NO328219B1 - Fremgangsmater for a fremstille kotyledonaere furukim. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for å fremstille kotyledonære furukim.

Behovet for furutrær for å fremstille treprodukter fortsetter å øke. En foreslått løsning på dette problemet er å identifisere individuelle trær som har ønskelige egenskaper, så som en rask veksthastighet, og fremstille tallrike genetisk identiske kloner av de overlegne trærne ved somatisk kloning. Disse klonene kan dyrkes for å gi grupper, eller hele skoger, av furutrær som har de ønskede egenskapene.

Én fremgangsmåte for kloning av furutrær anvender in vz/ro-behandling av isolert levende furuvev under betingelser som fremmer dannelsen av furukim, og deretter hele planter, fra det behandlede vevet (US 5036007). Det isolerte furuvevet kan dyrkes i nærvær av et eller flere auksiner, og/eller cytokiner, for å fremme dannelse og multiplikasjon av embryogeniske vev som deretter dyrkes under betingelser som fremmer dannelsen av kotyledonære furukim. Kimene kan deretter spire for å gi furutrær. Et eksempel på furuembryoniske vev er embryonale suspensormasser (ESM'er) som kan dannes, ved vevkultur in vitro, fra furukim dissektert fra furufrø.

Figur 1 viser furu embryonale suspensormasser i flytende kultur. Figur 2 viser et kotyledonært furukim dannet fra ESM (kotyledoner som er synlige ved toppen av embryo).

Optimalisering av somatisk embryo utvikling ved å endre sammensetningen av dyrkningsmediet er kjent innen teknikken. For eksempel har det i "In vitro cellular and developmental plant, vol. 33, nr.3,1997, side 184-189" blitt foreslått å anvende PEG, ABA og KC1 i dyrkningsmediet. Videre er det i "In vitro cellular and developmental plant, vol. 34, nr.l, 1998, side 22-26" foreslått å anvende maltose som karbohydratkilde og PEG som osmotikum i dyrkningsmediet.

Et vedvarende problem er imidlertid å stimulere effektiv dannelse av kotyledonære furukim som er i stand til å spire med høy frekvens for å gi furuplanter. Fortrinnsvis er de kotyledonære furukimene dannet in vitro, morfologisk, anatomisk og biokjemisk like eller identiske, med zygotiske furukim dannet in vivo, i furufrø. Spesielt er det et behov for fremgangsmåter for fremstilling, in vitro, av større antall av zygotisklignende kotyledonære furukim enn hva som fremstilles ved tidligere kjente fremgangsmåter. Fortrinnsvis bør spirefrekvensen og kvaliteten av de kotyledonære furukimene fremstilt ved de nye fremgangsmåtene være høyere enn spirefrekvensen og kvaliteten av kotyledonære furukim fremstilt ved tidligere kjente fremgangsmåter.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for fremstilling av kotyledonære furukim. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir større antall zygotisklignende kotyledonære furukim enn fremstilt ved tidligere kjente fremgangsmåter. I tillegg er spirefrekvensen og kvaliteten av de kotyledonære furukimene fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen høyere enn spiringsrfekvensen og kvaliteten av kotyledonære furukim fremstilt ved tidligere kjente fremgangsmåter.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter hver trinnet med dyrking av embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose for å gi kotyledonære furukim, hvori sakkaridet og glukosen hver er tilstede i mediet en konsentrasjon på mindre enn 3% (dvs. disakkaridet er tilstede i mediet i en konsentrasjon på mindre enn 3%, og glukosen er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%). I noen utførelsesformer omfatter mediet glukose (tilstede ved en konsentrasjon på mindre enn 3%) og minst to disakkarider, hvor den samlede konsentrasjonen av alle disakkaridene i mediet er mindre enn 3%. Mediet kan også omfatte en eller flere absorpsjonsmiddelsammensetninger. Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte trinnet med fremstilling av et eller flere furutrær (for eksempel en populasjon av furutrær) fra de kotyledonære furukimene fremstilt i henhold til oppfinnelsen.

Ved utførelsen av disse utførelsesformer av oppfinnelsen blir det embryogeniske vevet trinnvis dyrket på, eller i, en serie på mer enn to medier, hvorav minst et omfatter et disakkarid og glukose som hver er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%. Mediet som omfatter et disakkarid og glukose er tilpasset for å fremme utviklingen og modningen av kotyledonære kim fra embryogenisk vev.

I visse utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig fremgangsmåter for fremstilling av kotyledonære furukim, fremgangsmåtene innbefatter hver trinnene med: (a) dyrking av embryogenisk furuvev (så som furuembryonale suspensormasser) på,

eller i, et opprettholdelsesmedium; og

(b) dyrking av det embryogeniske furuvevet behandlet i henhold til trinn (a) på

utviklingsmedium omfattende et disakkarid og glukose for å danne kotyledonære furukim, hvor disakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet i en konsentrasjon på mindre enn 3%. Utviklingsmediet kan eventuelt omfatte en absorberende sammensetning. Fremgangsmåtene ifølge dette trekket ved

oppfinnelsen kan eventuelt omfatte trinnet med dyrking av furuvev, på eller i, et initieringsmedium for å gi embryogenisk furuvev, som deretter dyrkes på, eller i, et vedlikeholdsmedium som angitt i trinn (a).

Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige, for eksempel, for fremstilling av kotyledonære furukim som kan karakteriseres videre, så som ved genetiske eller biokjemiske fremgangsmåter, og/eller kan spires for å gi små furuplanter som kan vokse til modne furutrær, om dette er ønskelig. Følgelig kan for eksempel fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille kloner av individuelle furutrær som har en eller flere ønskelige egenskaper, så som rask veksthastighet eller forbedret trekvalitet. For eksempel kan de kotyledonære furukimene ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille grupper, eller skoger, av furutrær som har en eller flere ønskelige egenskaper, så som rask vekst av treet eller forbedret trekvalitet. Trærne kan anvendes for å fremstille treprodukter.

Detaljert beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser furuembryonale suspensormasser i flytende kultur.

Figur 2 viser et representativt kotyledonært furukim fremstilt ved å anvende fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (kotyledoner er synlige ved toppen av kimet).

Detaljert beskrivelse av foretrukket utførelsesform

Med mindre de spesifikt er definert her har alle betegnelser anvendt i denne beskrivelse samme betydning som de ville ha for fagmannen på feltet for foreliggende oppfinnelse.

Som anvendt her betyr betegnelsen " kotyledonært kim" et kim som har en eller flere kotyledoner.

Betegnelsen "disakkarid" refererer til karbohydrater som er sammensatt av to monosakkairdrester. Representative eksempler på disakkarider omfatter maltose, sukrose, laktose, cellobiose, isomaltose, gentiobiose, laminarabiose, chitobiose, xylobiose, inulobiose, mannobiose, hyalobiouronsyre, kondrosin og cellobiouronsyre,

Slik betegnelsen her anvendes refererer "embryogenisk vev" til et hvilket som helst vev, avledet fra en plante av familien Pinacea, som er i stand til å produsere ett eller flere kotyledonære furukim når det behandles ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Følgelig omfatter betegnelsen " embryogenisk vev" for eksempel furuembryonale suspensormasser.

Med mindre annet er angitt er alle konsentrasjons verdier som er uttrykt som prosenter vekt pr. volumprosenter.

Ifølge et trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av kotyledonære furukim. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter alle trinnet med dyrking av embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose for å gi kotyledonære furukim, hvor disakkaridet og glukosen er tilstede i mediet en konsentrasjon på mindre enn 3%.

I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse er minst 50% (så som minst 60%, eller så som minst 70, eller så som minst 80%, eller så som minst 90%) av de kotyledonære furukimene som fremstilles zygotelignende (dvs. har samme morfolgiske trekk og fysiologiske egenskaper som zygotiske kotyledonære furukim ved det samme stadium av utvikling). I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er følgelig fra 50% til 100% (så som fra 60% til 90%, eller så som fra 70% til 80%) av de kotyledonære furukimene som fremstilles zygotelignende.

Typisk har kotyledonære furukim, fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, hver en eller flere av de følgende egenskapene: kimene er lengere (typisk ved 0,5 mm til 1,0 mm) enn kim som behandles identisk, bortsett fra at glukose og/eller et disakkarid ikke er tilstede i dyrkningsmediet ved en konsentrasjon mindre enn 3%; kimene omfatter hver fra 8 til 12 kotyledoner; og kimene behandlet ifølge foreliggende oppfinnelse utvikles raskere enn kim som behandles identisk, bortsett fra at glukose og/eller et disakkarid ikke er tilstede i dyrkningsmediet ved en konsentrasjon større enn 3% (for eksempel i visse utførelsesformer utvikler kim fremstilt ifølge oppfinnelsen seg i løpet av 9 uker).

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å fremstille kotyledonære kim av et hvilket som helst medlem av familien Pinacea, så som medlemmer av slekten Pinus, så som Loblolly furu (Pinus taeda).

Et eksempel på embryogenisk vev som er nyttig ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse er embryonale suspensor masser (ESMS'er). ESM'er kan fremstilles fra prekotyledonære kim fjernet fra furufrø. Frøene blir typisk overflatesterilisert før de pre-kotyledonære kimene fjernes som deretter dyrkes på, eller i, medium som tillater dannelse av ESM'er som omfatter kim i tidlig stadium i fremgangsmåten for formering ved knoppdannelse og spaltning. Mediet kan, om ønsket, omfatte hormoner som stimulerer formering ved kim av tidlig stadium. Eksempler på hormoner som kan innbefattes i mediet er auksiner (for eksempel 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (2,4-D)) og cytokiner (for eksempel 6-benzylaminopurin (BAP)). Auksiner kan for eksempel anvendes ved en konsentrasjon på fra 1 mg/l til 200 mg/l. Cytokiner kan for eksempel anvendes i en konsentrasjon på fra 0,1 mg/l til 10 mg/l. Et eksempel på et medium som er nyttig for dyrking av furu prekotyledonære kim for å indusere dannelse av ESM'er er medium BMi angitt i eksempel 1 nedenfor.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter hver trinnet med dyrking av embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose for å gi kotyledonære furukim, hvor disakkaridet og glukosen hver er tilstede ved en konsentrasjon på mindre enn 3% (så som mindre enn 2,9%, eller så som mindre enn 2,8%, eller så som mindre enn 2,7%, eller så som mindre enn 2,6%). I visse utførelses-former av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er disakkaridet og glukosen hver tilstede i mediet ved en konsentrasjon fra 1% til 2,5%. I noen utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er disakkaridet og glukosen hver tilstede i mediet i en konsentrasjon på fra 2% til 2,5%. I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er disakkaridet tilstede i mediet ved en konsentrasjon på 2,5%, og glukosen er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på 1%. I noen utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter mediet glukose og minst to disakkarider, hvor konsentrasjonen av glukose i mediet er mindre enn 3%, og den samlede konsentrasjonen av alle disakkaridene i mediet er fra 1% til 2,5%. I noen utførelses-former av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen omfatter mediet glukose og minst to disakkarider, hvor glukosen er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%, og den samlede konsentrasjonen av alle disakkaridene tilstede i mediet er fra 2% til 2,5%.

I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen dyrkes embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose, hver ved en konsentrasjon på mindre enn 3%, i et tidsrom på fra 6 uker til 12 uker, så som fra 8 uker til 12 uker, eller så som fra 9 uker til 11 uker. I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen dyrkes embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose, hver ved en konsentrasjon på mindre enn 3%, ved en temperatur på fra 20°C til 24°C, så som fra 21°C til 24°C.

Mediet som omfatter et disakkarid og glukose kan også inneholde næringsstoffer (for eksempel salter) som underholder det inkuberte plantevevet, og ett eller flere midler for justering av osmolaliteten av mediet til innenfor det ønskede området. For eksempel kan osmolaliteten av mediet være fra 250 mM/kg til 450 mM/kg, så som fra 250 mM/kg til350mM/kg. pH av mediet kan også justeres til en ønsket verdi. For eksempel kan pH av mediet være fra 4,5 til 6,5, så som fra 5,0 til 6,0.

Mediet omfattenede et disakkarid og glukose kan være et flytende medium eller et fast medium. Når et flytende medium anvendes plasseres det embryogeniske vevet typisk på en absorberende bærer (for eksempel filterpapir) som er gjennombløtt i det flytende mediet. Når et fast medium anvendes kan det embryogeniske vevet plasseres på overflaten av mediet, og kan delvis penetrere overflaten av det faste mediet. Følgelig kan faste medier omfatte medier som er delvis størknet og tillater det embryogeniske vevet i det vesentlige å penetrere inn i bulken av mediet, og omfatter også fullstendig størknede medier som ikke tillater det embryogeniske vevet å penetrere bulken av det størknede mediet. Flytende medier kan størknes helt eller delvis ved tilsetning av en egnet mengde av et gelleringsmiddel, så som agar eller gelrite.

Det er funnet at innbefatningen av en absorberende sammensetning i mediet, som omfatter et disakkarid og glukose, ytterligere fremmer fremstillingen av et høyt utbytte av kotyledonære furukim som har forbedret spiringsfrekvens og kvalitet. Den absorberende sammensetningen kan være en hvilken som helst sammensetning som ikke er toksisk for det embryogeniske vevet ved konsentrasjonen anvendt ved utførelsen av foreliggende fremgangsmåter, og som er i stand til å absorbere vekstfremmende hormoner, og toksiske forbindelser fremstilt av plantecellene under kimutvikling, som er tilstede i mediet. Følgelig er det absorberende hormonet (hormonene) ikke lenger i stand til å fremme veksten av det embryogeniske vevet i, eller på, mediet, og de absorberte toksinene kan ikke i negativ retning påvirke plantecellene. I denne forbindelsen omfatter betegnelsen "absorberende" en hvilken som helst kjemisk eller fysisk interaksjon mellom den absorberende sammensetningen og et eller flere vekstfremmende hormoner, og/eller toksiner, i mediet, slik at det (de) vekstfremmende hormonet (hormonene) og/eller toksinene, er bundet til den absorberende sammensetningen.

I visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen inkuberes følgelig det embryogeniske vevet i, eller på, et medium som omfatter vekstfremmende hormoner, så som auksiner og/eller cytokiner, for å fremme formering av det embryogeniske vevet. Når tilstrekkelig embryogeniske vev er oppnådd kan det embryogeniske vevet deretter overføres til medium som ikke omfatter vekstfremmende hormoner, men omfatter et disakkarid og glukose og, eventuelt, en eller flere absorberende sammensetninger. De absorberende sammensetningene binder vekstfremmende hormoner tilstede i mediet slik at formeringshastigheten av det embryogeniske vevet reduseres, eller formeringen stoppes fullstendig, og disakkaridet og glukosen induserer fremstilling av furu-kotyledonære kim fra det embyrogeniske vevet.

Eksempler på nyttige absorpsjonsmiddelsammensetninger omfatter aktivert trekull, oppløselig poly(vinyl pyrrolidon), uoppløselig poly(vinyl pyrrolidon), aktivert aluminiumoksid og silikagel. Den absorberende sammensetningen kan være tilstede i en mengde, for eksempel, på fra 0,01 g/l til 5 g/l. I noen utførelsesformer er den absorberende sammensetning tilstede i en mengde på fra 0,05 g/l til 1 g/l. I disse utførelsesformene av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, hvori mer enn en absorberende sammensetning (for eksempel minst to absorberende sammensetninger) er tilstede i mediet refererer de foregående konsentrasjonsområdene til den samlede konsentrasjonen av absorpsjonsmiddelsammensetningen i mediet.

I utførelsen av visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen blir det embryogeniske vevet trinnvis dyrket på, eller i, en serie av minst to medier, hvorav minst et omfatter et disakkarid og glukose som hver er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%. Mediet som omfatter et disakkarid og glukose er tilpasset for å fremme utviklingen og modningen av kotyledonære kim fra embryogenisk vev, så som embryogenisk vev som er behandlet med ett eller flere veksthormoner. De kotyledonære furukimene har forbedret spiringsfrekvens og kvalitet.

Ved utførelsen av visse utførelsesformer av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen dyrkes for eksempel embryogenisk furuvev (så som ESM) på, eller i, et vedlikeholdsmedium som er tilpasset for å fremme celledeling og vekst av det embryogeniske vev. Vedlikeholdsmediet kan være et fast medium, eller et flytende medium som kan omrøres for å fremme vekst og formering av det embryogeniske vevet deri. Vedlikeholdsmediet kan inneholde næringsmidler som understøtter det embryogeniske vevet og kan omfatte hormoner, så som et eller flere auksiner (for eksempel 2,4-D) og/eller cytokiner (for eksempel kinetin, BAP), som fremmer celledeling og vekst av det embryogeniske vevet. Dersom auksin anvendes kan konsentrasjonen av auksin i vedlikeholdsmediet for eksempel være fra 0,1 mg/l til 10 mg/l (så som fra 0,1 mg/l til 5 mg/l). Dersom mer enn ettt auksin er tilstede i mediet refererer de foregående konsentrasjonsområdene til den samlede auksinkonsentrasjonen i mediet. Dersom cytokin anvendes kan konsentrasjonen av cytokin i vedlikeholdsmediet for eksempel være fra 0,1 mg/l til 2 mg/l (så som fra 0,1 mg/l til 1 mg/l). Dersom mer enn ett cytokin er tilstede i mediet refererer de foregående konsentrasjonsområdene til den samlede cytokinkonsentrasjonen i mediet.

Det er generelt ønskelig, men ikke vesentlig, å innbefatte maltose som den eneste eller viktigste sukkerkilden i vedlikholdsmediet. Maltosen kan være tilstede ved en konsentrasjon på fra 0,5 mg/l til 6 mg/l, så som fra 1 mg/l til 3 mg/l.

Osmolaliteten av vedlikholdsmediet kan justeres til en verdi som faller innenfor et ønsket område, så som fra 100 mM/kg til 250 mM/kg, eller så som fra 100 mM/kg til 200 mM/kg. pH av vedlikeholdsmediet kan også justeres til en verdi innenfor et ønsket område, så som fra 4,5 til 6,5, eller så som fra 5,0 til 6,0. Det embryogeniske vevet inkuberes typisk i, eller på, vedlikeholdsmediet i en temperatur i området på fra 20°C til 24°C, så som fra 21°C til 24°C. Et eksempel på et egnet vedlikeholdsmedium er medium BM2 angitt i eksempel 1 nedenfor.

Det embryogeniske vevet inkuberes i, eller på, vedlikeholdsmediet inntil det embryogeniske vevet er formert i ønsket grad (som bestemt for eksempel ved massen av den dyrkede embryogeniske vevet). Det embryogeniske vevet kan deretter overføres til et utviklingsmedium tilpasset for å fremme utviklingen av høykvalitets kotyledonære furukim. Utviklingsmediet er typisk et fast medium, selv om utviklingsmediet kan være et flytende medium.

Uviklingsmediet omfatter et disakkarid og glukose som hver er tilstede ved en konsentrasjon på mindre enn 3% (så som mindre enn 2,9%, eller mindre enn 2,8%, eller mindre enn 2,7%, eller mindre enn 2,6%). I visse utførelsesformer er disakkaridet og glukosen hver tilstede i utviklingsmediet ved en konsentrasjon på fra 1% til 2,5%. I visse utførelsesformer er disakkaridet og glukosen hver tilstede i utviklingsmediet ved en konsentrasjon på fra 2% til 2,5%.

Utviklingsmediet kan inneholde næringsstoffer (for eksempel salter) som understøtter det embryogeniske vevet. Egnede utviklingsmedier omfatter typisk ikke viltfremmende hormoner, så som auksiner og cytokiner, men kan omfatte hormoner absisinsyre. Når absisinsyre anvendes i utviklingsmediet anvendes det typisk ved en konsentrasjon i området på fra 1 mg/l til 200 mg/l, så som fra mg/l til 100 mg/l. Osmolaliteten av utviklingsmediet kan justeres til en verdi som faller innenfor ønsket område, så som fra 250 mm/kg til 450 mm/kg, eller så som fra 250 mm/kg til 350 mm/kg. pH av utviklingsmediet kan også justeres til en verdi innenfor et ønsket område, så som fra 4,5 til 6,5, eller så som fra 5,0 til 6,0. Det embryogeniske vevet inkuberes typisk i, eller på, utviklingsmediet ved en temperatur i området på fra 20°C til 24°C, så som fra 21°C til 24°C. Et eksempel på et egnet utviklingsmedium er medium BM3 angitt i eksempel 1 heri.

I noen utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen inkuberes det embryogeniske vevet i, eller på, utviklingsmediet i et tidsrom på fra seks uker til 12 uker, så som fra seks uker til ni uker.

I visse utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig fremgangsmåter for fremstilling av kotyledonære furukim, hvor fremgangsmåtene alle omfatter trinnene med: (a) dyrking av embryogeniske furuvev (så som furuembryonale suspensormasser) på,

eller i, et vedlikeholdsmedium; og

(b) dyrking av det embryogeniske furuvevet behandlet i henhold til trinn (a) på, eller i, et utviklingsmedium omfattenede et disakkarid og glukose for å danne kotyledonære furukim, hvor disakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%. Utviklingsmediet kan eventuelt omfatte en absorberende sammensetning. Fremgangsmåtene ifølge dette trekket av oppfinnelsen kan eventuelt omfatte trinnet med dyrking av furuvev i, eller på, et initieringsmedium for å gi embryogeniske furuvev, som deretter dyrkes i, eller på, et vedlikeholdsmedium som angitt i trinn (a). i andre utførelsesformer tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av kotyledonære furukim, hvor fremgangsmåtene hver innbefatter trinnene: (a) dyrking av embryogeniske furuvev (så som furuembryonale suspensormasser) på

fast vedlikeholdsmedium; og

(b) dyrking av det embryogeniske furuvevet behandlet i henhold til trinn (a) i et

flytende vedlikeholdsmedium; og

(c) dyrking av det embryogeniske furuvevet behandlet i henhold til trinn (b) på fast utviklingsmedium omfattenede et disakkarid og glukose, for å danne kotyledonære furukim, hvor disakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet ved en

konsentrasjon på mindre enn 3%. Utviklingsmediet kan eventuelt omfatte en absorberende sammensetning. Fremgangsmåtene ifølge dette trekket av oppfinnelsen kan eventuelt omfatte trinnet med dyrking av furuvev i et initieringsmedium for å gi embryogeniske furuvev, som deretter dyrkes på et vedlikeholdsmedium som angitt i trinn (a).

De kotyledonære furukimene fremstilt ved å anvende fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan eventuelt spires for å danne små furuplanter som kan dyrkes til furutrær, om ønsket. De kotyledonære furukimene kan spires på et fast spiringsmedium, så som medium BM5 angitt i eksempel 1 heri. De spirede plantene kan overføres til jord for ytterligere vekst. For eksempel kan de spirede plantene plantes i jord i et drivhus og tillates å gro før de overføres til et sted utendørs. Typisk belyses de kotyledonære furukimene for å stimulere spiring. Typisk gjennomføres alle trinnene av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, bortsett fra spiring i mørket.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan for eksempel anvendes for å fremstille kloner av individuelle furutrær som har en eller flere ønskede egenskaper, så som rask veksthastighet. Ifølge et trekk tilveiebringer foreliggende oppfinnelse følgelig fremgangsmåter for fremstilling av genetisk identiske, kotyledonære furukim. Fremgangsmåten ifølge dette trekket av oppfinnelsen omfatter alle trinnet med dyrking av genetiske identiske embryogeniske furuvev, i eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose for å gi genetisk identiske, kotyledonære furukim, hvori disakkaridet og glukosen hver er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%.

Eksempel 1

Dette eksemplet viser en representativ metode ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en populasjon av Loblolly furu ( Pinus taeda), kotyledonære kim, og spiring av kimene.

Hunn-gametofytter inneholdende zygotiske kim fjernes fra frø fire til fem uker etter befruktning. Frøskallene fjernes, men kimene skjæres ikke ytterligere ut av den omgivende gametofytten, bortsett fra å skjære ut den nusellære enden. Konusen er lagret ved 4°C inntil anvendelse. Umiddelbart før fjernelse av de umodne kimene steriliseres frøene ved anvendelse av en innledende vasking og detergent behandling etterfulgt av ti minutters sterilisering i 15% H2O2. Eksplantene vaskes grundig med sterilt destillert vann etter hver behandling.

Tabell 1 angir sammensetningene av representative medier nyttige for loblolly furu-embryogenese. Stadium 1 - Induksjon: Sterile gametofytter med intakte kim plasseres på et fast BMi kulturmedium og holdes i et miljø ved 22°C-25°C med en 24 timers mørk fotoperiode i en tid på 3-5 uker. Lengden av tiden avhenger av den spesielle genotypen som dyrkes. Ved slutten av denne tiden dannes en hvit slimet masse i forbindelse med de opprinnelige eksplantene. Mikroskopisk undersøkelse avslører typisk tallrike tidlig-stadiumkim assosiert med massen. Disse er generelt karakterisert som å ha en lang tynn vegg suspensor forbundet med et lite hode med tett sytoplasma og stor kjerne.

Osmolaliteter av induksjonsmediet kan i noen tilfeller være så høy som 170 mM/kg. Normalt er den ca. 160 mM/kg eller sågar lavere (så som 150 mM/kg).

Stadium II - vedlikehold og formerin<g>: Kim fra tidlig trinn fjernet fra massen generert i induksjonstrinnet plasseres først på et BM2 gellert vedlikeholds- og formeringsmedium. Dette adskiller seg fra induksjonsmediet ved at veksthormonet (både auksiner og cytokiner) er redusert med minst en fullstendig størrelsesorden. Osmolaliteter av dette mediet heves typisk fra den av induksjonsmediet til ca. 180 mM/kg eller høyere ved å øke konsentrasjonen av myo-inositol til 0,5% vekt/volum. Temperaturen og fotoperioden er igjen 22°-25°C med 24 timer i mørket. Kim dyrkes 12-14 dager på det BM2 faste mediet før overføring til et flytende medium for ytterligere underdyrking. Dette flytende mediet er av tilsvarende sammensetning, men mangler gelleringsmidlet. Kimene ved slutten av det faste vedlikeholdstrinnet er typisk lignende i utseende med de fra stadium I. Etter 5-6 ukentlige subkulturer på det flytende vedlikeholdsmediet dannes avanserte kim av tidlig stadium. Disse er kjennetegnet ved glatte embryonale hoder, anslått å typisk ha over 100 individuelle celler, med flere suspenderer.

Osmotisk potensial for vedlikeholdsmediet faller typisk innenfor området på ca. 180-400 mM/kg for Pinus taeda. Mest typisk osmotisk potensiale av vedlikeholdsmediet er i nærheten av ca. 1,5 ganger høyere enn det av induksjons- eller formeringsmedia.

Stadium III - kimutvikling: De avanserte tidligstadiums-kimene fra stadium Il-kulturen overført til en filterpapir bærer plassert på en pute mettet med flytende utviklingsmedium. Dette mediet mangler enten veksthormoner fullstendig, eller har dem tilstede bare ved meget lave nivåer og har det samme lave nivået av osmotiske midler som stadier I og II. Maltose og glukose er tilstede. Absesinsyre kan være innbefattet for å lette ytterligere utvikling. En absorberende sammensetning (så som aktivert trekull, oppløselige og uoppløselige former av poly(vinyl pyrrolidon), aktivert aluminiumoksid og silikagel) kan også innbefattes, så som ved en konsentrasjon på ca. 0,1-5 g/l, eller ca. 0,25-2,5 g/l.

De osmotiske potensialer av dette mediet kan heves vesentlig over det av vedlikeholdsmediet. For eksempel kan osmolaliteten være så høy som 350 mM/kg eller sågar høyere. Utvikling utføres fortrinnsvis i fullstendig mørke ved en temperatur på 22°-25°C inntil forlengede kotyledonære kimer er utviklet. Utviklingstid er typisk flere uker, så som 6 til 9 uker.

Kim inkuberes deretter ved 4°C til 10°C i 3 til 4 uker i et medium som ikke omfatter PEG eller AB A (for eksempel medium BM7).

Stadium IV - tørkin<g>: Kimene som fremdeles finnes på fllterpapirbæreren løftes fra puten og plasseres i en lukket beholder over en mettet oppløsning av K2SO4, eller vann, ved en realtiv fuktighet på 97%, i et tidsrom på ca. 3 uker.

Stadium V - spiring: De tørkede kotyledonære kimene fra stadium IV rehydreres ved å plassere dem, mens de fremdeles er på filterpapirbærereren, i ca. 24 timer på en pute mettet med flytende spiringsmedium. Kimene plasseres deretter individuelt på fast BM5 medium for spiring. Dette er et basalt medium som mangler veksthormoner som er modifisert ved å redusere sukrose, myo-inositol og organisk nitrogen. Kimene inkuberes på BM5 medium i ca. 6-8 uker under omgivelsesbetingelser på 23-25°C, og en 16 timers lys-8 timers mørke fotoperiode, inntil de resulterende småplantene har en vel-utviklet rotspire og kimstengel og grønn kotyledonær struktur og epikotyl. Om ønsket kan kotyledonære embryoene videre gjøres til kunstige frø.

På grunn av den reduserte karbohydrat konsentrasjonen er det osmotiske potensialet av spiringsmediet ytterligere redusert utover det av utviklingsmediet. Det er normalt under ca. 150 mM/kg (så som ca. 100 mM/kg).

Stadium VI - omdanning: Småplanter fra stadium V fjernes fra spiringsmediet og plantes i en jord omfattende like deler torv og fin perlitt.

Eksempel 2

Dette eksemplet viser effekten på kimutvikling og spiringsfrekvens av dyrking av Loblolly furu somtiske kim på utviklingsmedium som omfatter en kombinasjon av 2,5% maltose og 1% glukose.

Tre Loblolly furu genotyper ble testet: Genotype A, Genotype B og Genotype C. Embryonale suspensormasser (ESM) av hver genotype ble dyrket i en kolbe inneholdende 1 liter medium BM2. Hver kolbe av ESM ble segmentert i 15 minutter, mediet ble aspirert og de segmenterte cellene ble overført til ny beholder. Et like stort volum av medium BM6 ble tilsatt til cellene som deretter ble tillatt å segmentere i 10 minutter. Halvdelen av BM6 mediet ble fjernet, og 1,5 ml porsjoner av de segmenterte cellene (et celle til BM6 forhold på 1:0,5) ble overført direkte til utviklingsmediet BM3 (omfatter glukose og maltose) og BM4 (omfatter maltose, men ikke glukose), og også til mediet BM2, BM5, BM6 og BM7.

Etter inkubering i 4 uker på utviklingsmedia ble det observert at medium BM3 fremmet fastere utvikling enn medium BM4. De andre mediene viste ingen forskjell fra kontroll-mediet. Etter inkubering i 12 uker på utviklingsmediet var kimene dyrket på en BM3 mediet langt større, lengere og mer like zygotiske kim enn kimene dyrket på BM4 medium. Kimene dyrket på BM3 medium begynte å utvikle kotyledoner etter 8 uker. Kimene dyrket på BM3 medium hadde 8-10 kotyledoner (Genotype A produserte noen kim med 14-16 kotyledoner), som sammenlignet med 4-6 kotyledoner på kim dyrket på BM4 medium. Følgelig ga dyrking av kimene på et utviklingsmedium omfattende maltose og glukose (medium BM3) større kim av bedre kvalitet, med mer kotyledoner og synlige kupler enn de andre mediene. Tabell 2 viser antallet zygotisklignende Loblolly furukim fremstilt på medier BM4 og BM3.

Zygotelignende kim ble valgt fra BM3 og BM4 plater og overført til en Petri-plate inneholdende et filterpapir og en pute mettet med medium BM7. Petri-platene ble forseglet med parafilm og lagret i kald tilstand. Etter 4 uker ble filterpapirene med kim overført til målebroer i Magenta bokser som inneholdt ca. 100 ml vann. Etter 3 ukers tørking boksene ble filterpapirene med kim overført til Petri-plater inneholdende en pute mettet med flytende BM5 medium. Etter 24 timer ble kimene overført til fast BM5 medium i spiringsbokser. Boksene ble etterlatt i mørk tilstand i 1 uke og deretter overført til det lyse rommet.

Kim produsert på BM3 hadde en spiringsfrekvens som var tilnærmet dobbelt spirings-frekvensene av kim produsert på BM4. Videre var kvaliteten av spirene fremstilt fra medium BM3 bedre enn kvaliteten av spirene fremstilt av medium BM4. For genotyper A og B, for eksempel, hadde de bipolare spirene fra medium BM3 rette og tykke kimstengler, og kraftig epikotyl vekst. Derimot hadde bipolare spirer fremstilt fra medium BM4 kurvede, relativt tynne kimstengler.

Claims (28)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av kotyledonære furukim, karakterisert ved at den omfatter trinnet med dyrking av embryogenisk furuvev i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose for å gi kotyledonære furukim, hvor nevnte disakkarid og nevnte glukose hver er tilstede i mediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det embryogeniske furuvevet omfatter embryonal suspensormasser.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 60% av de kotyledonære furukimene omfatter fra 6 til 12 kotyledoner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 70% av de kotyledonære furukimene omfatter fra 6 til 12 kotyledoner.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 80% av de kotyledonære furukimene omfatter fra 6 til 12 kotyledoner.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst 90% av de kotyledonære furukimene omfatter fra 6 til 12 kotyledoner.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at disakkaridet og glukosen hver er tilstede i mediet i en konsentrasjon fra 1% til 2,5.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at disakkaridet og glukosen hver er tilstede i mediet ved en konsentrasjon fra 2% til 2,5%.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet omfatter minst to disakkarider, hvor den totale konsentrasjonen av disakkaridene i mediet er fra 1% til 2,5%.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet omfatter minst to disakkarider, hvor den totale konsentrasjonen av disakkaridene i mediet er fra 2% til 2,5%.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det embryogeniske furuvevet dyrkes i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose i et tidsrom fra 6 uker til 12 uker.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det embryogeniske furuvevet dyrkes i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose i et tidsrom fra 8 uker til 12 uker.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det embryogeniske furuvevet dyrkes i, eller på, et medium omfattende et disakkarid og glukose i et tidsrom fra 9 uker til 11 uker.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at osmolaliteten av mediet omfattende et disakkarid og glukose er fra 250 mM/kg til 450 mM/kg.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved atpH av mediet omfattende et disakkarid og glukose er fra 4,5 til 6,5.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet videre omfatter en absorberende sammensetning.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den absorberende sammensetningen er valgt fra gruppen bestående av aktive trekull, oppløselig poly(vinyl pyrrolidon), uoppløselig poly(vinyl pyrrolidon), aktivert aluminiumoksid, og silikagel.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at den absorberende sammensetningen er aktivert trekull.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at konsentrasjonen av den absorberende sammensetningen er fra 0,01 g/l til 5 g/l.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at konsentrasjonen av den absorberende sammensetningen er fr 0,05 g/l til 1 g/l.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at mediet omfatter minst to absorberende sammensetninger, hvor den samlede konsentrasjonen av absorberende sammensetninger i mediet er fra 0,01 g/l til 5 g/l.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at mediet omfatter minst to absorberende sammensetninger, hvor den samlede konsentrasjonen av absorberende sammensetning i mediet er fra 0,05 g/l til 1 g/l.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kotyledonære Loblolly furukim fremstilles fra Loblolly furu embryogenisk vev.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet er et flytende medium.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet er et fast medium.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av kotyledonære furukim, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) dyrking av embryogeniske furuvev i, eller på, et vedlikeholdsmedium; og (b) dyrking av det embryogeniske furuvevet behandlet i henhold til trinn (a) i, eller på, et utviklingsmedium omfattende glukose og et disakkarid, for å danne kotyledonære furukim, hvori sakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet ved en konsentrasjon på mindre enn 3%.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at disakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet i en konsentrasjon på fra 1% til 2,5%.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at disakkaridet og glukosen hver er tilstede i utviklingsmediet med en konsentrasjon på 2% til 2,5%.