst i tørr 1,1-dimetylformamid, tilsatt gradvis til den resulterende suspensjon under iskjølte betingelser. Etter 15 minutter ble reaksjonsblandingen returnert til romtemperatur og reaksjonen ble utført i én time under røring.

Like etter ble igjen 21,6 g (126 mmol) benzylbromid tilsatt gradvis til reaksjonsblandingen under iskjølte betingelser. Etter 15 minutter ble reaksjonsblanding returnert til romtemperatur, og omsatt i 3 timer under røring. Deretter ble 20 ml metanol og 30 ml kaldt vann tilsatt til reaksjonsblandingen for å stanse reaksjonen. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat (3 x 50 ml). De organiske lagene ble kombinert, vasket med saltoppløsning (2 x 100 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum og renset ved hurtig silikagelkromatografi (heksan: etylacetat =10:1). Som et resultat ble en blek, gulaktig, oljeaktig forbindelse oppnådd (utbytte: 21,6 g, 29,5 mmol, gjenvinning: 96,1 %).

Rf-verdi: 0,410 (heksametylacetat = 4:1)

Rute f: 2,3,4,-tri-O-benzyl-l-0-(2-prepenyl)-p-D-glukose (VII)

Forbindelse (VI) (21,6 g, 29,5 mmol) ble løst i 150 ml metanol og 2,80 g (14,7 mmol) p-toluensulfonsyremonohydrat ble tilsatt. Løsningen ble omsatt over natten under røring. Deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 100 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (3 x 200 ml). De organiske lagene ble kombinert, vasket med saltoppløsning (2 x 300 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset ved hurtig silikagelkromatografi (heksan:etylacetat = 4:1). Som et resultat ble et hvitt, krystallinsk substrat oppnådd (utbytte 9,0 g, 18,4 mmol, gjenvinning 62,4 %).

Smeltepunkt: 80-82 °C,

Rf-verdi: 0,338 (heksametylacetat = 4:1)

[a] = +0,4 (c 5,50 CHC13)

'H-NMR (300 MHz, CDCI3+TMS, 8); 7,36-7,23 (15H, m, Ar) 6,02-5,89 (1H, m,

-CH=CH2), 5,34 (1H, dd, J=l,5 & 17,2, -CH=CH2), 5,22 (1H, dd, J=l,4 &10,4, -CH=CH2), 4,95 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,94 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,86 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,81 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,73 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,64 (1H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,50 (1H, d, J=7,8, H-l), 4,43-4,13 (2H, m, -0-CH2-CH=CH2), 3,88-3,34 (6H, m, H-2 & H-3 & H-4 & H-5 & H-6a,b)

Rute g: 2,3,4-tri-O-benzyl-l-0-(2-propenyl)-6-0-(4-tolylsulfonyl)-p-D-glukose (VIII)

9,80 g (20,0 mmol) av forbindelsen (VII) løst i 200 ml vannfritt pyridin, og deretter ble 24,4 mg (0,2 mmol) DMAP og 11,4 g (60,0 mmol) p-toluensulfonylklorid tilsatt. Løsningen ble omsatt ved romtemperatur over natten under røring. Deretter ble

reaksjonen stoppet ved tilsetning av 300 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (3 x 200 ml). De resulterende organiske lagene ble kombinert, nøytralisert til pH 4 med 1,0 N og 0,1 N saltsyre, vasket med saltoppløsning (2 x 300 ml), tørket over vannfritt natrium-

sulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset ved hurtig silikagelkromatografi (heksametylacetat = 4:1). Som et resultat ble en hvit krystallinsk substans oppnådd (utbytte: 9,00 g, 14,0 mmol, gjenvinning 70,0 %).

Smeltepunkt: 111-112 °C, Rf-verdi: 0,295 (heksan:etylacetat = 4:1).

<*>H NKR (300 MHz, CDC13+ TMS, □); 7,77 (2H, d, J=8,2, H at Ts Me), 7,31-7,25 (15H, m Ar), 7,19-7,16 (2H, m, H at Ts S02), 5,98-5,85 (1H, m, -CH=CH2), 5,35-5,19 (2H, m, -CH=CH2), 4,92 (2H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,81 (1H, d, J=10,8, Ar-CH2), 4,75 (1H, d, J=10,9, Ar.CH2), 4,68 (2H, d, J=10,9, Ar-CH2), 4,48 (1H, d, J=10,8, Ar-CH2), 4,39 (1H, d, J=7,8, H-l), 4,34-3,38 (8H, m, H-2 & H-3 & H-4 & H-5 & H-6a,b & ;-0-CH2-CH=CH2), 2,42 (3H, s, Ts CH3) ;;Rute h: 2,3,4-tri-0-benzyl-l-O-(2-propenyl)-6-deoksy-6-acetyltio-P-D-gIukose (IX) ;9,00 g (14,0 mmol) av forbindelsen (VIII) ble løst i 250 ml vannfri etanol, og deretter ble 4,80 g (42,0 mmol) kaliumtioacetat tilsatt. Løsningen ble omsatt med tilbakeløp i 3 timer under røring. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 300 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (3 x 200 ml). De organiske lagene ble kombinert, vasket med saltoppløsning (2 x 300 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, renset ved hurtig silikagelkromatografi (heksametylacetat = 10:1). Som et resultat ble en hvit krystallinsk substans oppnådd (utbytte: 6,60 g, 12,0 mmol, gjenvinning: 85,7 %). Smeltepunkt:70-73 °C, Rf-verdi: 0,295 (heksametylacetat = 4:1). ;[a]D = +26.7(c 0.75, CHCI3) ;<1>h NMR (300MHz, CDCI3+TMS, 5) ;7.35-7.25 (15H, m, ;Ar), 6.00-5.89 (1H, m, -CH=CH2), 5.35 (1H, dd, J=1.5 &;17.2, -CH=CH2), 5.22 (1H, dd, J=1.3 & 10.4, -CH=CH2), ;4.95 (1H, d, J=10.9, Ar-CH2), 4.93 (1H, d, J=10.8, ;Ar-CH2), 4.87 (1H, d, J=10.8, Ar-CH2), 4.78 (1H, d, ;J=10.9, Ar-CH2), 4.71 (1H, d, J=10.9, Ar-CH2), 4.63 (1H, ;d, J=10.7, Ar-CH2), 4.42 (1H, d, J=7.9, H-l), 4.37-3.33 ;(7H, m, H-2 & H-3 & H-4 & H-5 & H-6a & -0-CH2-CH=CH2), ;2.96 (1H, dd, J=6.9 & 13.6, H-6b) , 2.34 (3H, s, ;SCOCH3) ;;Rute i: 3-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-6-deoksy-6-acyltio-P-D-glukopyranosyl)-glyserol (X) ;Forbindelse (IX) ble oppløst i en blanding av t-butanol: H20 (4:1), 3,30 g (6,02 mmol), og deretter ble 1,34 g (12,1 mmol) trimetylamin-N-oksiddihydrat og 1,7 ml 0,04 M løsning av osmiumtetraoksid i t-butanol tilsatt. Løsningen ble omsatt ved romtemperatur i 3 dager under røring. Deretter ble 5,8 g aktivert trekull tilsatt, og reaksjonsblandingen ble deretter tillatt oppbevart under røring i 1,5 time. Etter filtrering med sug, ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 250 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (3 x 200 ml). De organiske lagene ble kombinert, vasket med saltoppløsning (2 x 300 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset med hurtig silikagelkromatografi (heksan:etylacetat = 1:1). Som et resultat ble en hvit krystallinsk substans oppnådd (utbytte: 1,79 g, 3,08 mmol), gjenvinning 51,2 %). Smeltepunkt: 91-93 °C, Rf-verdi: 0,112 (heksametylacetat = 1:1), ;[ a]D = +18.0 (c 0.75, CHCI3) ;<1>h NMR (300MHz, CDCI3+TMS, 5) ;7.35-7.25 (15H, m, ;Ar), 4.94-4.61 (6H, m, Ar-CH2), 4.38 (0.5H, d, J=7.8, ;H-1(R or S)), 4.37 (0.5H, d, J=7.8, H-1(R or S)), 3.83-3.37 (7H, m, H-2 & H-3 & H-4 & H-5 & H-6a & -0-CH2-CH=CH2), 2.96 (1H, dd, J=6.9 & 13.6, H-6b), 2.34 (3H, s, ;SCOCH3) ;;Rute j: 3-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-6-deoksy-6-acetyltio-p-D-glukopyranosyl)-l,2-di-0-stearoylglyserol (XI) ;1,23 g (2,12 mmol) av forbindelsen (X) ble løst i 100 ml diklormetan, og deretter ble 1,30 g (6,79 mmol) l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydroklorid (EDO), 260 mg (2,13 mmol) DMAP, og 1,75 (6,15 mmol) stearinsyre tilsatt. Løsningen ble omsatt ved romtemperatur i én dag under røring. Deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 100 ml diklormetan, vasket med saltløsning (2 x 50 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset ved hurtig silikagelkromatografi (heksametylacetat = 10:1 —> 8:1). Som et resultat ble en hvit ikke-krystallinsk fast substans oppnådd (utbytte: 2,10 g, 1,88 mmol, gjenvinning: 88,7 %). Rf-verdi: 0,487 ((heksametylacetat = 4:1) ;[a]D = -21.3 (c 0.15, CHCI3) ;<!>H NMR (300MHz, CDC13+TMS, 5) ;7.34-7.26 (15H, m, ;Ar), 5.28(1H, m, Gly-H-2), 4.92-4.60 (6H, m, Ar-CH2), ;4.36 (0.5H, d, J=7.7, H-1(R or S)), 4.35 (0.5H, d,_ ;J=7.8, H-1(R or S)), 4.25-2.96 (10H, m, H-2 & H-3 & ;H-4 & H-5 & H-6a, b & Gly-H-la, b & Gly-H-3a, b), 2.37 ;(1.5H, s, SCOCH3(R or S)), 2.35 (1.5H, s, SCOCH3(R or S)), 2.32-2.24(4H, m, OCOCH2), 1.65-1.58 (4H, m, ;OCOCH2CH2), 1.25 (56H, br, -CH2-), 0.88 (6H, t, J=6.3, ;<C>M3) ;;Rute k: 3-0-(2,3,4-tri-O-benzyl-6-deoksy-6-suIfo-p-D-glukopyranosyl)-l-2-di-O-stearoylglyserolnatriu msalt (XII) ;1,24 g (1,11 mmol) av forbindelsen (XI) ble løst i 50 ml eddiksyre, og deretter ble 1,5 g kaliumacetat og 1,55 g OXONE (2KHS05, KHSO4, K2S04) tilsatt. Løsningen ble omsatt over natten ved romtemperatur under røring. Deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 100 ml kaldt vann, og ekstrahert med etylacetat (5 x 50 ml). De organiske lagene ble kombinert, nøytralisert med mettet natriumhydrogenkarbonat (2 x 100 ml), vasket med saltløsning (2 x 100 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert, konsentrert under vakuum, og renset ved hurtig silikagelkromatografi (kloroform:metanol = 20:1 —> 15:1). Som et resultat ble en hvit ikke-krystallinsk fast forbindelse oppnådd (utbytte: 773 mg, 0,677 mmol, gjenvinning: 61,0 %). Rf-verdi: 0,288 (diklormetan:metanol = 10:1), ;[a]D = +4.8° (c 0.17, CHCI3) ;<!>h NMR (300MHz, CDCI3+TMS, 5) ; 7.29-7.16 (15H, m, ;Ar), 5.3K1H, m, Gly-H-2), 4.91-4.56 (6H, m, Ar-CH2), ;4.50 (1H, d, J=7.6, H-l), 4.44-3.03 (10H, m, H-2 & H-3 ;& H-4 & H-5 & H-6a, b & Gly-H-la, b & Gly-H-3a, b), ;2.62(4H, br, OCOCH2), 2.19-2.17 (4H, br, OCOCH2CH2), ;1.49 (4H, br, OCOCH2CH2CH2), 1.25 (52H, br, -CH2-), ;0.88 (6H, t, J=6.3, CH3) ;;<R>101<=R>102=stear°y1 ;Rute 1: 3-0-(6-deoksy-6-sulfo-p-D-gIukopyranosyl)-l,2-di-O-stearoylglyserolnatriumsalt (XIII) ;773 mg (0,677 mmol) av forbindelsen (XII) ble løst i 50 ml etanol, og deretter 2,00 g 10% palladiumaktivert karbon (Pd-C) tilsatt. Etter at atmosfæren i flasken ble erstattet med hydrogen, ble løsningsblandingen omsatt ved romtemperatur over natten under røring. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert med sug under anvendelse av "celite", konsentrert under vakuum, renset ved hurtig silikagelkromatografi (kloroform:metanol = 10:1 —»■ kloroform:metanol:vann = 70:30:4). Som et resultat ble en hvit ikke-krystallinsk fast substans oppnådd (utbytte: 311 mg, 0,356 mmol, gjenvinning: 52,6 %). Rf-verdi: 0,402 (kloroform:metanol:vann = 65:25:4), [a]D = -3,6 °C (c 0,59, CHCI3: CH3OH:H20 = 70:30:4). ;<*>H NMR (300MHz, CDCI3+TMS, 5) ; 5.28(1H, m, Gly-H-2), 4.32 (1H, d, J=7.7, H-l), 4.27-3.11 (10H, m, H-2 &

H-3 & H-4 & H-5 & H-6a, b & Gly-H-la, b & Gly-H-3a, b),

2.36-2.30 (4H, m, 0COCH2), 1.60 (4H, m, OCOCH2CH2), 1.27

(56H, br, -CH2-), 0.89 (6H, t, J=6.4, CH3)

<R>l01<=R>102=stear°y1

Analyse 1

Blandet lymfocyttreaksjon

Lymfocytter som tjener som stimulatorceller og responderceller, ble fremstilt fra blod tatt fra individuelle friske personer.

Respondercellene ble videre separert fra lymfocyttcellene, hvilket ga T-lymfocytter alene.

Det ble ikke anvendt noen behandling på respondercellene. 10<6>/ml stimulatorceller ble behandlet med 10 ug/ml mitomycin C for å stoppe celleveksten. Deretter ble stimulatorcellene vasket med PBS (fosfatbufret saltoppløsning) 4 ganger. Deretter ble respondercellene inokulert i en mengde på IO<5> celler per brønn, og deretter ble testsubstansene (forbindelsene SQAG 3, SQAG 5, SQAG 7 og SQAG 9 angitt i tabell 1 nedenfor) tilsatt til en på forhånd bestemt konsentrasjon. Reaksjonsblandingen ble dyrket ved 37 °C i én time. Deretter ble stimulatorcellene tilsatt i en mengde på IO<5> celler per brønn. Blandingen ble dyrket i en C02-inkubator ved 37 °C i 4 dager. Etter inkubering ble respondercellenes prolifereringsevne kvantifisert som følger. Først ble [<3>H]-tymidin tilsatt til respondercellene, og inkorporert i cellekjernen ved dyrking av cellene i 12 timer. Så ble mengden av [<3>H]-tymidin-opptak i cellene bestemt med en scintillasjonsteller.

Resultatene er vist i fig. 1-4.

Fig. 1-4 viser mengdene av [<3>H]-tymidin-opptak når SQAG 3, SQAG 5, SQAG 7 og SQAG 9 er tilsatt. Jo lavere mengde [<3>H]-tymidin-opptak, jo høyere immunoundertrykkende aktivitet. I hver av fig. 1-4 indikerer den vertikale aksen radioaktivitetsintensiteten, og den horisontale aksen indikerer konsentrasjonen av testforbindelsen.

Det er tydelig fra fig. 1-4 at alle testforbindelsene har signifikante immunoundertrykkende aktiviteter. Spesielt har SQAG 9 en betydelig høyere immunoundertrykkende aktivitet enn andre forbindelser.

Analyse 2

Test for avstøtning av hudtransplantat

ACI-rotter og LEW-rotter ble klargjort og bedøvet ved inhalasjon av eter. Etter barbering av ryggen på hver ACI-rotte ble en bakre laterale hudlapp (1 x 1 cm) fjernet for å danne et hudflådd sår, og deretter ble en hemostatisk behandling utført. På den annen side ble et stykke hud (lxl cm) oppnådd fra halen til hver LEW-rotte. Donorhuden ble påført det hudflådde såret på hver ACI-rotte, og påsydd med 5-0 nylonsøm. Deretter ble gassbind anvendt på den kirurgisk opererte delen, og et korsett med en gummibandasje ble videre festet derpå for å beskytte det. På den samme måten ble en slik hudtransplanta-sjonsoperasjon anvendt på alle ti ACI-rottene. Av de ti ACT-rottene ble fem rotter tilfeldig utvalgt og klassifisert som en kontrollgruppe, og de gjenværende fem rottene ble klassifisert som en testgruppe, hvortil testforbindelsen administreres. Til kontrollgruppen ble 10 ml fysiologisk saltoppløsning injisert intraperitonealt daglig i fem dager etter kirurgi. Til testgruppen ble 10 ml løsning av SQAG 9 oppløst i fysiologisk saltoppløsning ved en konsentrasjon på 1 mg/ml injisert intraperitonealt daglig i fem dager etter kirurgi på den samme måten som for kontrollgruppen.

På den sjuende dagen etter operasjon en ble et transplantat tatt for å klargjøre en vevsprøve. Deretter ble H-E-farging utført i samsvar med fremgangsmåten til Fujita et al.

(T. Fujita, S. Takahashi, A. Yagihashi, K. Jimbow, N. Sato, Transplantation, vol. 64, 922-925, 1997). Resultatene ble undersøkt histologisk.

Som et resultat av histologisk observasjon ble det bekreftet at det epidermale laget ble fjernet fra lærhuden i alle fem rottene i kontrollgruppen, og at det hadde oppstått nekrose i epidermis. I kontrast til dette ble nekrose i det epidermale laget observert i tre av fem rotter i den SQAG-9-administrerte gruppen. Imidlertid ble det i de gjenværende to rottene observert at enkelte deler av epidermis hadde festet seg til lærhuden med et godt resultat, til tross for at andre deler av det epidermale laget delvis var fjernet fra lærhuden.

De foreliggende oppfinnere betrakter hudtransplantatavstøtningstesten som den mest stringente fremgangsmåten for evaluering av en immunoundertrykkende aktivitet. Det er antatt at avstøtning i størst grad skjer når transplanteringen ble gjort mellom ACI-serien med rotter og LEW-serien med rotter, som anvendt i denne analysen. Imidlertid ble aktiviteten for avstøtningsundertrykking, under slike stringente betingelser, observert i to ut av fem rotter i denne analysen. Dette faktum demonstrerer at SQAG-ene er svært effektive som et immunoundertrykkende middel.

I tillegg var det ingen av rottene som ble administrert med SQAG-er, som døde av akutt toksisitet i løpet av testperioden. Vektreduksjon eller dårlige fysiske betingelser ble heller ikke synlig observert. Intet unormalt ble observert med hensyn til hovedorganer i generelle patologiske tester. Det er derfor demonstrert at de immunoundertrykkende midler har ekstremt lav toksisitet.

Blant de kommersielt tilgjengelige immunoundertrykkende midler, er noen få (f eks FK506) kjent for å være effektive i undertrykking av avstøtning i hudtransplantat-tester. Imidlertid har det hittil ikke blitt rapportert immunoundertrykkende midler som er svært effektive, som samtidig har lav toksisitet.

Claims (9)

1. Anvendelse av i det minste én forbindelse valgt fra gruppen bestående av: forbindelser representert ved formel (1): hvor Ri oi og R102 uavhengig av hverandre er en acylrest av en høyere fettsyre representert ved R-C(=0), hvor R er en alkyl- eller alkenylgruppe med 13 eller flere karbonatomer, og et farmasøytisk akseptabelt salt derav, ved fremstilling av et medikament for undertrykkelse av en immunrespons.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor forbindelsen representert ved formel (1) er representert ved formel (2): hvor Rioi og Ri02 har de samme betydningene som definert for formel (1).

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor bindingen mellom sulfokinovosylresten og glycerylresten i formel (1) er i a-anomer konfigursjon.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, hvor R er en alkylgruppe.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor R har 13 til 25 karbonatomer.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor både R|0i og R102 er CH3(CH2)i4CO-.

7. Anvendelse ifølge krav 5, hvor både Ri01 og R!02 er CH3(CH2)|6CO-.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor R er en alkenylgruppe.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor R har 13 til 25 karbonatomer.