NO328085B1 - Anvendelse av staurosporinderivater for fremstilling av et medikament for behandling av okulaere neovaskulaere sykdommer - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører anvendelsen av staurosporinderivater ved fremstillingen av et medikament for behandling av okulær neovaskulær sykdom f.eks. retinal neovaskularisering og koroidal neovaskularisering.

Netthinnen i øyet mottar dens blodtilførsel fra vaskulære "senger", de retinale karene som forsyner den indre to tredjedelen av retinaen og de koroidale karene som forsyner den ytre tredje delen. Skade på de retinale blodkarene som resulterer i tilstopping av de retinale kapillærer skjer i atskillige sykdomsprosesser inklusiv diabetis retinopati, retinopati ved for tidlig modenhet, forgrenet retinal vene okklusjon og sentral retinal vene okklusjon, de refereres kollektivt til som iskemiske retinopatier. Retinal iskemi resulterer i frigivning av en eller flere angiogenetiske faktorer som stimulerer neovaskularisering. De nye blodkarene bryter gjennom den interne begrensende membranen (ILM) som avgrenser den indre overflaten til retinan og gror langs den ytre overflaten til glasslegemet. De rekruterer mange andre celler og produserer lag av blodkar, celler og ekstracellulær matriks som utøver trekkevne på retina, ofte førende til retinal løsrivelse og kraftig synstap.

Koroidal neovaskularisering skjer i et antall av sykdomsprosesser, den mest vanlige av disse er aldersrelatert makel degenerering. I denne tilstand er makelen som er spesielt tilpasset for akutt og detaljert syn skadet ved gradvis død av fotoreseptor og RPE celler. Dette utgjør den degenererende delen av sykdommen som resulterer i gradvis tap av sentralt syn. Grunnen til at cellene dør er ukjent og det finnes i dag ingen behandling. I det degenereringen skjer er det tendens til at nye blodkar vokser fra koroidet for å invadere under-RPE'en og underretinalområdene. Denne prosessen kalles koroidal neovaskularisering (CNV) og fører ofte til hurtig og kraftig tap av syn fra blødning av arrdannelse. Hvis CNV'en er godt avgrenset og ikke under senteret for foveaen, hvilket er tilfellet for en liten minoritet av pasienter, kan laserbehandling noen ganger hjelpe. Selv når laser innledningsvis er suksessfull er det en høy rate av tilbakevendende CNV og tap av syn. En behandling rettet mot stimuleringen av blodkarvekst er påkrevd og vil hjelpe pasienter med enten retinal eller koroidal neovaskularisering.

US5,093,330 og Thomas Meyer et al. I Int. J. Cancer 43, 851-856 (1989) beskriver forskjellige staurosporinderivater og deres anvendelse protein kinase inhibitorer.

Det er ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebrakt anvendelse av spesifikke staurosporinderivater for fremstilling av et medikament for behandling eller hindring av okulære neovaskulære sykdommer inklusiv retinal neovaskularisering og koroidal neovaskularisering. Medikamentet kan anvendes for administrering av en effektiv mengde av et staurosporinderivat eller et salt herav.

Staurosporinbehandlingen ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelsen er høy effektiv i inhibering og hindring av okular neovaskularisering, ikke tilsvarende den kjente laser-behandlingen som har en begrenset effektivitet. I tillegg er staurosporinbehandlingen enkel å administrere, forskjellig fra behandlingsmetoden ifølge kjent teknikk f.eks. laserbehandling som er invasiv og krever komplekst utstyr.

Det er nå overraskende blitt funnet at forbindelsene av formel (I) er særdeles nyttig for behandling av okulær neovaskularisering inklusiv retinal neovaskularisering og koroidal neovaskularisering.

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelsen anvendelsen av en forbindelse av formel (I) eller et salt derav,

hvor R representerer en benzoylgruppe, en naftylkarbonylgruppe, en bifenylkarbonylgruppe, en antrylkarbonylgruppe, en fluorenylkarbonylgruppe, eller en azulenylkarbonylgruppe,

ved fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller hindringen av okulære neovaskulære sykdommer.

Egnede staurospoirnderivater for den foreliggende oppfinnelsen er angitt i videre detalj i U.S. patent nr. 5,093,330 til Caravatti et al.

Spesielt foretrukne staurosporinderivater av formel (I) for den foreliggende oppfinnelsen omfatter:

N-bezoyl-staurosporin og farmasøytisk akseptable salter herav.

Medikamentet som fremstilles ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelsen inneholder en forbindelse av formel (I) som den aktive ingrediensen og kan administreres enteralt, nasalt, bukkalt, rektalt, topikalt, oralt og parenteralt, f.eks. ved intravenøs, intramuskulær, intravitreal, subkonjuktival eller subkutan administrering for å behandle okkulær neovaskularisering i pattedyrobj ekter spesielt mennesker. Sammensetningene kan inneholde den aktive ingrediensen alene eller fortrinnsvis den aktive ingrediensen sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Den effektive dosen av den aktive ingrediensen avhenger av typen av sykdom som behandles så vel som arten, alderen, vekten og den fysiske tilstanden til subjektet, farmakokinetiske data og administreringsmåten.

Forbindelsen av formel I administreres i en mengde effektiv mot patologiske tilstander i et pattedyr f.eks. mennesket. For et individ med en kroppsvekt på omkring 70 kg er den daglige systemiske dose som administreres fra omkring 0,1 g til omkring 20 g, fortrinnsvis fra omkring 0,5 g til omkring 5 g av den aktive ingrediensen og egnede farmasøytiske sammensetninger kan ha fra omkring 1% til omkring 95% av den aktive ingrediensen. Egnede enhetsdoseformer omfatter belagte eller ubelagte tabletter, ampuller, flasker, suppositorier eller kapsler. Andre egnede doseringsformer omfatter injekterbare medikamenter, intraokulære anordninger, intravitreale anordninger, salver, kremer, pastaer, skum, tinkturer, leppestifter, øyedråper, orale dråper, spray, dispergeringer og lignende. Medikamentet som fremstilles ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelsen fremstilles på en måte kjent fra kjent teknikk f.eks. ved hjelp av konvensjonell blanding, granulering, belegging, oppløsning eller lyofiliserings-prosesser.

Det foretrekkes å anvende oppløsningen av den aktive ingrediensen og også suspensjoner eller dispergeringer spesielt isotoniske vandige løsninger, dispergeringer eller suspensjoner. Egnede farmasøytiske sammensetninger inneholdende den aktive ingrediensen kan ha bærer f.eks. mannitol og stivelse, konserveringsmidler, stabilisatorer, fuktemidler, emulgatorer, oppløsningshjelpestoffer, salter for regulering av osmotisk trykk, buffere og lignende. Sammensetningene fremstilles på en måte kjent innenfor kjent teknikk f.eks. ved hjelp av konvensjonell oppløsnings og lyofiliserings- prosesser. En løsning eller suspensjonsform av sammensetningen kan inneholde viskositetsøkende midler f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, karboksymetyl-cellulose, dekstran, polyvinylpyrrolidon og gelatiner, og oppløsningshjelpestoffer f.eks. Tween 80 [polyoksyetylen(20)sorbitan mono-oleat, varemerke til ICI Americas, Inc,

USA].

Egnede bærestoffer omfatter fyllstoffer f.eks. sukre f.eks, laktose, sakkarose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater, kalsiumfosfater, f.eks. trikalsiumfosfat og kalsiumhydrogenfosfat, bindemidler f.eks. stivelser, metylcellulose, hydroksypropyl-metylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og polyvinylpyrrolidon, og hvis ønsket nedbrytningshjelpestoffer/sprengmidler f.eks. stivelser, tverrbundet polyvinylpyrrolidon, algininsyre eller salter herav. Ytterligere egnede eksipienter er flyteevne-tilpasningsmidler og smøremidler f.eks. kiselsyre, talkum, stearinsyre og salter herav, slik som magnesium eller kalsiumstearat, polyetylenglykol og derivater herav.

Den aktive ingrediensen, dvs. et staurosporinderivat som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer fullstendig eller hovedsakelig fullstendig okulær neovaskularisering, spesielt retinal neovaskularisering og korodial neovaskularisering. I tillegg observeres en preventiv virkning når en forbindelse som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres til et individ. I hver tilfelle er virkningen på de patologiske blodkarene dramatisk og inngående med fullstendig eller nesten fullstendig inhibering men det er ingen identifiserbar toksisk virkning på modne retinalkar.

Den foreliggende oppfinnelsen illustreres videre med de følgende eksemplene. Imidlertid skal disse ikke ansees som begrensende for oppfinnelsen.

Eksempel 1

Iskemisk retinopati produseres i C57/BL6J mus ved en fremgangsmåte beskrevet av Smith et al., Oxvgen- induced Retinopathv in the Mouse. Invest, Ophtalmol. Vis. Sei. 35,101-111 (1994). Syv dager gamle mus og deres mødre anbringes i en lufttett inkubator og utsettes for en atmosfære med 75 ± 3% oksygen i 5 dager. Inkubator-temperatur opprettholdes ved 23 ± 2°C og oksygen måles hver 8 time med en oksygen-analysator. Etter 5 dager fjernes musene fra inkubatoren, anbringes i romluft og utsettes for en medikamentbehandling. N-benzoyl-staurosporin (NBS) oppløses i dimetyl-sulfoksid (DMSO) og fortynnes til endelig konsentrasjoner med vann, maksimal- konsentrasjon av DMSO er 1%. Vehikkel (1% DMSO) eller vehikkel inneholdende forskjellige konsentrasjoner av medikamentet (volum = 10 ul per gram kroppsvekt) anbringes i magen ved gavage. Forskjellige mus gis 60, 300 eller 600 mg NBS per kg kroppsvekt. Som en kontroll gis en gruppe av mus vehikkelet uten NBS.

Etter 5 dager ofrer musene, øynene fjernes hurtig og fryses i "optimum cutting temperature embedding compound" (OCT, Miles Diagnostics, Elkehart, IN) eller fikseres i 10% fosfat-bufferet formalin og innleires i parafin. Voksne C57BL6J mus behandles også ved gavage med medikamentet eller vehikkelet og etter 5 dager ofres de og deres øyne behandles for frysing eller parafinseksjon.

Frosne seksjoner (10 nm) av øynene fra medikamentbehandlede og kontrollmus plettes histokjemisk med bitinylert griffonia simplicifolia lektin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) som selektivt binder til endotelialceller. Skiver inkuberes i metanol/ H2O2i 10 minutter ved 4°C, vaskes med 0,05 M Tris-bufferet saltoppløsning, pH 7,6 (TBS) og inkuberes i 30 minutter i 10% normal griseserum. Skivene inkuberes i 2 timer ved romtemperatur med biotinylert lektin og etter rensing med 0,05 M TBS inkuberes de med avidin koblet til peroksidase (Vector Laboratories) i 45 minutter ved romtemperatur. Etter å være vasket i 10 minutter med 0,05 M TBS inkuberes skivene med diaminobenzidin for å gi et brunt reaksjonsprodukt. Noen skiver motplettes med hematoksylm og alle anbringes med cytoseal.

For å utføre kvantitative analyser skjæres 10 um serieseksjoner gjennom på midten av øyet og seksjoner grovt 50-60 nm fra hverandre plettes med lektin, tilveiebringende 13 seksjoner per øye for analyse. Lektin-plettede seksjoner analyseres med et aksioskop-mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) og bildet digitaliseres anvendende et 3 CCD fargevideokamera (IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan) og en rammefinner. Image-Pro Plus software (Media Cybemetics, Silver Spring, MD) anvendes til å skildre lektin-plettede celler på overflaten av retina og deres areal måles. Gjennomsnittet av 13 målingene for hver øye anvendes som en enkelt eksperimentell verdi.

Musene med iskemiske retinopati behandlet med vehikkelet uten NBS viser en markert økning i arealet av endotelialcellepletting ut over retinaen med store klumper av celler på retinal overflaten sammenlignet med ikke iskemiske mus som viser normale kar i de overflatiske og dypere kapillære sjikt med noen få forbundene kar. Iskemiske mus som blir gitt 600 mg/kg NBS en gang per dag i 5 dager har en dramatisk minskning i endotelialcellepletting på overflaten og inn i retinaen sammenlignet med de vehikkel- behandlede mus. Faktisk er endotelialcelleplettingen inn i retinaen til de NBS-behandlede iskemiske musene mindre enn til de ikke iskemiske musene. Stor forstørrelse viser at det ikke er noen identifiserbare endotelialceller på overflaten av retinaen indikerende at det er en fullstendig inhibering av neovaskularisering. Det er også merkbart fravær av endotelialcellepletting i det indre nukleære laget og ytre pleksiforme laget hvor de dypere kapillære sjiktene normalt finnes.

Musene med iskemiske retinopati som blir gitt 300 mg/kg eller 60 mg/kg NBS to ganger dagen ved gavage utviser noen klumper av neovaskularisering på overflaten av retinaen som er mindre enn klumpene i retinaen til de vehikkelbehandlede kontrollmusene. Retinaene til NBS-behandlede mus viser også noen minskning i endotelpletting inne i retinaen. Resultatet av billedanalysen demonstrerer at endotel-celleplettingen på og i retinaene til mus behandlet med 600 eller 60 mg/kg en gang per dag var signifikant mindre enn i vehikkelbehandlede mus og viste en doseavhengig effekt sammenlignet med musene som ble behandlet to ganger per dag. Resultatene demonstrerer klart at staurosporinderivatet inhiberer retinal neovaskularisering.

Eksempel 2

Voksne C57BL6J mus gis vehikkelet eller 600 mg/kg NBS ved gavage en gang per dag og etter 5 dager ofres de og deres øyne behandles som i eksempel 1.

Billedanalyse viser at de ikke er noen forskjell i totalarealet av endotel pletting i retinaen eller forekomsten av retinalkar i de NBS-behandlede mus sammenlignet med de vehikkelbehandlede mus. Analysene viser heller ingen forskjell i mengden av retinal endotelcellepletting mellom NBS- og vehikkel-behandlede mus. Dette demonstrerer at staurosporinderivatene ikke er toksiske for endotelceller i modne blodkar.

Eksempel 3

Kull av nyfødte C57/BL6J mus (neonatalmus) ble oppdelt i behandlings- og kontrollgrupper som mottok daglige subkutane injeksjoner av 100 mg/kg av respektivt medikamentet eller vehikkelet. Ved en alder på 7 eller 10 dager anestiseres musene med eter og stenges med 1 ml fosfatbufferet saltløsning inneholdende 50 mg/ml fluoresein-merket dekstran (2xl0<6>gjennomsnittlig mw, Sigma, St. Louis, MO) som beskrevet av Tobe et al., Evolution of Neovascularization in Mice with Overexpression of VEGF in Photorecetpros. Invest. Ophtalmol. Vis. Sei. 39,180-188 (1998). Øynene ble fjernet og fiksert i 1 time i 10% fosfastbufferet formalin. Hornhinnene og linsene ble fjernet og hele retinaen forsiktig atskilt fra øyekoppen. Radiale snitt ble gjort fra kanten av retinaen til ekvatoren i alle 4 kvadranter og retinaen anbringes flatt i aquamont med fotoreseptorene rettet oppad. De flatt anbrakte prøvene undersøkes ved fluorosens mikroskopi og avbildene digitaliserers anvendene et 3 CCD fargevideokamera og en rammefinner. "Image-Pro" pluss anvendes ved å måle avstanden fra senteret av den optiske nerven til den ledene fronten av utviklende retinalkar i hver kvadrant og gjennomsnittet anvendes som en enkelt eksperimentell verdi.

Ved 7 dagers alder når retinalkarene i de vehikkelbehandlede musene nesten den perifere kanten av retinaen men i de NBS-behandlede musene strekker retinalkarene seg kun litt mer enn halvveis til periferien. Ved 10 dagers alder er det overflatiske kappilarsjiktet fullstendig å strekker seg hele veien fra den perifere kanten til retinaen og det dypere kapillære sjiktet er delvis utviklet. Men i de NBS-behandlede musene har det overflatiske kapillære sjiktet ikke enda nådd kanten av retinaen. Avstanden fra den optiske nerven til den vaskulære fronten beregnes ved billedanalyse og forskjellen mellom de behandlede og kontrollmusene ved 7 og 10 dagers alder er statistisk signifikant. Dette indikerer at staurospoirnderivatet inhiberer retinal vaskulær utvikling.

Eksempel 4

C57BL/6J mus behandles i overensstemmelse med the Association for Research in Vision and Ophthalmology resolution for the treatment of animals. Koroidal neovaskularisering genereres ved modifisering av en tidligere beskrevet teknikk, Tobe et al. Targeted disruption of the FGF2 gene does not prevent choroidal neovascularization in a murin model. Amer. J. Path, til trykking. Kort fortalt blir 4 til 5 uker gamle hann C57BL/6J mus anestisert med ketaminhydroklorid (100 mg/kg kroppsvekt) og pupillene forstørret med 1% tropikamid. Tre brenninger med kryptonlaser fotokoagulering (100 nm plettstørrelse, 0,1 sekunders varighet, 150 mW) avlevert til hver retina anvendende slisslampe avleveringssystemet til en Coherent Model 920 Photocoagulator og et håndholdt tildekningsark som en kontaktlinse. Brenningene ble utført på klokken 9,12 og 3 posisjonene til den bakerste polen til retinaen. Produksjonen av en boble ved lasertiden, hvilket indikerer brudd på Bruch's membran er en viktig faktor for oppnåelse av CNV så kun mus i hvilke en boble er produsert for alle tre brenninger er inkludert. Ti mus tildeles tilfeldigvis til behandling med vehikkel alene og ti mus tildeles til å motta vehikkelinneholdende 400 mg/kg/dag NBS gitt ved oral

gavage. Etter 14 dager drepes musene med en overdose pentobarbital natrium og deres

øyne fjernes hurtig og fryses i "optimal cutting temperature embedding compound (OCT). Frosne serielle seksjoner (10 um) skjæres gjennom hele utstrekningen av hver brenning og plettes histokjemisk med biotinylert graffonia siplicifolia lectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), som selektivt bindes til endotelceller. Utskjæringene inkuberes i metanol/H202i 30 minutter ved 4°C, vaskes med 0,05 M Tris-bufferet saltløsning, pH 7,4 (TBS) og inkuberes i 30 minutter i 10% normal svineserum. Utskjæringene renses med 0,05 M TBS og inkuberes i 2 timer ved 37°C med biotinylert lectin. Etter å være renset med 0,05 M TBS inkuberes utskjæringene med streptavidin-fosfatase (Kirkegaard and Perry Laboratories, Cabin John, MD) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter 10 minutters inkubering i 0,05 M Tris buffer, pH 7,6 utvikles utskjæringene i Histomark Red (Kirkegaard and Perry) for å gi et rødt reaksjonsprodukt og anbringes med Cytoseal (Stephens Scientific, Riverdale, NJ). Noen utskjæringer motplettes med Contrast Blue (Kirkegaard and Perry).

For å utføre kvantitative analyser undersøkes lectin-plettede seksjoner med et aksioskop mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) og avbildinger digitaliseres anvendende i 3 CCD fargevideokameraer (JX-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan) og en rammefiner. Image-Pro Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) anvendes til å skissere å måle arealet av lectin-plettede blodkar i subretinalområdet. For hver lesjon blir arealmålinger gjort for alle seksjoner på hvilke noe av lesjonen forekommer og adderes sammen for å gi den integrerte arealmålingen. Gjennomsnittet av verdiene tas for å gi en eksperimentell verdi per mus. En 2-prøve t-test for ulike varianter utføres for å sammenligne det logaritmiske gjennomsnittlige integrerte arealet mellom behandlede og kontrollmus.

To uker etter laser viser alle lesjoner i begge grupper av mus en diskontinuitet i Bruch's membran som grovt tilsvarer skaden til den ovenliggende retinaen. Alle mus behandlet med vehikkel alene viste store arealer av koroidal neovaskularisering på stedet for hver laser-indusert brudd på Bruch's membran. Det er økning i retinal pigmenterte epitel-celler langs margen av de nye blodkarene. Retinale blodkar plettet med lektin sees i den overliggende retinaen. I motsetning hertil har alle mus gitt 400 mg/kg/dag NBS meget lite hvis noen koroidal neovaskularisering på stedet for hver laser-induserte brudd på Bruch's membran. I de fleste tilfeller er det ingen identifiserbar lektin-pletting av neovaskulær ved gjennom hele brenningen men noen brenninger inneholder området i hvilken det er en tynn skive av lektin-plettet vev. Det er en mild økning av RPE celler. På tross av den markante minskning i koroidal neovaskularisering i øynene til behandlede mus forekommer de overliggende retinale blodkarene som normale. Dette sees best i seksjoner uten noen motpletting.

Kvantifisering av det integrerte arealet av lektinpletting per lesjon viser en dramatisk minskning i musene behandlet med NBS (0,0090182 ± 0,0017540 mm<2>) sammenlignet med lesjoner i mus behandlet alene med vehikkel (0,0695621 ± 0,0073960 mm<2>). Denne forskjellen er statistisk høy signifikant (p = 0,004). Disse resultatene viser klart av staurosporinderivatet dramatisk inhiberer korodial neovaskularisering.

Eksemplene ovenfor illustrerer virkningen av den aktive ingrediensen. Staurosporinderivatene som anvendes i den foreliggende oppfinnelsen er høyt effektive ved fullstendig eller ved vesentlig fullstendig inhibering av retinal og korodial neovaskularisering og de aktive ingrediensene kan administreres til en pasient ved en medikamentbehandlingsfremgangsmåte som er konvensjonell og/eller praktisk.

Claims (6)

1. Anvendelse av en forbindelse av formel (I) eller et salt derav,

hvor R representerer en benzoylgruppe, en naftylkarbonylgruppe, en bifenylkarbonylgruppe, en antrylkarbonylgruppe, en fluorenylkarbonylgruppe, eller en azulenylkarbonylgruppe, ved fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller hindringen av okulære neovaskulære sykdommer.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor den aktive ingrediensen er N-benzoyl-staurosporin eller et salt derav.

3. Anvendelse ifølge krav 1 hvor behandlingen og/eller hindringen er behandlingen og/eller hindringen av human okulære neovaskulære sykdommer.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor behandlingen og/eller hindringen er behandlingen og/eller hindringen av human retinal neovaskulære sykdommer.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor behandlingen og/eller hindringen er behandlingen og/eller hindringen av human korodial neovaskulære sykdommer.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor behandlingen og/eller hindringen er behandlingen og/eller hindringen av pattedyr okulære neovaskulære sykdommer.