NO323754B1

NO323754B1 - Anvendelse av en sammensetning som omfatter anti-(alfa-fetoproteinreseptor)-antistoff til a femstille et farmasoytisk preparat til a behandle kreft

Info

Publication number: NO323754B1
Application number: NO19971256A
Authority: NO
Original assignee: Moro Ricardo J
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2007-07-02
Also published as: CA2197490A1; CN1132012C; RU2161042C2; EP1955714A1; CN100472213C; FI970990A0; CN1502994A; NO971256D0; EP0782709B1; DE69536019D1; US6514685B1; WO1996009551A1; EP1956374A1; AU3764895A; ES2336976T3; EP0782709A1; NO971256L; BR9508959A; DK0782709T3; CN1169778A

Description

Den aktuelle oppfinnelsen angår anvendelse av anti-(a-fetoproteinreseptor) antistoffer til fremstilling av et formasøytisk preparat til behandling av kreft; Helt spesielt, benytter den aktuelle oppfinnelsen seg av en AFP-reseptor som er til stede, og som danner grunnlaget for å kunne begrense eller eliminere kreft i en pasient.

For tyve år siden, rapporterte Abelev et al., tilstedeværelse av det første oncoftale antigenet, alpha-fetaprotein (AFP) [Abelev, G.I., Perova, S.D., Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A. og Irlin, I.S., Transplantation 1, 174 (1963)]. Selv om dette er det viktigste sirkulerende proteinet i løpet av fosterstadiet, forsvinner det nesten etter fødselen idet den normale voksne serumkonsentrasjonen er mindre enn 50 ng/ml [Ruoslahti, E. og Seppals, M., Int. J. Cancer 8, 374 (1971)]. Imidlertid, i. noen

ondartede sykdommer, slik som nepatokarsinom eller teratokarsinom, vil plasmanivåene være tusen ganger høyere [Ruoslahti, E. og Seppals, M. Adv. Cancer

Res. 29,275 (1979)]. Dette funnet fikk ikke bare klinikerenes oppmerksomhet, som

nå forestilte seg en ny fremgangsmåte for å påvise maligniteter og kunne overvåke kreftpasienter, men det var også interesse blant forskere som studerte fysiologien tilknyttet proteinet i løpet av fosterstadiet.

En av de første parameterene som ble undersøkt var AFP-fordelingen innenfor

fosteret. Ved bruk av immunoperoksidase metoder, beskrev Benno og Williams fordeling av AFP i den utviklende rottehjernen [Benno, R.H. og Williams, T.H.,

Brain Res. 142, 1982 (1978)]. Kort tid deretter rapporterte en hel rekke artikler lokalisering av plasma proteiner i løpet av utvikling av nerve-celler blant forskjellige arter, inkludert fugler og mann [Trojan, J. og Uriel, J., J. Oncodevelop.

Biol. Med. 1, 107 (1980); Uriel, J., Trojan, J., Dubouch, P. og Pieiro, A., Path. Biol.

30, 79 (1982); Moro, R. og Uriel, J., J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Dziegielewska, K.M., Evans, C.A.N., Lorscheider, E.L., Malinowska, D.H.,

Mollgard, K., Reynolds, M.L. og Saunders, N.R., J. Physiol. 318, 239 (1981);

Mollgard, K., Jacobsen, M., Krag-Jacobsen, G., Praetorius-Claussen, P. og

Saunders, N.R., Neurosci. Lett. 14, 85 (1979). Når det gjelder et spesielt vev eller et organ, følger kinetikken for farging etter AFP og SA et nokså konstant mønster blant alle forskjellige artene, [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. and Pieiro, A., Ann.

N.Y. Acad. Sei. 417, 321 (1983)]. Når en nervestruktur er meget umoden, blir intet intracellulært AFP eller SA påvist. Deretter skjer det plutselig, og i løpet av et spesielt tidsrom, avhengig av artene at begge proteinene blir observert samtidig, til og med inne i samme celle [Torand-AUerand, C.D., Nature 286, 733 (1980)].

Deretter blir fargestyrken blekere, og det blir mer og mer uvanlig å se positive

celler, først når det gjelder AFP og senere for SA. Modne strukturer er negative for begge proteiner. Andre serumbestanddeler, slik som IgG, eller ovalbumin i hønsefostre, blir aldri funnet i løpet av fosterstadiet inne i nøytrale celler, til tross for at de er til stede i cerebrospinal væsken [Fielitz, W., Este ves, A. og Moro, R.,

Dev. Brain Res. 13, 111 (1984)].

AFP innlemmelse ved embryone celler.

Et spørsmål som oppsto fra disse opprinnelige iakttakelser var. hvorvidt AFP og SA ble innlemmet fra ekstracellulære kilder eller syntetiserte in-situ. Selv om det ennå ikke er helt klart hvorvidt nøytrale celler er i stand til å syntetisere plasmaproteiner [Ali, M, Raul, H. og Sahib, M., Dev. Brain Res. 1, 618 (1981); Ali, M., Mujoo, K. og Sahib, M.} Dev. Brain Res. 6,47 (1983); Schachter, B.S. og Toran-AUerand, C.D., Dev. Brain Res. 5, 95 (1982); Pieiro, A., Calvo, M., Iguaz, F., Lampreave, F. og Naval, J. Int. J. Biochem. 14, 817 (1982)], har det blitt demonstrert, både i in-vitro [Uriel, J., Faivre-Bauman, A., Trojan, J. og Foiret, D. Neurosci. Lett. 27, 171 (1981); Hajeri-Germond, M., Trojan, Uriel, J. and Hauw, J.J. Dev. Neurosci. 6, 111 (1984)] og in-vivo [Villacampa, M.J., Lampreave, F., Calvo, M., Pieiro, A. og Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. og Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci. 2, 143 (1984)], at nevroblaster ganske lett kan innlemme AFP og serum albumin fra ekstracellulære kilder. In-vivo eksperimentene ble utført med homologe og med heterologe proteiner. I det første tilfellet [Villacampa, M.J., Lampreave, F., Calvo, M., Pieiro, A. og Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984)], viste det seg at etter innsprøytning i gravide rotter, ble 1251-AFP lokalisert i fosterhjernen, og også i andre fosterorganer, slik som tarm, hud og tunge, og organer hvor naturlig forekommende intracellulær AFP tidligere var blitt rapportert [Trojan, J. og Uriel, J., Oncodev. Biol. Med. 3, 13 (1982)]. Neste sett med eksperimenter [Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. og Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci. 2, 143 (1984)] viste at når serum fra nyfødte rotter ble sprøytet inn i den mesencephale åpningen hos hønsefostre, kunne rotte AFP og rotte SA påvises på samme beliggenhet som deres naturlig forekommende motparter. Dette viste også at AFP og SA fra en art blir tatt opp av celler fra en annen art, og på denne måten peker det på strukturer og mekanismer som har blitt opprettholdt gjennom evolusjon. Dette antyder således at et grunnleggende biologisk prinsipp er involvert.

Til tross for de høye konsentrasjonene med rotte IgG som ble innsprøytet, var farging for dette proteinet negativt. Dette var ikke en følge av den høye molekylvekten (150.000) som kunne forhindre en passive diffusjon, da ovalbumin (MW=43.000) heller ikke kunne påvises, til og med når det ble sprøytet inn med dobbelte mengder av normale molare konsentrasjoner av AFP i den embryone cerebrospinalvæsken [Fielitz, W., Esteves, A. og Moro, R., Dev. Brain Res. 13,111

(1984)]. Denne selektiviteten var til fordel for hypotesen som gjaldt en spesifikk

reseptor formidlet mekanisme av endocytose [Moro, R. og Uriel, J., J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. og Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci. 2, 143 (1984)].

AFP innlemmelse er avhengig av celledifferensiering.

Imidlertid var det fremdeles på dette tidspunkt uklart hvorvidt opptak av AFP og SA var et celleavhengig fenomen, eller hvis fargen forsvant som en følge av lav ekstracellulær protein tilgjengelighet takket være forhindring ved blod-hjerne-barrieren eller den lave konsentrasjonen av sirkulerende AFP mot slutten på . fosterlivet. Det ble demonstrert, først hos høns [Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253

(1983)] og deretter i menneskefostre [Jacobsen, M., Lassen, L.C. og Mollgard, K.,

Tumor Biol. 5, 55 (1984)], at nevral cellene i spinal gangliet oppnår hele den negative-positive-negative fargingssyklusen for AFP før den høyeste toppen i serum ble nådd. I tillegg, når AFP ikke lenger kan påvises, er SA fortsatt til stede en stund, som er et tegn på at disse serumproteinene har tilgang til de ganglione nevroblaster.

AFP-reseptorer i umodne celler.

Det cellulære opptaket av AFP antyder tilstedeværelse av en spesiell reseptor hvis fremvisning blir regulert i følge graden av celledifferensiering [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. og Pieiro, A., Ann. N.Y. Acad. Sei. 417, 321 (1983); Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253 (1983)]. En tidligere rapport [Uriel, J., Bouillon, D., Russel, C. og Dupiers, M., Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 73, 1452 (1976)] påviste tilstedeværelse av to ultrasentrifugerings-fraksjoner bestående av AFP i umodne uterine cytosoler i rotte; en 4s fraksjon, som svarer fullstendig til AFP, og en 8s fraksjon hvor den immunologiske påvisning av AFP bare var mulig etter behandling med 0,4 M KCI. Denne behandlingen forandret 8s brøkdelen til en 4s. Det er høyst sannsynlig at 8s fraksjonen tilsvarte et reseptor-AFP kompleks som ikke ble atskilt ved høye KCI konsentrasjoner, selv om AFP-reseptorbegrepet ennå ikke var oppfunnet på det tidspunktet. Denne atskillelse av AFP-reseptor- komplekset med KCI ble også observert av Smalley og Sarcione [Smalley, J.R. og Sarcione, E.J. Bioch. Biohys. Res. Comm. 94, 1429 (1980)] som også skaffet til veie bevis på at AFP molekylet kunne syntetiseres ved hjelp av umodne rottelivmorceller.

Påvisning av AFP-reseptor i kreftceller.

I og med at kreftceller har en rekke biokjemiske og antigene egenskaper til felles med fosterceller [Uriel, J., Adv. Cancer Res. 29, 127 (1979)], er det mulig at ondartede celler, som stammer fra vev som innlemmer AFP i løpet av fosterlivet, på nytt kan uttrykke den tilsvarende reseptoren og deretter oppta AFP igjen. Som støtte for denne hypotesen, har Sarcione et al. [Sarcione, E.J., Zloty, M., Delluomo, D.S., Mizejewski, G. og Jacobson, H., Cancer Res. 43, 3739 (1983)] funnet AFP i et 8s kompleks som stammer fra human brystkreft som kunne atskilles ved hjelp av KCI behandling på samme måte som i de eksperimentene hvor umodne rotte cytosoler er benyttet. Ganske nylig har disse forfatterne demonstrert at AFP blir syntesisert av MCF-7 humane brystkreftceller som et kompleks som trenges å bli atskilt, for å kunne gjøre AFP immunologisk påvisbar [Sarcione, E.J. og Hart, D., Int. J. Cancer 35, 315 (1985)]. På den annen side viste det seg at denne cellelinjen [Uriel, J., Failly-Crepin, C, Villacampa, M.J., Pieiro, A., og Gueskens, M., Tumor Biol. 5,41

(1984)], og et nikkel-indusert rotte-rhabdomyosarkom [Uriel, J., Poupon, M.F. og Geuskens, M., Br. J. Cancer 48, 263 (1983)], tok opp AFP in vitro. Som en bekreftelse på disse indirekte resultatene, ble overflatereseptorer for AFP påvist på MCF-7 linjen [Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J., Failly-Crpin, Ch., Lampreave,

F. og Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122, 1322 (1984)]. Bindingsparameterene peker på en to-punkts reseptormodell som viser positivt samarbeide. Høyaffinitetsområdet har en Kd på 1,5 x 10-9 M med påvist positivt samarbeide. Høyaffinitetsområdet har en Kd på 1,5 x 10-9 M med en n-2.000/celle. Lavaffinitetsområdet, til stede ved 320000/celle, har en Kd på 2,2 x 10-7 M. Senere undersøkelser viste tilstedeværelse av et lignende reseptorsystem på overflaten av mus YACT lymfome celler, som ikke er til stede hos normale voksne miis T celler [Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. og Uriel, J. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82, 3301 (1985)].

Disse undersøkelsene ble utført samtidig med in-vivo eksperimenter hvor mus med spontane brysttumører (svulster) ble innsprøytet med jodmerket AFP. Vevsfordelingen av radioaktivitet viste et tumor/normalt vev (lever) forhold på 3,6 [Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro* R., Naval, J. og Failly-Crpin, CH. CR. Acad.

Sei. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. og Failly-Crpin, C , Cancer Res. 44, 5314 (1984)]. Autoradiografi av tumorsnitt fra

disse dyrene viste en stor oppsamling av sølvkrystaller rundt nukleærmembranen på ondartede celler, men ikke på normale celler. [Uriel Ji, Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. og Failly-Crpin, C, Cancer Res. 44, 5314 (1984)].

Scintigrafisk fremstilling av tumører hos mus ved bruk av 13II-AFP

Ved å bruke <131>I-AFP, har positive scintigrafiske bilder av brysttumører hos mus

blitt påvist, som er så små som 3-4 mm [Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R.,

Naval, J. og Failly-Crpin, C, Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moro, R., Heuguerot,

C, Vercelli-Retta, J., Fielitz, W., Lpéz, J.J. og Roca, R., Nuclear Med. Comm. 5, 5

(1984)]. Det viste seg at elleve av tolv av denne typen tumører ble påvist med et standard gamma kamera tilknyttet til en datamaskin. En annen mus-tumor, et nevroblastom, kunne også avsøkes på en lignende måte [Hajeri-Germond, M.,

Naval, J., Trojan, J. og Uriel, J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)].

Påvisningen av AFP opptak eller direkte bevis på AFP-reseptoren har blitt vist i mange forskjellige typer tumører, som blant annet de følgende: Et rotte rhabdomyosarkom [Uriel, J., Poupon, M.F. og Geuskens, M., Br. J. Cancer 48,263

(1983)], et mus nevroblastom [Hajeri-Germond, M., Naval, J., Trojan, J. og Uriel,

J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)], mus og humant mammae-karsinom [Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J., Failly-Crpin, Ch., Lampreave, F. og Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122,1322 (1984); Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel,

A.F. og Uriel, J. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82, 3301 (1985); Uriel, J.,

Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. og Failly-Crpin, CH. CR. Acad. Sei. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. og Failly-Crpin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moroj R., Heuguerot, C, Vercelli-Retta, J., Fielitz, W., Lpez, J.J. og Roca, R., Nuclear Med. Comm. 5, 5 (1984); Biddle, W. og Sarcione, E.J., Breast Cancer Res. Treat. 10,281 (1987)] mouse T lymphomas [Naval, J., Villacampa, M. J., Goguel, A.F. og Uriel, J. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82, 3301 (1985), human T and B cell lymphomas [Laborda, J., Naval, J., Allouche, M., Calvo, M., Georgoulias, V., Mishal, Z. og Uriel, J. Int. J. Cancer 40, 314 (1987); Calvo, M., Laborda, J., Naval, J., Georgoulias, V. og Uriel, J., presented på XIII motet av the ISOBM (Paris 1985); Torres, J.M., Anel, A., og Uriel, J., J. Cell Physiol. 150,458 (1992); Torres, J.M., Gueskens, M. og Uriel, J., Int. J. Cancer 47, 112 (1991)] i tillegg ti phittohemaglutinin activated human T lymphocytes [Torres, J.M., Laborda, J., Naval, J., Darracq, N., Calvo, M., Mishal, Z. og Uriel, J. Mol. Immunology 26, 851 (1989)], the human malignant monocyte cell line U937 [Suzuki, Y., Zeng, C.Q., Alpert, E.J. Clinic. Invest. 90, 1530 (1992)] and the HT29 human colon karsinoma cell line [Esteban, C, Gueskens, M. og Uriel, J., Int. J. Cancer 49,425 (1991)].

Disse funn plasserer AFP-reseptoren som et omfattende onkofetal antigen, tilknyttet den ondartede tilstanden istedenfor tumor-typen.

Monoklonale antistoffer mot ÅFP-reseptoren.

Merket AFP (FITC, radioaktive merker) bindes ikke til tumorcellene på parafin-vevsnitt, sannsynligvis takket være den delvise denatureringen av reseptorens bindeområde i løpet av fikseringen, og til den relative lave affinitet som den påviser mot sin reseptor. Derfor ble monklonale antistoffer (Mabs) mot AFP-reseptoren fremstilt ved bruk av en samling av humane bryst karsinom som immunogenet [Moro, R., Tamaoki, T., Wegmann, T.G., Longenecker, B.M., og Laderoute, M.P. Tumor Biol. 14, 116 (1993), inkludert som referanser]..

De to IgM fremstillende Mabs igjenkjenner et 67 KD dobbeltbånd på PAGE geler under ikke-reduserende forhold. 67 KD båndene er også reaktive med <12>SI-AFP. Disse Mabs reagerer med bindingssetet på AFP-reseptoren, i og med at de hindrer binding av AFP til tumorceller, og i motsatt tilfelle er de forhindret fra binding til cellene i nærvær av et stort overskudd av AFP. Mabs reagerer ikke med AFP. De kjenner igjen fosterceller og brystadenom på vevsnittene, men ikke brystadenom eller de fleste andre normale voksne vevtypene. I løpet av de siste ti-årene, har vitenskapsmenn forsøkt å karakterisere antigener som er tilknyttet maligniteter. AFP-reseptoren, som skulle ansees for å være en onkoføtal antigen, kunne oppfylle mange av kravene for en klinisk brukbar svulstmarkør. Videre arbeide ved hjelp av monoklonale antistoffer mot denne utbredte kreften tilknyttet antigen, vil gjøre det mulig for en person å påvise deres kliniske brukbarhet samtidig som man også kan undersøke AFP mottakerens fysiologiske rolle.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe en anvendelse av AFP-reseptorantistoffet til å fremstille et farmasøytisk preparat for å behandle kreft. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Den foreliggende oppfinnelsen angår anvendelse av anti-AFP-reseptor antistoffer til fremstilling av et medikament til å behandle kreftceller i en pasient.

Den foreliggende oppfinnelsen angår også til en anvendelse som angitt ovenfor til å vaksinere en pasient.

I de vedlagte tegningene, har oppfinnelsens foretrukne utforming og de fremgangsmåtene for å bruke utformingen blitt illustrert på følgende måte:

Figur 1 er en tabell som består av ondartede og godartede sykdommer.

Figur 2 er et fotografi av bryst karsinom hvor de lyse cellene er ondartede. Figur 3 er et fotografi av bryst karsinom hvor de mørke brune cellene er

ondartede.

Figur 4 er et godartet brystadenom.

Figur 5 er et fotografi av lunge karsinom hvor de brune cellene er kreftceller. Figur 6 er et fotografi av magekreft hvor de mørke brune er kreftceller. Figur 7 er et fotografi av tarmkreft. Figur 8 er et diagram som viser P-388 veksthemming av AFPr-1. Figur 9 er et fotografi med tre kontroll dyr øverst, og fire behandlede dyr

etter fem dager med innsprøytninger.

Figur 10 viser et fotografi av dyr fra et annet eksperiment hvor tre dyr

har blitt behandlet og som nå er sykdomsfrie, og hvor to har store

svulster.

Den foreliggende oppfinnelsen angår en anvendelse til å tilveiebringe et farmasøytisk preparat for behandling av kreftceller i en pasient. Anvendelsen består av fremstilling av medikamenter hvor AFP-reseptor-antistoffer introduseres for kreftceller hos pasienten. Antistoffene kan være monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, antistoffer fra helt andre arter enn pasienten, eller antistoffer som har blitt fremstilt in-vitro fra lymfocytter av samme type som pasientens. Deretter finnes det et trinn hvor AFP-reseptor-antistoffer reagerer med AFP-reseptor-kreftceller for å forhindre tilvekst av kreftcellene eller for å tilintetgjøre kreftcellene.

Det fremstilte medikamentet kan benyttes ved at AFP-reseptor-antistoffer sprøytes inn i pasienten. Det trinnet hvor innsprøytning finner sted kan bestå av et trinn hvor AFP-reseptor-antistoffer sprøytes intravenøst inn i pasientens blodomløp. Alternativt kan trinnet hvor innsprøytning finner sted bestå av et trinn hvor AFP-reseptor-antistoffer sprøytes inn i pasienten på et sted i nærheten av kreftcellene.

Nok en utforming består av at behandlingen kan inkludere et trinn hvor pasienten vaksineres mot kreftceller. Vaksineringstrinnet kan inkludere et trinn hvor AFP-reseptor fra en annen art enn pasienten, sprøytes inn i pasienten for å forårsake at AFP-reseptor-antistoffer blir fremstilt av pasienten mot den innsprøytede AFP-reseptoren. AFP-reseptor-antistoffene fremstilt av pasienten vil kryssreagere med AFP-reseptoren eller kreftcellene i pasienten.

Reaksjonstrinnet kan bestå av et trinn hvor man lar AFP-reseptoren for kreftceller i pasienten reagere med AFP-reseptor-antistoffer slik at AFP-reseptoren for kreftceller blir blokkerte eller funksjonelt skadet. En annen mulighet er at AFP-reseptor-antistoffer er AFP-reseptor-antistoffer som fikserer komplementet. Da vil reaksjonstrinnet bestå av et trinn hvor AFP-reseptor-antistoffene reagerer som fikseringskomplement til kreftcellen, slik at når komplement-kjedereaksjon finner sted, blir det stukket hull på kreftcellens hinne som dreper kreftcellene.

I en annen utforming av anvendelsenvil AFP-reseptor-antistoffer inneholdt i det fremstilte medikamentet bli konjugert til legemidler eller toksiner. Deretter vil reaksjonstrinnet bestå av et trinn hvor AFP-reseptor-antistoffer reagerer med de konjugerte legemidlene eller toksiner til kreftcellene, slik at kreftcellene opptar legemidlene eller toksinene i kreft-cellene, hvor enzymer fra kreftceller spalter legemidlene eller toksinene fra antistoffene og forårsaker at cellene blir fullstendig ødelagte og. tilintetgjort.

I enda en alternativ versjon, blir AFP-reseptor-antistoffene inneholdt i det fremstilte medikamentet radiomerket. Deretter vil reaksjonstrinnet bestå av et trinn hvor radiomerkede AFP-reseptor-antistoffer reagerer med kreftceller i pasienten, slik at bestråling fra de radiomerkede AFP-reseptor-antistoffene like i nærheten av kreftcellenes DNA vil skade og deretter resultere i dreping av kreftcellene.

Rent generelt, bortsett fra bruk av AFP, modifisert AFP eller antistoffer som reagerer med AFP-reseptor, vil de ovennevnte fremgangsmåtene være kjent for personer som har kunnskap på området.

Bruk av det farmasø<y>tiske preparatet

I kroppsvæsker:

Enten ved sekresjon eller ved passiv spredning etter celledød, kan AFP-reseptoren fra kreftvev eller føtalt/embryont vev frigjøres inn i blodomløpet og derifra inn i mange andre kroppsvæsker, slik som urin, tårer, spytt; etc. AFP-reseptor-konsentrasjonén i kroppsvæskene (inkludert serum) ville da være signifikant forskjellig hos friske personer og hos kreft-eller gravide pasienter. I tillegg vil utvikling av AFP-reseptor-konsentrasjonen i disse kroppsvæskene også kunne

brukes til etterkontroll. For eksempel: En pasient blir diagnostisert med brystadenokarsinom og serumkonsentrasjonen av AFP-reseptoren er høy. Pasienten blir deretter operert og svulsten fjernes. Senere AFP-reseptor-påvisninger i serum viser en skarp økning like etter operasjonen, etterfulgt av et platå. Seks måneder senere begynner imidlertid konsentrasjonen av AFP-reseptoren i serum å øke igjen. Dette er et tegn på tilbakefall eller metastase av kreften, som sannsynligvis nå påvises før de tradisjonelle kliniske eller andre diagnostiske metodene. Ved å ha blitt varslet på forhånd gjennom en forholdsvis billig test, av den typen som nå blir foreslått, kan legen nå kunne lete etter en masse med mer sofistikerte, dyrere, og hvis nødvendig, mer invasive fremgangsmåter.

I vevsprøver:

AFP-reseptoren er til stede i de fleste kreftceller. Derfor kan den påvises ved hjelp av immunohistologiske metoder eller inkubasjon med AFP, passende merket (selv om det sistnevnte forslaget ikke er blitt brukt med hell på parafinsnitt, så fungerer dette på frosne snitt). Basert på dette, kan en diagnose av malignitet gis. I tillegg, ved bruk av fluorescein som merke, kan meget få positive celler påvises på et vevsnitt. Dette reduserer feilmarginen som ble oppnådd med en klassisk patologisk analyse hvor ondartede kreftceller i et ellers normalt vev ellers ikke ville bli sett. I tillegg, i og med at uttrykk av AFP-reseptor ikke er rettet på anatomiske endringer, men til differensiering og biokjemiske endringer, er det sannsynlig at celler, som ellers ville virke normale, men som i virkeligheten er i tidlige stadier av tumordannelse, vises som positive hvis de testes for å påvise AFP-reseptoren.

Igjen, for å gjøre det helt klart, selv om det ikke er noen forskjell i prinsippet, og kun meget liten forskjell i de teknikkene som brukes, vil påvisning av en AFP-reseptor i kroppsvæsker og vevsnitt bli behandlet separat: Denne beskrivelse vil illustrere området i tilknytning til oppfinnelsen.

Kroppsvæsker:

Eksempel 1

I et eksempel, ble 22 serumprøver fra pasienter uten kreft og 17 prøver fra pasienter med malign kreft testet ved hjelp av en enzym immunoassay (EIA) for AFP-reseptor-konsentrasjon. Den følgende teknikken ble brukt: EIA 96 brønnersplater ble belagt fra 1 time til over natten med serum prøver fra de ovennevnte gruppene, oppløst 1/16384 i fosfat bufret saltoppløsning (PBS) (0,05 M P04, 0,15 M NaCl, pH 7,5). Noen brønner ble belagt på lignende måte med en pleuraeffusjon i 1/256 fortynning fra en pasient med lungemestastase fra brystkreft. Dette materialet, navnkodet P89, ble brukt som en standard på grunn av de store mengdene som var

tilgjengelige. Dette gjorde det mulig å bruke P89 som samme standard for sammenlikning av alle prøvene mot alle de andre i alle eksperimentene. Etter skylling 3 ganger med PBS ble ikke-spesifikke bindeseter blokkerte med 1% ovalbumin eller gelatin i PBS i 1 time. Etter å ha blitt skylt 3 ganger, ble 100 ul av en 1/200 fortynning i 1% ovalbumin i PBS fra monoklonale antistoff (Mab) ascitter fremstilt i mus, og rettet mot AFP-reseptor ( Mab 167H. 4 slik som beskrevet i

[Moro, R., Tamaoki, T., Wegmann, T.G., Longenecker, B.M., og Laderoute, M.P. Tumour Biol. 14, 116 (1993)], inkludert som referanse) og inkubert i hver brønn i 3 timer. Deretter ble brønnen skylt 3 ganger med PBS, og en kommersiell peroksidase-anti-mus IgM blanding ble tilsatt i konsentrasjonen anbefalt av leverandøren (Sigma Chemicals, S. Louis). Etter 1 time, ble platene skylt 3 ganger med PBS, og fargesubstratene for peroksidase (ABTS) ble tilsatt i konsentrasjonen anbefalt av leverandøren (Sigma). All inkubasjon bie utført ved romtemperatur. Etter en halv time ble den optiske tettheten (O.D.) i hver brønn avlest med 405 nm ved bruk av en standard Titertek plateleser. Resultatene vises i tabell I og figur 1.

Tabellen viser pasienten, svulsttypen og forholdet mellom prøven og P89 brukt som en standard gjennom hele undersøkelsen. Resultatene viser at alle kreftpasientene, bortsett fra en, var positive når terskelen mellom positiv og negativ blir innstilt på 54% for P89. Pasienter uten kreft var. alle negative, bortsett fra en, ved bruk av samme terskel. En uavhengig T-test gav de følgende verdier (hvor data analyse i Excel (TM) har blitt brukt).

En to-halet analyse gir en p=0,00000054, et meget signifikant tall, til og med for det lille antallet prøver som man har her.

En pasient (ikke inkludert i denne tabellen) fra den negative kontrollgruppen var positiv. Da man ble varslet hvor signifikante de oppnådde data var, utførte den ansvarlige lege for denne pasienten en CAT-scan, og fant en svulst som viste seg å være et ondartet hypernefrom. Denne ondartede tumor ble først oppdaget ved bruk av denne prøven, og DERETTER bekreftet klinisk.

Figur 1 viser samme resultat uttrykt i en grafisk fremstilling hvor X-aksen har blitt oppdelt i 2 deler (ondartet og godartet, enhetene er ikke viktige) og hvor Y-aksen representerer P89 prosenten for hver pasient. Den horisontale linjen representerer +/-54% av terskelen.

Eksempel 2

Et tilstrekkelig plast- eller glass-substrat (EIA plater eller prøverør) vil bli dekket med monoklonale antistoffer (Mab) mot AFP-reseptor med en passende konsentrasjon. Etter at ekstra mengder Mab ble skylt av, ble substratet blokkert med en uviktig protein- eller amino-syreblanding for å unngå uspesifikk binding, og en passende prøveoppløsning, fra en pasientens kroppsvæsker (serum, spytt, urin, etc.) ble inkubert med det belagte substrat i et passende tidsrom. Etter at man skylte det hele for å fjerne det ikke-bunnede (det frie) prøvematerialet, ble et annet antistoff tilsatt, av en polyklonal type (polyklonale antistoffer blir fremstilt ved å immunisere et dyr, og deretter ved å bruke dyrets serum som kilde for antistoffer for reaksjonen, i motsetning til Mabs, som ble fremstilt av individuelle kloner av immortaliserte miltceller i kultur og podet til en passende vert). Dette antistoffet kan konjugeres til et passende merke eller et enzym som kan utvikle en farge, eller på annen måte påvise reaksjon, eller så kan prøven gjennomføres ved at man tilføyet et anti-andre antistoff, merket med nevnte merke eller enzym. Hvis reaksjonen involverer dette tredje antistoffet, så må det andre antistoffet bli fremstilt i forskjellige arter enn det første antistoffet, og ingen kryssreaksjon mellom de første og tredje antistoffene skulle da bli påvist. Denne reaksjonen blir deretter lest av en passende detektor tilsvarende den type reaksjon som utvikles (farge, konduktivitet, kemiluminesens, etc).

Eksempel 3

På samme måte som eksempel 2, men ved å bruke to forskjellige polyklonale antistoffer istedenfor et monoklonalt, samt et antistoff for henholdsvis det første og andre antistoffet.

Eksempel 4

På samme måte som i eksempel 2, hvor substratet er nitrocellulose eller en nylonmembran. Reaksjonen blir ikke målt av et apparat, men det vises som en fargeflekk på substratet; Reaksjonen er ansett for å være positiv eller negativ til det blotte øyet.

Eksempel 5

På samme måte som i eksempel 3 hvor substratet er av nitrocellulose eller en nylonmembran. Reaksjonen blir ikke målt med et apparat, men blir vist som en fargeflekk på substratet. Reaksjonen er ansett for å være positiv eller negativ til det blotte øyet.

Eksempel 6

En av antistoffene I eksempler 2-5 ble erstattet av homolog eller heterolog AFP som bindes til reseptoren.

Eksempel 7

KCI i konsentrasjoner på over 0,4 M av KCI separeres fra AFP-reseptor-

komplekset. Dette frigjør en ekstra mengde av AFP-reseptoren som kan forbli upåvist da gjenkjennelse av en av ligandene (Mab, polyklonale eller AFP),

beskrevet i et av de tidligere eksemplene, kan bli skadet av endogen AFP som eventuelt kan være til stede i sirkulerende AFP-reseptor- komplekser. Som en følge,

kan mengden med AFP-reseptor økes, og på denne måten økes følsomheten i prøven. I dette tilfellet, kan prøven bli behandlet med KCI før og i løpet av. inkubasjon med den solide fasen av prøven.

Eksempel 8

Alle de ovennevnte eksemplene hvor merket er en radioaktiv blanding (for radioimmunassey og tilknyttede fremgangsmåter).

Eksempel 9

Alle de ovennevnte hvor lesingen av assayet utføres av cheuriluminescens eller fluorescens.

Eksempel 10

Alle de ovennevnte hvor lesingen er basert pa konduktivitet

I vevsprøver:

Vevprøven kan skaffes til veie og behandles på forskjellig måter:

KILDER:

(a) Fra organprøver fjernet ved kirurgiske inngrep.

(b) Ved utstryk fra sekresjoner eller andre kroppsvæsker eller ved kontakt (PAP utstryk).

(c) Fra nålebiopsier.

Behandling av vevet før måling for å påvise AFP- reseptor

Vevsprøvene kan bli fikserte og skåret, hvis nødvendig, på forskjellige måter:

a) Frosne snitt: Vevet er frosset fast før det skjæres. Et fiksativ kan brukes eller vil eventuelt ikke bli brukt på disse snittene. b) Parafinsnitt: Vevet blir rutinemessig behandlet slik at prøven kan settes fast i en parafinblokk før det skjæres. c) Akrvliske og andre behandlingsmåter: Stort sett for elektron-mikroskopi-behandling.

Eksempel 11

I dette eksemplet, ble rutinemessig parafinsnitt brukt fra en patologisk avdeling på

et sykehus. Vevet ble skåret i 4-8 um tykke snitt. Etter rehydrering ble snittene inkuberte i en oppløsning av monoklonale antistoff (Mab) asciter mot AFP-reseptor oppløst 1:2000. Førtifem minutter senere ble snittene vasket og inkubert med en anti-mus IgG + IgG peroksid eller Rhodamin-merket blanding. Etter 45 minutter ble

snittene igjen skylt og enten observert under mikroskopet med passende lyskilde, eller inkuberte med peroksidsubstratet DAB, helt til farge ble fremkalt. Snittene ble deretter montert rutinemessig og observert under klart lys. Figur 2-7 viser

fotografier av Rhodamintf arget AFP-reseptor på brystkarsinom (Fig. 2-3), et godartet brystadenom (Fig. 4), et lungekarsinom (Fig. 5), magekreft (Fig. 6), og et tarmkarsinom (Fig. 7). Figurene viser at kreftcellene eller strengene eller stripene på kreftcellene er positivt farget, mens de godartede tilstøtende vevene ikke er. Dette er tydelig i Fig. 4 som viser et godartet brystadenom. Cellene er negative og det finnes ingen fargeforskjell mellom adenomcellene og det omgivende normale vevet.

Behanding av kreft

Påvisning av kansermerkeré på overflaten av kreftceller gjør det mulig å bruke disse til å angripe kreftceller for terapeutiske formål.

Det finnes en hel rekke fremgangsmåter for å fremme dreping av celler ved hjelp av overflateantigener. For eksempel kan man ganske enkelt bruke antistoffer som fikseringskomplement. Når komplementet-kjedereaksjon finner sted, blir hull laget i cellemembranen som resulterer i at cellene drepes. En annen mulighet er å bruke anti-svulst antigen antistoffer som har blitt konjugert til legemidler eller toksiner. Når disse har blitt festet til celleoverflaten, blir blandingen opptatt av celle cytoplasma, hvor celle-enzymer frigjør legemidlene eller toksinene fra antistoffene. Når disse blir frigjorte, vil legemidlene eller toksinene skade cellen for alltid og cellen drepes. I en annen situasjon, kan radiomerkede antistoffer brukes. Når de først har blitt festet til cellen, vil strålingen, like i nærheten av cellens DNA, resultere i skade på sistnevnte og derfor fremme dreping av cellen i den neste replikasjonen.

Hovedbestanddelen i alle de ovennevnte fremgangsmåter er antistoffer, som spesielt kjenner igjen ondartede celler. Hvis den (AFP-reseptoren) brukes som en kreftmerker, så vil ikke bare antistoffene mot den bli brukt som målsøkende molekyler, men alpha-fetoproteinet (AFP) vil selv spesielt være i stand til å kjenne igjen reseptoren. Derfor kan AFP også bli merket med en hel rekke cytolytiske midler for å fremkalle celledød.

I tillegg til å ødelegge kreftceller, kan siste versjon også bli brukt til å stoppe proliferering, slik som vist i det følgende eksempelet.

Eksempel 12

P-388 museceller, som uttrykker AFP-reseptor, ble inkuberte med forskjellige oppløsninger fra et monoklonalt antistoff mot AFP-reseptor. En komplement fikserings-prøve hadde blitt utført tidligere og viste ingen celle-ødeleggelse takket være komplementfikseringen. Etter 2-6 timer med inkubasjon ble P-388 celler pulsert med <3>H-tymidin, skylt og talt. Figur 9 viser det radioaktive tyminantallet på celler behandlet med samme konsentrasjon med AFPr-1 (et anti-AFP-reseptor monoklonalt antistoff) eller normalt museserum. Som ventet kan P388 proliferering bli meget redusert av Mab. Det er imidlertid interessant å se at når cellene blir inkubert i noen få timer med Mab, og deretter skylt og plassert i kultur igjen, vil deres replikasjonsrate være meget lik den man får fra kontrollgruppen som har blitt behandlet med irrelevante antistoffer (normalt muse-serum), som er et tegn på at cellene ikke blir drept, men forhindret fra proliferering av Mab. Prolifereringshindringen in-vi tro ble også observert på det menneskelige Lo Vb fordøyelseskanal kreftcellelinjen (resultatene er ikke vist).

Årsakene til at celle-proliferering forhindres er ikke klarlagt. En mulig forklaring er at AFP, i løpet av fosterstadiet, antas å bringe fettsyrer inn i fostercellene. Disse fettsyrene er nødvendige for at cellene skal kunne syntisere membranen som har en meget aktiv oppgave i løpet av organogenesen. Da den ekstracellulære konsentrasjonen av AFP varierer fra tid til annen, og fra et vev til et annet, kan det være dødelig for en celle å dele seg når konsentrasjonen av AFP som omgir den er utilstrekkelig. Dette begrepet støtter ideen om at AFP-reseptoren kan fungere som en budbringer mellom cellemembran og kjernen. Antistoffene mot AFP-reseptoren beskrevet i eksperimentene med P388 kan eventuelt på en eller annen måte "forsinke" budskapet til kjernen, og derfor blir cellen ikke oppdelt. Dette er viktig i og med at det finnes andre måter som kan "blokkere" AFP-reseptorsystemet ved å bruke andre stoffer enn Mabs, slik som vil bli diskutert nedenfor.

Et viktig hensyn både i dette eksemplet og andre er at mus anti-AFP-reseptor monoklonale antistoffer fremstilt mot humane AFP-reseptorer også gjenkjenner kreftceller hos mus. En lignende kryssreaktivitet mellom artene ble observert i bindingsundersøkelser når AFP fra en art ble inkubert og bundet til celler fra forskjellige arter, og på denne måten foreslå samsvarende paralleller mellom AFP-reseptorene fra en annen art.

Eksempel 13

C57 Black mus ble innsprøytet samtidig med 2 x IO<6> EL-4 celler subkutant i maven, og 100 ul av anti-AFP-reseptor asciter eller normalt museserum som en kontroll inn i halevenene. Takket være en mindre histo-inkompatibilitet, ble dyrene bestrålet med 300 rads. Dette hjalp EL-4 cellene med å oppta og fremstille tumører. Dyrene ble observert i opp til 21 dager; deretter drept og fotografert. Figur 10 og 11 viser resultatene fra to av denne type eksperimenter. Figur 10 viser 3 kontrolldyr øverst (innsprøytet med normalt museserum) og 4 behandlede dyr (innsprøytet med normalt museserum) og 4 behandlede dyr etter 5 dager med innsprøytning. Tumørene i kontrollgruppen (noen av disse ble farget med et rødt felt for å markere dem enda tydeligere) var omtrent 5 mm i diameter. De behandlede dyrene hadde ingen sykdom (man kunne bare se et arr på innsprøytningsområdet.) Figur 11 viser noen få dyr fra et annet eksperiment hvor alle 5 av de behandlede dyrene var uten tegn på sykdom (3 av disse vises) og 2 av dem har store tumører (disse dyrene ble drept 15 dager etter innsprøytningene).

I et annet eksperiment, ble de behandlede dyrene holdt i live i 8 måneder uten tegn på sykdom eller abnormaliteter.

Prøver og kroppsvæsker: AFP-reseptoren er til stede på cellemembranen, men også i cytoplasmaet. Det er et faktum at når radioaktiv AFP inkuberes med kreftceller, blir omtrent 2/3 av cellene funnet i cytoplasmaet, høyst sannsynligvis tilknyttet AFP-reseptoren. (henvisning 32. Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. og Uriel, J., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82, 3301 (1985) i den generelle introduksjonen som. jeg sendte deg). En'metode for å rense AFP-reseptoren fra humant "cord"-serum har blitt fremkalt [Moro, R., Tamaoki, T., Wegmann, T.G., Longenecker, B.M., og

Laderoute, M.P. Tumour Biol. 14, 116 (1993)], innlemmet som referanse. Denne metoden virker da man her tror at det finnes en sirkulerende AFP-reseptor som er frigjort fra døende celler eller som på en aktiv måte blir utskilt av disse. Det er et faktum at AFP-reseptoren er et oppløsbart protein som er til stede i blodet hos nyfødte barn, slik som man skulle vente..

Det samme finner sted igjen hos en person med en svulst, men i dette tilfellet er opprinnelsen av AFP-reseptoren ondartede celler istedenfor de foster-cellene i hvilke den blir uttrykt fysiologisk. Følgelig finnes det en AFP-reseptor i tumorens ekstracellulære væske. Dette er viktig da noen kroppsvæsker eller sekresjoner kan tilføres direkte fra denne ekstracellulære væsken. For eksempel, vil et peritonealt karsinom (kreftceller fra hvilken som helst opprinnelse som gjennom metastase til peritonéum sprer seg over hele maveregionen) vanligvis produsere ascitesvæske som vi har testet, og som er rik på AFP-reseptor (må ikke forvekles med asciter fremstilt i mus som en kilde for monoklonale antistoffer, selv om de fysiopatologiske mekanismene er de samme: kreftcellene (i dette tilfelle hybridom som fremstiller monoklonale antistoffer) i peritonal-rommet skaper en provoserende reaksjon som genererer ascitene hvor hybridom cellene frigjører de monoklonale antistoffene).

P-89, som vi har brukt som en henvisningsstandard i våre enzym immunoassay er en pleural effusjon hos en pasient med lungemetastase fra et bryst-karsinom. Situasjonen her er at cellene fra brystkreften migrerer til lungen og begynner å vokse på pleura, den hinnen som dekker lungene. Pleura reagerer på kreftcellene på samme måte som peritonéum gjør, bortsett fra at væsken blir kalt for pleural-effusjon istedenfor ascites. I disse tilfellene (ascites og pleural effusjon) vil kreftcellene som er i direkte kontakt med væsken (eller som flyter oppå den) frigjøre AFP-reseptoren rett inn i den.

Ascites og pleural effusjonene blir innsamlet ved å stikke hull med en nål. I andre tilfeller kan sekresjonen komme spontant ut gjennom kroppen. For eksempel kan en blærekreft frigjøre AFP-reseptor i urinen som så kan overvåkes. Et bronkalt-karsinom kan frigjøre AFP-reseptor i slim, som kan samles som oppspytt ved bare å tvinge pasienten til å hoste.

Hvis de ondartede cellene er i nær kontakt med blodet, som er tilfelle med leukemi og noen lymphomer, vil den høyeste konsentrasjonen av AFP-reseptor finnes i serum.

Alt som er blitt beskrevet ovenfor henviser til virkelige situasjoner, men de forekommer ikke ofte. De mest vanlige kreftsykdommer, magekreft, brystkreft, livmorskreft, tykktarm- og lungekreft vil frigjøre AFP-reseptor inn i blodstrømmen. Denne kroppsvæsken vil utvise høyest konsentrasjonen av merke i de væskene som er tilgjengelig for analyse. Imidlertid, etter hvert som følsomheten for forskjellige immunokjemiske teknikker øker, vil det eventuelt bli mulig å påvise AFP-reseptor i andre væsker. For eksempel, en liten mengde av de fleste serumproteinene kan finnes i spytt. Det er selvfølgelig mere praktisk å få en prøve av et spytt enn blod, og hvis mengden av AFP-reseptor er høy nok, og reaksjonens følsomhet som brukes også er tilstrekkelig, vil man være i stand til å bruke spytt istedenfor blod til diagnose og kontrollformål. Det samme gjelder for andre kroppsvæsker.

I sammendrag er det i noen tilfeller praktisk å bruke kroppsvæsker som ascites, artikulær væske, (for eksempel ved benkreft i et ledd), pleural effusjon, oppspytt, cerebrospinalvæske, urin, avføring, etc. I andre tilfeller, vil blod eller serum være det beste valg. Til sist, i noen tilfeller, ville det være mere behagelig av praktiske og juridiske årsaker å prøve andre kroppsvæsker, som spytt eller urin, selv om eventuelt flere AFP-reseptorer vil være til stede i serum. Kroppsvæsker kan oppsamles fra spontane sekresjoner, eller så kan man lage hull med en passende nål.

Immunokiemiske metoder: Disse metodene kan oppdeles i 2 grupper: De som utføres i et prøverør eller platebrønner hvor den faste fasen som reaksjonen sitter "fast på" er av en kunstig type, og hvor den faste fasen er en naturlig del av verten, for eksempel, et vevsnitt eller utstryk av blodceller. De første blir vanligvis referert til som immunokjemiske prøver, og de siste blir kalt immunohistokjemiske (når det gjelder et vevsnitt) eller immunocytokjemiske (når cellene er løse som i et "utstryk") teknikker. Prinsippene er identiske; det opprinnelige materialet varierer. For immunokjemiske prøver må molekylet som skal påvises eller måles befinne seg i en oppløsning, mens når det gjelder immunohistokjemiske eller immunocytokjemiske prøver, må det molekylet som skal undersøkes være en del av en celle som er i reaksjonen.

Det generelle prinsippet for disse reaksjonene er ganske enkelt: Antistoffer (monoklonale eller fra serum eller immuniserte dyr) er meget spesifikke når det gjelder å kjenne igjen den strukturen som de reagerer mot. Hvis et dyr har blitt

immunisert med meget rene fraksjoner a<y> for eksempel menneskelig albumin, vil serumet KUN kjenne igjen det albuminet som er til stede, i en prøve som også eventuelt inneholder meget store konsentrasjoner av hundrevis av andre proteiner. Antistoffene kan også ha meget stor likhet med stoffene som de er dannet mot (kalles antigener). Derfor vil meget små mengder av disse antigenene kunne bli påvist.

Den måten som brukes til å utføre immunokjemiske eller immunohistokjemiske reaksjoner er akkurat lik (immunocytokjemiske reaksjoner er blir inkludert blant den sistnevnte typen, da den eneste forskjellen er at i ett tilfelle er cellene en del av vevsstrukturen som har blitt snittet dg plassert på et snitt, og i det andre tilfellene er cellene blitt spredt utover snittet): Stoffet (antigenet) som skal påvises (i dette tilfelle AFP-reseptor) reageres med et antistoff som er spesifikt for det antigenet. En av de to (antistoffet eller antigenet) er blitt merket på en eller annen måte. Etter at de to er blitt inkubert sammen, vil den overflødige reagenten bli skylt ut, og merket vil da bli fremvist på en hel rekke forskjellige måter. Hvis merket er en radioisotope, vil de radioaktive tallene bli målt med en passende detektor (vanligvis brukes <125>1 til disse fremgangsmåtene og gamma-stråle emisjon blir målt. Disse teknikkene blir vanligvis gruppert under navnet radioimmunoassay (RIA)). Hvis inkubasjonen med radioaktivt merke utføres på et vevssnitt, vil <3>H bli fortrukket, og det blir fremvist på snittet etter at det har blitt dekket med en fotografisk emulsjon. Sølvfargede korn (sorte) vises hvis radioaktivitet er til stede. Disse kornene kan sees under et mikroskop.

En annen meget populær teknikk bruker et enzym som merke. Et enzym er en katalysator, og på denne måten kan det omforme et substrat til et nytt produkt. Den interessante egenskapen her er at et eneste enzym-molekyl (slik som pepperrot peroksidase eller alkalinsk fosfatåse (de 2 mest brukte)) kan behandle 10000 eller flere substrat-molekyler. På denne måten vil følsomheten bli enorm da forsterkelsesevnen er 10000 ganger så stor. Disse reaksjonene er kjent som enzym-immunoassay (EIA) eller enzym-bundet immuno-absorbente prøver (ELISA). Disse enzymene fremstiller vanligvis en fargeendring i stoffet. I oppløsbare assay (immunokjemiske reaksjoner) vil oppløsningen i et prøverør eller en platebrønn endre farge, og derfor, hvis man måler endringene, kan man kvantifisere reaksjonen (ved å bruke et fotokolorimeter eller et spektrofotometer). I andre tilfeller, vil enzymet frigjøre ioner fra en ikke-ionisk oppløsning, og på denne måten endre en oppløsnings elektriske ledningsevne, som deretter kan måles elektrisk. I en variasjon av disse teknikkene, vil merket være biotin som deretter blir gjenkjent av avidin blandet med enzymet. Avidin-biotin reaksjonen øker assayets rent generelle følsomhet.

Ganske nylig, ble en helt annen type merking introdusert. Disse merkene er fluorokromer som etter at de ble stimulert av UV-lys sender ut fotoner til det synbare spektrum. Reaksjonene ble målt med en fotocelle med en gang etter at de har blitt utsatt for en høy intensitet av UV-stimulerende lyspulser. Disse teknikkene er kjent som immunokjemoluminescens.. ,

Uansett hvordan molekylene hår blitt merket, eller hvordan reaksjonene blir lest, vil reaksjonene finne sted i hoen få godt definerte rekkefølger, som beskrives på

følgende måte:

Konkurrerende prøver: I dette tilfellet må fritt antigen (AFP-reseptor her) være tilgjengelige i relativt store mengder, og av en meget ren type. Antistoffet (Ab) ble festet til den faste fasen (prøverøret eller plastplate brønnen eller en passende membran, mer om dette nedenfor). Prøven som inneholder antigenet (Ag) blandes med en kjent mengde rent, merket Ag. Blandingen blir inkubert med Ab i den faste fasen. Dessto mere Ag som finnes i den opprinnelige prøven, jo mindre merket Ag kan festes til en spesiell mengde Ab på den faste fasen (Ag i metning sammenlignet med mengden Ab). Reaksjonen blir kvantetisert ved ekstrapolering mot en

oppløsning som inneholder en kjent mengde ikke-merket Ag. Denne teknikken fungerer kun med oppløsbare antigener, og er ikke praktisk for vevprøver. Hovedfordelen med konkurranse-prøver er at de kun trenger et antistoff.

"Sandwich" teknikkene: Her finnes det mange variasjoner: den tradisjonelle ELISA "sandwich" består av å kjemisk feste et Ab til en fast fase. Deretter vil den prøven som inneholder Ag og som skal måles bli tilføyet. Oppløsningene er av en slik type at reaksjonen fortsetter i overskudd av Ab. Etter inkubasjon i noen få minutter opp til flere timer, blir tilleggsreagensene skylt ut, og et annet antistoff blir tilføyet. Dette andre antistoffet må gjenkjenne et sete på Ag molekylet som er

annerledes enn det som ble gjenkjent av den første Ab. Ellers, vil setet bli tatt av den første Ab, og da ville ingen reaksjon kunne finne sted (med mindre Ag har mer enn ett identisk bindingssete som den andre Ab kjenner igjen, men dette ville være et meget uvanlig tilfelle). Det andre Ab er også til stede i store mengder slik at hele Ag blir gjenkjent. Denne andre Ab vil bli merket. Etter at man har skylt igjen, vil reaksjonen bli avlest. "Sandwich" teknikkene har en fordel, og det er at det er ikke nødvendig å ha en helt ren Ag. Ulempene er: Man behøver mere tid til reaksjonen (minst 2 inkubasjoner er nødvendig), og det trenges to forskjellige antistoffer.

Det er "Sandwichen" med "en skive" som blir brukt i dette eksempelet, og det er det som blir brukt i de fleste immunohistokjemiske reaksjoner når det gjelder vev. Her blir Ag festet til den faste fasen, og den merkede Ab (bare ett Ab) blir deretter inkubert på den. Ulempen, ved å bruke et prøverør som den faste fasen, er at p.g.a. den måten som Ag sitter fast på prøverøret, kan dette påvirke reaksjonsstyrken, og at selve festeevnen kan være avhengig av andre bestanddeler i prøven som varierer fra en pasients serum til et annet (dette er fordi styrkene som binder fast proteinene til glass eller plast i prøverøret eller platebrønnen, er elektrostatiske og faktisk

ganske svake, i motsetning til de sterke reaksjonene som knytter et Ag til sitt Ab). For å unngå dette, vil den dobbelte "sandwichen" som beskrives ovenfor fungerere

med en ekstra mengde på den første Ab. Deretter er spørsmålet hvorvidt den første Ab sitter fast til den faste fasen eller ikke, mer eller mindre uviktig. Det er alltid tilstrekkelig, og det er ingen variasjon fra en prøve til en annen, da det ikke-spesifikke festet til den faste fasen alltid bruker samme produkt i en prøve (det første Ab midlet). Forskjellen i eksperimentene mellom kreft og ikke-kreft pasienter, var her slik at disse ikke kunne forklares ved hjelp av forskjellene i belegget på de plastpl åtene som ble brukt.

Når det gjelder den faste fasen: Her kan det dreie seg om vevet på et mikroskopisk snitt, eller en passende overflate som molekylene vil feste seg til, vanligvis ved hjelp av elektrostatisk styrke (midlet har vanligvis nettopp vært inkubert i noen få timer i prøverørene som deretter skylles. Proteinene vil fortsatt sitte fast på glasset eller plasten). Imidlertid, i noen tilfeller, kan den faste fasen være en membran som vanligvis er laget av nylon eller nitrocellulose. Disse membranene er hvite. Når membranen først er blitt dekket med Ag eller Ab, så vil en prøve, av samme type som den som ble utført på mikroskop vevssnitt bli utført, og fargen blir fremkalt ved hjelp av et substrat, som istedenfor å forandre på fargen vil generere et farget bunnfall, og deretter på slutten av prosessen, vil et farget merke være tegn på hvorvidt en reaksjon var positiv eller ikke. Hvis det finnes farge, så finnes det en reaksjon; og hvis det ikke er noen farge, var reaksjonen negativ. Dette er et eksempel på den "alt eller ingenting" typen reaksjonen som har blitt nevnt tidligere. Denne reaksjonstypen har store fordeler i og med at den ikke krever at noe spesielt apparat må leses; det blotte øye er tilstrekkelig. Den største ulempen er at den ikke er spesielt nøyaktig.

Introduksjon av antistoffer i den menneskelige kroppen: Det finnes mange forskjellige metoder som kan brukes til å utsette pasientens kreftceller for anti-AFP-reseptor antistoffer: En måte er å sprøyte rene monoklonale antistoffer fra mus (Mab) inn i pasienten. Hvis ondartede celler er i direkte kontakt med blodet (for eksempel ved leukemi), så vil den intravenøse (LV.) fremgangsmåten være valget. Det samme gjelder hvis svulsten bare kan hås gjennom blodet. Det finnes imidlertid noen tilfeller hvor andre fremgangsmåter kan vise seg å være bedre. Slik som nevnt ovenfor, vokser noen svulster i avgrensede områder, slik som i pleurahulen, eller peritonalhulen. I disse tilfeller, vil det være bedre å sprøyte antistoffer direkte inn i hulen, istedenfor inn i blodstrømmen. En annen måte å få antistoffer mot AFP-reseptor er ved å bevirke at de kommer inn i verten. En kreftpasient kan immuniseres med AFP-reseptor fra forskjellige arter. Meget små forskjeller i samsvar mellom den menneskelige og andre arter av AFP-reseptor ville eventuelt gjøre det mulig å fremstille antistoffer i den pasienten, som selv om de for eksempel har blitt planlagte for AFP-reseptor for mus eller kveg, vil kryssreagerer med den autologe menneskelige AFP-reseptor. På denne måten blir pasienten "vaksinert" mot sin egen svulst. Det er verdt å nevne at antistoffene ikke er den eneste fremgangsmåten som "blokkerer" reseptor på overflaten av kreftceller. En denaturt

AFP skulle oppnå samme formål. Til og med et syntetisk stykke av AFP kan oppnå

det resultatet og derfor være til meget stor nytte når det gjelder å stoppe vekst av tumører.

Det finnes forskjellige fremgangsmåter for å oppnå modifisert AFP, deler av vanlige AFP eller deler syntisert ved hjelp av molekulær teknikk fra DNA. Hovedsaken her er at den AFP-delen som reagerer med AFP-reseptoren er i live, mens den gjenstående delen av AFP enten ikke er til stede, eller har blitt endret på eller skadet så meget at den ikke er i stand til å utføre sin funksjon. Alle disse fremgangsmåtene er i og for seg nokså kjente innenfor fagområdet. AFP blir ganske enkelt tilføyet til

hver og en av disse fremgangsmåtene. For eksempel bruker man en polypeptid synthesizer fra Beckman Instruments til å fremstille en syntetisk del av AFP som vil reagere med AFP-reseptoren. Aminosyresekvensen, som tilsvarer til den delen av

AFP som reagerer med AFP-reseptoren, blir ført inn i den polypeptide "synthesizeren", som da blir aktivert. Syntetisert polypeptid blir da resultatet. I en annen versjon, kan AFP-delen syntetiseres med innføring av den ønskede delen av DNA- sekvensen inn i et vertssystem, via en passende vektor slik som er godt kjent

i fagområdet. Vertssystemet vil deretter fremvise AFP delen, som deretter blir samlet og rengjort, hvis ønsket. Ellers kan transgen syntese bli brukt ved for eksempel å føre den ønskede DNA-sekvensen inn i et fertilisert bovint egg. Den ønskede AFP-delen blir deretter skaffet til veie fra dyret etter fødselen, noe som også er godt kjent i fagområdet. Vi henviser for eksempel til Maniatis et al. (1982).

En annen fremgangsmåte for å få tak i en ønsket AFP er å fjerne naturlig forekomst

av AFP. AFP blir kløvet med et kjedereagens, såsom cyanimid-bromid, og deretter renset for å oppnå den ønskede AFP-delen.

Claims

1. Anvendelse av en sammensetning som omfatter anti-(a-fetoproteinreseptor) antistoffer til å fremstille et farmasøytisk preparat for å behandle kreftceller hos en pasient med behov derav.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori behandlingen omfatter å vaksinere pasienten mot kreftceller.

3. Anvendelse som angitt i krav 2, hvori vaksinasjonen omfatter a-fetoproteinreseptor fra en art forskjellig fra pasienten.

4. Anvendelse som angitt i krav 3, hvori a-fetoproteinreseptoren til kreftcellene blir blokkert eller funksjonelt svekket.

5. Anvendelse som angitt i krav 1, hvori det farmasøytiske preparatet omfatter anti-(a-fetoproteinreseptor) antistoffer konjugert til legemidler eller toksiner.

6. Anvendelse som beskrevet i krav 1, hvori det farmasøytiske preparatet omfatter anti-(a-fetoproteinreseptor) antistoffene som er radiomerket.

7. Anvendelse som beskrevet i krav 1, hvori det farmasøytiske preparatet omfatter anti-(a-fetoproteinreseptor) antistoffene som er monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, antistoffer fra en art forskjellig fra pasienten, eller antistoffer fremstilt in vitro fra lymfocytter fra samme art som pasienten.