NO324247B1

NO324247B1 - 16,17-karbocykliske kondenserte steroidforbindelser med selektiv ostrogen aktivitet samt anvendelse derav og farmasoytisk preparat

Info

Publication number: NO324247B1
Application number: NO20025793A
Authority: NO
Inventors: Hubert Jan Jozef Loozen
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 2000-06-06
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2007-09-17
Also published as: KR100769865B1; PL359238A1; US20110224183A1; NO20025793L; TWI225068B; CZ20024014A3; ATE293124T1; SK286852B6; HUP0301190A2; PT1294739E; BR0111445A; US20100249083A1; PE20020214A1; HUP0301190A3; JP5095902B2; DE60110069T2; HK1052012A1; CA2410220C; DK1294739T3; EP1294739A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører 16,17-karbocykliske kondenserte steroidforbindelser med selektiv østrogen-aktivitet samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig steroid-forbindelser med en ytterligere E-ring forbundet med ring D i steroidskjelettet, som har østrogen aktivitet.

Det er fortsatt interesse for nye forbidelser med affinitet for østrogen-reseptoren. Dette skyldes oppdagelsen av to distinkte subtyper av reseptorer, betegnet ERa og ERp (se Mosselman et al., FEBS Letters 392 (1996) 49-53 så vel som EP -A- 0 798 378). Forbindelser som er selektive for slike subtyper av reseptorer gjør det mulig å gi en mer selektiv østrogen-reseptor-relatert behandling. Fordeler kan for eksempel oppnås fra den forskjellige distribusjon av reseptorundertyper i humant vev. Dette tillater behandling med en lavere byrde av østrogen-relaterte bivirkninger. Eksempler på østrogen-relaterte medisinske behandlinger som kan ha fordel av selektive forbindelser, er slike for prevensjon, for terapi av menopausale plager, osteoporose og østrogenavhengig tumorkontroll.

I EP 0 869 132 er beskrevet østrogene steroidforbindelser som har formel (1):

hvor:

stiplede bindinger representerer eventuelle dobbeltbindinger;

R6 er H, =CH2 eller -CH3 eller -CH2-CH3;

R7 er H, d-4-alkyl, C2-5 alkenyl eller C2-5-alkynyl, hvor alkyl-, alkenyl- eller alkynyl-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer;

Rn er H, Ci-4-alkyl, C2-4-alkenyl, C2-4-alkynyl eller Ci-4-alkyliden, hvor alkyl-, alkenyl-, alkynyl- eller alkyliden-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer;

E sammen med karbonatomer 16 og 17 i steroidskjelettet representerer en fire til syv-leddet ring, idet nevnte ring er a i c/s-konfigurasjon med hensyn til steroid-skjelettet, eventuelt omfattende én eller to endocykliske bindinger og substituert med RE, som har en rekke betydninger.

Det er videre beskrevet i EP 0 869 132 at hvilken som helst alkyl-, alkenyl-, alkynyl- og alkyliden-gruppe i steroidforbindelsen som har formel (I) kan være forgrenet eller uforgrenet. Hvis R6 eller Rn er forbundet med steroid-skjelettet gjennom en enkeltbinding omfatter det substituerte karbonatom steroid-skjelettet enten et hydrogenatom eller er involvert i en dobbel karbon-karbon-binding. Forbindelsene kan inneholde forskjellige chiralitetssentere og kan eksistere som enantiomerer og diastereomerer. Hydroksylgrupper kan ha substituenter så som acyl eller alkyl, hvilket fører til prodrug av en forbindelse med formel 1.

Foreliggende oppfinnelse vedrører steroidforbindelse som har formel (1):

hvor:

stiplede bindinger representerer eventuelle dobbeltbindinger;

R6 er H, =CH2 eller -CH3 eller -CH2-CH3;

R7 er H, Ci-4-alkyl, C2.5 alkenyl eller C2.5-alkynyl, hvor alkyl-, alkenyl- eller alkynyl-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer;

Rn er H, Ci-4-alkyl, C2.4-alkenyl, C2-4-alkynyl eller Ci-4-alkyliden, hvor alkyl-, alkenyl-, alkynyl- eller alkyliden-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer;

E representerer sammen med karbonatomer 16 og 17 i steroid-skjelettet en fire- til syv-leddet ring, hvor nevnte ring er a i c/s-konfigurasjon med hensyn til steroid-skjelettet, eventuelt omfattende én eller to endocykliske bindinger;

eller et prodrug derav, hvor nevnte prodrug er forbindelser hvor hydroksylgruppene er koblet til en av de følgende gruppene: eter, ester, acyl, fosfat, sulfat, sulfonat og aromatisk karboksylat.

Det er nå følgelig funnet at en steroidforbindelse som har formel 1 med symboler og betegnelser som har betydningene definert ovenfor, karakterisert ved at Re er en p-hydroksygruppe eller et prodrug derav, uventet har en konsekvent bedre selektivitet for østrogen reseptoren a kombinert med en høy østrogen a-potens. En slik forbindelse, heretter referert til som en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, er vanligvis ikke bare meget svakt aktiv på østrogenreseptor p, men er generelt faktisk en antagonist for østrogen reseptor p, hvilket bidrar til den meget høye selektivitet for østrogenreseptor a og videre tillater en selektiv behandling basert på blokkade av østrogenreseptor p. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ovennevnte enantiomerer og diastereomerer innenfor sitt omfang og hver av de individuelle (R)- og (S)-enantiomerer, hovedsakelig fri, dvs. assosiert med mindre enn 5%, fortrinnsvis mindre enn 2%, spesielt mindre enn 1% av den andre enantiomer og blandinger av slike enantiomerer i hvilket som helst forhold omfattende racemiske blandinger inneholdende hovedsakelig like mengder av de to enantiomerer.

En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er en steroidforbindelse som definert tidligere og videre karakterisert ved at R6 er H, R7 er C-i-3-alkyl, E-ringen er en fem- eller seks-leddet ring uten dobbeltbindinger som har hydroksy i stilling 22 i S-stereokonfigurasjon.

Mest foretrukket er forbindelsen med formel 2, som er (7a,16p,17a, 22S)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17,22-triol, som har kodenavnet Org 41621:

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse tillater derfor en mer styrt, med andre ord selektiv modifikasjon av aktiviteten til østrogen a- eller (3-reseptorer i en organisme.

Et prodrug er definert som en forbindelse som omdannes i kroppen til en mottager til en forbindelse med formel 1 hvor Re er en p-hydroksylgruppe. Spesielt kan hydroksygruppene i stilling 3,17 og på E-ringen for eksempel omdannes til etere (alkyl<*>oksy) eller estere så som acyl<*>oksy, fosfat, sulfat, sulfonat eller aromatisk karboksylat, hvor karbonkjedelengden av gruppene betegnet med en stjerne (<*>) ikke skal betraktes som skarpt avgrenset. En acylgruppe er avledet fra et lineært eller forgrenet alkan<*> og et aromatisk karboksylat vil generelt omfatte fenyl, pyridinyl eller pyrimidyl. Lengden av alkyl- og acylgruppene blir valgt avhengig av de ønskede egenskaper til prodrug'et, idet prodrug med lenger kjeder med for eksempel lauryl- eller kaproyl-kjeder er mer egnet for forsinket frigjøring og depot-preparater. Det er kjent at slike substituenter spontant hydrolyserer eller blir enzymatisk hydrolyser! til de frie hydroksylsubstituenter på skjelettet av forbindelsen. Slike prodrug vil ha biologisk aktivitet sammenlignbar med forbindelsene til hvilke de blir omdannet i kroppen til mottagerne. Den aktive forbindelse til hvilken et prodrug blir omdannet er betegnet stamforbindelsen. Begynnelse av virkning og virkningsvarighet så vel som distribusjon i kroppen av et prodrug kan avvike fra slike egenskaper til stamforbindelsen.

Både for medisinske terapier så vel som for fysiologiske, medisinske og farmakologiske forsøk er det et sterkt behov for slike selektive forbindelser som nå er funnet.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse er anvendelse av steroidforbindelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for fremstilling av et medikament for en selektiv østrogenreseptor-relatert behandling.

Den forskjellige distribusjon av a- og p-reseptorer i forskjellige vev i en organisme gir mål for mer selektive inngrep i funksjonen til forskjellige vev. Det er kjent at artsavhengig blir østrogenreseptorer a uttrykt overveiende i vaginalt vev og levervev, mens p-reseptorer blir uttrykt overveiende i prostatavev, epitelcelle-laget av rotteblære, vaskulære endotel-glattmuskelceller og visse hjerneregioner, så som den basale forhjerne, neocortex og hippocampus. Vev hvor begge reseptorer er til stede er for eksempel hypofyse, hypothalamus, thymus, livmor, eggstokk og ben.

Østrogenreseptor-affinitetsprofilen av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, gjør dem egnet som forbedrede østrogener eller anti-østrogener med reduserte østrogen-relaterte bivirkninger. Således beskriver oppfinnelsen en metode for selektiv modifikasjon av aktiviteten til østrogenreseptorer ved å bringe en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse i kontakt med østrogenreseptorer. En slik metode kan være behandling av menneske- eller dyrekroppen, men den kan også være en ikke-medisinsk metode. Den sistnevnte metode kan være en eksperimentell metode, så som en analyse for selektive forbindelser eller en in vitro laboratoriemetode for å oppnå informasjon om østrogenreseptorer eller forbindelser som interagerer med dem. Fortrinnsvis kan disse forbindelser anvendes for selektive østrogenreseptor a- eller p-relaterte befruktnings-hindrende, eksperimentelle eller medisinske behandlinger, så som for behandling eller forebygging av østrogenreseptor-relaterte lidelser, menopausale plager, osteoporose, kardiovaskulære lidelser, modulering av hypofyse-hormonregulering, godartet prostata-hypertrofi, østrogenavhengig tumorkontroll, kolonkreft, endometriose eller sentralnervesystem-lidelser. En viktig felles karakteristikk for disse selektive metoder og behandlinger er at disse omfatter å bringe en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse i kontakt med østrogenreseptorer

Oppfinnelsen angår også farmasøytisk preparat omfattende steroidforbindelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

Oppfinnelsen angår videre anvendelse ifølge krav 5, idet den østrogenreseptor-relaterte behandling er en frukbarhetshindrende behandling. Således kan medikamentet anvendes for prevensjon dvs. administrering til et individ, som er en kvinne eller et hunndyr, av et progestogen og et østrogen som er vanlig på området, hvor østrogenet er en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse (i en egnet farmasøytisk doseform).

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelse ifølge krav 5, idet den selektive østrogen-reseptor-relaterte behandling er forebygging eller behandling av peri-menopausale eller post-menopausale plager.

Dosemengdene av foreliggende forbindelser vil være i normal størrelsesorden for østrogen-relaterte forbindelser, f.eks. i størrelsesroden 0,01 til 100 mg pr. administrering.

For dette formål kan doseenheter fremstilles inneholdende mengder av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse i samme størrelsesorden som de ovenfor angitte behandlingsdoser. Foreliggende oppfinnelse angår derfor også et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse blandet med et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved forskjellige metoder kjent på området organisk kjemi generelt og spesielt området steroidkjemi. Se for eksempel: Fried, J. og Edwards, J.A., " Organic Reactions in Steroid Chemistry", Vol. I og II, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1972; og C. Djerassi," Steroid Reactions ", Holden-Day, Inc., San Francisco, 1963.

For syntese av en forbindelse ifølge oppfinnelsen må steroider med en ytterligere 16,17 tilknyttet ring syntetiseres. Metoder for dette er beskrevet i EP 0 869 132. For forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse må en ytterligere hydroksyfunksjon innføres på den tilknyttede ring. For dette formålet er det hensiktsmessig å utføre tilknytningsreaksjonen på en slik måte at hensiktsmessig lokaliserte dobbeltbindinger blir et resultat av den syntetiske prosedyren, for eksempel ved anvendelse av en velkjent olefin-metatese-prosedyre, hvorved overgangsmetallkatalysatorer blir anvendt som er avledet fra f.eks. ruthenium, molybden eller wolfram, for å lukke et 16oc,17o>bis umettet fragment i en umettet kondensert 5- eller 6-leddet ring. Olefinringen således syntetisert blir først stereoselektivt epoksydert. Dette kan generelt utføres med midler så som persyrer (fortrinnsvis i et bufret medium) eller katalytiske systemer ved anvendelse av metallkomplekser i nærvær av oksydasjonsmidler (så som hydrogenperoksyd eller t-butylhydroperoksyd). I foreliggende tilfelle gir perbenzosyre med natrium-bikarbonat-buffer generelt gode resultater. Epoksydene kan nesten regioselektivt reduktivt åpnes med hydrid-reagenser til de ønskede beta-alkoholer. Hydroksy-grupper kan også lett syntetiseres ved anvendelse av en hydroborering/ oksydasjons-prosedyre. I tilfeller hvor oc-hydroksy-forbindelsene blir oppnådd fører en Mitsunobu-inversjon lett til ^-alkoholene, som er de tilsiktede. Hydroksy-forbindelsene kan omdannes til prodrug, så som alkyletere, acylestere, karbonater, sulfonater eller fosfater, ved omsetning med det passende alkyl-halogenid eller syreklorid som ønsket.

Et farmasøytisk preparat omfattende én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles med eller uten kombinasjon med farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler, så som beskrevet i standardreferansen Gennaro et al., Remminaton' s Pharmaceutical Sciences. (18. ed., Mack Publishing Company, 1990, se spesielt Del 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture).

En blanding av én eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen og ett eller flere farmasøytisk akseptable tilsetningsmidler kan komprimeres til faste doseenheter, så som piller eller tabletter eller prosesseres til kapsler eller suppositorier. Ved hjelp av farmasøytisk egnede væsker kan forbindelsene også anvendes som et injeksjonspreparat i form av en løsning, suspensjon, emulsjon eller som en spray, f.eks. nasalspray. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også inkluderes i et implantat, en vaginalring, et plaster, en gel og hvilken som helst annen anordning for forsinket frigjøring. For fremstilling av doseenheter, f.eks. tabletter, kan det anvendes konvensjonelle additiver så som fyllmidler eller bærere, fargemidler, polymere bindemidler og lignende. Generelt kan hvilket som helst farmasøytisk akseptabelt additiv som ikke griper inn i funksjonen til de aktive forbindelser anvendes. Egnede bærere med hvilke preparatene kan administreres omfatter laktose, stivelse, cellulosederivater og lignende eller blandinger derav anvendt i egnede mengder.

EKSEMPLER

Synteseveiene anvendt i eksemplene er illustrert i skjema I og II. Tallene anvendt for å identifisere forbindelsene er definert av de strukturelle formler i disse skjemaer.

Forbindelse 2

Til en løsning av 5,65 ml vinyltributyltinn i 50 ml tørr THF ble ved -50°C dråpevis satt 12 ml 1,6M BuLi i heksan. Etter omrøring i ytterligere 0,5 time ble en løsning av 6,2 g 16a-allyl,7a-etyløstron-3-0-metyleter (1) i 20 ml tørr THF tilsatt ved -50°C. Etter omrøring i ytterligere Vfe time ble blandingen hellet i mettet NH4CI og ekstrahert med etylacetat. Konsentrasjon av den organiske fasen fulgt av silikagelkromatografi ga 4,2 g av 2 som en olje,

Rf 0,47 (toluen/etylacetat 95/5), i 1 Rf 0,65. NMR (CDCI3) 8 5,80 (m, 1, CH allyl), 6,07 (m, 1, CH vinyl) 0,98 (s, CH3), 0,93 (t, 3, etyl), 3,78 (s, 3, CH3).

Forbindelse 3

Til en løsning av 4,2 g av 2 i 80 ml metylenklorid ble satt 0,32 g benzylidentriscykloheksylfosfinoruthenium-diklorid (Grubbs metatese-katalysator). Etter omrøring i 1 time ble ytterligere en porsjon av 0,3 g katalysator tilsatt. Etter fullføring av reaksjonen (21) ble blandingen konsentrert og residuet renset ved kolonnekromatografi, hvilket ga 3,5 g av 3, Rf 0,29 (heptan/etylacetat 8/2, for 2 Rf 0,55). NMR (CDCI3) 8 5,72 (m, CH=) 6,02 (m, 1, C=) 0,99 (s,3, CH3), 0,89(t, 3, CH3) 3,77(OCH3) 0,92 (m,3, CH3).

Forbindelse 4

En blanding av 0,4 g av steroid 3 og 0,5 g NaHC03 i 12 ml metylenklorid ble behandlet med 0,34 g m-CI-perbenzosyre. Etter omrøring i mange timer ved

omgivelsestemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med vann og behandlet med natriumtiosulfat-løsning for å destruere gjenværende peroksyd. Det organiske materialet ble ekstrahert med etylacetat og til slutt renset ved kromatografi, hvilket ga 110 mg av det ønskede p-epoksyd 4; Rf 0,50 (toluen-aceton 9/1); NMR(CDCI3) 5 0,98 (t, 3, CH3), 0,92 (t, 3, CH3), 3,65 + 3,70 (2xm, epoksyd CH'er).

Forbindelse 5

En løsning av 80 mg av steroid 4 i 3 ml THF ble tilbakeløpskokt med 10 mg LiAIH4 . Etter 2 timer var utgangsmaterialet forsvunnet. Blandingen ble behandlet ved tilsetning av 30 uJ av mettet Na2S04-løsning og 0,20 g Na2S04 , omrørt i 15 min. og filtrert over Celite. Filtratet ble konsentrert og residuet passert over en kort silikakolonne, hvilket ga 55 mg av 5; Rf 0,24 (toluen-aceton 9/1); NMR(CDCI3) 8 4,04 (m, 1, CHOH), 3,78 (s,3,OCH3) 2,85 (m, 2, CH2 ved C6), 0,92 (s, 3, CH3).

Forbindelse 6

Til en løsning av natriumetantiolat (fremstilt fra 0,7 ml etantiol og 0,27 g 60% NaH-dispersjon ) i 9 ml DMF ble satt 120 mg av steroid 5. Blandingen ble tilbakeløpskokt i 3 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen hellet i vann og ekstrahert med etylacetat. Kromatografi av det organiske materialet ga 80 mg av 6, Sm.p. 224-226; Rf 0,30 (toluen-aceton 8/2); NMR(CDCI3) 8 4,00 (m, 1, CHOH), 7,12 (ar H1), 6,20 (ar H2), 6,54 (ar H4).

Forbindelse 7

Til en løsning av 2,7 g av steroid 3 i 20 ml metylenklorid og 3 ml pyridin, ble ved 0°C satt 1,9 ml trimetylsilylklorid. Etter omrøring i 1/2 time ble reaksjonsblandingen hellet i vann og ekstrahert med etylacetat, hvilket ga 3,3 g i det vesentlige rent silyloksy-derivat 7, Rf 0,8 (heptan-aceton 8/2); NMR (CDCI3) 8 0,03 (s, 9, TMS), 5,68, 5,91 (2x s, CH olefin).

Forbindelse 8

En løsning av 3,2 g av 7 i 25 ml tørr THF ble ved 0°C behandlet med en løsning av 2,2 ml boran-dimetylsulfid-kompleks i 20 ml THF. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt i 2 timer ved 45°C. Overskudd av reagens ble fjernet ved forsiktig tilsetning av 4,5 ml abs.etanol, fulgt av 11 ml 2N NaOH og 7,7 ml 30% hydrogenperoksyd . Reaksjonsblandingen ble omrørt natten over, fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. Det således oppnådde råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi og ga 1,7 g av den ønskede oc-alkohol 8. Rf 0,36 (heptan-aceton 8/2); NMR(CDCI3) 8 4,42 (m, 1, CHOH), 0,12 (s, 9, TMS), 0,79 (s, 3, CH3).

Forbindelse 9

En løsning av 1,6 g av 8 og 1,3 g trifenylfosfin i 60 ml toluen ble behandlet med 0,84 g p-nitrobenzosyre og 0,8 ml dietylazodikarboksylat ved 0°C. Etter omrøring i-1 time var reaksjonen fullstendig. Blandingen ble hellet i mettet vandig NaHC03-løsning og ekstrahert med etylacetat. Kromatografisk rensning ga 2,9 g p-nitrobenzoat, Rf 0,64 (heptan-aceton 8/2); NMR (CDCI3) 8 5,34 (m, 1, CHOC(O)Ar), 0,91 (s, 3, CH3), 0,95 (t, 3, CH3), 3,80 (s, 3, OCH3). Dette materialet ble oppløst i en blanding av 40 ml THF-metanol (1/1 volum/volum) og behandlet med 4 ml 2N NaOH-løsning. Etter omrøring i 15 min. ble reaksjonsblandingen hellet i vann og produktet ekstrahert med etylacetat. Etter passering gjennom en kort silikakolonne ble 1,3 g p-alkohol 9 oppnådd;. Rf 0,64 (heptan-aceton 8/2); NMR (CDCI3) 8 4,31 (m, 1, CHOH).

Forbindelse 10

En løsning av 1,3 g av 9 i 30 ml aceton ble behandlet med 2 ml 2N HCI. Etter 1 time ble blandingen nøytralisert ved tilsetning av mettet NaHC03 og konsentrert. Residuet ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat, hvilket ga 1,0 g av 10, Rf 0,10 (heptan-aceton 8/2); NMR (CDCI3) 8 0,90 (t, 3, CH3) 0,95 (s, 3, CH3), 4,48 (m, 1, CHOH).

Forbindelse 11

Til en løsning av natriumetantiolat (fremstilt fra 0,7 ml etantiol og 0,3 g 60% NaH-dispersjon ) i 9 ml DMF ble satt 120 mg av steroid 10. Blandingen ble tilbakeløpskokt i 3 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen hellet i vann og ekstrahert med etylacetat. Kromatografi av det organiske materialet ga 80 mg av 11, Sm.p. 143-145X (etanol-vann); Rf 0,41 (toluen-aceton 7/3); NMR (CDCI3) 8 4,45 (m, 1, CHOH), 0,93 (s, 3, CH3) 0,90 (t, 3, CH3), 6,62 + 7,10 (AB.2, H1,2), 6,53 (d, 1, H4).

Forbindelse 13

Til en løsning av 29 ml 1M allylmagnesiumbromid i eter ble satt 80 ml tørr THF. Ved -50°C ble tilsatt 10 g 7a-propyl,16a-allyløstron-3-0-benzyleter 12 i 40 ml THF. Etter omrøring i Vfe time fikk blandingen komme til romtemperatur og ble hellet i 300 ml mettet vandig NH4CI. Produktet ble ekstrahert med etylacetat og renset ved kromatografi over silikagel for å fjerne stereoisomerer, hvilket ga 7,2 g av det ønskede 16a, 17a-diallyl-derivat 13.

R, 0,26 (heptan-etylacetat 9/1);17p-allyl-isomer Rf 0,45. NMR (CDCI3) 8 0,88 (t, 3, CH3), 0,96 (s, 3, CH3), 6,08 (m, 1, CH allyl), 5,80 (m, 1, CH allyl), 4,95-5,20 (m, 4, 2x CH2 allyl) 5,02 (CH2OBz).

Forbindelse 14

En porsjon av 40 mg benzyliden-triscykloheksylfosfinoruthenium-diklorid (Grubbs metatese-katalysator) ble satt til en løsning av 450 mg av 13 i 10 ml metylenklorid. Etter omrøring i 1 time ble ytterligere 400 mg katalysator tilsatt. Etter 2 timer ble løsningsmidlet fjernet og erstattet av 20 ml toluen og blandingen ble omrørt med 5 g basisk alumina ved 60°C for å absorbere katalysatoren. Etter filtrering over Celite og vasking med toluen og etylacetat ble 400 mg av nesten ren 14 oppnådd; Rf 0,34 (heptan-etylacetat 8/2); Rf 13 0,45. NMR(CDCI3) 8 5,02 (s, 2, CH20), 5,97 (s, 2, CH=CH), 0,97 (s, 3, CH3)

Forbindelse 15

Til en løsning av 340 mg av 14 i 0,5 ml metylenklorid ble satt 8 uJ av pyridin, 0,14 ml 30% vandig H202, fulgt av 2 mg metyltrioksorhenium. Etter omrøring i 1 time var epoksyderingen fullstendig, hvilket ga overveiende det ønskede (3-epoksyd så vel som noe a-isomer. Blandingen ble hellet i vann og mettet Na2S203 og ekstrahert med etylacetat. Kromatografi ga 230 mg av 15 og 80 mg av det uønskede a-epoksyd. Rf 0,36 (toluen-etylacetat 95/5; for referanse: Rf forbindelse 14: 0,39). NMR(CDCI3) 8 3,31, 3,38 (m, 2, CH(O)CH).

Forbindelse 16

En blanding av 4,2 g av 15 og 350 mg LiAIH4 i 20 ml tørr THF ble tilbakeløpskokt i 2 timer. Deretter ble blandingen avkjølt og deretter behandlet med 1 ml mettet vandig Na2S04, 28 ml etylacetat og 8 g Na2SC*4. Etter omrøring i Vz time ved omgivelsestemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert over Celite og filtratet konsentrert og kromatografert , hvilket ga 3,4 g av 16, Sm.p. 147-148°C, Rf 0,20 (toluen-etylacetat 8/2; Rf 23 0,55). NMR (CDCI3) 8 4,25 ( bred s, 1, CHOH), 0,90 (s, 3, CH3), 0,86 (t, 3, CH3), 5,02 (s, 2, OCH2Ar).

Forbindelse 17; (=7a,16(3,17a, 22S)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17,22-triol

En løsning av 3,3 g av 16 i 200 ml etanol ble hydrogenen i nærvær av 300 mg 5% Pd/C. Etter fullføring av reaksjonen ble katalysatoren filtrert over Celite og løsningsmidlet konsentrert. Residuet ble utgnidd med eter og deretter med vann, hvilket ga 1,7g av 17; Sm.p. 146-147°C , Rf 0,53 (toluen-etylacetat 1/1; Rf 16 0,60) NMR(CDCI3) 8 4,26 (bred s, 1, CHOH) 7,14, 6,62 AB, 2, H1.H2), 6,54 (d, H4).

Tester for østrogen-aktivitet in vitro

Forbindelser blir testet for deres østrogenreseptor-aktivitet i et bindings-forsøk og i et transaktiveringsforsøk ved anvendelse av den humane østrogeneseptor a eller (3.

Kompetitiv binding til cytoplasmatisk human østrogenreseptor a eller p fra rekombinant kinesisk hamster-eggstokk- (CHO) celler blir anvendt for å bédømme den relative bindingsaffinitet (=RBA) (potensforhold) av en testforbindelse sammenignet med (17(3)-østradiol (E2) for østrogenreseptorer a eller (3 til stede i cytosolen til rekombinante CHO-celler, stabilt transfektert med den humane østrogeneseptor a (hERa) eller p reseptor (hERP).

Den østrogene og antiøstrogene aktivitet av forbindelser blir bestemt i en in vitro bioanalyse med rekombinante kinesisk hamster-eggstokk- (CHO) celler stabilt kotransfektert med den humane østrogenreseptor a (hERa) eller p (hERP), rotte-oksytocin-promoter (RO) og luciferase-rapportørgen (LUC). Den østrogene agonistiske transaktivering (potensforhold) av en testforbindelse til å stimulere transaktivering av enzymet luciferase mediert via østrogenreseptorene hERa eller hERp blir sammenlignet med standard østrogen østradiol. Den antiøstrogene aktivitet (potensforhold) av en testforbindelse til å hemme transaktivering av enzymet luciferase mediert via østrogenreseptorene hERa eller hERp av (17P)-østradiol blir sammenlignet med standard ICI 164,384 (= (7a,17p)-N-butyl-3,17-dihydroksy-N-metyløstra-1,3,5(10)-trien-7-undekanamid).

Resultater:

Forbindelse 17 har i antagonistforsøkene et selektivitetsforhold Era/Erp på

<0,1/67.

En forbindelse fra tidligere teknikk med formel 3, men uten 22-hydroksy og som har R7 a-propyl, Rn hydrogen og 6-leddet E-ring, som er betegnet (7a,16p, 17a)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol, har et ERa/ERp forhold i bindingsforsøket på 15/7 og i agonist-transaktiveringsforsøket 0,3/<0,1.

Test for forebygging av ovariektomi-fremkalt bentap i rotter (anti-osteoporosetest).

Innføring

Ovariektomi i rotter fremkaller bentap, som skyldes østrogenmangel. Administrering av østrogene forbindelser forhindrer denne effekten. Testen blir anvendt for å bedømme anti-osteoporose-aktiviteten til en forbindelse i ovariektomiserte (OVX) rotter. Effekten på benmasse kan evalueres ved perifer kvantitativ datatpmografi (pQCT) eller ved kvantitativ analyse av røntgenbilder. Plasma-osteocalcin og urinær deoksypyridinolin, kalsium og fosfat gir informasjon om benmetabolisme. Økning av livmorvekt og reduksjon av kropps- og thymus-vekt reflekterer østrogeneffekt.

Testd<y>r

Utviklede jomfruelige Wistar hunnrotter på 225-250 g. Stamme: Hsd/Cpd:Wu, SPF-avlet av Harlan, CPB, Zeist, Nederland.

Forsøk

På dag 1 av forsøket blir rottene veiet og fordelt i bur etter kroppsvekt, hvor rotten med den minste kroppsvekten blir plassert i det første buret og den tyngste rotten i det siste buret. Behandlingene er randomisert for rottene.

Sham-operasjon og ovariektomi blir utført under eter-bedøvelse. Etter restitusjon fra bedøvelsen, innen 24 timer, blir konstituent, referanseforbindelse eller testforbindelse administrert én gang eller to ganger daglig i 4 uker. I løpet av denne perioden blir rottene veiet ukentlig. Etter 4 uker ble autopsi utført. Ved autopsien blir rottene bedøvet med eter og blod blir oppsamlet fra bukaorta. Både lår, virvel L1L2L3L4 (eventuelt), livmor, thymus, lever, nyrer, binyrer, skjoldbrusk-kjertel og hypofyse blir dissekert ut. Måling av benmineral-tetthet og geometri av høyre lår blir utført ved pQCT på dagen for autopsi på friskt vev. Trabekulær benmineral-tetthet av metafyse-delen av låret (FBMDDIS mg/cm<3>) blir målt ved pQCT (perifer kvantitativ data-tomografi-maskin; XCT 960A, Stratec, Birkenfeld, Tyskland).

Tolking av resultater

Ovariektomi forårsaker en statistisk signifikant reduksjon i distal bentetthet

og trabekulært benvolum av låret og en statistisk signifikant økning i plasma-osteocalcin- og urinære deoksypyridinolin-nivåer (P < 0,05, 2-veis ANOVA).

Testforbindelser er betraktet som aktive når gjennomsnittlige bentetthet-verdier av distal femur er betydelig øket sammenlignet med den ovariektomiserte kontrollgruppe. Effekterjay forbindelser, på urinære deoksypyridinolin-nivåer reflekterer en effekt på benresorpsjon, effekter på plasma-osteocalcin-nivåer reflekterer en effekt på benomsetnihg og kan hjelpe til å forstå virknings-mekanismen.

Den minimale aktive dose (MAD) er dosen hvor en gjennomsnittlig proporsjonal forskjell i trabekulær benmineral-tetthet mellom 40 og 60% blir oppnådd.

Referanser

Wronski T.J. and Yen C.F.: The ovariectomised rat as an animal model for

postmenopausal bone loss. Cells and Materials, Supp. 1 (1991): 69-76.

Yamazaki I. and Yamaguchi H.: Characteristics of an ovariectomised

osteopenic rat model. J. Bone Min. Res. 4 (1989): 12-22.

Ederveen A.G.H. and Kloosterboer H.J.: Tibolone, a steroid with a tissue-specific hormonal profile, completely prevents ovariectomy-induced bone loss in sexually mature rats. J. Bone & Mineral Research Vol 14,

s. 1963-1970, 1999.

Resultat:

Forbindelse 17 (Org 41621): Osteoporosetest oral 30 u.g/kg.

Kjent forbindelse (7a, 16f3,17a)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol: 190 |ig/kg oralt.

Test av østrogenaktivitet in vivo

In vivo østrogenaktivitet ble bestemt ved hjelp av Allen Doisy-test, beskrevet i F.AIIen, L.A.Doisy, J.Amer. Med.Assoc, 8J..819-821 (1923)

Resultat:

Forbindelse 17 (Org 41621): Allen Doisy sc 5 |ig/kg , oral 30 ug/kg.

Kjent forbindelse (7a, 16p, 17a)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol: Allen Doisy sc 24 ug/kg , oral 125 ug/kg.

Claims

1. Steroidforbindelse som har formel (1): hvor: stiplede bindinger representerer eventuelle dobbeltbindinger; R6 er H, =CH2 eller-CH3 eller-CH2-CH3; R7 er H, Ci-4-alkyl, C2-5 alkenyl eller C2-5-alkynyl, hvor alkyl-, alkenyl- eller alkynyl-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer; Rn er H, C-M-alkyl, C2-4-alkenyl, C2-4-alkynyl eller Ci-4-alkyliden, hvor alkyl-, alkenyl-, alkynyl- eller alkyliden-gruppen kan være substituert med 1 til 3 halogenatomer uavhengig valgt fra gruppen fluor- eller klor-atomer; E representerer sammen med karbonatomer 16 og 17 i steroid-skjelettet en fire- til syv-leddet ring, hvor nevnte ring er a i c/s-konfigurasjon med hensyn til steroid-skjelettet, eventuelt omfattende én eller to endocykliske bindinger; eller et prodrug derav, hvor nevnte prodrug er forbindelser hvor hydroksylgruppene er koblet til en av de følgende gruppene: eter, ester, acyl, fosfat, sulfat, sulfonat og aromatisk karboksylat.

2. Steroidforbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R6 er H, R7 er C1.3-alkyl, E-ringen er en fem- eller seks-leddet ring uten dobbeltbindinger som har hydroksy i stilling 22 i S-stereokonfigurasjon.

3. Steroidforbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at forbindelsen har formel 2 betegnet (7a, 16p\17a, 22S)-7-propyl-16,24-cyklo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17,22-triol.

4. Steroidforbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for anvendelse i terapi.

5. Anvendelse av steroidforbindelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 for fremstilling av et medikament for en selektiv østrogenreseptor-relatert behandling.

6. Anvendelse ifølge krav 5, idet den selektive østrogen-reseptor-relaterte behandling er forebygging eller behandling av peri-menopausale eller post-menopausale plager.

7. Anvendelse ifølge krav 5, idet den østrogenreseptor-relaterte behandling er en frukbarhetshindrende behandling.

8. Farmasøytisk preparat omfattende steroidforbindelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 og et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel.